Abstract
Трансфекция ДНК была неоценима для биологических наук и с учетом последних достижений в органотипических препаратов мозга срезов, влияние различных гетерологичных генов, таким образом, может быть исследован легко, сохраняя многие аспекты биологии в естественных условиях. Там было все больший интерес для трансфекции терминально дифференцированных нейронов, для которых обычные методы трансфекции которые были сопряжено с трудностями, например, низкой урожайности и значительным потерям в жизнеспособности. Biolistic трансфекции могут обойти многие из этих трудностей, но лишь недавно этот метод был модифицирован таким образом, что она поддается для использования в тканях млекопитающих.
Новые модификации ускорительной камеры имеют повышенную точность стрельбы гена пистолета и увеличил глубину проникновения, а также позволяет использование более низком давлении газа (50 фунтов на квадратный дюйм) без потери эффективности трансфекции, а также позволяет сфокусированный региоселективное распространение годовыхrticles в пределах 3 мм. Кроме того, этот метод является прямым и быстрее, чем для выполнения трудоемких микроинъекций. И переходным и стабильной экспрессии возможны наночастиц бомбардировки, где выражение эписомной может быть обнаружен в течение 24 ч и выживаемость клеток было показано, что лучше, чем, по крайней мере, равна, обычными способами. Эта техника имеет однако один решающее преимущество: она позволяет трансфекции быть локализованным в пределах одного сдержанный радиусом что позволяет пользователю анатомически изолировать эффекты гетерологичных генов в. Здесь мы представляем протокол углубленный подготовить жизнеспособным взрослых органотипической ломтики и отправляйте их региоселективного трансфекции с помощью усовершенствованного генной пушки.
Introduction
Первоначально биолистическую техника, рубежа фраза для "биологических баллистики", была создана для переноса генов опосредованной частицами в клетках растений 1. Этот физический метод трансформации клеток ускоряет микро или наночастиц с высокой скоростью, чтобы преодолеть физические барьеры из непроницаемых мембран клеток для того, чтобы доставить грузы, такие как ДНК или красителей. Поскольку это не зависит от конкретных лиганд-рецепторов и / или биохимических свойств на поверхности мембран клеток, перенос генов опосредованной частицами могут быть легко применены в различных биологических системах, таких как органотипических срезах мозга.
Использование органотипической ломтики имеют преимущества перед другой в платформах пробирке, так как они поддерживают много анатомические и биохимические свойства, которые имеют отношение к в естественных условиях биологии 2-4. Ломтики основном сохранить местные архитектурные особенности от того, где они возникли и preserве нейрохимический активность и соединения синапсов. Использование срезах мозга для фундаментальных исследований, так и в фармацевтических начинаниях, уже одновременно увеличивается с числом возможных биотехнологических манипуляций возможность определять и отслеживать нейробиологические поведения мозга в в естественных условиях, как контексте 3,5-7. Основные преимущества для использования органотипической ломтик основе тест-систем является то, что он обеспечивает легкий экспериментального контроля и позволяет получить точные манипуляции внеклеточных средах.
Плодотворно, системы культуры органотипической ломтик были созданы из различных областях мозга, таких как, но не ограничиваясь, коры, спинного мозга и мозжечке 8-10. Кроме того, ряд совместных культурах было продемонстрировано, которые позволяют оценить межклеточной коммуникации по дистальных отделах головного мозга, а также между нейронами и патологических клеток 11,12. Многие протоколы уже были созданы, чтобы сuccessfully ломтики культура органотипической и может поддерживать долгосрочную жизнеспособность и многие недавние исследования в настоящее время используют методы интерфейса мембрана и различные изменения в нем 13. Этот принцип сохраняет органотипической ломтики на границе раздела между средой и увлажненной атмосфере инкубатора путем размещения ломтики на пористом мембранном фильтре. Среда может, таким образом, обеспечить достаточного количества питательных веществ, чтобы накормить органотипической ломтики через капиллярную движения. Обычно ломтики были получены из ранних послеродовых животных (3 - 9 дней старых; P3 - 9). Однако, мозговые ткани из этих кусочков отображения высокий уровень клеточного пластичности и имеют неотъемлемое стойкость к механическим воздействиям, что очень удобно для получения жизнеспособных культур, еще зрелые синапсы и нейроанатомическом схема не полностью не развились в естественных условиях до 2 до 3-недельного возраста 14. Например, предыдущие наблюдения показали, что срезах гиппокампа, полученных от P0 - 1 новорожденных, хотя и очень viabле следующее подготовки, постепенно потеряли некоторые морфологические характеристики. По сути, они были показаны непригодными для длительных культур предлагая незрелые клетки, скорее всего, де-дифференцируемая по сравнению с органотипических культур из старых животных 15,16. По этой причине наш метод был оптимизирован для взрослых органотипических срезах мозга, при которой созревание и архитектурного развития достигли своих терминальных стадий 13,17-21. Тем не менее, этот метод также подходит для новорожденных и малолетних органотипических ломтиками.
