Abstract
Transfeksjon av DNA har vært uvurderlig for biologi og med nylige fremskritt til organotypic hjernen slice forberedelser, kan effekten av ulike heterologe gener dermed bli undersøkt lett og samtidig opprettholde mange aspekter av in vivo biologi. Det har vært økende interesse for å transfektere terminalt differensierte nevroner som konvensjonelle transfeksjonsmetoder har vært nervøs med vanskeligheter som lave avlinger og betydelige tap i levedyktighet. Biolistic transfeksjon kan omgå mange av disse vanskelighetene ennå bare nylig har denne teknikken blitt modifisert slik at det er mottagelig for bruk i pattedyr-vev.
Nye endringer i gasskammeret har forbedret genet pistolens skyting nøyaktighet og økt sine dypet av penetrasjon og samtidig tillate bruk av lavere gasstrykk (50 psi) uten tap av transfeksjon effektivitet så vel som tillater en fokusert regioselektiv spredning av particles til i løpet av 3 mm. I tillegg, er denne teknikken rett frem og hurtigere å utføre enn kjedelige microinjections. Både forbigående og stabilt uttrykket er mulig med nanopartikkel bombardement hvor episomal ekspresjon kan påvises i løpet av 24 timer og celleoverlevelse ble vist å være bedre enn, eller minst lik, konvensjonelle metoder. Denne teknikken har imidlertid en avgjørende fordel: den tillater transfeksjon å være lokalisert innenfor en enkelt behersket radius og dermed slik at brukeren kan anatomisk isolere det heterologe genet effekter. Her presenterer vi en grundig protokoll for å forberede levedyktig voksen organotypic skiver og sende dem til regioselektiv transfeksjon ved hjelp av en forbedret genet pistol.
Introduction
Opprinnelig biolistic teknikk, en turn-of-setning for "biologiske ballistikk", ble etablert for partikkel-mediert genoverføring inn i planteceller en. Denne fysiske metode for celletransformasjon akselererer mikro-eller nanopartikler med høy hastighet til å overvinne de fysiske barrierer av de tette cellemembraner for å levere last som for eksempel DNA-eller fargestoffer. Fordi det ikke er avhengig av spesifikke ligand-reseptorer og / eller biokjemiske egenskaper ved de celleoverflatemembraner, kan partikkel-mediert genoverføring lett kan anvendes på en rekke forskjellige biologiske systemer slik som organotypic hjerneskiver.
Bruke organotypic skiver har fordeler fremfor andre in vitro-plattformer siden de opprettholder mange anatomiske og biokjemiske egenskaper som er relevante for in vivo biologi 2-4. Sektorene hovedsakelig bevare de lokale arkitektoniske egenskaper fra der de har sin opprinnelse og preserve neurochemical aktivitet og tilkobling av synapser. Bruken av hjernen skiver for grunnleggende forskning, og i farmasøytiske bestrebelser, har samtidig økt med antall mulige bioteknologiske manipulasjoner for å måle og overvåke de nevrobiologiske atferd av hjernen i en in vivo som kontekst 3,5-7. De største fordelene for bruk av organotypic skive-baserte analysesystemer er at det gir enkel eksperimentell kontroll og tillater presis manipulasjoner av ekstracellulære miljøer.
Fruktbar måte, har organotypic skive kultur systemer er etablert fra en rekke områder av hjernen slik som, men ikke begrenset til, cortex, ryggmargen, og lillehjernen 8-10. Videre har en rekke cocultures blitt påvist, noe som tillater vurdering av intercellulær kommunikasjon på tvers av de distale områder av hjernen, så vel som mellom nevroner og patologiske celler 11,12. Mange protokoller er allerede etablert for å successfully kultur organotypic skiver og kan opprettholde langsiktig levedyktighet og mange nyere studier nå benytte membran grensesnittmetoder og ulike endringer i det 13. Dette prinsippet opprettholder organotypic skiver ved grenseflaten mellom mediet og inkubatoren er fuktet atmosfære ved å plassere skivene i en porøs membranfilter. Mediet kan dermed gi tilstrekkelig næring til å mate de organotypic skiver via kapillær bevegelse. Vanligvis skiver er utarbeidet fra tidlig postnatal dyr (3-9 dager gammel, P3 - 9). Imidlertid hjernevev fra disse skiver viser en høy grad av cellulær plastisitet og har en iboende motstandsdyktighet mot mekaniske påkjenninger, som er nyttig for å få levedyktige kulturer, men modne synapser og nevroanatomi kretser har ikke fullt utviklet in vivo til 2 til 3 ukers alder 14. For eksempel, hadde tidligere observasjoner vist at hippocampus skiver hentet fra P0 - en nyfødte, selv om svært viable etter forberedelse, gradvis mistet noen morfologiske kjennetegn. I hovedsak ble de vist seg å være uegnet for langsiktige kulturer tyder umodne celler var mer sannsynlig å de-differentiate forhold til organotypic kulturer fra eldre dyr 15,16. Av denne grunn vår metode har blitt optimalisert for voksne organotypic hjernen skiver der modning og arkitektoniske utvikling har nådd sin siste fasene 13,17-21. Likevel er denne metoden også egnet for nyfødte og juvenile organotypic skiver.
