Abstract
Cellen reageren op stimulatie door chemokine verliezen hun ronde vorm in een proces genaamd polarisatie, en door het veranderen van de subcellulaire lokalisatie van verschillende proteïnen. Klassieke beeldvormende technieken gebruikt om deze fenomenen. Echter, vereist zij de handmatige overname van vele cellen, gevolgd door tijdrovende kwantificering van de morfologie en de co-localisatie van de kleuring van tientallen cellen. Hier is een snelle en krachtige methode beschreven om deze fenomenen te bestuderen monsters uit meerdere duizenden cellen met een beeldvormende flowcytometrie technologie die de voordelen van een microscoop met die van een cytometer combineert. Met T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19 en kleuring voor MHC klasse I moleculen en filamenteuze actine, wordt een gating gepresenteerde gelijktijdig meten van de mate van veranderingen vorm en de mate van co-lokalisatie van markers die worden beïnvloed door CCL19 signalering. Bovendien is deze gating strategie liet ons toe om OBSERVe de segregatie van draadvormige actine (aan de voorzijde) en gefosforyleerd Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) eiwitten (aan de achterkant) in gepolariseerd T-cellen na CXCL12 stimulatie. Deze techniek was ook nuttig om de blokkerende effect op de polarisatie van twee verschillende elementen waarnemen: remming van actine polymerisatie door een farmacologische remmer en expressie van mutanten van de Par6 / atypische PKC signaleringsroute. Aldus wordt bewijs blijkt dat deze techniek nuttig is voor zowel morfologische veranderingen en eiwit herverdeling analyseren.
Introduction
Chemokines zijn kleine oplosbare eiwitten die cellen aan te trekken om gespecialiseerde locaties 1. Daarom zij deelnemen aan de juiste positionering van de cellen in weefsels, een cruciale functie in de ontwikkeling en fysiologie. Het immuunsysteem is geen uitzondering op deze regel als het gebaseerd is op de actie van vele verschillende celtypen die in onderling overleg handelen om een effectieve immuunrespons. Door het regelen van de specifieke locatie van een immuun celtype in een bepaalde toestand, chemokinen vooraf vereist voordat vreemde antigenen kunnen worden gedetecteerd en geneutraliseerd.
In T-lymfocyten in het bijzonder, chemokines binden aan specifieke oppervlak receptoren die, de huisbediende ontlokken vele intracellulaire signalen (calcium stijging, ERK fosforylering, Rho GTPasen activering, toename van integrines affiniteit en cytoskelet wijzigingen) dat T-cel beweeglijkheid 2,3 bevoordelen. Op cellulair niveau, kan men morfologische wijzigingen geïnduceerd op chemokine stimulatie observeren.Deze veranderingen in cel vormen zijn bijzonder dramatisch in T-cellen: rustende T cellen een druppelvormig ronde morfologie reizen binnen de bloedstroom. De detectie van de aanwezigheid van chemokinen in ontstekingsplaatsen of nabijheid van lymfoïde organen zal de vorm van T-cellen die nu vast een typische "hand-mirror" morfologie bestaande uit een bipolaire vorm veranderen: een leidende rand aan de voorzijde en een achterste rand, of Uropode, aan de achterkant 4. Daarnaast kunnen intracellulaire componenten gescheiden in de twee tegenoverliggende gebieden van een gepolariseerde T-cel migratie ondersteunen. Bijvoorbeeld, actine filamenten polymerisatie stijgt op chemokine stimulatie 5 en gepolymeriseerd actine accumuleert aan de voorzijde van een gepolariseerde T-cel 2. Anderzijds, verscheidene eiwitten, zoals gefosforyleerde eiwitten van de Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) familie die het plasmamembraan koppelen aan de corticale F-actine cytoskelet, opnieuw lokaliseren de Uropode gepolariseerdeT-cellen 6. Interessant wij en anderen hebben aangetoond dat dit polarisatieproces vereist voor T celmigratie. Inderdaad, zal er geen behandeling die interfereert met polarisatie cellulaire beweeglijkheid remmen. Bijvoorbeeld, remming van de activiteit van de leden van de atypische eiwitkinasen C (PKC) families, PKCζ en PKCι blokken T cel polarisatie en hun trekkende scannen van dendritische cellen 7. T-cel polarisatie wordt ook geregeld door Rho GTPasen. We hebben aangetoond dat de modulatie van RhoA activiteit van de recent beschreven Fam65b eiwit interfereert met T cel veranderingen in morfologie en hun vermogen om te migreren in Transwell assay 6. Als polarisatie voorwaarde stap voor cellulaire motiliteit, is dus cruciaal te kunnen kwantificeren als belangrijkste uitlezen van chemokine reacties. Cel vorm verbouwingen waren eerder handmatig 8 gemeten. Echter, dergelijke kwantificering is zeer tijdrovend, waardoor gewoonlijk slechts enkeletientallen cellen rekening gehouden.
Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om snel kwantificeren van de mate van veranderingen vorm van T-lymfocyten blootgesteld aan stimulatie chemokine. Een imaging flowcytometrie technologie (zie tabel specifieke reagentia / Apparatuur) gebruikt, die de voordelen van een stromingscytometer en een microscoop 9 combineert efficiënt kwantificeren van de hoeveelheid gepolariseerde cellen onder verschillende condities van chemokine stimulatie. Naast de kwantificering van de morfologische veranderingen die robuust kan meten met deze techniek, is het ook mogelijk om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van sommige eiwitten op chemokine signalering evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van T lymfocyten
- Bereid primaire muis of humane T cellen zoals beschreven 10,11.
- Telen menselijke T-cellen in compleet RPMI-medium met 10% humaan AB serum bij een dichtheid van 2-3 x 10 6 cellen / ml.
Opmerking: Het gebruik van foetaal kalfsserum (FCS) in plaats van humaan serum kan spontane polarisatie van een groot deel van humane T-cellen in kweek te wekken. Bewaar deze cellen in kweek gedurende 4-5 dagen en verder verwerken ze op elk moment gedurende deze periode. - Handhaaf muis T-cellen in volledig RPMI medium aangevuld met 10% FCS in een soortgelijk celdichtheid. Gebruik direct of de volgende dag, na een O / N kweek bij 37 ° C in aanwezigheid van 10 ng / ml IL7.
- Cultiveren CEM humane T-cellijn in compleet RPMI aangevuld met 10% FCS.
2. Chemokine Stimulatie
- Was 5 x 10 5 cellen per experimentele conditie in warm HBSS medium aangevuld met 10 mM Hepes. Voor sommige experimenten, co-transfectie van primaire menselijke T-cellen de dag ervoor met 2 ug pmaxGFP en 8 ug pcDNA3.1 + (lege vector, controle), PKCζ kinase dood, of N-terminale Par6 plasmiden.
- Resuspendeer de cel pellet in warm HBSS-Hepes medium (gebruik 0,3 ml x aantal experimentele condities).
- Verdeel de cellen in 1,5 ml microcentrifuge buisjes.
OPMERKING: Daarom zal één buis overeenkomt met één experimentele conditie 5 x 10 5 cellen bevatten in 0,3 ml HBSS-Hepes medium. Voor sommige experimenten, voeg 500 nM latrunculine A of drager (DMSO) en incubeer de cellen gedurende 30 min voor chemokine stimulatie. - Voeg 10 tot 500 ng / ml CCL19 of CXCL12 chemokine in elke buis.
LET OP: We gebruiken meestal 10-200 ng / ml chemokine voor menselijke T-cellen. CEM cellen niet drukken de CCR7-receptor die CCL19 bindt. Daarom zal CEM cellen alleen in staat om te reageren op een CXCL12 stimulatie. Bovendien gebruiken hogere chemokine concentraties (300-500 ng / ml), muis T-cellen polariseren. - Flip de tubes meerdere malen en incubeer ze in een 37 ° C waterbad gedurende 8 of 10 minuten voor primaire T-cellen of CEM respectievelijk.
- Stop de polarisatie proces door aan elke buis 0,3 ml van een warme oplossing met 2% paraformaldehyde (PFA) en 10 mM Hepes in PBS. Flip de buizen en incubeer ze bij 37 ° C gedurende 5 min.
3. kleuringen
- Breng de cellen van de reactievaatjes aan flowcytometrie buizen.
- Vul de buizen volledig met RB oplossing die 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5 mM EDTA en 10 mM Hepes in PBS.
- Centrifugeer de buizen bij 460 g gedurende 4 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 pl van een RT oplossing met 5% FCS in PBS.