Как только жизнеспособные органотипической ломтики были произведены вся пластина, содержащая ломтики могут быть доведены до биобаллистической горе и представлен региоселективного доставку и трансфекции. Правильная установка в генной пушки (как описано на рисунке 1), ориентированных на 90 ° на расстоянии 10 мм непосредственно над ломтиками (с отверстием в ткани), позволяет быстрое Biolistic поставка 40 нм перейтисть частиц покрытием грузов. Эти грузы, такие как красители и флуоресцентные ДНК-векторов, а также любая интерес ген, легко доставлены в жизнеспособных срезов с легкостью. Этот метод, таким образом описывает протокол необходимо доставить, в региоселективного образом, грузовые покрытием наночастицы золота в жизнеспособные органотипических срезах мозга. Ствол генной пушки и оптимальное крепление можно увидеть на рисунке 1. Дополнительную информацию о улучшенными баррель и наночастиц баллистики, смотрите О'Брайен, и др. 17.
Последующие усовершенствования также показаны для пользователя с целью оптимизации условий, таких как надлежащее количество золота поставляемого за целевой области, определяемой как микроносителю количество нагрузки (MLQ), и для определения количества ДНК, загруженной на мг золота, определяемая как ДНК Loading Соотношение (DLR). До осаждения ДНК на частицах золота и загрузки их в трубки TEFZEL который содержит картриджи фактического генной пушки "9 ;, необходимо рассчитать количество ДНК и золота, необходимое для каждой трансфекции, которые могут слегка отличаются друг от тканей и условий (соотношение следует поддерживать в диапазоне от 1 мг золота и 1 мкг ДНК до 1: 5). Это имеет жизненно важное значение для подготовки надлежащего долю MLQ в DLR как в противном случае частицы золота ДНК покрытием может придерживаться вместе, образуя больше, чем ожидалось, агломерации, которые могли бы уменьшить общую однородность биобаллистической распространения, а также повреждения увеличение тканей и цитотоксичности.
Этот метод показывает недавние улучшения в биобаллистической поставки, которые были испытаны с точки зрения их поддаются для новорожденных, несовершеннолетних и взрослых органотипических срезах мозга. Кроме того, за счет использования пониженной Biolistic распространение гена ствола пушки, пользователь теперь может выборочно трансфекции пунктуальность область в мозге. После соответствующей времени инкубации, выражение из флуоресцентных белков, которые достигает своих максимальных показателей между 24 и 48ч, могут быть визуализированы эпифлуоресцентной и конфокальной микроскопии. Эти флуорофоров разрешить морфологического анализа и локализации отдельных клеток в биологически соответствующих структур. Тем не менее, региоселективный модуляция органотипических ломтиками другими гетерологичных генов также можно контролировать с помощью любых других тестов, поддающихся этих препаратов. Возможные рабочие стратегии для локализованной доставки гена представлены на рисунке 2.
Protocol
Использование животных и животных тканей следует строго придерживаться утверждения этического комитета под местные правила и регуляции. Все ткани, полученные в ходе данного исследования, прикрепленной к принципов экспериментов на животных в клетках MRC-LMB в.
1 Подготовка материалов и питательных сред
- Подготовьте все решения, используя Millipore воды; использовать реактивы только аналитические класса. Подготовка и хранить все реагенты при комнатной температуре (если не указано иное).
- Сделать 500 мл HEPES-буферным раствором (10 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, рН 7,2). Фильтр через блок стерильных фильтров 0,2 мкм. Хранить при 4 ° С.
- Сделать 500 мл фосфатно-солевом буфере (PBS; 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ КН 2 РО 4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, рН 7,4). Стерилизовать автоклавированием.
- Подготовка нейронов среды путем дополнения DMEM (модифицированной среды Игла в Дульбекко) с 25 мМ HEPES, 10% фетальной телячьей сыворотки, 30 мМ глюкозы, 1: 100 N2 суpplement, пенициллин-стрептомицин 1100 ед / мл; рН 7,2. Фильтр с блоком стерильных фильтров 0,2 мкм. Хранить при 4 ° С.