Når levedyktige organotypic skiver har blitt produsert hele platen inneholder skiver kan bli brakt til biolistic mount og sendt til regioselektiv levering og transfeksjon. Riktig montering av genet pistolen (som beskrevet i figur 1), orientert 90 ° i en avstand på 10 mm direkte over skivene (fra åpningen til vevet), tillater den hurtige biolistic levering av de 40 nm gåld partikkel belagt last. Disse lastene som fargestoffer og fluorescerende DNA vektorer, samt eventuelle gen av interesse, er lett overgis i levedyktige skiver med letthet. Denne fremgangsmåte beskriver således protokollen er nødvendig for å levere, på en regioselektiv måte, laste belagt gull nanopartikler til levedyktige organotypic hjerneskiver. Genet pistol og optimal montering kan sees i figur 1. For ytterligere informasjon om de forbedrede fat og nanopartikkel ballistikk, se O'Brien, et al. 17.
Senere forbedringer er også indikert for brukeren å optimalisere betingelsene for eksempel den riktige mengde gull avlevert pr target-området, definert som Mikrobærere lastes Mengde (MLQ), og for å bestemme mengden av DNA lastet pr mg av gull, definert som DNA lastes Ratio (DLR). Før utløsende DNA på gullpartikler og legger dem i Tefzel slangen som består av selve genet pistol 'patroner9 ;, det er nødvendig å beregne mengden av DNA og gull er nødvendig for hver transfeksjon som kan variere noe mellom vev og forhold (forhold må opprettholdes mellom 1 mg gull og 1 mikrogram DNA til 1: 5). Det er viktig å forberede riktig andel av MLQ til DLR som ellers DNA belagt gull partikler kan feste sammen danner større enn forventet tettbebyggelse, noe som kan redusere den totale homogenitet av biolistic spredning samt øke vevsskade og cytotoksisitet.
Denne metoden viser siste forbedringene i biolistic levering, som er testet og fastslått å være mottagelig for neonatale, unge og voksne organotypic hjernen skiver. Videre, ved å utnytte genet pistol reduserte biolistic spredning, er at brukeren nå i stand til selektivt transfektere en punktlig region i hjernen. Etter passende inkubasjonstid, ekspresjonen av de fluorescerende proteiner, som når sitt maksimum frekvenser mellom 24 og 48time, kan bli visualisert ved epifluorescence og konfokal mikroskopi. Disse fluoroforer tillate morfologisk analyse og lokalisering av individuelle celler innenfor biologisk relevante strukturer. Imidlertid kan den regioselektiv modulering av de organotypic skiver med andre heterologe gener også overvåkes ved andre tester mottagelig for disse preparater. Mulige arbeids strategier for den lokaliserte genet levering er presentert i figur 2.
Protocol
Bruken av dyr og animalske vev bør strengt holder seg til etisk komité godkjennelse under lokale regler og forskrifter. Alle vev innhentet i løpet av denne studien følges til MRC-LMB retningslinjer dyreforsøk.
1. Utarbeidelse av Materialer & Culture Media
- Forbered alle løsninger ved hjelp av Millipore vann; bare bruke analytiske karakteren reagenser. Forbered og lagre alle reagenser ved RT (med mindre annet er oppgitt).
- Lag 500 ml av HEPES-bufret saltvann (10 mM HEPES, 120 mM NaCl pH 7,2). Filtrer gjennom et 0,2 um sterilfilter-enhet. Oppbevar ved 4 ° C.
- Lag 500 ml fosfat-bufret saltløsning (PBS, 10 mM Na HPO 2 4, 2 mM KH PO 2 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4). Steriliser ved autoklavering.
- Forbered neuronal medium ved å supplere DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) med 25 mM HEPES, 10% føtalt kalveserum, 30 mM glukose, 1: 100 N2 supplement, penicillin streptomycin 1100 U / ml; pH 7,2. Filter med et 0,2 mikrometer steril filterenhet. Oppbevar ved 4 ° C.
- Lag polyvinylpyrrolidon (PVP) stamoppløsning med 20 mg PVP i 1 ml 100% etanol. Delmengde dette inn i en ml mengder, fryse og oppbevar ved -20 ° C. Arbeidsoppløsninger er 0,05 mg / ml, derfor tilsettes 10 mL av PVP-stamoppløsning til hver 4 ml av 100% etanol.
- Forbered en 0,05 M spermidin stamløsning i Millipore vann; justere pH til 7,2.
- Gjør en 2% agarose-løsning i DMEM (2 g agarose elektroforese karakter i 100 ml DMEM i en sterilisert skrukork flaske). Mikrobølgeovn dette før agarose er oppløst. Lagre i 4 ° C kjøleskap i flere uker, hvis det er nødvendig.
2. Utarbeidelse av organotypic Slices
- Avlive C57 Sort 6 mus i ønsket alder av CO 2 kvelning fulgt av halshogging. Fjern hjernen ved hjelp av side skallen kutt starter på foramen magnum og endte påolfactory fliker. Løft forsiktig skallen fra baksiden for å eksponere hjernen.
