Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Abstract

Hücreler, bir süreç olarak adlandırılan kutuplaşma onların yuvarlak kaybederek ve birçok proteinlerin hücre içi lokalizasyonu değiştirerek uyarılmasını kemokin cevap. Klasik görüntüleme teknikleri bu olguları incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, morfolojisi ve hücre onlarca boyama eş-lokalizasyonu zaman alıcı miktarının ardından birçok hücrede elle toplama gerektiriyordu. Burada, hızlı ve güçlü bir yöntem, bir sitometresinde kişilerce mikroskop avantajlarını bir araya teknolojisi sitometri bir görüntüleme akışı kullanılarak hücrelerin birkaç bin oluşan numuneler üzerinde, bu olayları incelemek için tarif edilmektedir. MHC sınıf I molekülleri ve filamentli aktin için CCL19 ve boyama ile uyarılmış T lenfositleri kullanılarak bir yolluk stratejisi aynı zamanda şekil değişikliklerinin derecesi ve CCL19 sinyal etkilenen belirteçlerin eş-lokalizasyonu derecesini ölçmek için sunulmuştur. Üstelik, bu yolluk strateji gözlemleme için bize izine CXCL12 uyarıldıktan sonra polarize T hücrelerinde (ön) ipliksi aktin ve (arkada) fosforile Ezrin-Radixin-moesin (fosfo-ERM) proteinlerin ayrımı. Par6 / atipik PKC sinyal yolunun mutantlar bir farmakolojik inhibitörü ve ifade ile aktin polimerizasyonu inhibe: Bu teknik aynı zamanda iki farklı unsurların kutuplaşma engelleme etkisini gözlemlemek için yararlı oldu. Böylece, kanıtlar bu tekniğin morfolojik değişiklikler ve protein yeniden dağıtımı esnasında hem de analiz etmek yararlı olduğu gösterilmiştir.

Introduction

Kemokinler özel yerlere ¹ hücreleri çekmek küçük çözünebilir proteinlerdir. Bu nedenle, bu dokularda hücre doğru konumlandırılması, geliştirme ve fizyolojisi çok önemli bir işlevine katılırlar. Bu, etkili bir bağışıklık karşılığının ortaya çıkarılması için birlikte hareket birçok farklı hücre tiplerinin hareketlerine dayanır, bağışıklık sistemi, bu kurala istisna değildir. Yabancı antijenler tespit ve nötralize edilebilir önce belirli bir durumda bir bağışıklık hücre tipi özel konumunu kontrol ederek, kemokinler önceden gerekli bulunmaktadır.

Özellikle T lenfositleri kemokinler T hücresi hareketliliği ^2,3 tercih geçişi üzerine, hücreiçi sinyal ortaya, özel yüzey reseptörleri (kalsiyum yükselişi ERK fosforilasyonu, Rho GTPazlar aktivasyonu, integrinler afinite ve sitoskeletal değişimler artış) bağlanır. Hücresel düzeyde, bir kemokin stimülasyon üzerine ortaya morfolojik değişiklikler gözlemleyebilirsiniz.Hücre şekilleri bu değişiklikler T hücrelerinin özellikle dramatik: kanda seyahat ederken dinlenme T hücreleri, bir boncuk gibi yuvarlak morfoloji var. Ön bir ön kenarı: Bununla birlikte, iltihabik bölgelerde veya lenfoid organların yakınlık kemokinlerin varlığı algılama hemen iki kutuplu bir formundan oluşan tipik bir "el ayna" morfolojisi kabul T hücrelerinin şeklinin değiştirilmesi için gidiyor ve arka ⁴ bir arka kenar veya uropod. Buna ek olarak, hücre içi bileşenleri göç sürdürmek için polarize T hücresinin bu iki zıt bölgeye ayırmak olabilir. Örneğin kemokin uyarımı ⁵ ve polimerize aktin üzerine aktin filamentler polimerizasyon artar kutuplaşmış T hücresinin ² ön birikir. Öte yandan, bu tür kortikal F-aktin hücre iskeleti, plazma membranı bağlantı Ezrin-Radixin-moesin (ERM); ailesinin fosforile proteinler gibi bazı proteinler, kutuplaşmış uropod yeniden lokalizeT hücreleri, ^6. İlginç bir şekilde, ve diğerleri, bu kutuplaşma süreci T hücre göçü için gerekli olduğunu göstermiştir. Nitekim, polarizasyon müdahale herhangi bir tedavi hücresel hareketliliğini engeller. Örneğin, atipik protein üyelerinin etkinliğinin engellenmesi, C (PKC), aile, PKCζ ve PKCι blok T hücresi polarizasyon ve dendritik hücrelerin ⁷ için göç tarama işlemini kinaz. T hücre kutuplaşma da Rho GTPases tarafından düzenlenir. Son zamanlarda tarif edildiği Fam65b proteini ile RhoA aktivitesinin modüle bir Transwell tahlilinde ⁶ geçirilecek T hücre morfolojisindeki değişikliklerle ve kapasiteyi etkiler göstermiştir. Polarizasyon hücre motilitesi için bir ön adım olarak, kemokin tepkilerin ana okuma olarak ölçmek mümkün böylece önemlidir. Hücre şekli değişiklikleri önceden elle ⁸ ölçüldü. Ancak, miktar bu tür çok zaman tüketen olduğunu, genellikle sadece birkaç yüzdenhücre on dikkate alınmaktadır.