- Сделать поливинилпирролидон (ПВП) маточного раствора с 20 мг ПВП в 1 мл 100% этанола. Алиготе это в 1 мл составляет, замораживания и хранения при -20 ° С. Рабочий раствор 0,05 мг / мл, следовательно, добавить 10 мкл исходного раствора ПВП, чтобы каждые 4 мл 100% этанола.
- Приготовьте 0,05 М спермидинсинтазу маточного раствора в Millipore воды; доведения рН до 7,2.
- Сделайте 2% раствор агарозы в DMEM (2 г электрофорез класса агарозы в 100 мл DMEM в стерилизованную завинчивающейся крышкой бутылки). Микроволновая это пока агарозном не растворится. Хранить в 4 ° С холодильником в течение нескольких недель, если это необходимо.
2 Получение Органотипической Ломтики
- Эвтаназии C57 черный 6 мышей желаемого возраста СО 2 с последующим удушье путем декапитации. Снимите мозг с помощью боковых порезов черепа, начиная с большого затылочного отверстия и заканчивается вобонятельные доли. Аккуратно поднимите череп с тыла, чтобы разоблачить мозг.
- Вырезать между обонятельных долей и лобной коре, и ростральнее мозжечка. Аккуратно поднимите ростральную часть мозга и сократить зрительные нервы. Наконец, извлечь мозг и поместить его в чашку Петри, наполненную льдом холодные HEPES-буферным раствором на льду.
- Использование рассекает микроскопом, удаляйте Пиа использованием тонких щипцов; тщательно удалить кровеносные сосуды и мозговые оболочки вокруг мозга.
- Расположите новую мозг в небольшой формы получателя и покрыть ее раствора агарозы охлаждают до чуть выше комнатной температуры. Затем быстро охладить формы до 4 ° С, поместив его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс ломтики как можно быстрее, чтобы избежать потери жизнеспособности. - Когда агарозном установить (5 - 10 мин), снимите агарозном встраиваемый мозг от формы (обрезать, если это необходимо), а затем приклейте ее к vibroslicer платформы. Поместите это в vibroslicer камеру, содержащую стерильный ледяной PBS. Disinfect в vibroslicer камеру перед использованием 70% этанолом, чтобы свести к минимуму последующие загрязнения.
- Вырезать мозг, используя индивидуальному заказу vibroslicer или коммерческую эквивалент. Эта модель концепции было создание ткани срез, который может генерировать большие амплитуды и высокой частоты движения в горизонтальной кромки лопасти при минимизации вертикальных вибраций.
- Использование частоту колебаний 90 Гц, при амплитуде 1,5 - 2,0 мм, а режущего лезвия, расположенной под углом 15 ° к горизонтальной плоскости; установить монтажный блок проведения агарозном встраиваемый мозг двигаться в 1,7 мм / мин по направлению к лезвию. Соберите разделы (150 мкм) в камеру, содержащую ледяной культуральной среде (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Посмотреть резки и манипуляции с кусочками ткани в качестве дополнительного видео в Arsenault и О'Брайен 13.
- Аккуратно поместите ломтики в культуре клеток вставками (, диаметром 0,4 мкм 30 мм) в лоток 6 многолуночном с культурой медIA на внешней стороне вставки, и инкубируют в увлажненном инкубаторе при 37 ° С с 5% CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для правильной жизнеспособности тканей, крайне нежное время передачи и обработки ломтики. Кроме того, слишком много жидкости будет препятствовать органотипической ломтики от присоединения к мембране фильтрующего элемента. Если это произошло, удалите лишнюю жидкость или пластины снова. - Хотя органотипической ломтики можно культивировать в течение нескольких недель, не переходите к трансфекции не позднее чем за 4 дня после посева для лучших урожаев трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать глиальных разрастание в долгосрочной условиях культивирования, использование AraC или безсывороточную среду 2.
3 Получение покрытых ДНК Micro & Nano-снарядов
- Подготовьте нано-снаряды, используя 40 нм диаметр частицы золота. Вкратце, добавить 50 мкл 0,05 М спермидин и 10 мкл ДНК в концентрации 1 мг / мл (pEYFP-N1) до 10 мг частиц золота.
- Добавить кальций и спермидин в смеси растворары во время ДНК-золотой микрочастиц подготовку для того, чтобы помочь в связывание молекул ДНК, чтобы наночастиц золота.