- Skjær mellom olfactory lapper og frontal cortex, og rostral til lillehjernen. Løft forsiktig rostral delen av hjernen og kutte synsnervene. Til slutt fjerner hjernen og legg den i en petriskål fylt med iskald HEPES-bufret saltvann på is.
- Ved hjelp av en dissekere mikroskop, skrelle bort pia bruker fine tang; forsiktig fjerne blodårer og hjernehinnene rundt hjernen.
- Plasser den friske hjernen til en mottakerdel formen og dekke det med agarose oppløsningen avkjølt til litt over romtemperatur. Deretter kjøles ned raskt formen til 4 ° C ved å plassere den på is.
MERK: prosess skivene så raskt som mulig for å unngå tap av levedyktighet. - Når agarose har satt (5 - 10 min), fjern agarose-embedded hjernen fra formen (trim om nødvendig), og deretter lim den til vibroslicer plattformen. Plasser denne inn i en vibroslicer kammeret inneholder sterilt iskald PBS. Disinfect den vibroslicer kammeret før de blir brukt sammen med 70% etanol for å minimalisere etterfølgende forurensninger.
- Skjær hjernen ved hjelp av en tilpasset bygget vibroslicer eller kommersiell tilsvarende. Modellen konseptet var å designe en vev slicer som kan generere store amplitude og høyfrekvente bevegelser horisontale til kanten av bladet samtidig minimere vertikale vibrasjoner.
- Bruk oscillasjonsfrekvens på 90 Hz, med en amplitude på 1,5 - 2,0 mm, og skjærebladet plassert i en vinkel på 15 ° i forhold til horisontalplanet; angi monteringsblokken holder agarose-innebygde hjernen til å bevege seg på 1.7 mm / min mot kniven. Samle seksjoner (150 mikrometer) til et kammer inneholdende iskald kulturmedia (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Vis skjæring og manipulering av vev skiver som en supplerende video i Arsenault og O'Brien 13.
- Forsiktig plassere skivene i cellekultur inserts (0,4 mikrometer, 30 mm diameter) i en 6 multi-brønn brett med kulturen Media på utsiden av innsatsen, og inkuberes i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: For riktig vev levedyktighet, være svært forsiktig ved overføring og manipulere skiver. Dessuten vil for mye væske hindre organotypic skiver ikke fester seg til membranen av filterinnsatsen. Hvis dette skjer, fjern overflødig væske eller plate igjen. - Selv organotypic skiver kan være dyrket i et par uker, går du videre til transfeksjon senest 4 dager etter plating for beste transfeksjonsteknologier avkastning.
MERK: For å unngå glial overvekst i langsiktige kultur forhold, bruk Arac eller serumfritt medium to.
3. Utarbeidelse av DNA-belagt Micro & Nano-prosjektiler
- Forbered nano-prosjektiler som bruker 40 nm diameter gullpartikler. Kort fortalt, tilsett 50 pl av 0,05 M spermidin og 10 pl DNA ved 1 mg / ml (pEYFP-N1) til 10 mg av gullpartikler.
- Legg kalsium og spermidin i løsningen mixratur under DNA-gull mikropartikler preparatet for å hjelpe til med binding av DNA-molekyler til de gull nanopartikler.
MERK: Mengden av DNA brukes per mg av gull bærere (DLR), bør ligge mellom 1 og 5 mikrogram DNA per 1 mg av gull. Videre er mengden av gull bærerpartiklene som blir skutt per patron (MLQ), bør selve området fra 0,1 til 0,5 mg av gull. DLR og MLQ skal prøves og optimalisert for hver bruker, avhengig av det spesielle system som undersøkes, så vel som type og partikkel genet pistol benyttes.
- Legg kalsium og spermidin i løsningen mixratur under DNA-gull mikropartikler preparatet for å hjelpe til med binding av DNA-molekyler til de gull nanopartikler.
- Bland ved hjelp av en vortex under sakte tilsetning av 50 pl av 1 M CaCl 2 i fraksjoner på 10 - 15 mikroliter. Etter 5 min av sporadisk virvling, sentrifuger ved 1000 xg i 30 sek så fjern supernatanten. Resuspender gullpartikkel pelleten i 3,5 ml 0,075 M PVP.
- Tegn denne suspensjonen inn i slangen (2,36 mm innvendig diameter) ved hjelp av en sprøyte. Plasser røret på slangen preparatet stasjonen. Tillategullpartiklene å slå seg ned og fjern supernatanten ved aspirering med en sprøyte. Roter slangen til jevnt fordelt gullpartikler, som deretter ble tørket under en konstant nitrogenstrøm på 5 l pr min.
- For å opprette DNA-kuler, kutte slangen ved hjelp av en slange kutter i 1 cm lengder. Enten setter inn umiddelbart inn i genet gun kassett eller holder uttørket (4 ° C) inntil påkrevet.
4. Biolistic Transfeksjon på organotypic Slices
- Utfør følgende trinn innen en steril laminær hette.
- Sett inn et 9 V batteri og en tom patronholderen i Helios genet pistol.
- Fest genet pistol til heliumtanken med helium slangen. Brann 2 - 3 blanks (tom slots) på 50 psi for å trykksette helium slangen og reservoarene i pistolen.