Burada, yeni bir yöntem hızlı uyarımı kemokin maruz bırakılan T lenfositlerinin şekil değişiklikleri derecesini ölçmek için sunulmuştur. Teknoloji sitometri bir görüntüleme akış kemokin stimülasyon farklı koşullarda verimli polarize hücrelerin miktarını ölçmek için bir akış sitometresinde ve bir mikroskop ⁹ avantajlarını birleştiren, kullanılan (Belirli Reaktifler / Ekipman Tablo). Bir bu teknoloji ile sağlam ölçebilen morfolojik değişimlerin değerlendirilmesiyle ek olarak, bu kemokin sinyali üzerine, bazı proteinlerin hücre altı lokalizasyonda değişiklikleri değerlendirmek için de mümkündür.

Protocol

T Lemfositleri hazırlanması 1.

1. ^10,11 tarif edildiği gibi primer, fare veya insan T hücrelerini hazırlamak.
2. 3 x 10 ⁶ hücre / mL - 2 arasında bir yoğunlukta% 10 insan serumu AB ile tam RPMI ortamı içinde insan T hücrelerini yetiştirmek.
   Not: kültürde insan T hücrelerinin büyük bir kısmını kendiliğinden polarizasyon ortaya fetal sığır serumu (FCS) yerine, insan serumu kullanılması. Bu dönemde herhangi bir zamanda 5 gün ve daha fazla işlem onları - 4 kültürde bu hücreleri tutun.
3. Benzer bir hücre yoğunluğunda,% 10 FCS ile desteklenmiş tam RPMI ortamı içinde fare T hücrelerini koruyun. 10 ng / ml IL7 mevcudiyetinde 37 ° C 'de hemen ya da ertesi gün, bir O / N kültürden sonra kullanın.
4. Tam RPMI,% 10 FCS ile takviye edilmiş CEM insan T hücre soyu geliştirin.

2. Kemokin Uyarım

1. 10 mM HIPE ile desteklenmiş sıcak HBSS ortamında deneysel koşul başına 5 x 10 ⁵ hücre yıkayıns. Bazı deneyler için, 2 ug pmaxGFP ve 8 ug pcDNA3.1 ⁺ (boş vektör kontrol), ölü yer PKCζ kinaz ya da N-ucu Par6 plazmidler ile bir gün önce, primer insan T hücrelerinin ko-transfekte.
2. Sıcak HBSS-hepes ortamında hücre pelletini (deneysel koşullar 0.3 ml x numarasını kullanın).
3. 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine hücreleri dağıtın.
   NOT: Bu nedenle, tek bir deneysel koşuluna karşılık gelen bir boru, 0.3 ml HBSS-HEPES ortamında 5 x 10 ⁵ hücre içerir. Bazı deneyler için, 500 nM Latrunculin A veya aracı (DMSO) ilave ediniz ve kemokin uyarılmadan önce 30 dakika için kuluçkalayın.
4. Her bir tüp içinde 10 ng / ml CCL19 veya CXCL12 kemokin 500 ekleyin.
   NOT: Biz genellikle 10 kullanın - İnsan T hücreleri için 200 ng / ml kemokini. CEM hücreleri CCL19 bağlayan CCR7 reseptörü ifade yoktur. Bu nedenle, CEM hücreleri sadece bir CXCL12 uyarısına cevap mümkün olacak. 500 N - Ayrıca, daha yüksek bir kemokin konsantrasyonları (300 kullanımıg / ml) fare T hücrelerini kutuplaşmaya.
5. Tüpler birkaç kez ters çevirin ve sırasıyla, birincil T hücrelerinin veya CEM 8 ya da 10 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde inkübe.
6. Her bir tüpe,% 2 paraformaldehit (PFA) ile PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden ılık bir çözeltiye, 0.3 ml ilave etmek suretiyle polarizasyon işlemi durdurun. Tüpler ters çevirin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe.