- Voeg 5 ul FITC-anti-HLA-ABC in elke buis, vortex hen en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Was de cellen eenmaal met PBS met 5% FCS, eennd eenmaal met alleen PBS.
- At RT: voeg 500 ul 1% PFA, incubeer gedurende 10 min, daarna wassen cellen met een oplossing die 1% BSA, 0,5 mM EDTA en 10 mM HEPES in PBS.
- Verwijder het supernatant, vul de buizen volledig met een oplossing van PBS met 0,2% BSA, 0,1% saponine, 0,5 mM EDTA en 10 mM Hepes (permeabilisatie buffer).
- Was de cellen tweemaal in dit medium.
- Flip de buizen het medium te verwijderen en vortex ze de celpellet dissociëren.
- Voeg 0,25 pg / ml TRITC-Phalloidin en / of een 1: 100 verdunning van anti-P-ERM antilichaam aan elke buis, vortex hen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen met de permeabilisatie buffer. Incubeer met een fluorescerende secundaire antilichaam indien nodig.
- Resuspendeer de cellen in 200 ul PBS en overbrengen naar microcentrifugebuizen.
OPMERKING: Cellen zijn klaar voor overname. Alternatief, terwijl maximaal totaal volume van 200 gl per buis, voeg geconcentreerd PFA tot een uiteindelijke 1%concentratie teneinde de kleuringen behouden wanneer de cellen niet worden gebruikt op dezelfde dag voor verdere verwerking.
4. Images Acquisition and Analysis
- Schakel het apparaat (zie Tabel van specifieke reagentia / Equipment) en laat hem zelf te kalibreren volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De INSPIRE-software werd gebruikt met een 40X objectief (0,75 NA). De ideeën 3.0-software werd gebruikt voor alle gerapporteerde kwantificeringen. - Maak een reeks overname ramen die kunnen worden opgeslagen in een sjabloon voor toekomstige experimenten. Teken histogrammen dat de RMS-gradiënt waarden te kwantificeren. Van de "In Focus" bevolking, geselecteerd op de RMS gradiënt histogram, begrenzen de "Single cell" populatie op een histogram van de omgeving. Zodra de microcentrifugebuisje heeft in de machine is geplaatst, past het laservermogen, hek aan individuele cellen en het verwerven van 5000 T-lymfocyten.
- In de Ideeën zachteware, opent de overname bestand en maak een histogram dat de waarde van de gradiënt RMS-waarde voor helderveld beelden zal tonen (kanaal 1) verkregen voor elke individuele cel. Teken een hek aan de RMS gradiënt histogram dat cellen vertonen RMS gradiënt waarde boven 57 beschouwt.
OPMERKING: De RMS gradiënt hiermee rekening te houden bij de analyse alleen de T-lymfocyten die in het brandvlak. We hebben empirisch vastgesteld dat individuele cellen vertonen een RMS-gradiënt waarde superieur is aan 57 zijn in het brandvlak, en nauwkeurig kan worden beschouwd. - In de analyse / Maskers menu, maak een nieuw masker, genaamd Erode (M01,2) van de morfologie masker op de helderveld beelden M01, geërodeerde van 2 pixels. Daarna, in de analyse / Features menu, een nieuwe functie van de ruimte, berekend over het eroderen (M01,2) masker. Van de geselecteerde in de vorige poort cellen, opent een histogram dat de omgeving van de cellen met behulp van deze nieuw gecreëerde masker.
OPMERKING: De morfologie maskers die beschikbaar zijn doorStandaard zijn veel groter dan de werkelijke grootte van de cel. Zo is nauwkeuriger te eroderen tot 2 pixels. - Teken een hek aan de individuele T-cellen, met uitzondering van de kalibratie kralen en puin (klein gebied) en de wambuizen (grote Area). Stel deze poort bij elke aankoop.
OPMERKING: Variaties in celgrootte de positie van de poort beïnvloeden. Een muis T-cellen zijn kleiner dan menselijke T-cellen die zelf kleiner is dan CEM cellen, zal het gebied van elke celtype evenredig met de grootte. - Gezien de single, focus cellen die werden afgesloten in de vorige stappen, opent een puntenplot bestaande uit de ruwe Max pixel op het HLA-ABC kleuring (kanaal 2, x-as) als functie van de Raw Max pixel op de phalloidin kleuring (Channel 4, y-as). Maak een poort naar de ongekleurde of verzadigd fluorescerende gebeurtenissen uit te sluiten. Open twee histogrammen tonen de Raw Max Pixel voor HLA-ABC (kanaal 2) en phalloidin (Channel 4) kleuringen.