- Last inn patronene som inneholder DNA-belagt gull i kassetten holdere og laste holderen inn i genet pistol.
- Skru av genet pistol spacer og festdet modifiserte genet pistol til genet pistolen.
- Ved hjelp av steril tang, plassere en filterinnsats som inneholder organotypic skive i en steril plast parabolen.
- Ta ut mediet fra organotypic skiver.
- Still gasstrykket ved 50 psi.
MERK: Øyevern er viktig og anbefales hørselsvern. - Plasser genet pistolen ved passende avstander ved hjelp av monterings målt til 10 mm. Nøye mål i sentrum av sylinderen over det ønskede område for genetisk levering.
- Etter avfyring, erstatte innsatsene tilbake til sin rett med friske media og returnere dem til normale vekstforhold, dvs. 37 ° C med 5% CO 2 inkubator.
- Når du er ferdig, lukker du helium tank, slipper presset fra genet pistol og ta av genet pistol fra helium tank.
- Ta av kassettholderen og kast patronene og rengjør genet pistol.
- Sjekk vevet for morfologi og for vellykket penetrasjon av visualizing skiver ved hjelp av en invertert mikroskop. Ved bruk av mikropartikler, jevnt spre gullet; det bør være noen tette områder av gullpartikler sett på stykket. Nanopartikler på grunn av sin lille størrelse kan ikke bli sett på som enkle enheter ved konvensjonelle mikroskopi teknikker.
- Etter det aktuelle tidsintervall (vanligvis 1 - 2 dager), fikse skivene i 4% paraformaldehyde (PFA) for mikroskopi observasjon.
MERK: Feste i PFA er ikke alltid ønskelig. For live cell imaging unngå dette trinnet.
5. Feste og visualisering av hjernen skiver
- Etter biolistic transfeksjon, vaskes to ganger i PBS skiver i 2 min.
- Fix skiver ved inkubasjon i rykende fersk, iskald 4% PFA i PBS i 20 min.
- Vask skiver to ganger i PBS i 2 min.
- Forsiktig kuttet rundt membranen støtter ved hjelp av en skalpell, uten å forstyrre de skiver som er montert på dem. Bruk pinsett til å plassere hver membran support / skive på et objektglass. Hvil organotypic stykker på toppen av membranen på glass-slide.
- Tilsett en dråpe monterings media på toppen av stykket, og legge til et dekkglass forsiktig uten kraft direkte i kontakt med organotypic skive.
- Fest dekkglass med et tynt lag med neglelakk.
- Vis skivene på et passende mikroskop.
6. Confocal Applications
- Visual skiver ved hjelp av en oppreist scanning laser confocal mikroskop med 60x / 1.4 numerisk apertur (NA) oljeimmersjon objektiv.
MERK: Det mest problematiske trekk ved konfokal mikroskop er pinhole størrelse (satt til 1 AU) som er i stand til å isolere og samle en fokusplanet, og dermed eliminere ute av fokus "dis" normalt sett med en fluoriserende prøven. Fine detaljer er ofte skjult av denne dis og kan ikke oppdages i en nonconfocal mikroskop. - Sett argon laser til en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og optimalisere for innsamling av emitted lys i 500-520 nm-båndet. Vanligvis samle bilder på 1024 x 1024 piksler, og med stabler av z-seksjoner på 0,5 mikrometer intervaller til å omfatte hele bredden av hver nervecelle som ble analysert.
- Å observere morfologi av kjernen, teller flekker disse cellene med DAPI (eksitasjon bølgelengde satt til 405 nm og emisjon lys samlet mellom 420-4 40 nm). Til slutt, for å undersøke rød fluorescens, sette laser på 561 nm for eksitasjon og 565-620 nm for utslipp.
- Vanligvis, hente bilder ved hjelp av en 4X scan zoom som dekket et område på 57,6 mikrometer 2; bildestørrelser var i regionen på 1024 x 1024 piksler. Rekord stabler av z-seksjoner i 0,5 mikrometer intervaller og projeksjoner av 5 - 8 rammer kombinert.
Representative Results
Organotypic skive levedyktighet kan overvåkes med laktat-dehydrogenase-aktivitet, propidium jodid merking, og dUTP farging som ble tidligere rapportert 13,22. Tydeligvis, levedyktighet og integriteten til skivene er viktig for den langsiktige vedvarende uttrykk for det leverte genetisk last. Etter biolistic levering inn i organotypic skiver, ble ekspresjon av det fluorescerende heterologe gen overvåkes av konfokal mikroskopi. Tettheten av biolistic spredning ved hjelp av den modifiserte fat kan sees i figur 3A. Figur 3B viser et representativt bilde av den transfekterte hippocampus-området ved hjelp av DNA-belagte gull nanopartikler. Figur 4 viser representative bilder av transfekterte voksen mus organotypic skiver. Som kan sees i figur 4A, en Purkinje neuron med en bemerkelsesverdig dendrittiske havn funnet ved grenseflaten av Purkinje laget og den molekylære lag av cerebellum viser tydelig merking etter transient transfeksjon biolistic med pEGFP-N1. Figur 4B viser en høyere forstørrelse av disse dendritter hvor piggene kan observeres. Figur 4C viser en pyramideformet celle finnes i CA1-regionen av hippocampus følgende biolistic levering av pDSredFP belagte gull nanopartikler .