3. Renklendirmeler

1. Tüpler akış sitometri mikrosantrifüj tüpleri hücreleri aktarın.
2. % 1 sığır serum albümini (BSA), 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM Hepes ihtiva eden bir RT çözeltisi ile tam olarak tüpler doldurun.
3. 4 dakika için 460 xg'de tüpler santrifüj.
4. Süpernatant atılır ve PBS içinde% 5 FCS ihtiva eden bir RT çözeltisi 100 ul süspansiyon hücrelerin.
5. Işıktan uzakta, girdap onları, her bir tüp içinde FITC-anti-HLA-ABC 5 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe.
6. PBS,% 5 FCS ihtiva eden bir kez hücreler yıkayınSadece bir kez PBS ile nd.
7. Oda sıcaklığında: daha sonra% 1 BSA, 0.5 mM EDTA ve PBS içinde 10 mM HEPES içeren bir solüsyon ile yıkama hücreleri, 10 dakika süre ile inkübe edilir, 500 ul% 1 PFA ekleyin.
8. Süpernatant atılır, PBS,% 0.2 BSA,% 0.1 saponin, 0.5 mM EDTA ve 10 mM Hepes (permeabilizasyon tamponu) ihtiva eden bir çözelti ile tamamen tüpleri doldurun.
9. Bu ortam içinde hücreler iki kez yıkayın.
10. Orta kaldırmak ve hücre pelet ayırmak için onları vorteks tüpleri çevirin.
11. Her bir tüpe, anti-P-KRY antikorun 100 seyrelti, girdap onları ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir: ve / veya 1 ila 0.25 ug / ml TRITC-falloidin ekleyin.
12. Permeabilizasyon tampon maddesi ile hücreleri yıkayın. Bir fluorescent sekonder antikor gerektiğinde kuluçkalayın.
13. 200 ul PBS hücrelerin tekrar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz.
    NOT: Hücreler edinimi için hazırız. Tüp başına 200 ul maksimum toplam hacmi korurken, alternatif olarak, bir son% 1 konsantre PFA eklemekHücreler daha fazla işlem için aynı gün kullanılmak üzere takdirde için yoğunlaştırma lekelenmelerinin korumak için.

4. Görüntüler Toplama ve Analiz

1. Aparat (Belirli Reaktifler / Ekipman Tabloya bakınız) açın ve üreticinin talimatlarına göre kendisini kalibre edelim.
   NOT: INSPIRE yazılımı 40X objektif (0.75 NA) ile kullanılmıştır. FİKİRLER 3.0 yazılımı tüm bildirilen sayımsal için kullanılmıştır.
2. Gelecek deneyler için bir şablona kaydedilebilir satın alma pencereleri bir dizi hazırlayın. RMS degrade değerlerini ölçmek histogramlar çizin. RMS degrade histogram seçilen "Focus" nüfus itibaren, Alan histogram "Tek hücreli" nüfus sınırlandırmak. Mikrosantrifüj tüpü makinesinde yerleştirildikten sonra, tek tek hücreler ile bir kapı lazer gücünün ayarlanması ve 5000 T lenfositleri kazanır.
3. Yumuşak Fikirlerware, satın alma dosyasını açın ve her hücre için elde edilen parlak bir alan görüntüler için degrade RMS değerini gösteren bir histogram (Kanal 1) oluşturun. 57 Yukarıda RMS degrade değeri sergileyen hücreler gördüğü RMS degrade histogram üzerinde bir kapı çizin.
   NOT: RMS degrade analizinde odak düzleminde sadece T lenfositler dikkate alarak sağlar. Bu 57 um'nin RMS gradyan değeri gösteren tek tek hücreler odak düzlem içindedir ve doğru olarak kabul edilebilir ampirik olarak tespit edilmiştir.
4. Analiz / Maskeler menüsünde, 2 piksel aşınmış aydınlık görüntüler M01, üzerinde morfoloji maskesinden (M01,2) Erode denilen, yeni bir maske oluşturmak. Ardından, Analiz / Erode (M01,2) maske hesaplanan Area, yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır. Bir önceki kapısı seçilen hücrelerden, bu yeni oluşturulan maske kullanarak hücrelerin Alan gösteren bir histogram açın.
   NOT: ulaşırsınız morfoloji maskeleriVarsayılan hücrenin gerçek boyutundan daha büyüktür. Böylece, 2 piksel o kadar aşındırmak için daha hassas.
5. Kalibrasyon boncuk ve enkaz (küçük Alan) ve çiftler (büyük Area) hariç, bireysel T hücreleri üzerinde bir kapı çizin. Her satın alma bu kapıyı ayarlayın.
   NOT: Hücre boyutu varyasyonlar kapısı konumunu etkileyecektir. Fare T hücrelerinin kendilerini CEM hücreleri daha küçük olan insan T hücrelerinin daha küçük olduğu için, her hücre tipi alan büyüklüğü ile orantılı olacaktır.
6. Önceki adımlarda Geçitli edildi tek odakta hücreleri göz önüne alındığında, Phalloidin Raw Max Pixel bir fonksiyonu olarak HLA-ABC boyama Raw Max Pixel (Kanal 2, x ekseni) oluşan bir nokta arsa açmak boyama (Kanal 4, y ekseni). Lekesiz veya doymuş floresan olayları dışlamak için bir kapı oluşturun. Ham Max HLA-ABC için Pixel (Kanal 2) ve Phalloidin (Kanal 4) lekelenmelerinin gösteren Aç iki histogramlar.
7. Analiz / Maskeler menüsünde, creat içinde2 piksel aşınmış HLA-ABC boyanmış hücreler (Kanal 2), morfolojisi maskesinden (M02,2) Erode denilen adet yeni maske. Ardından, Analiz / Erode (M02,2) üzerinden hesaplanan Circularity parametresi oluşan yeni bir özellik oluşturmak, menü bulunmaktadır.
   NOT: Bu parametre, bir daire hücre şeklinin sapmasını ölçer. Bu nedenle, mükemmel yuvarlak T hücresi düşük dairesellik endeksi sergileyecek uzatılmış polarize hücreler ise yüksek bir yuvarlaklık değerine sahip olacaktır.
8. Daha sonra, daha önce kapı hücrelerden Circularity özelliği değerlerini rapor başka bir histogram yaratmak. Doğrudan her bir hücre için daireselliğe değerine göre bir birey, odakta hücre popülasyonu dağılımının çizmek için bu histogram kullanın.
9. Uyarılmamış hücrelere için histogram şeklinde bakıldığında, dairesellik sınır değerine kadar düşük dairesellik değerden başlayarak polarize hücreler için bir kapı çizmek burada Uyarılmamış hücrelere ençizilmiştir. Kapılı nüfus arasında polarize hücrelerin yüzdesi istatistikleri ekrana bak (% Geçitli).
   NOT: Biz 13 altında Circularity indeks değerleri için bu kapıyı belirledik.
10. Hücrelerde aktin boyama kutuplaşma bakmak için, HLA-ABC boyama (Kanal 2) ve falloidin boyama karşılaştırarak, Parlak Detay Benzerlik R3 değeri için histogram arsa (Kanal 4).
    NOT: Bu özellik büyük değeri, en fazla iki Renklendirmeler vardır bindirilmiş.
11. Daha önce olduğu gibi aynı yolluk strateji kullanarak, polarize aktin boyama ile hücrelerin yüzdesini gösterir ayrılmış boyama için, uyarılmamış hücreler ile bir kapı çizilir.
12. Tamamlandığında, MHC Sınıf I ve falloidin boyamalar, birlikte SD ± bütün hücrelerin Circularity ve Benzerlik indeksleri ortalama değerleri ile polarize hücrelerin yüzdesi dağılımında bir ayrımı sergileyen hücrelerin yüzdesi Nominal değerden uygun olarak gösterilmektedironding istatistik paneller.