ПРИМЕЧАНИЕ: количество ДНК используется на мг золота носителей (DLR), должен находиться в диапазоне между 1 и 5 мкг ДНК на 1 мг золота. Кроме того, количество частиц золота носитель, который будет снят на картридж (MLQ), должно само по себе в диапазоне от 0,1 до 0,5 мг золота. DLR и MLQ должны быть опробованы и оптимизирована для каждого пользователя, в зависимости от конкретной исследуемой системы, а также от типа частиц и генной пушки, используемой.
- Добавить кальций и спермидин в смеси растворары во время ДНК-золотой микрочастиц подготовку для того, чтобы помочь в связывание молекул ДНК, чтобы наночастиц золота.
- Смешайте с помощью вихря, медленно добавляя 50 мкл 1 М CaCl 2 в долях 10 - 15 мкл. После 5 мин от времени встряхивая, центрифуги в 1000 мкг в течение 30 сек, то удалите супернатант. Ресуспендируют гранул золота частиц в 3,5 мл 0,075 М ПВП.
- Нарисуйте суспензии в трубки (2,36 мм внутренний диаметр) с помощью шприца. Поместите трубку в подготовке трубки станции. Разрешитьзолотые частицы осели и удалить супернатант аспирацией с помощью шприца. Поворот трубы, чтобы равномерно распределить частицы золота, которые были затем сушат при постоянном потоке азота при 5 л в минуту.
- Для создания ДНК-маркеры, вырезать трубки резаком трубки в 1 длины см. Либо вставьте сразу в генной пушки картриджа или держать высушенный (4 ° С), пока не требуется.
4 Biolistic Трансфекцию на Органотипической Ломтики
- Выполните следующие шаги в рамках стерильной ламинаре.
- Вставьте батареи 9 В и пустой держатель фильтра в генной пушки Helios.
- Прикрепите генной пушки на гелия бака с гелием шланга. Своих 2 - 3 заготовки (пустые слоты) на 50 фунтов на квадратный дюйм для создания давления в шланг гелия и резервуары в пистолете.
- Загрузите картриджи, содержащие золото, покрытых ДНК в держатели картриджей и загрузить держатель в генной пушки.
- Отвинтите генной пушки прокладку и прикрепитемодифицированный ген ствол к генной пушки.
- Использование стерильного пинцета, поместить фильтрующий содержащий органотипической кусочек в стерильный пластиковый блюдо.
- Удалить носитель из органотипических ломтиками.
- Установите давление газа на 50 фунтов на квадратный дюйм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защита глаз имеет важное значение и ушей рекомендуется. - Поместите генной пушки в соответствующих расстояний с помощью монтажа, измеренный до 10 мм. Тщательно направлены к центру ствола над требуемой областью для генетического доставки.
- После обжига, заменить вставки обратно в их блюдо со свежими СМИ и вернуть их в нормальных условиях роста, то есть, 37 ° C с 5% CO 2 инкубаторе.
- После завершения закройте бак гелия, выпустить давление из генной пушки и отсоединить гена пушки из танка гелия.
- Снимите держатель фильтра и выбросить патроны и очистите генной пушки.
- Проверьте ткани для морфологии и для успешного проникновения visuaлизинг ломтики с помощью инвертированного микроскопа. При использовании микрочастиц, равномерно разогнать золото; не должно быть никаких плотные участки золотых частиц видно на срезе. Наночастицы в связи с их небольшой размер не может рассматриваться в качестве отдельных единиц традиционными методами микроскопии.
- После соответствующей временной интервал (обычно 1 - 2 дней), исправить ломтики в 4% параформальдегида (PFA) для микроскопии наблюдения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крепление в PFA не всегда желательно. Для изображений живых клеток избежать этого шага.
5 Крепление и Визуализация мозга Ломтики
- После биобаллистической трансфекции, мыть ломтики дважды в PBS в течение 2 мин.
- Fix ломтики путем инкубации в недавно сделаны, ледяной 4% PFA в PBS в течение 20 мин.
- Промыть срезы дважды в PBS в течение 2 мин.
- Аккуратно разрезать круглый мембрана поддерживает с помощью скальпеля, не нарушая ломтики, установленные на них. Используйте пинцет, чтобы поместить каждую мембраны поддержки / кусочек на предметное стекло микроскопа. Наведите organotypIC срезы на верхней части мембраны на предметное стекло.
- Добавьте одну каплю крепежных средств массовой информации в верхней части среза и добавить покровное аккуратно без силу непосредственно в контакте с органотипического среза.
- Безопасность покровное с тонким слоем лака для ногтей.