Fargestoffer i stedet for fluoriserende kodet DNA last kan også brukes på lignende måte for å visualisere morfologiske egenskaper i organotypic skiver. DiO, hvilke etiketter plasmamembraner, kan hurtigere avgrense individuelle celle morfologi eller kan brukes i forbindelse med et DNA-belagt biolistic levert til den samme region for å bekrefte regioselection. Som kan sees i figur 5A et neuron farget med DiO i hippocampus viser også lange dendritter med en rekke pigger. En pil indikerer axon som identifiseres ved tilstedeværelsen av synaptiske BOUTONS i forhold til dentritic pigger på de andre neurites. Figur 5B viser et annet eksempel på CA1, som fremhever mange hippocampus anslag med en DAPI teller flekken å merke kjernen. Figur 5C viser en høyere forstørrelse av disse typer parallelle dendritter med mange pigger.
Tydeligvis, disse bildene illustrerer morfologiske kjennetegn følgende cellular merking. Intet er til hinder for at samme metodologi fra å bli anvendt for å levere et antall eksogene gener belagt på gull nanopartikler. For å muliggjøre en visuell bekreftelse på vellykket transfeksjon, kan et enkelt plasmid konstrueres til å ko-uttrykke både genet av interesse, og et fluorescerende reporter protein på den samme vektor.
Figur 1. Gene pistol og montering. (A) forbedre d fat utviklet av Dr. O'Brien ved MRC-LMB som har en begrenset biolistic spredning som minimerer vevsskade ved å senke det nødvendige trykket for partikkelakselerasjon. (B) Et sideriss av en optimalisert genet gun montering utviklet av Dr. Henderson og Dr. Andras Nagy ved University of Toronto. Monteringen holder genet pistol på nøyaktig 90˚ vinkelrett på organotypic skiver samtidig tillater brukeren å nøyaktig kontrollere avstanden biolistic levering. For optimale biolistic forhold blenderåpning bør plasseres direkte over regionen av interesse på en 10 mm avstand fra organotypic skiver. (C) bakfra av genet pistol montering. Den region av interesse å bli transfektert må plasseres direkte under tønneåpningen. Målretting kan bekreftes med fargestoff (diolistic) eller fluorescerende protein tranfection (biolistic).ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. organotypic skive forberedelse og regioselektiv målretting. (A) En DMEM innebygd voksen mus hjernen klar for slicing. (B) Formen ble limt på vibroslicer montering med bladet klar til å kutte et stykke. (C) Selektiv heterologe genuttrykk strategier for biolistic levering i koronale organotypic hjernen skiver. Bilder forberedt fra bilder hentet fra Allen Brain Atlas anatomiske referanse atlas 23. Venstre panel viser to forskjellige områder av hjernen målrettet som et eksempel. For å begrense genekspresjon (1) til det kortikale området av venstre halvdel. For å begrense heterolog genekspresjon (2) til hypothalamus region av hjernen. Midtre panelet viser that ekspresjonen av to heterologe gener (3 og 4) kan isoleres og sammen hippocampus av to halvkuler i samme organotypic skive, i det vesentlige eliminere enhver skjevhet fra å bruke forskjellige deler og / eller å gi dem mulighet til å ta opp distale krysstale fra virkningene av de genene. Høyre panel viser en mulig overlapping av transgen levering til å uttrykke det første gen (5) i en presis kortikal regionen mens uttrykker et annet gen (6) i et uensartet, men overlappende kortikale området. Dette tillater å analysere effekten av genetisk modulering av hver heterologe genet alene og også i kombinasjon innenfor samme skive. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Biolistic scatter mønster sett på filteh papir og lav forstørrelse bilde. (A) Den forbedrede fat ble avfyrt på filterpapir for å bestemme spredningen av gullpartikler. Venstre side viser fordelingen av det forbedrede fat mens den høyre panel viser den normale fat. Svart bar: 1 cm. Bilde tatt fra O'Brien, et al. 17. (B) Lav forstørrelse bilde som viser den stokastiske transfeksjon patter innen 3 mm biolistic spredning innenfor hippocampus regionen i seks uker gamle mus. Hvit bar:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Biolistic levering av fluorescerende protein kodet DNA i organotypic skiver av seks uker gamle mus. (A) Inverted confocal bilder av en fast organotypic skive av lillehjernen av en pEGFP-N1 belagt gull partikler transfektert Purkinje celle. Bildet ble tatt ved 40X forstørrelse. Svart bar:. 30 mikrometer (B) Viser en 60x forstørrelse på en annen Purkinje cellens dentritic havnen for å markere pigger. Svart bar:. 5 mikrometer (C) Viser en confocal bilde av faste skiver tatt fra hippocampus regionen på 60x forstørrelse på fire DSredFP transfekterte pyramidale celler. Svart bar:. 10 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Diolistic levering av membran merking fluorescerende fargestoffer i organotypic skiver. (A) viser levende avbildning av en hippocampus nevron labeled med DiO henhold 20X forstørrelse. De dentritic pigger kan tydelig observeres samt axon som identifiseres ved fravær av dentritic pigger og tilstedeværelsen av synaptiske BOUTONS indikert av en hvit pil. Hvit bar:. 30 mikrometer (B) Uttalt farging av hippocampus regionen merket med DiO og kontra med DAPI. Hvitt bar:. 30 mikrometer (C) Høyere forstørrelse (60x) av dentritic pigger som finnes i CA1-regionen av hippocampus. Hvit bar:. 5 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen beskriver tilnærminger for å levere fargestoffer og genetisk materiale inn i voksen organotypic skiver ved hjelp av en forsterket gen pistol. Hovedsak, hvilke typer av fargestoffer og ulike mulige gener gjør denne metoden mangefasettert og mottagelig for å svare på et bredt spekter av biologiske spørsmål. Den regioselektiv leveringsmetode som brukes, i dette tilfelle til spesifikke hjerneregion, åpner nye muligheter for eksperimentering som heterologt gen modulering av lokaliserte områder i et biologisk relevant arkitektur har ikke vært lett gjennomførbart før. Vi har tidligere bestemt at denne metoden kan anvendes på voksne organotypic skiver, der modne synapser er fullstendig dannet, som det viste forbedret celleoverlevelse og heterolog genekspresjon i mange uker 13. Med bruk av nye og forbedrede dyrkningsbetingelser for mammalske hjerne så vel som andre vev, vil bruken av regioselektiv genetiske modulasjoner blitt stadig mer nyttig for et bredt utvalg av Biochemical analyser.