- In de analyse / Maskers menu, createa nieuw masker, genaamd Erode (M02,2) van de morfologie masker van de HLA-ABC gekleurde cellen (Channel 2), geërodeerde van 2 pixels. Daarna, in de analyse / Features menu, maak dan een nieuwe functie, bestaande uit de parameter Circulariteit, berekend op Eroderen (M02,2).
OPMERKING: Deze parameter meet de afwijking van de cel vorm van een cirkel. Daarom zal een perfect ronde T-cel een hoge circulariteit waarde terwijl langgerekte gepolariseerde cellen zullen een lage cirkelvormigheid index exposeren. - Vervolgens maakt een histogram dat de waarden van de functie Recursiviteit van de eerder gated cellen rapporteert. Met dit histogram direct plot de verdeling van een individu, in-focus celpopulatie volgens de waarde van de Recursiviteit per individuele cel.
- Kijkend naar de vorm van het histogram voor niet gestimuleerde cellen opneming van een poort voor gepolariseerde cellen, beginnend bij de laagste circulariteit waarde tot de circulariteit grenswaarde waar de meeste van de niet gestimuleerde cellenworden uitgezet. Kijk naar de statistieken display voor het percentage van de gepolariseerde cellen onder de gated bevolking (% Gated).
LET OP: Wij hebben deze poort voor Circulariteit index waarden onder 13 in te stellen. - Om te kijken naar de polarisatie van het actine kleuring in de cellen plot een histogram voor de heldere details Gelijkenis R3 waarde, het vergelijken van de HLA-ABC kleuring (kanaal 2) en de phalloidin kleuring (Channel 4).
OPMERKING: Hoe groter de waarde van deze functie, hoe meer bovenop de twee kleuringen zijn. - Met dezelfde gating strategie als voorheen, breng een hek aan de niet-gestimuleerde cellen voor de gescheiden kleuring dat het percentage cellen met gepolariseerde actine kleuring toont.
- Wanneer voltooid, het percentage cellen vertonen een scheiding in de verdeling van de MHC klasse I en falloïdine kleuringen het percentage gepolariseerde cellen met de gemiddelde waarden van de Recursiviteit en Gelijkenis indexen van alle cellen ± SD wordt in corresponding statistieken panelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het eerste voorbeeld hier gekozen heeft betrekking op het gebruik van menselijke primaire T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19. Echter, kan dezelfde strategie worden toegepast met primaire muis T-cellen, T-cellijnen of ander celtype reageren op chemokine stimulatie. De gating strategie hier gepresenteerde omvat een reeks vensters die de gefocusseerde evenementen, dan de enkele cellen selecteren. Tenslotte het bereik van fluorescentie-intensiteit gevolgd hier als voorbeeld twee markers: de MHC klasse I HLA-ABC en filamenteus actine te rusten (figuur 1) en CCL19-gestimuleerde (Figuur 2) T-lymfocyten.
Eerst wordt de Recursiviteit index gemeten in onbehandelde (figuur 1) en CCL19-gestimuleerde (Figuur 2) T-lymfocyten. Dat rustende cellen een grote enkele piek met een hoge index Recursiviteit waarde geeft aan dat de meeste cellen dicht afronden. Het is echter duidelijk dat CCL19 stimulatie opwekt het uiterlijk ofa tweede subpopulatie van cellen met een lage Circulariteit index. Deze subpopulatie omvat cellen die een gepolariseerde morfologie hebben aangenomen. Ook wanneer die de heldere details Similarity index tussen HLA-ABC en F-actine kleuring, kan men waarnemen dat sommige cellen vertonen een daling van de waarde van deze index op CCL19 behandeling, wat aangeeft dat beide markeringen vertonen een lagere graad van co-localisatie . Interessant is dat uit de dot-plots eerder gepresenteerd, kan men de cursor positioneren op een bepaald punt om een foto van de cel bestaat een helderveld imago en een beeld voor elk van de kleuringen uitgevoerd te krijgen. Figuur 3 dus presenteert voorbeelden van CCL19 gestimuleerde T lymfocyten die vallen in de poort van niet gepolariseerd (figuur 3A) en gepolariseerd (Figuur 3B) cellen. Duidelijk is te visualiseren de verschillen in morfologie tussen beide subpopulaties. Uit de statistieken onderstaande tabellen de Circulariteit histogrammen van de figuren 1 2, kan men het percentage cellen die vallen in de gepolariseerde poort in de afwezigheid of aanwezigheid van CCL19 (figuur 3C) te plotten. Zoals verwacht, is het duidelijk dat chemokine stimulatie verhoogt het percentage gepolariseerde T-cellen (van 11,2% tot 50,6%). Men kan ook plot de gemiddelde Recursiviteit index van de gehele celpopulatie verkregen in beide omstandigheden (figuur 3D). CCL19 stimulatie lokt een daling in deze index. Aangezien slechts de helft van de cellen gepolariseerd, de verandering in de gemiddelde Recursiviteit index waargenomen bij CCL19 stimulatie klein.