- Посмотреть ломтики на соответствующем микроскопом.
6. Конфокальные Приложения
- Представьте ломтики с помощью вертикальное сканирующего лазерного конфокальной микроскопии с 60X / 1,4 числовая апертура (NA) иммерсионным объектива.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее проблематичным особенностью конфокальной микроскопии является обскуры размер (заход в 1 а.е.), который способен изолировать и сбора плоскость фокуса, тем самым устраняя из фокуса 'дымки' обычно видели с флуоресцентным образца. Мелкие детали часто затемняется этом тумане, и не могут быть обнаружены в неконфокальных микроскопом. - Установите лазер аргона к длине волны возбуждения 488 нм и оптимизировать для сбора эмitted свет в нм полосы 500 до 520. Как правило, собирать изображения в 1024 х 1024 пикселей и со стеками Z-секций в 0,5 мкм интервалами, чтобы охватить всю ширину каждого нервной клетки, что было проанализировано.
- Для наблюдения морфологии ядра, счетчик окрасить эти клетки с DAPI (длины волны возбуждения, установленные на 405 нм и эмиссии света, собранного между 420 - 4 40 нм). Наконец, для изучения красной флуоресценции, установить лазер на 561 нм для возбуждения и 565 - 620 нм для эмиссии.
- Как правило, получить изображения от использования сканирования зум 4x, который охватил площадь в 57,6 мкм 2; размеры изображений были в области 1024 х 1024 пикселей. Запись стеки Z-секций в 0,5 мкм интервалами и прогнозы 5 - 8 кадров в сочетании.
Representative Results
Органотипической жизнеспособность срез можно контролировать с лактатдегидрогеназы деятельности, пропидийиодида маркировки и окрашивания дУТФ как сообщалось ранее 13,22. Очевидно, что жизнеспособность и целостность ломтиками важны для долгосрочного устойчивого выражения поставляемого генетического груза. После Biolistic доставку в органотипических ломтиками, выражение флуоресцентного гетерологичного гена контролировали с помощью конфокальной микроскопии. Герметичность биолистической распространения с помощью модифицированного ствол можно видеть на фигуре 3А. Фиг.3В показан репрезентативный образ трансфицированных гиппокампа области с использованием ДНК покрытием наночастицы золота. Рисунок 4 показывает репрезентативные фотографии, трансфицированных взрослых мышей ломтиками органотипических. Как можно видеть на фиг.4А, нейрона Пуркинье с замечательной дендритной гавани найденного на границе раздела слоя Пуркинье и молекулярном слое ССВebellum показывает выраженный маркировку следующий переходного биобаллистической трансфекции pEGFP-N1. 4В показывает большее увеличение этих дендритов, где можно наблюдать шипы. Фиг.4С показывает пирамидальную клетку найти в СА1 гиппокампа следующий биобаллистической доставки pDSredFP покрытых наночастиц золота .
Красители вместо флуоресцентных кодируется грузов ДНК также могут быть использованы аналогичным образом, чтобы визуализировать морфологические характеристики в органотипических ломтиками. DIO, которые этикетки плазматических мембранах, может более быстро разграничить отдельные морфологии клеток или может быть использован в сочетании с ДНК покрытием Biolistic подаваемого в той же области, чтобы подтвердить regioselection. Как видно на фиг.5А нейрон окрашивали DIO в гиппокампе также показывает длинные дендриты с многочисленными шипами. Стрелка указывает аксон, который идентифицируют путем присутствии синаптических бутонов по сравнению с dentritIC шипов на других нейритов. фиг.5В показан другой пример СА1, который выдвигает на первый план многочисленные прогнозы гиппокампа с DAPI счетчика пятно для обозначения ядра. Рисунок 5C показывает большее увеличение этих типов параллельных дендритов с многочисленными шипами.
Очевидно, что эти изображения иллюстрируют морфологические характеристики следующие сотовой маркировки. Ничто не мешает ту же методологию от быть применены для доставки любого количества экзогенных генов, нанесенных на золотых наночастиц. Чтобы разрешить визуальное подтверждение успешного трансфекции плазмидой одного могут быть построены для совместного выразить как представляющий интерес ген и флуоресцентный репортерный белок на том же векторе.