Som vi skal markere her og tidligere nevnt av andre 24, kan mange ulike faktorer lett påvirke nøyaktigheten og påliteligheten av biolistic levering. For det første må fremstillingen av gullpartikkel knyttet til fargestoffer eller DNA være tilstrekkelig balansert for å forhindre aggregering og å lette patron lasten utstøtning. Kalsium og spermidin i DNA-gull mikropartikler løsning kan hjelpe bindingen av DNA-molekyler til de gull nanopartikler. Muligheten for nanopartikler å trenge inn i cellene under redusert trykk ble tidligere fastslått 17. For det andre må genet gun monteres så jevnt som mulig med den riktige vinkel og avstand. En pålitelig trykkmåler er også nødvendig for reproduserbarhet, for å opprettholde integriteten til vev, og for å akselerere riktig gullpartikler til sine tiltenkte mål. Faktisk avstand, retning og stabilitet av utstyr er også en avgjørende faktorer for targeting og presisjon av regioselektiv levering. Ettersom disse hjernestrukturer er svært liten, kan mindre variasjoner i avfyring vinkel lett gjengi hele prosedyren mindre pålitelig. Og til slutt, utarbeidelse og vedlikehold av levedyktige organotypic skiver har vært nervøs med vanskeligheter for mange tiår ennå rikelig og pålitelige protokoller for forskjellige dyr, hjerneregioner, aldre og cocultures er for tiden tilgjengelig 2,4,25,26. Disse prosedyrene skal være bruker optimalisert før du sender vev til biolistic prosedyrer. Dette vil lettere tillate brukeren å unbiasedly fastslå virkningen av de biolistic partikler, og effekten av det heterologe gen på sine egne kulturer. For å oppnå dette, kan bruk av fluorescerende gener som EYFP og EGFP både tillate en roman bruker å teste målretting presisjon og også følge den cellulære levedyktighet gjennom heterologe genuttrykk over en lengre tidsperiode 13. Mange av de kritiske trinnene for påliteligog reproduserbar bruk av denne protokollen er uthevet i følgende tre avsnitt.
For effektiv transfeksjon, må DNA-konsentrasjon være hensiktsmessig. Konsentrasjoner som er for lave vil hindre transfeksjon utbytte, mens konsentrasjoner som er for høye kan forårsake agglomerering av nanopartikler. Aggregater av gull kan dramatisk redusere transfeksjon effektivitet, forårsaker ujevne fordelinger, og kan føre til økt cytotoksisitet og oksidativt stress. Problemer med belegg effektivitet skyldes mest sannsynlig utløpet av spermidin løsning (bør skiftes hver 2 til 3 måneder). For en tilstrekkelig biolistic spredning, må merkingen være enda. En ikke-homogen merking av gull nanopartikkel / DNA-suspensjonen kan være på grunn av PVP-løsning. Det bør også skiftes hver 2 til 3 måneder. Belegg av gull nanopartikler kan sees på agarose gel-elektroforese som et høyere MW båndet 27..
Hver biologisk system under etterforskning samt hver annen instrument som brukes kan kreve små endringer i gasstrykk for å nå optimale nivåer av transfeksjon og biolistic spredning. Den kritiske parameter er trykket av helium puls som kreves for å strippe den mikro-eller nano-bærere fra plastpatronen og drive dem inn i vevet. En høy gasstrykket vil påvirke celleoverlevelse, fordi den vil skape sjokkbølger over hele målet og forstyrrer eller løsne vev fra matrisen 17.. Sikter genet pistol og har anordningen nøyaktig vinkelrett på vev er viktig for nøyaktig biolistic levering. Det valgte område bør plasseres i direkte sentrum av sylinderen på nøyaktig 10 mm fra den ytre åpning. Dette resulterer i en 3 mm diameter av gullpartikkel levering rundt i sentrum. Genet pistol bør rengjøres med 70% etanol etter hver bruk. For å beskytte vev fra store partikkel-aggregater, inneholder sylinderen også en nylonmesh som should byttes ut regelmessig for å opprettholde optimal ytelse. For å erstatte mesh skru hetten deretter sette inn en ny nylon mesh mellom hetten og o-ring.