Representative Results

Burada seçilen ilk örnek CCL19 ile uyarılmış insan primer T lenfositlerinin kullanımı ile ilgilidir. Bununla birlikte, aynı strateji primer fare T hücreleri, T hücre çizgileri ya da kemokin stimülasyona yanıt veren herhangi bir başka hücre tipi ile kullanılabilir. Burada sunulan yolluk strateji odaklı olaylar, ardından tek hücreleri seçin pencerelerin bir dizi içerir. (Şekil 1) veya CCL19-uyarılmış (Şekil 2), T lenfositleri istirahat için MHC Sınıf I HLA-ABC ve ipliksi aktin: Nihayet floresan yoğunluğu aralığı iki belirteçleri üzerine burada bir örnek olarak takip edilmektedir.

İlk olarak, dairesel göstergesi muamele edilmemiş (Şekil 1) ya da CCL19 uyarılmış (Şekil 2), T lenfositleri ile ölçülür. dinlenme Hücreler, yüksek Circularity göstergesi değeri olan bir büyük tek bir pik sahip olması en hücreler yuvarlak yakın olduğunu göstermektedir. Ancak, CCL19 stimülasyon o görünümünü ortaya çıkarır açıktırDüşük Circularity indeksi hücrelerin fa ikinci ICSI'nin. Bu ICSI'nin polarize morfoloji benimsemiştir hücreleri kapsar. HLA-ABC ve F-aktin boyama arasındaki parlak Detay benzerlik endeksi temsil ettikleri zaman, ayrıca, bir tanesidir hücrelerinin her iki belirteçler eş-lokalizasyonu daha düşük bir derecede olduğunu göstermektedir gösteren CCL19 muamele edilerek, bu indeks değerinin bir düşüş sergiler olduğu görülmektedir . Nokta-araziler önceden sunulmuş gelen İlginçtir, bir. Bir aydınlık görüntü ve yapılan boyamalar her biri için bir görüntünün oluşan hücrenin bir resim elde etmek için herhangi bir nokta üzerinde curser yerleştirin böylece CCL19 örnekleri T uyarılmış sunar Şekil 3 edebilirsiniz olmayan polarize (Şekil 3A) veya polarize (Şekil 3B) hücrelerin kapısı düşmek lenfositler. Bir açıkça her iki alt popülasyonlar arasındaki morfoloji farklılıkları oluşturulabiliyor. Şekil 1 Circularity histogramlar aşağıdaki istatistik tabloları 2, bir yokluğu veya CCL19 varlığı (Şekil 3C) polarize kapısı düşmek hücrelerin yüzdesini çizebilirsiniz. Beklendiği gibi, bu kemokin stimülasyonu (% 11.2 den% 50.6 kadar) polarize T hücrelerinin yüzdesini arttırır açıktır. Bir de Her iki durumda da (Şekil 3D) 'de elde edilen bütün hücre popülasyonunun ortalama Circularity endeksi belirleyebiliriz. CCL19 stimülasyon bu endekste bir düşüş ortaya çıkarır. Yalnızca hücrelerin yarısının polarize Ancak, CCL19 stimülasyonu üzerine gözlenen ortalama Circularity endeksinin değişmesi küçüktür.