Рис.1 Джин ствол и монтажа. () Улучшить д ствола разработана доктором O'Brien в MRC-ЛКМ, который имеет ограниченный разброс Biolistic, что сводит к минимуму повреждение ткани за счет снижения требуемого давления для ускорения частиц. (В) вид сбоку оптимизированной генной пушки монтажа разработана доктором Henderson и д-р Андраш Надь в Университете Торонто. Монтаж занимает генной пушки в точности 90˚ перпендикулярно органотипических ломтиками то же время позволяя пользователю точно контролировать расстояние баллистической доставки. Для получения оптимальных условий Biolistic отверстие ствола должны быть размещены непосредственно над интересующей области в 10 мм на расстоянии от органотипических ломтиками. (C) Вид аппарата генной пушки монтажа. Области, представляющей интерес для трансфекции должен быть размещен непосредственно под отверстием ствола. Ориентация может быть подтверждена с красителем (diolistic) или флуоресцентной tranfection белка (биобаллистической).АНК "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Органотипической подготовка ломтик и региоселективный таргетинг. () DMEM встроенные взрослых мозга мыши готово для нарезания. (B) Форму приклеивается к vibroslicer монтажа с лезвием готовы подрезать кусочек. (C) Региоселективный экспрессии гетерологичных генов стратегии биобаллистической доставки в корональных органотипических срезах мозга. Изображения, полученные из фотографий, полученных из Аллен Brain Atlas анатомические справочных атласа 23. Левая панель показывает два разных участки мозга целевых качестве примера. Чтобы ограничить экспрессию генов (1) в области коры левого полушария. Чтобы ограничить экспрессию гетерологичных генов (2) в области гипоталамуса мозга. Средняя панель показывает тхат экспрессии гетерологичных генов двух (3 и 4) может быть выделено и сравнивает гиппокамп двух полусфер в том же органотипического среза, по существу, исключает любое смещение от использования различных секций и / или предоставления возможности для решения дистальный перекрестных помех от воздействия эти гены. Правая панель показывает возможно перекрытие трансгенных доставки, чтобы выразить первое ген (5) в точном кортикальной области, выражая другой ген (6) в разрозненных пока перекрытие области коры. Это позволяет проанализировать влияние генетического модуляции только и также каждый гетерологичным геном в сочетании в пределах того же среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Biolistic модели разброс увидеть на FILTER бумаги и низкое увеличение изображения. (А) улучшена ствол огонь на фильтровальную бумагу, чтобы определить, распространение частиц золота. Левая сторона показывает распределение улучшенной баррель в то время как правая панель показывает нормальную баррель. Черная полоса: 1 см. Изображение взято из О'Брайен, и др. 17. (B) Низкая увеличением изображение, показывающее стохастический трансфекции скороговоркой в пределах 3 мм биолистическую распространение в пределах гиппокампа области 6-недельных мышей. Белый бар:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 Biolistic доставка флуоресцентного белка, кодируемого ДНК в органотипических ломтиками 6-недельных мышей. () Беспозвоночныхд конфокальные образы фиксированной органотипической ломтик мозжечка pEGFP-N1 золото покрытием частицы трансфицированной Пуркинье клетки. Изображение было принято на 40-кратном увеличении. Черная полоса:. 30 мкм (B) Показывает 60x увеличение в dentritic гавани другого Пуркинье клетки, чтобы выделить колючки. Черная полоса:. 5 мкм (C) Показывает конфокальной образ фиксированных срезов, взятых из области гиппокампа на 60x увеличением четырех DSredFP трансфектированных пирамидальные клетки. Черная полоса:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 Diolistic доставка мембрана маркировки люминесцентных красителей в органотипических ломтиками. (А) показывает живую съемку гиппокампа нейронов лabeled с Dio под 20-кратным увеличением. В dentritic шипы четко можно наблюдать, а также аксона, как это определено отсутствием dentritic шипами и наличием синаптических бутонов указанных белой стрелкой. Белый бар:. 30 мкм (B) Произносится окрашивание гиппокампа регионе, помеченный Dio и контрастно с DAPI. Белый бар:. 30 мкм (C) Более высокое увеличение (60x) из dentritic шипами, найденных в СА1 гиппокампа. Белый бар:. 5 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Протокол описывает подходы к решению красители и генетические материалы во взрослую органотипических ломтиками с помощью расширенной генной пушки. По существу, типы красителей и разнообразие возможных генов делают этот метод многогранен и поддаются ответить на широкий спектр биологических вопросов. Региоселективный способ доставки используется, в данном случае к конкретной области мозга, открывает новые возможности для экспериментов в качестве гетерологичных генов модуляции локализованных районах в пределах биологически соответствующего архитектуры не было легко осуществимо прежде. Ранее мы определили, что этот метод может быть использован на взрослых органотипических ломтиками, где зрелые синапсы полностью сформирован, как это показали улучшение выживаемости клеток и экспрессией гетерологичных генов в течение многих недель 13. С появлением новых и улучшенных условий культивирования для мозга млекопитающих, а также других тканей, применение Региоселективный генетических модуляции становится все более полезным для широкого спектра биохимическиеческое анализов.