Fluorescensmerkede celler skal være synlig på minst 1-2 dager etter transfeksjon rundt i sentrum. Fravær eller forskyvning av merking kan skyldes utilstrekkelig forberedelse og ustabilitet av genet pistol montering. Observasjonene av celler ved hjelp av konfokal mikroskopi, avhenger av en rekke faktorer: bølgelengden til eksitasjon / emisjon lys, pinhole størrelse, NA av objektivlinsen, brytningsindeks av komponenter i lysbanen, dybden av vevet, og justeringen av instrumentet. Disse faktorene bør være optimalisert for hvert system under etterforskning.
Nylige fremskritt i biolistics ble utnyttet for å lykkes med denne metoden. Genet gun barrel brukt i denne studien ble modifisert for å redusere trykket som er nødvendig, så vel som trakt biolisticscatter mønster i et mer begrenset og bestemt område 17,19. Andre fat modifikasjoner har forsøkt å begrense biolistic spredning og redusere utstrømningen trykket 28 men dette tilpasset designet genet pistol designet av Dr. O'Brien er en enkelt komponent montert på standard Helios Gene pistol. Deretter ble sub-mikrometer gullpartikler som brukes til å redusere invasivitet av mikrometerpartikler som vi tidligere hadde bestemt forårsaket cellulær skade og til slutt, vedvarende tap av heterolog gen-ekspresjon. Disse endringer i biolistic fremgangsmåte forbedres den samlede gjennomførbarheten og reproduserbarheten av metoden 13. Andre forbedringer på skive forberedelse for eksempel inngående feilsøking av slicing prosedyre, ved hjelp av en DMEM-Agarose matrise for å bevare hjernen, og en rekke andre nyttige fremskritt i organotypic hjernen skive forberedelse tidligere rapportert 13 aktivert oss å utforske bruken av voksne skiver som har utviklet modensynaptiske nettverk.
I vår undersøkelse vi brukt hovedsakelig fluorescerende fargestoffer og heterologe gener for å visualisere cellemorfologi som en avlesning på transfeksjon effektivitet og evne til å bilde de morfologiske karakteristika for nevroner i mus hjernevev. Signal til støyforhold på den stokastiske levering innen en definert radius aktivert oss å fullstendig isolere en enkelt celle dentritic havn innenfor sin opprinnelige kontekst. Som mange innsats brukes til å undersøke disse morfologiske egenskaper, for å kartlegge 'connectomics' eller påføres enkeltceller for ulike analyser, kan denne metoden lett kombineres med eksisterende protokoller som elektrofysiologi og neurite målinger 29,30. Øyensynlig, kombinasjoner av fluorescerende heterologe gener kunne muliggjøre en mer robust avgrensning av enkeltceller som stokastisk fordeling av fluorescerende proteiner, og deres kombinasjoner vil bestemme fargen av de individuelle celler 31,32. Bruken av cellespesifikke promotorer slik som synapsin og glial fibrillary syre protein oppstrøms for det heterologe gen ekson kan også begrense ekspresjonen til 33 subpopulasjoner. Faktisk kan den uendelige rekke av genetisk materiale også bli levert i en regioselektiv måte av gull nanopartikler ved hjelp av den samme prosedyre. De samlede transfektert regioner kunne således bli analysert med tradisjonelle metoder, slik som disseksjon og sende den regionen til vestlig immunoblotting for å analysere den lokaliserte virkning av det heterologe genet.
Forbedringer i organotypic skive prosedyrer vil også tillate større bruk av hjernen vev for langsiktig eksperimentering samt tillate bruk av andre vev og cocultures og ville lette transfeksjonsteknologier prosedyrer. Lipid og polymer transfeksjon tidligere har blitt rapportert å påvirke membran homeostase, internalisering, protein permeabilitet 34 og ofte viser svært lav effektivitet for å transfektere terminally differensiert nevroner. Cell bestemt laste målrettingen er også mottagelig bare til celler som uttrykker celleoverflatereseptorer som er nødvendig for internalisering, og selv om denne metode kan være svært selektiv, kan den mangel målrettet regioselectivity 35. Virale vektorer ellers er ofte vanskelige og kostbare å produsere, krever strenge regler og har til tider vist sikkerhetsmessige bekymringer. Biolistic levering har dermed en enestående evne til å regioselectively transfektere nevroner og andre celletyper innenfor levedyktig vev. Som gull er ikke giftig, ytterligere fremskritt i bruk av biolistics kunne bane vei for biomedisinske anvendelser som transdermal farmasøytiske levering, noninvasive in vivo genet levering, samt lokaliserte ikke-virale genterapi.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke MRC-LMB verksted for produksjon av den forsterkede genet pistol. Vi ønsker også å takke Dr. David R. Hampson ved Universitetet i Toronto for bruk av utstyr og ressurser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
| HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
| NaCl | Sigma | S7653-250G | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
| 0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
| Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
| Spermidine | Sigma | S2626 | |
| Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
| Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
| Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
| Humidified cell culture incubator | |||
| Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
| pEYFP-N1 | Clontech | ||
| Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
| Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
| Barrel | Custom made by the LMB | ||
| Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
| Dissecting microscope | for convenience | ||
| Confocal microscope | user defined for usage | ||
| Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
| Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
| Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |
References
- Klein, R. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Biotechnology. 24, 384-386 (1987).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacolog., & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Morin-Brureau, M., De Bock, F., Lerner-Natoli, M. Organotypic brain slices: a model to study the neurovascular unit micro-environment in epilepsies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 11 (2013).