Benzer şekilde, Şekil 4, HLA-ABC ve F-aktin iki boyamaları (Şekil 4A) yapmak ya da (Şekil 4B) colocalize olmayan hangi CCL19 uyarılmış hücrelerin örnekleri temsil eder. Şekil 1 ve 2'de gösterilen Parlak Detay Benzerlik histogramlarına aşağıdaki istatistik tabloları, bir oran elde edebilirsinizHLA-ABC ve F-aktin arasında eş-lokalizasyonu çok düşük derecede gösteren hücreleri temsil eden 1,5 altında bir endeks değeri gösteren hücre. Şekil 4C gösterir CCL19 stimülasyonu üzerine bu kapı artar düşen hücre fraksiyonu ( 3.4 ila%) 13.9% ile. Her bir hücre için endeks değerlerini toplamak, bir de Her iki durumda da (Şekil 4D) 'de elde edilen bütün hücre popülasyonunun ortalama aydınlık Detay benzerlik endeksi belirleyebiliriz. CCL19 Ancak, daha önce olduğu gibi aynı nedenlerle, değişiklikler küçük, endekste bir düşüş ortaya çıkarır. Eş-lokalizasyon F-aktin hücre, bir kutup F-aktin kümelenme kaynaklanmaktadır - ilgili hücre görüntüleri bakarak, HLA-ABC bu düşüş görülmektedir. Tersine, HLA-ABC MHC Sınıf I moleküllerinin hücre içi dağılımı kabaca CCL19 stimülasyon etkilenecek görünmüyor.

Yani bir sonraki daha test etmeye karar verdim nedeni budurBilinen iki işaret (F-aktin ve fosfo-ERM) analiz ederek yöntem kemokin ile uyarılmış T hücrelerinin kutuplara olarak ayrılma. (50 ng / ml CXCL12 ile uyarılmaya 8 dakika sonra 5,95 ila% 79,10,% polarize hücre) daha önce aynı yolluk stratejisi Şekil 5A'da miktarı olarak CXCL12 ile uyarılan insan T hücrelerinin, güçlü bir polarize. F-aktin ve fosfo-ERM CXCL12 uyarıldıktan sonra daha az colocalize, yani Şekil 5B ve 5D 'de gösterildiği gibi, bu koşullar altında, ortalama aydınlık Detay Benzerlik indeksinde kuvvetli bir azalma vardır. Beklendiği gibi, burada seçilen markerlerin ayrılmasını gösteren hücrelerin yüzdesi, daha önce ele olanlar (% 14, Şekil 4C) ile karşılaştırıldığında (% 48, Şekil 5C) daha yüksektir. Buna göre, her koşul ortalama Benzerlik endeksinde düşüş de (Şekil 5D) daha açıktır. Bu nedenle, burada sunulan görüntüleme akış sitometri tekniği su olduğunuitable farklı ortamlarda iki boyamalar eş-lokalizasyonu derecesini ölçmek için.