Evenzo Figuur 4 geeft voorbeelden van CCL19-gestimuleerde cellen, waarbij zowel de HLA-ABC en F-actine kleuringen do (figuur 4A) of niet colocaliseren (figuur 4B). Uit de statistische tabellen de heldere details Similarity histogrammen getoond in figuren 1 en 2 kan men de proportie verkrijgenvan cellen die een index waarde onder de 1,5 vertonen, die de cellen die een zeer lage mate van co-localisatie tussen HLA-ABC en F-actine vertonen. Figuur 4C toont aan dat de fractie van cellen die valt in deze poort stijgt op CCL19 stimulatie ( van 3,4% tot 13,9%). Het verzamelen van de waarden van de index voor elke individuele cel, kan men ook plot de gemiddelde Bright Detail Similarity index van de gehele celpopulatie verkregen in beide omstandigheden (figuur 4D). CCL19 lokt een daling van de index, maar om dezelfde redenen als hiervoor, veranderingen zijn klein. Door naar de afbeeldingen van de overeenkomstige cellen, blijkt deze daling HLA-ABC - F-actine co-localisatie is vooral door de clustering van F-actine in een pool van de cel. Omgekeerd heeft de subcellulaire verdeling van HLA-ABC MHC Klasse I moleculen niet te grove beïnvloed door CCL19 stimulatie.
Dat is de reden waarom we naast besloten verdere testende methodologie analyseren twee markers (F-actine en fosfo-ERM) bekend te scheiden in tegengestelde polen van chemokine-gestimuleerde T-cellen. Menselijke T-cellen gestimuleerd met CXCL12 sterk gepolariseerd, zoals gekwantificeerd in figuur 5A met dezelfde gating strategie dan voorheen (van 5,95% tot 79,10% gepolariseerde cellen na 8 minuten stimulering met 50 ng / ml CXCL12). In deze omstandigheden is er een sterke toename van het gemiddelde Bright Detail Similarity index zoals getoond in Figuren 5B en 5D, waardoor F-actine en fosfo-ERM minder na CXCL12 stimulatie colocaliseren. Zoals verwacht, het percentage cellen vertonen een scheiding van de hier gekozen markers hoger (48%, figuur 5C) in vergelijking met de eerder bestudeerd (14%, figuur 4C). Dienovereenkomstig, de daling van de gemiddelde Similarity index van elke voorwaarde is duidelijker (Figuur 5D). Daarom is de beeldvormende flowcytometrie techniek hier gepresenteerde sutinueren de mate van co-lokalisatie van twee kleuringen in verschillende instellingen kwantificeren.