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale Journal of Biology and Medicine. 85, 501-521 (2012).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45, 117-127 (2004).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2013).
- Drexler, B., Hentschke, H., Antkowiak, B., Grasshoff, C. Organotypic cultures as tools for testing neuroactive drugs - link between in-vitro and in-vivo experiments. Current Medicinal Chemistry. 17, 4538-4550 (2010).
- Oishi, Y., Baratta, J., Robertson, R. T., Steward, O. Assessment of factors regulating axon growth between the cortex and spinal cord in organotypic co-cultures: effects of age and neurotrophic factors. J Neurotrauma. 21, 339-356 (2004).
- Baratta, J., Marienhagen, J. W., Ha, D., Yu, J., Robertson, R. T. Cholinergic innervation of cerebral cortex in organotypic slice cultures: sustained basal forebrain and transient striatal cholinergic projections. Neuroscience. 72, 1117-1132 (1996).
- Barateiro, A., Domingues, H. S., Fernandes, A., Relvas, J. B., Brites, D. Rat Cerebellar Slice Cultures Exposed to Bilirubin Evidence Reactive Gliosis, Excitotoxicity and Impaired Myelinogenesis that Is Prevented by AMPA and TNF-alpha Inhibitors. Molecular Neurobiology. 49 (1), 424-439 (2013).
- Franke, H., Schelhorn, N., Illes, P. Dopaminergic neurons develop axonal projections to their target areas in organotypic co-cultures of the ventral mesencephalon and the striatum/prefrontal cortex. Neurochemistry International. 42, 431-439 (2003).
- Mingorance, A., et al. Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino-hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions. Molecular and Cellular Neurosciences. 26, 34-49 (2004).
- Arsenault, J., O'Brien, J. A. Optimized heterologous transfection of viable adult organotypic brain slices using an enhanced gene gun. BMC Research Notes. 6, 544 (2013).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
- Laywell, E. D., et al. Neuron-to-astrocyte transition: phenotypic fluidity and the formation of hybrid asterons in differentiating neurospheres. J Comp Neurol. 493, 321-333 (2005).
- Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. Up-regulation of neural stem cell markers suggests the occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213, 625-630 (2003).
- Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Brien, J., Unwin, N. Organization of spines on the dendrites of Purkinje cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1575-1580 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Nano-biolistics: a method of biolistic transfection of cells and tissues using a gene gun with novel nanometer-sized projectiles. BMC Biotechnology. 11 (66), 1472-6750 (2011).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistic labeling of neuronal cultures and intact tissue using a hand-held gene gun. Nature Protocols. 1, 1517-1521 (2006).
- Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends in Biotechnology. 25, 530-534 (2007).
- Han, X., et al. Validation of an LDH assay for assessing nanoparticle toxicity. Toxicology. 287, 99-104 (2011).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. Journal of Visualized Experiments. 12, (2008).
- Su, T., Paradiso, B., Long, Y. S., Liao, W. P., Simonato, M. Evaluation of cell damage in organotypic hippocampal slice culture from adult mouse: a potential model system to study neuroprotection. Brain Research. 1385, 68-76 (2011).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PloS One. 7, 45017 (2012).
- Ito, T., Ibe, K., Uchino, T., Ohshima, H., Otsuka, M. Preparation of DNA/Gold Nanoparticle Encapsulated in Calcium Phosphate. Journal of Drug Delivery. 2011, 647631 (2011).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Appl Phys Lett. 87, 014103 (2005).
- Meijering, E. Neuron tracing in perspective. Cytometry. Part A : the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 693-704 (2010).
- Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. Targeted axon-attached recording with fluorescent patch-clamp pipettes in brain slices. Nature Protocols. 7, 1228-1234 (2012).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Gholizadeh, S., Tharmalingam, S., Macaldaz, M. E., Hampson, D. R. Transduction of the central nervous system after intracerebroventricular injection of adeno-associated viral vectors in neonatal and juvenile mice. Human Gene Therapy Methods. 24, 205-213 (2013).
- Arsenault, J., et al. Botulinum protease-cleaved SNARE fragments induce cytotoxicity in neuroblastoma cells. Journal of Neurochemistry. 129, 781-791 (2014).
- Arsenault, J., et al. Stapling of the botulinum type A protease to growth factors and neuropeptides allows selective targeting of neuroendocrine cells. Journal of Neurochemistry. 126, 223-233 (2013).