Как мы будем выделить здесь и ранее упомянуто другими 24, много различных факторов может легко повлиять на точность и надежность биобаллистической доставки. Во-первых, подготовка золотой частицы связаны с красителями или ДНК должны быть надлежащим образом сбалансированы для предотвращения агрегации и содействовать картридж грузовой изгнание. Кальций и спермидин в ДНК-золото микрочастиц решения может помочь связывание молекул ДНК, чтобы наночастиц золота. Способность к наночастиц проникать в клетки при пониженном давлении ранее определено 17. Во-вторых, генной пушки должен быть установлен как устойчивый, как можно с правильным углом и расстоянием. Надежный манометр также необходимо для воспроизводимости, чтобы сохранить целостность тканей, а также должным образом ускорить частицы золота на их предполагаемых целей. В самом деле, расстояние, ориентацию и устойчивость оборудования являются также важными факторами для тargeting и точность региоселективного доставки. Поскольку эти структуры мозга очень малы, незначительные колебания угла зажигания может легко сделать вся процедура менее надежны. И, наконец, подготовка и сопровождение жизнеспособных органотипических ломтиками были сопряжено с трудностями для многих десятилетий еще обильные и надежные протоколы для различных животных, областей головного мозга, возрастов и совместных культурах в настоящее время доступны 2,4,25,26. Эти процедуры должны быть удобными для оптимизированы перед отправкой ткани для Biolistic процедур. Это будет легче разрешить пользователю беспристрастно установить воздействие Biolistic частиц и эффект гетерологичных генов на своих культур. С этой целью, использование флуоресцентных генов, таких как EYFP и EGFP может разрешить как новый пользователь, чтобы проверить точность таргетинга, а также следить за клеточную жизнеспособность через экспрессии гетерологичных генов в течение длительного периода времени 13. Многие из важных шагов для надежнойи воспроизводимое использование этого протокола выделены три следующих пункта.
Для эффективной трансфекции, концентрация ДНК должна быть соответствующей. Концентрации, которые являются слишком низкими будет препятствовать выход трансфекции в то время как концентрации, которые являются слишком высокой может вызвать агломерацию наночастиц. Агрегаты золота может значительно снизить эффективность трансфекции, вызывают неравномерное распределение, и может привести к увеличению цитотоксичности и окислительного стресса. Проблемы с эффективностью покрытия, скорее всего, в связи с истечением срока спермидина решения (должны быть заменены каждые 2 до 3 месяцев). Для адекватного биобаллистической распространения, маркировка должна быть четной. Неоднородный маркировки суспензии наночастиц золота / ДНК может быть связано с раствором ПВП. Он также должен быть заменен каждые 2 до 3 месяцев. Покрытие из наночастиц золота можно увидеть на электрофореза в агарозном геле как высшего диапазона MW 27.
Каждый биологический систет под следствием, а также друг другом анализаторе используется может потребоваться небольшие изменения давления газа, чтобы достичь оптимизированные уровни трансфекции и биобаллистической распространения. Критическим параметром является давление гелия импульса, необходимого, чтобы лишить микро или нано-носителей из пластмассового патрона, и вывести их в ткани. Высокое давление газа будет влиять на выживаемость клеток, потому что она будет создавать ударные волны по всей мишени и нарушать или отделить ткань из матрицы 17. С целью гена ствол и имеющий устройство точно перпендикулярно к ткани имеет важное значение для точного баллистической доставки. Выбранный участок должен быть размещен в непосредственном центре ствола именно в 10 мм от наружной диафрагмы. Это приводит к диаметром 3 мм поставки частиц золота вокруг эпицентра. Ген ствол должен быть очищен с 70% этанола после каждого использования. Для защиты ткани от крупных агрегатов частиц, ствол также содержит нейлоновую сетку, шоÜLD регулярно заменять для поддержания оптимальной производительности. Для того, чтобы заменить сетки отвинтить колпачок затем вставить новую нейлоновая сетка между крышкой и уплотнительным кольцом.