Uiteindelijk hebben we besloten te illustreren in hoeverre de verstoring van bepaalde cytoskelet element of signaleringsroute bekende veranderingen in T-celmorfologie op chemokine stimulatie beïnvloeden kunnen worden gemeten met beeldvorming flowcytometrie. Controle T-cellen werden eerst vergeleken met enkele voorbehandeld met actine verstoren drug latrunculine A (figuur 6A). Cellen werden gestimuleerd met CXCL12, gekleurd met fluorescent falloïdine en geanalyseerd door beeldvorming flowcytometrie. Histogrammen tonen de Raw Max pixel intensiteit van het F-actine kleuring getoond voor beide celpopulaties (figuur 6A, boven). Zoals verwacht van het verbreken activiteit van latrunculine A richting actine filamenten, de intensiteit van de kleuring phalloidin lager in deze cellen (rechter paneel) in vergelijking met T-lymfocyten die met het vehikel DMSO (linker paneel) regelen. Bovendien latrunculine A-treated T-cellen vertonen een grotere Recursiviteit index aangeeft dat zij blijven ronder dan controlecellen (figuur 6A, onderaan). Dit kan worden gekwantificeerd door een poort die op de histogrammen het percentage cellen die morfologische veranderingen vertonen meten. Hoewel 32% van de controlecellen gepolariseerd in deze toestand, slechts 10% van latrunculine A behandelde T lymfocyten vertonen eventuele vormveranderingen (figuur 6B). Daarom wordt hier de beeldvormende flowcytometrie technologie geschikt verschillen in morfologische veranderingen te meten wanneer men bestudeert de mogelijke gevolgen van sommige cytoskeletelementen dit fenomeen.
Ten tweede, de verwerving van een groot aantal cellen met deze methode opent ook de mogelijkheid om snel kleine subsets van cellen aanwezig als minderheid analyseren. In figuur 7 wordt een voorbeeld weergegeven waarbij de analyse specifiek beperkt tot het gedrag van T-cellen co-transfecterened met GFP samen met plasmiden die coderen voor dominant negatieve mutanten van de polariteit complex Par6 / PKCζ. Het histogram overeenkomt met de niet getransfecteerde cellen heeft ons in staat gesteld gate alleen voor de relevante GFP + -T-cellen (figuur 7A, links). De intensiteit van GFP gemeten als histogrammen die de verdeling van de fluorescentie intensiteit van het kanaal 2 kwantificeren inderdaad blijkt dat slechts een klein deel van de gehele celpopulatie getransfecteerd (figuur 7A). De mate van morfologische polarisatie van deze getransfecteerde cellen werd vervolgens gekwantificeerd door alleen de Recursiviteit index van de GFP + cellen (Figuur 7B). Een extra poort voor T-cellen vertonen lage waarden van Recursiviteit toegestane schatting van het percentage gepolariseerde cellen per conditie (figuur 7C). De resultaten tonen dat verstoring van de functie van de Par6 / PKCζ signaleringsroute remde T cel polarizatiop geïnduceerd door zowel CCL19 en CXCL12 chemokines, in lijn met onze eerdere bevindingen 7.
Figuur 1. Vertegenwoordiger van niet-gestimuleerde kleuringen op primaire menselijke T-cellen. Het bovenste linker paneel toont het histogram verdeling van de Gradient RMS berekend met de M01 masker op het heldere gebied afbeeldingen (kanaal 1). Het bovenste rechter paneel toont de omgeving van de M01 masker geërodeerde van 2 pixels, gebaseerd op de helderveld beelden (kanaal 1) van de In Focus cellen gated van de vorige plot. De middelste panelen tonen de ruwe Max pixelwaarden van zowel HLA-ABC en Phalloidin kleuringen (respectievelijk kanaal 2 en 4) hetzij als puntenplot (linker paneel) of als histogrammen (middelste en rechter panelen) voor het individu, in- richten cellen geselecteerd in de vorige stap. Van deze populatie van afzonderlijke, in-focus cellen met de juiste kleuring, wordt berekend op de functie Circulariteit op de M02 masker geërodeerde van 2 pixels van het HLA-ABC kleuring (linksonder) en de heldere details Gelijkenis R3 functie (lagere rechter paneel) toont de mate van overeenstemming tussen de HLA-ABC en de Phalloidin kleuringen . Voor deze laatste twee percelen, statistieken waaruit de verdeling van de bevolking (% gated, betekenen van de functie, SD) zijn aangegeven in onderstaand een tabel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Representatieve kleuringen op primaire humane T-cellen gestimuleerd met 200 ng / ml CCL19 gedurende 8 min Het paneel indeling en gating strategie identiek aan figuur 1.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van de morfologische toestand van T-lymfocyten gestimuleerd door CCL19. (A, B) Voorbeelden van cellen van figuur 2 buiten of in de "gepolariseerd" gate respectievelijk (C) Histogram met het percentage gepolariseerde verkregen in afwezigheid van CCL19 T-cellen. (Figuur 1, -) of met 200 ng / ml CCL19 (Figuur 2 +) (D) Histogram die de gemiddelde waarden van de circulariteit index ± SE in de afzonderlijke in-focus celpopulatie in afwezigheid. (-) of aanwezigheid (+) van CCL19. *** P <0,001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Kwantificering van de mate van co-localisatie tussen de HLA-ABC en falloïdine kleuringen. (A, B) Voorbeelden van cellen van figuur 2 buiten of in de "niet colocalized" gate van de heldere details Gelijkenis histogram respectievelijk. (C) Histogram met het percentage van T-cellen vertonen geen co-localisatie tussen beide merkers in aan- gestimuleerd (-). of CCL19 gestimuleerde (+) omstandigheden (D) Histogram die de gemiddelde waarden van de Similarity index ± SE in de afzonderlijke, in-focus celpopulatie in afwezigheid (-) of aanwezigheid (+) van CCL19. *** P <0,001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
p-together.within-page = "always"> 
Figuur 5. Analyse van F-actine - fosfo-ERM uitsluiting van CXCL12 stimulatie van humane primaire T-cellen. (A) Percentage gepolariseerde T-cellen in de afwezigheid of aanwezigheid van CXCL12 (10 of 50 ng / mL). (B) Imaging flowcytometrie histogram toont de verdeling van de afzonderlijke in-focus celpopulatie volgens de Bright detail Similarity index dat vergelijkt de mate van co-localisatie tussen de fosfo-ERM en falloïdine kleuringen, in afwezigheid van CXCL12 of met 10 ng / ml of 50 ng / ml CXCL12. (C) Kwantificering van percentage cellen vertonen geen co-localisatie de permanent en falloïdine kleuringen in T-cellen gestimuleerd indien met CXCL12. (D) Kwantificering van de gemiddelde waarden van de Similarity index ± SE per conditie. *** P <0.001.upload / 52140 / 52140fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Effect van actine polymerisatie op T cel polarisatie. (A) F-actine kleurintensiteit (bovenste panelen) en Recursiviteit (onderste panelen) van primaire humane T-cellen behandeld met latrunculine A (500 nM, 30 min) of DMSO en vervolgens gestimuleerd met 100 ng / ml CXCL12 gedurende 8 min. ( B) Histogram met het percentage van de gepolariseerde T-cellen behandeld met DMSO of latrunculine A na 8 min van stimulatie met CXCL12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Expressie van het PKCζ dood kinase mutant of het N-terminale mutant van Par6 blokken T cel polarisatie na CCL19 en CXCL12 behandeling. (A) Imaging flowcytometrie histogrammen tonen de intensiteit van GFP expressie in niet-getransfecteerde primaire T-cellen en primaire T-cellen co-getransfecteerd met GFP en een lege vector (Control) of de dood kinase mutant van PKCζ of de N-terminale van Par6 (B) Imaging flowcytometrie histogrammen die de Recursiviteit index van het GFP-positieve celpopulatie expressie verschillende constructen op basisniveau (NS: geen stimulatie). of na CCL19 en CXCL12 stimulatie (100 ng / ml gedurende 8 min ). (C) Kwantificering van het percentage morfologisch gepolariseerde T-cellen die de verschillende constructies op het basale niveau of na CCL19 of CXCL12 stimulatie. Klik hier om een grotere ver te bekijkensie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een recente techniek van beeldvorming flowcytometrie, een snelle en informatieve gating strategie analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen geïnduceerd door chemokine stimulatie wordt gepresenteerd. De veranderingen in celmorfologie geïnduceerd door chemokine stimulatie en de subcellulaire verdeling van verschillende eiwitten tijdens het polarisatieproces: Uit één experiment kan men twee soorten informatie. Interessant is bewijs ook voorzien in de mogelijkheid om een groot aantal cellen, die statistische robuustheid en relevante analyse van een klein deel van de gehele celpopulatie maakt analyseren. Zoals vermeld, kan deze techniek ook bruikbaar voor de analyse van moleculaire herverdeling gebeurtenissen in de context van de immunologische synaps 12. Bovendien is een soortgelijke opstelling reeds gebruikt voor SDF1 gestimuleerde T-cellen maar geen analyse van de mate van co-localisatie tussen twee markers is verstrekt 13.
Hoeweldeze techniek kan dus geschikt voor vele celtypen, hechtende cellen niet direct geanalyseerd en cellen in suspensie moeten vooraf worden vastgesteld verwerving. Naast deze intrinsieke beperkingen van de machine, is het essentieel om de cellen bij 37 ° C houden bij het stimuleren ze. Temperatuur is inderdaad belangrijk om de juiste T-cel polarisatie bereiken, aangezien cytoskelet veranderingen, zoals actine polymerisatie die vormveranderingen rijdt, zijn sterk afhankelijk van de temperatuur. Onze experimenten met latrunculine Behandelde cellen bevestigen dat de juiste actine remodeling geïnduceerd door chemokine stimulatie Inderdaad is voor een cel om de volledig gepolariseerde toestand bereiken. Naast de hier gegeven met dit geneesmiddel data ook getest imaging flowcytometrie technologie menselijke primaire T-lymfocyten getransfecteerd met mutante eiwitten die de Par6 / PKCζ signaleringsroute remt. In overeenstemming met onze eerder gepubliceerde resultaten 7, wordt hier aangetoond dat deze polariteit complex favors T cel polarisatie.
Bij chemokine stimulatie, T-cellen verliezen hun ronde morfologie om een gepolariseerde vorm aannemen. We hebben de parameter Circulariteit de meest nauwkeurige die morfologische veranderingen te kwantificeren te zijn gevonden. Echter, andere parameters voor vormveranderingen worden voorgesteld door de analysesoftware zoals de Aspect Ratio of Elongatedness. Daarom kan men gemakkelijk testen van de bijdrage van een bepaalde signaalweg of een specifiek eiwit in dit proces.
In dit onderzoek hebben we steeds vastgesteld dat het percentage cellen vertonen een morfologische polarisatie hoger dan die voor moleculaire polarisatie. Dit geeft aan dat een fractie van cellen die een verandering vast te stellen in morfologie niet presenteren grote moleculaire herverdelingen van de markers bestudeerd. Dit kan het gevolg zijn van het feit dat sommige cellen verliezen hun ronde vorm, zodat ze vertonen een lagere Circulariteit index hoewel ze niet duidelijk een leading rand en een Uropode. Deze gedeeltelijk gepolariseerde T-cellen zou kunnen vallen nog steeds in de poort van morfologisch gepolariseerde T-cellen zonder presenteren duidelijke moleculaire herverdelingen van typische markers. Bovendien verschillen in de chemokine signalering drempel die kan groter zijn voor markers herverdeling dan shape veranderingen die verschillen ook kunnen verklaren.
Ook wordt hier aangetoond dat het HLA-ABC marker niet geherlokaliseerde in gepolariseerde T-cellen en er is geen verandering in de intensiteit van de kleuring op CCL19 stimulatie. Omgekeerd wordt een bevestiging aangevoerd dat F-actine kleuring verhogingen op CCL19 behandeling (figuren 1 en 2) zoals bekend, aangezien chemokine stimulatie activeert actine polymerisatie 5. Bovendien wordt aangetoond dat actine filamenten te geherlokaliseerde aan de voorzijde van gepolariseerde cellen. Bijgevolg is de Bright Detail Gelijkenis index die de mate van co-lokalisatie meet tussen beide markers vaak af op CCL19 stimulatie. Ter vergelijking is een dergelijke analyse hier bedoeld de mate van F-actine co-lokalisatie met fosfo-ERM eiwitten die een uitsluiting cel voorzijde. Het percentage chemokine-gestimuleerde T-cellen vertonen F-actine - MHC klasse I segregatie veel lager dan die van F-actine - fosfo-ERM (14% vs. 48%, respectievelijk) aangezien F-actine herlokaliseert vooraan en fosfo-ERM eiwitten aan de achterzijde van gepolariseerde T-cellen, terwijl de verdeling van MHC klasse I-moleculen niet wordt beïnvloed door de chemokine stimulatie. Deze heldere details Similarity index kan aldus systematisch gebruikt worden voor de verdeling van twee markers in gepolariseerde T-cellen vergelijken. Derhalve is deze techniek zeer geschikt om de mate van co-lokalisatie of co uitsluiting van twee verschillende merkers te kwantificeren op een groot aantal cellen of potentieel op zeldzame gebeurtenissen aanwezig in een brede celpopulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs sterk erkennen Pierre Bourdoncle, Thomas Guilbert en Louise Rimbault van de Cochin Imaging Facility. Dit werk werd ondersteund door Inserm, CNRS en de Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
References
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