Son olarak, biz ne ölçüde bazı sitosköletal eleman veya kemokin stimülasyon üzerine T hücre morfolojisi değişiklikleri etkilediği bilinen sinyal yolunun pertürbasyon göstermek için karar, akım sitometri görüntüleme ile ölçülebilir. T-hücreleri kontrol önce Bir (Şekil 6A) Latrunculin aktin kesintiye ilaç ile önceden muamele edilmiş bir karşılaştırıldı. Hücreler akış sitometrisi görüntüleme ile floresan falloidinle boyanmış ve analiz, CXCL12 ile uyarıldı. F-aktin boyama Ham Max Piksel yoğunluğu gösteren histogramlar her iki hücre popülasyonlarının (Şekil 6A, üst) için gösterilmiştir. Aktin filamentler karşı Latrunculin A kesilmesi aktivitesi beklendiği gibi, falloidin boyama yoğunluğu araç DMSO (sol panel) ile muamele T lenfositleri kontrol ile karşılaştırıldığında, bu hücreler (sağ panel) daha düşüktür. Ayrıca, A-tr LatrunculinEated T hücreleri, kontrol hücreleri (Şekil 6A, alt) daha çok yönlü kalmasını gösteren daha büyük bir Circularity endeksi gösterir. Bu morfolojik değişiklikler sergileyen hücrelerin yüzdesini ölçmek için histogramlar ayarlanmış bir kapı ile ölçülebilir. Kontrol hücrelerinin% 32 bu durumda polarize olsun karşın, bir ile tedavi edilen T Latrunculin sadece 10% sergi herhangi bir şekil değişiklikleri (Şekil 6B) lenfosit. Bu nedenle, bu kimse bu fenomen bazı hücre iskeletinin potansiyel etkisini inceleyen zaman teknoloji sitometri görüntüleme akışı morfolojik değişiklikler farklılıkları ölçmek için uygun olduğunu burada gösterilmektedir.

İkinci olarak, bu yöntemle hücre çok sayıda alıcı ayrıca bir azınlık olarak, bu hücrelerin hızlı bir şekilde küçük alt kümelerini analiz ihtimalini açmaktadır. Analizimiz spesifik T hücrelerinin davranışı ko-transfeksiyonu ile sınırlıdır burada Şekil 7'de, bir örneği sunulmuşturpolarite kompleksi Par6 / PKCζ dominant negatif mutantlar için kodlayan plazmid ile birlikte GFP ile ed. transfekte-olmayan hücrelere tekabül eden histogram ilgisi GFP ⁺ T hücrelerinin (Şekil 7A, sol) ile kapısı izin verdi. Kanal 2'nin floresan yoğunluğu dağılımını ölçmek hıstogramlar olarak ölçülen GFP yoğunluğu aslında bütün hücre popülasyonunun sadece küçük bir bölümü (Şekil 7A), transfekte edilmiş olduğunu göstermektedir. Bu transfekte edilmiş hücrelerin morfolojik polarizasyon derecesi daha sonra GFP ⁺ hücreleri (Şekil 7B), sadece Circularity indeksinin ölçülmesi ile nicelendirildi. Dairesellik düşük değerler sergileyen T hücreleri için ek bir kapı her bir durum (Şekil 7C) polarize hücre yüzdesi tahmin sağladı. Sonuçlar Par6 / PKCζ sinyal yolunda işlev bozulması, T hücresi polarizati inhibe ettiğini gösterdiBizim daha önceki bulgularla ⁷ ile uyumlu, hem CCL19 ve CXCL12 kemokin tarafından uyarılan üzerinde.

Şekil birincil insan T hücreleri üzerinde 1. Temsilcisi olmayan uyarılmış boyama sonuçları. Sol üst paneli (Kanal 1) parlak bir alan görüntülerde M01 maske ile hesaplanan Gradient RMS histogram paylaştırılmasını gösterir. Sağ üst paneli önceki grafiğinden kapılı olarak Odak hücrelerinin aydınlık görüntüleri dayalı 2 piksel aşınmış M01 maskesi, bir Alan (Kanal 1) göstermektedir. orta paneller birey için, HLA-ABC ve Phalloidin boyamalar (sırasıyla kanallar 2 ve 4) ya da bir nokta arsa (sol panel) ya da histogramlar (orta ve sağ paneller) ve hem de ham maksimum piksel değerlerini göstermektedir in Bir önceki aşamada seçilen hücreleri odak. Doğru boyama bireysel, odakta hücrelerinin bu nüfusun itibaren, HLA-ABC ve Phalloidin boyamalar arasındaki benzerlik derecesini gösteren HLA-ABC boyama (sol alt panel) ve Parlak Detay Benzerlik R3 özelliği (sağ alt panel) 2 piksel aşınmış M02 maske Circularity özelliği hesaplanır . Bu son iki araziler için, nüfusun yeniden bölmek gösteren istatistikler aşağıda tabloda belirtilmiştir (kapılı% özelliği, Güney Dakota demek). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Şekil 1 ila 8 dakika süreyle 200 ng / ml CCL19 ile uyarılmış primer insan T hücreleri üzerinde Örnek boyama sonuçları panel yerleşim ve yolluk stratejisi aynıdır.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3: CCL19 tarafından uyarılmış T lenfositlerinin morfolojik durumunun belirlenmesi. (A, B), Şekil 2 dış veya "polarize" kapısı hücrelerin örnekleri arasında, CCL19 yokluğunda elde polarize T hücrelerinin yüzdesini gösteren, sırasıyla (Cı) Histogram. (Şekil 1 -) ya da 200 ng / mi CCL19 (Şekil 2, +) bireyde ± SE dairesellik indeksi ortalama değerleri temsil eden (D) Histogram yokluğunda odakta hücre popülasyonu. - CCL19 ya da varlığında (+) (). *** P <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