Флуоресцентно меченые клетки должны быть видны по крайней мере 1 - 2 дня после трансфекции вокруг эпицентра. Отсутствие или смещение маркировки может быть результатом недостаточной подготовки и нестабильности генной пушки монтажа. Наблюдения клеток с использованием конфокальной микроскопии зависит от ряда факторов: от длины волны света возбуждения / излучения, обскура размера, Н. А. линзы объектива, показатель преломления компонентов на пути света, глубина ткани, и выравнивание прибор. Эти факторы должны быть оптимизированы для каждого исследуемой системы.
Последние достижения в области биолистики эксплуатировались для успеха этого метода. Ген ствол, используемый в этом исследовании, была модифицирована, чтобы уменьшить давление, необходимое, а также воронки BiolisticРазброс модели в более ограниченном и конкретном районе 17,19. Другие модификации баррель пытались ограничить Biolistic распространение и уменьшить давление оттока 28 еще этот обычай разработан ген ствол предназначен доктором О'Брайен является однокомпонентным установлены на стандартный Helios генной пушки. Впоследствии частицы золота суб-микронных были использованы, чтобы снизить инвазивность частиц микронных, что мы ранее определенных причиной повреждения клеток и в конечном итоге потери устойчивой экспрессии гетерологичных генов. Эти изменения в биобаллистической процедуры улучшили общую целесообразность и воспроизводимость метода 13. Другие улучшения по подготовке среза, такие как углубленного поиска неисправностей процедуры нарезки, с использованием матрицы DMEM-агарозы сохранить мозг, и множество других полезных достижений в органотипической подготовки мозг среза сообщалось ранее 13 позволило нам изучить возможность использования взрослых ломтиками, что разработали зрелыесинаптические сети.
В нашем исследовании мы в основном используется красители и флуоресцентные гетерологичных генов визуализировать морфологию клеток как отсчетом на эффективность трансфекции и способность к изображению морфологические характеристики нейронов в тканях мозга мыши. Отношение сигнал-шум стохастического доставка по определенному радиусу позволило нам полностью изолировать dentritic гавань одной клетки в пределах своей родной контексте. Как показывают многочисленные усилия используются для расследования этих морфологических характеристик, картографические 'connectomics »или маркировать отдельные клетки для различных анализов, этот метод может быть легко объединены с существующими протоколами, такими как электрофизиологии и аксонов измерений 29,30. Очевидно, комбинации люминесцентных гетерологичных генов может позволить гораздо более устойчивый разграничение отдельных клеток, как стохастического распределения флуоресцентных белков, а их сочетание будет определять цвет отдельных элементов 31,32. Использование специфических промоторов клеток, таких как synapsin и глиальных фибриллярного белка кислоты выше гетерологичного гена экзона может также ограничить выражение субпопуляций 33. В самом деле, бесконечное разнообразие генетического материала также может быть доставлен в региоселективного образом с помощью наночастиц золота с использованием этой же процедуре. Суммарные трансфецировали регионы могут таким образом быть проанализированы с традиционными методами, такими как рассечение и утверждая, что область к западной иммуноблотинга анализировать локализованную эффект гетерологичных генов.
Улучшения в органотипических процедур срезов также позволит более широкому использованию тканях мозга для долгосрочного экспериментов, а также разрешения на использование других тканей и совместных культурах и будет способствовать процедуры трансфекции. Липидов и полимер трансфекции были ранее сообщалось влияет мембраны гомеостаза, интернационализации, белка проницаемость 34 и часто показывают очень низкую эффективность трансфицировать теrminally дифференцированы нейроны. Конкретной ячейке нацеливание груза также поддаются только клетки, которые экспрессируют рецепторы клеточной поверхности, необходимые для интернализации, и хотя этот метод может быть очень избирательным, он может не хватать целевых региоселективность 35. Вирусные векторы в противном случае часто сложно и дорого производить, требуют строгие правила и при случае показали проблемы безопасности. Biolistic доставка таким образом, имеет беспрецедентную возможность региоселективно трансфекции нейронов и другие типы клеток в жизнеспособных тканей. Как золото не токсичен, дальнейший прогресс в использовании биолистики может проложить путь для биомедицинских применений, таких как трансдермального фармацевтической доставки, неинвазивной естественных доставки генов в, а также локализованных невирусных генной терапии.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить мастерскую MRC-LMB для производства усиленного баррель генной пушки. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Р. Хэмпсон в Университете Торонто за использование оборудования и ресурсов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
References
- Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
- Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
- Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
- Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
- Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
- Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
- Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
- Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544 (2013).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
- Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
- Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
- Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
- Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
- Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017 (2012).
- Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).
- Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
- Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
- Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).