HLA-ABC ve falloidin boyamalar arasında eş-lokalizasyonu derecesi Şekil 4. miktarının belirlenmesi. (A, B), Şekil 2 dışında veya parlak Detaylı sırasıyla Benzerlik histogramı itibaren "lokalize olmayan" kapısı hücrelerin örnekleri arasında. (C), un- her iki işaret arasında herhangi bir ko-lokalizasyonunu sergileyen T hücrelerinin yüzdesini gösteren histogram (-) ile uyarıldı. ya da CCL19 uyarılmış (+) koşullar bireyde ± SE benzerlik endeksi ortalama değerleri temsil eden (D) Histogram yokluğunda odakta hücre popülasyonu - CCL19 ya da varlığında (+) (). *** P <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

p-together.within sayfa = "always">
F-aktin Şekil 5. Analizi - insan primer T hücrelerinin uyarılması üzerine CXCL12 fosfo-ERM dışlama. CXCL12 (10 ya da 50 ng / ml) varlığında ya da yokluğunda polarize T hücreleri (A) yüzdesi. (B), parlak Detay Benzerlik endeksine göre birey, odakta hücre popülasyonunun bir bölünmeyi gösteren histogramlar sitometrisi Görüntüleme akış herhangi bir ko-lokalizasyonunu arzeden hücrelerin oranının bu CXCL12 yokluğunda ya da 10 ng / ml ya da 50 ng / ml CXCL12 ile, fosfo-erm falloidin boyamalar arasındaki eş-lokalizasyonu ölçüde karşılaştırır. (C) miktarının belirlenmesi PERM ve T hücrelerinde falloidin boyamaları uyarılmış ya da CXCL12 ile. Her durumda ± SE benzerlik endeksi ortalama değerleri (D) miktarının belirlenmesi. *** P <0.001./ 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "upload> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

T hücre kutuplaşma üzerine aktin polimerizasyonu Şekil 6. etkisi. (A), F-aktin sonra Latrunculin bir (500 nM, 30 dakika) ya da DMSO ile muamele edilmiş ve primer insan T hücrelerinin boyama yoğunluğu (üst panel) ve daireselliği (alt panel) 8 dakika boyunca 100 ng / ml CXCL12 ile uyarılır. ( B) CXCL12 ile stimülasyon 8 dakika sonra DMSO veya Latrunculin A ile tedavi polarize T hücrelerinin yüzdesini gösteren Histogram. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil PKCζ kinaz ölü mutantı veya CCL19 ya da CXCL12 muameleden sonra Par6 blok T hücresi polarizasyon N-terminali mutant 7. ifadesi. Transfekte-olmayan primer T-hücreleri veya birincil T hücrelerinin ko-transfekte edilmiş GFP ve boş vektör (kontrol) ya da PKCζ kinaz ölü mutantı ya da bir N-terminali GFP ekspresyon yoğunluğunu gösteren histogramlar sitometrisi (A) 'Görüntüleme akışı, Par6 parçası (B), temel seviyede farklı yapıları ifade eden, GFP-pozitif bir hücre popülasyonu daireselliğine bir göstergesini temsil eden histogram sitometrisi Görüntüleme akışı (AD: Resim stimülasyonu). ya da CCL19 ya da CXCL12 uyarılması (100 sonra ng / ml, 8 dakika boyunca ). (C) düzeyinde veya bazal CCL19 veya CXCL12 uyarılmasından sonra farklı yapıları ifade morfolojik polarize T hücrelerinin yüzdesi miktarının belirlenmesi. tıklayınız ver bir büyük görmek içinBu rakamın sion.

Discussion

Sitometri, hızlı ve bilgilendirici yolluk strateji kemokin uyarımı ile uyarılan hücresel ve moleküler olayları analiz etmek görüntüleme akışının son teknolojiyi kullanarak sunulmuştur. Kemokin uyarılması ve polarizasyon sürecinde farklı proteinlerin hücre içi dağılımı ile oluşturulan hücre morfolojisi değişiklikleri: Tek bir deney itibaren, bir iki ana bilgi edinebilirsiniz. İlginç bir şekilde, kanıtlar da istatistiksel sağlamlık ve bütün hücre nüfusun küçük bir fraksiyonu ilgili analizine izin verir hücrelerin geniş bir sayısı analiz imkanı sağlanır. Belirtildiği gibi, bu teknik, aynı zamanda bağışıklıkla sinaps ¹² bağlamında molekül yeniden dağıtım olayları analiz etmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, benzer bir düzenleme kadar önceden sdf1 uyarılmış T hücreleri için kullanılmaktadır, fakat iki işaret arasındaki eş-lokalizasyonu derecesi hiç analizi ¹³ temin edilmiştir.

RağmenBu teknik, bu şekilde bir çok hücre tipinde için uygun olabilir, yapışan hücreler direkt olarak analiz edilemez ve süspansiyon halindeki hücreler önce satın sabit olması gerekmektedir. Makinenin bu iç sınırlamalarına ek olarak, bunları stimüle 37 ° C'de hücreler kalması açısından çok önemlidir. Böyle şekil değişiklikleri sürücüler aktin polimerizasyonu gibi hücre iskeleti değişiklikler, sıcaklığa çok bağlıdır çünkü sıcaklık gerçekten uygun T hücre kutuplaşma elde anahtarıdır. Latrunculin bir muamele edilen hücreler ile deneyler, bir hücre, tam polarize durumunu elde etmek için kemokin uyarılması tarafından uyarılan uygun aktin remodeling gerçekten önemli olduğunu onaylayın. Bu ilaçla burada sağlanan verilere ilave olarak, aynı zamanda Par6 / PKCζ sinyal yolunu inhibe eden mutasyona uğramış proteinleri ile transfekte edilmiş insan primer T lenfositleri ile görüntüleme akış sitometrisi teknolojisi test edilmiştir. Sürekli bizim önceden yayınlanmış sonuçlarla ^7, burada gösterilen bu polarite kompleksi fT hücresi polarizasyon avors.

Kemokin uyarımı üzerine, T-hücreleri, bir polarize şeklinin benimsenmesi bunların yuvarlak bir morfolojisi kaybeder. Biz bu morfolojik değişiklikler ölçmek için en doğru olması için Circularity parametresini bulduk. Ancak, şekil değişiklikleri açıklayan diğer parametreler gibi Aspect Ratio veya Elongatedness gibi, analiz yazılımı tarafından önerilmiştir. Bu nedenle, kolayca bu işlem, belirli bir sinyal yolunun katkısı ya da belirli bir protein test edebilir.

Bu çalışmada, her zaman bir morfolojik kutuplaşma sergileyen hücrelerin yüzdesi moleküler polarizasyon biri daha yüksek olduğunu gözlemledik. Bu işaretlerin büyük moleküler yeniden dağıtımı mevcut olmayan morfoloji değişikliği kabul hücrelerin bir kısmı incelenmiştir gösterir. Bu açıkça bir leadin görünmüyor, ancak onlar daha düşük bir Circularity endeksi sergileyen yüzden bazı hücreler yuvarlak kaybetmek gerçeğinden kaynaklanmaktadır olabilirg kenar ve bir uropod. Bunlar kısmen polarize T hücreleri hala tipik belirteçlerin bariz moleküler yeniden dağıtımı esnasında sunmadan morfolojik polarize T hücrelerinin kapısında düşebilir. Belirteçler de bu farklılıkları açıklayabilir şekil değişiklikleri için daha tekrar dağıtıma Üstelik, kemokin sinyal eşik farklılıklar daha yüksek olabilir.

Ayrıca HLA-ABC işaretleyici polarize T hücrelerinde tekrar lokalize değildir ve CCL19 stimülasyonu üzerine bu boyama yoğunluğu herhangi bir değişiklik olmadığını burada gösterilmektedir. Bunun aksine, bir onay burada temin edilmesidir CCL19 muamele edilerek F-aktin boyama artar (Şekil 1 ve 2) kemokin uyarım aktin polimerizasyonu ^{5'i etkin} hale getirir çünkü zaten bilindiği gibi. Ayrıca, polarize hücrelerin ön tekrar lokalize olsun bu aktin filamanlarını gösterilmiştir. Her iki ma arasındaki işbirliği lokalizasyon derecesini ölçen Sonuç, Parlak Detay Benzerlik indeksirkers CCL19 stimülasyonu üzerine azalma eğilimi gösterir. Karşılaştırma olarak, bu tür bir analiz, hücre ön dışında olsun fosfo-ERM proteinleri ile birlikte yeri F-aktin derecesi için sağlanır. F-aktin sergileyen kemokin ile uyarılmış T hücrelerinin yüzdesi - F-aktin ön relocalizes beri fosfo-ERM'in (% 14 vs% 48, sırasıyla), - MHC sınıf I ayrımı F-aktin için çok daha düşük olduğu MHC Sınıf I moleküllerinin bölümlerini yeniden kemokin uyarılması etkilenmez ise polarize T hücrelerinin arka fosfo-ERM proteinlerdir. Bu parlak Detay Benzerlik indeks, sistematik olarak polarize T hücrelerinin her iki işaretleyicinin bir dağılımını karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu nedenle, bu teknik, geniş bir hücre popülasyonunda rastlanan durumlarda ise, potansiyel olarak büyük hücrelerin sayısı ya da, ilgili eş-lokalizasyonu ya da iki farklı belirteçler birlikte dışlama derecesini ölçmek için çok uygundur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Pre-heat to inactivate the complement.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Pre-heat to inactivate the complement.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 °C water bath before use.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antibody	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antibody	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis