Abstract
유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 렌티 기반 재 프로그래밍 방법론으로 생성 될 수있다. 그러나, 게놈의 적극적 전사 영역에 남아있는 잠재적 발암 유전자의 흔적은 인간의 치료 응용 프로그램 (1)에 사용하기 위해 자신의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 또한, 치료 학적으로 중요한 유도체 줄기 세포 분화 또는 재 프로그래밍 유래의 비 - 인간 항원 인간 임상이 문맥에서 사용되는 이러한 hiPSCs는 배제. 이 비디오에서는, 우리는 재 프로그래밍 및 외래 유전자의 무료 요인이없는 hiPSCs를 분석하는 절차를 제시한다. 이러한 hiPSCs이어서 렌티 바이러스를 포함하는 특정 인트론 유전자 발현의 이상에 대해 분석 할 수있다. 이러한 분석은 이전에 유전자 발현의 차이 (3)를 검출하는 데 덜 민감한 기술 위에 이점을 갖는다 민감한 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 수행 될 수있다. 로 전체 변환임상 등급의 우수 제조 기준 (GMP) 조건, 인간의 임상 적 관련성을 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 제공하는 또 다른 방법이 제공하는 현재의 안전 항구 기준이 확장 인간의 치료 응용 프로그램-을 위해 만기가 인간이 아닌 항원에 어떤 면역 원성의 위험을 제거해야한다 GMP 수준의 hiPSCs를 유도하는 요인이없는 특성화 된 hiPSC 기반의 파생 상품을 포함 할 것이다. 이 프로토콜은 모든 유형의 세포로 재 프로그램 렌티 폭넓게 적용되며, GMP 수준의 조건으로 세포를 재 프로그램을 변환하기위한 재생 가능한 방법을 제공한다.
Protocol
주 :.이 방법은 경외 등 (10)에보고 된 연구에 사용 하였다.
STEMCCA 1. 재 프로그래밍 성인 인간 피부 섬유 아세포
- 해동 성인 피부 인간 섬유 아세포 (한국 외대), 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 통로 (4) 이하, 물을 유리 병의 상단 잠수함 않도록주의.
- 15 ML 원뿔 유리 병에 인간 섬유 아세포의 1 ml의 슬러리를 놓고 천천히 드롭 현명한 방식으로, 37 ° C로 미리 예열 표준 HUF 미디어, 4 ml의 배치, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 밖으로 희석하기 다시 중단 세포를.
- 실온에서 10 분 동안 200 XG에서 바이알을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 / ㎖ 100,000 세포 현탁액을 만들 매체의 적절한 볼륨에서 셀을 다시 중단하고 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 2를 가하여, 0.2 % 젤라틴으로 20 분 동안 미리 코팅.
참고 : 라인과 조건에 따라 세포의 동일한 수의 잘 자매 fo를 접종해야R 셀 카운팅 / 감염 (MOI) 계산의 다양성. - 세포를 균일하게 분배하는 전후 좌우하고 판측 락. 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 밤새 인큐베이션.
- 전달의 날, 세포 자매의 수 (들) 잘 초기 HUF 도금 후 (들) 약 24 시간을 구하십시오.
- 2 × 10 8 TU 또는 이와 동등한, 렌티 바이러스 농축 (STEMCCA)을 밖으로 해동 HUF 미디어 1 × 10 8 TU / ㎖로 희석.
- 8 ㎍ / ㎖의 트랜 스펙 션 제로 보충 HUF 배지에서 10 MOI 비율로 세포를 형질 도입. 균등 형질 우물을 혼합하고 가습 배양기에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 밤새 품어.
- 렌티 바이러스 전달 후 약 24 시간은 표준 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 매체에 HUF 매체를 전환합니다.
- 일 2 ~ 6 일, 인간의 PSC 매체 매일 미디어를 변경합니다.
- 하루 6 일, 두 0.2 % 젤라틴 코팅 10 cm 판을 판HUF 미디어 12 CF1 마우스에서 파생 된 1.5 10 × 1.75 6 MEFs에.
- 7 일에, 조심 사이에 균등하게 세포를 도금, 1시 16분 비율로 6 웰 플레이트 및 통로의 한 우물에서 7 일 다시 프로그램 섬유 아세포를 들어 올릴 때는 100 개 이상의 XG, 사용 실온 트립신을 원심 분리하지 전날 MEFs에 도금 된 신선한 인간의 PSC 미디어, 두 10cm 플레이트. 37 ° C에서 시계 방향으로 나선형 운동과 장소에 세포 집합체를 배포, 5 % CO 2 하룻밤 인큐베이터를 가습.
- 약 48 시간 이후 MEFs에 매일에 재 프로그램 세포를 파종 한 후, 신선한 매체와 소비 인간의 PSC 미디어를 변경합니다.
- 3~4주 후, 21 게이지 바늘 형태처럼 전형적인 ESC 개별 콜로니를 선택하고 0.2 % 젤라틴 - 코팅 된 개별 웰에 특정 콜로니 약 8-10 개별적인 조각을 배치하여 24 웰 플레이트 아웃 서브 클로닝 24 웰 플레이트 전 씨인간의 PSC 매체 CF1 마우스에서 파생 된 MEFs에와 에드.
주 : 촬상 콜로니 전개 후, 콜로니를 단백질 수준에서 배아 체 형성 및 다 능성 마커의 발현 분석에 의하여 다 능성 특징으로 할 수있다.
2. 벡터 통합 사이트 분석 및 STEMCCA 절제술
- 10 바와 같은 비 제한적인 선형 PCR에 의해 증폭 STEMCCA 통합 사이트를 분석한다.
- 오래된 인간의 ESC 매체를 흡입하여 게놈, 소비세 STEMCCA의 원하는 영역으로 하나의 통합을 보장하기 위해 시금 후. 그 후, 24 시간 동안 표준 PSC 미디어 3 ㎖ 8 ㎍ / ㎖의 트랜 스펙 션 제로 농축 아데노 - 치운다 PuroR 바이러스의 45 μl를 결합한다.
- 24 시간의 잠복기 후, 혼합 바이러스 뜨는을 대기음과 인간의 PSC 미디어로 두 번 세포를 씻으십시오. 5 일 동안 2 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신과 함께 신선한 인간의 PSC 매체를 놓고 미디어 매일 재치 변경시간 신선한 매체와 항생제.
- 오일 후 서브 클론 12- 웰 플레이트에서 0.2 % 젤라틴 - 코팅 된 웰에 21 게이지 바늘을 가진 콜로니로부터 유도 된 잔류 CF1mice MEFs에 사전에 도포하고, 위에서 설명한 바와 같이 확장.
참고 : 충분한 확장은 냉동 보관을 얻을 후, 공급이없는 상태로 변환이 필요합니다. 대부분의 세포가 성공적으로 형질 도입되지 않고 배양 오일 걸쳐 항생제에 굴복하는 바와 같이 95 % 이상의 줄기 세포 콜로니 사멸 예상된다. 아데노 Cre 호텔 - PuroR는 요인이없는 식민지의 샘플을 reexposing, 감염된 세포의 호스트 염색체에 0.001 %의 효율로 통합 있지만 더 통합 13 발생하지 확인합니다 100 % 세포 사멸을 보장하기 위해 퓨로 마이신합니다. - 매트릭스가 액체가 될 때까지 약 2 시간 (제조자의 권고)에 걸쳐, 얼음에 사전 분취 기저막 매트릭스의 한 바이알을 해동하고 차가운 기저 매체 1:30 최종 농도로 희석 아웃. 공동물론 당 1 mL를 여섯 웰 플레이트에 웰 원하는 번호로. 실온에서 1 시간 동안 앉아 보자.
- 물론 이전에 MEFs에 코팅 30 식민지 적어도 20 (18 게이지 바늘, 또는 유리 또는 플라스틱 "팁"을 사용하여) 크로스 해치. MEF는 고양 줄이고 판에서 전송할주의하십시오.
- 멸균 플라스틱 피펫 팁의 간단한 사용법으로, 화염에, 더 복잡한 가열에서, 다른 접근 방법을 통해 유리 파스퇴르 피펫의 당김, 및 마무리를 해칭 장치를 생성하거나, 우리의 경우에서와 같이, 21- 및 / 또는 18 게이지 바늘.
- 코팅 잘 후 배양에서 행렬을 기음.
- 200 μL 피펫으로 이전 판에서 부드러운 스크랩하여 식민지의 조각을 제거하고 조심스럽게 매트릭스 코팅 접시에 신선한 결합 된 미디어 (1) 3 ㎖에 배치합니다. 37 ° C, 5 % CO 2 가습 배양기에서 하룻밤 품어. 미디어 변경, 48 시간 계대 후.
- 상업 DNA 추출 키트를 사용하여 80 % 이상의 포화 상태에, 절제 포스트 및 피더없는 변환 된 hiPSCs에서 게놈 DNA를 추출합니다.
- STEMCCA의 렌티 바이러스의 외생 적 통합을 위해 특정 프라이머와 적절한 절제에 대한 분석 : gDNA를-헨도-MycS 감기, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA를-hWPRE-역, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. 10 μM 원액을 PCR 등급 물을 동결 건조 된 프라이머를 복원합니다.
- 다음과 같은 5 단계 프로토콜 PCR을 실행하여 초기 변성을 3 분 동안 95 ° C에서; 15 초 동안 72 ° C에서 15 초, 및 확장을위한 62 ° C에서 20 초, 프라이머 어닐링 98 ° C에서 변성, 다음의 각 35주기 3 분 72 ° C에서 단일주기 최종 확장 하였다.
- 아가 로스를 1.5 g 칭량하고 50 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 - EDTA 버퍼에 배치하여 3 % 아가 로즈 젤을 확인. 아가로 오스 때까지 전자 레인지 용해 DNA 젤 얼룩의 장소는 p로퍼 희석, 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안 고화 겔 카세트에 적절한 양을 분배.
- PCR 산물의 부하 12 μl의 3 % 아가 로즈 겔에 로딩 염료 3 μL와 혼합 하였다. V. 80에서 30 분 동안 젤을 실행
- 적절한 절제를 나타내는 밴드의 부재에 대한 자외선 시각화.
사전 및 사후 적출 hiPSCs에서 정량 PCR을 이용한 유전자 발현의 차이 3. 정량
- 상업 RNA 추출 키트를 사용하여 절제 포스트 및 피더없는 변환 된 hiPSCs에서 총 RNA를 추출합니다.
- - 역 전사 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용하여 총 RNA 1 μg의 최대. 고정 - 올리고 (DT) (18) 임의 헥사 프라이머를 사용합니다.
참고 : PCR 프로토콜은 4 KB보다보다 더 많은 이하의 유전자 성적 증명서에 맞게 조정되어 있는지 확인합니다. 특정 프라이머 중 유전자 STEMCCA 원래 통합 전을 위해 만든해야합니다NTO. - 20 μM 원액을 PCR 등급 물을 동결 건조 된 프라이머를 복원합니다.
- 10 μM의 UPL 프로브로 구성되어 반응 20 μL, 2 배의 LightCycler 480 프로브 마스터 당 샘플의 5 NG를 사용하고, 앞으로 20 μM 및 역방향 프라이머.
GMP 수준의 조건으로 4. 변환
- GMP 수준의 조건을 통해 후 절제 hiPSCs를 전환의 첫 날, 결합 된 인간의 PSC로 구성된 미디어의 혼합을 미디어 1 (결합 된 미디어 1) 임상 성적 우수 제조 기준 (GMP) 호환 미디어 (결합 된 미디어 2 ) 80 : 20의 비율로.
- 대기음 오래 결합 매체 (1)과 80:20의 비율로 조합 된 새로운 매체 1 및 2, 예열 3 ㎖를 배치 오프. 이 특정 비율로 3 일 동안 매일 미디어를 변경합니다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
- 하루에 4 일, 50 : 50의 비율로 결합 된 미디어 (1)과 (2)를 확인합니다. 기존 매체와 REPLAC 대기음50 대 50의 비율로 결합 된 미디어 1과 2와 미리 예열 미디어와 전자. 이 특정 비율로 3 일 동안 미디어를 변경합니다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
- 7 일째, 20:80의 비율로 혼합 매체 1 및 2를 만든다. 대기음 기존 매체 오프와 20:80의 비율로 결합 된 미디어 1과 2, 예열 용지로 교체합니다. 이 특정 비율로 3 일 동안 미디어를 변경합니다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
- 100 비 : 10 일에, 0에 결합 된 미디어 1과 2를합니다. 대기음 기존 매체 끄고 0 결합 된 미디어 1과 2, 미리 예열 용지로 교체 : 100 비율. 이 특정 비율로 매일 미디어를 변경합니다. 세포는 완전히 정의 이종 무료 매체에있다. 다시 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포.
주 :이 전체 변환 프로세스 중, 18 게이지 바늘로는 적절한 루틴 계대 콜로니 크기 및 밀도를 유지하기 위해 필요하다. 페이지에 계획콜로니 크기, 포화 상태, 및 분화에 기초하여 모든 4~5일 세포 assaging. - 제조업체에서 권장 정의 이종 무료 기판과 여섯 잘 플레이트에 잘 코트 하나.
- 기계적 통로 합류가 아니라, 이미 18 게이지 바늘 여섯 웰 플레이트에서, 이종없는 미디어 조건을 변환. 중요한 것은, 미디어를 조건을 사전에 계대 전에, 1 시간 동안 1 배 ROCK 억제제와 세포에 새로운 미디어 (결합 된 미디어 2)를 배치합니다.
- 세포로 전달되고 있다는 새로운 플레이트 오프 합성 기질 용액 기음. 이전 판에서 줄기 세포 덩어리를 포함하는 모든 용지를 제거하고 새로운 판에 전송합니다.
- (한 번 인큐베이터 내부, 직접 방식으로 접촉하지 않는 이상적 판) 다시 최소한의 물리적 방해 2 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 장소 세포는 최대 첨부를 허용합니다.
참고 : 세포는 매일 미디어를 변경해야합니다. 지속적인 passaging 4 일마다이 중요 할 것이다. 21 게이지 바늘, 최적의 ESC와 같은 형태 (높은 nucleocytoplasmic 비율)와 식민지의 통로 부분 만 사용. 이것은 잘 성장하고 결국 동질적인 식민지를 얻을 것입니다 적절한 hiPSC 식민지에 대한 선택을 보장합니다. 식민지 같은 ESC의 유도에 전체 시간은 초기 결합 된 미디어를 변경 한 후 15~20일 사이에있다. - 18 게이지 바늘을 사용하여 첫 번째 크로스 해치에 의해 식민지를 모두 GMP 수준의 사후 적출 hiPSCs을 동결. 200 μL의 피펫을 사용하여 해제 모든 조각을 올리고 4 ℃에서 5 분 동안 200 XG에 15 ML 원뿔 유리 병 원심 분리기에 세포를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다.
- 세포를 원심 분리하는 동안 차가운 결합 매체 (2)의 같은 부피로 이루어진 7.5 %의 최종 DMSO 농도 매체 냉동 동결 매체를 만든다.
- 세포 펠렛 후, 기존 매체를 대기음 및 냉동 매체와 펠렛을 다시 일시 중지 현명한 놓습니다. 즉시 TR동결 튜브에 ansfer와 C의 냉동고 °에서 -80했습니다.
5. 특성화 GMP 수준의 사후 적출 hiPSCs
- 3 단계 QPCR 방법론에서 언급 한 다음 키 능성 마커 (SOX2, 인 Oct4, 및 NANOG) 같은 단계를 표 1에 프라이머를 사용하여의 발현을 정량화하는 QPCR를 사용 능성 마커 변환 후 적절한 표현을 보장하기 위해 3 단계에 나열된 같은 단계를 반복합니다.
- 사용 이전에 (10)이 발표 한 키트에 나열된 표준 약관에 따라 인간이 아닌 시알 산 Neu5Gc (N -glycolylneuraminic 산)을 감지하는 유동 세포 계측법.
- 부드럽게 1X 인산 완충 식염수 (PBS)를 사용하여 세포를 세포 배양 플레이트를 세척한다.
- 실온에서 5 분 동안 1X 해리 시약을 사용하여 콜로니를 떼어 놓다.
- 단계 5.4의 5 분의 배양 시간 동안에 설치된 차단 용액 (제조얼음 - 냉각 PBS로 차단제 0.5 %함으로써 키트).
- 유동 세포 계측법 분석을위한 튜브의 다음 세트 레이블 : 흠을; 4 ', 6- Diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) DAPI; 대조군 항체 1 : 200; 차 항체 1 : 200; 이차 항체 1 : 200 당나귀 안티 치킨의 IgG (H + L); 샘플 MEFs에; 매트릭스에 샘플 후 절제 세포; 및 샘플 합성 기판에 세포를 포스트 - 절제.
- 조심스럽게 15 ML 원뿔 튜브에 솔루션 및 전송 내용을 차단 2 ㎖를 추가하여 단계 5.4에서 세포 집합체을 제거. 4 ℃에서 5 분 80 XG에 원심 분리기.
- 단계 5.7에 명시된 솔루션과 원심 분리기를 차단로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 부드럽게 각 해당 항체의 희석 부피 차단 용액 100 ㎕에 약 1 × 106 세포를 다시 일시. 부드러운 1 시간 동안 4 ° C에서 락을 함께 품어.
- 단계 5.8에서와 같이 세척을 세 번 반복합니다.
- 희석제 니어 400 μL의 세포 펠렛을 다시 일시ffer은 1 (키트에서) : 튜브 2, 6, 7 DAPI 100, 8 단계 5.6 아래에 나열된.
- 40 μm의 여과기를 통해 변형 세포와 사이토 흐름을 통해 실행합니다.
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Representative Results
우리 STEMCCA의 렌티 기반 리 프로그래밍 방법을 사용하여 임상 등급 인자없는 hiPSCs를 유도 프로토콜을 제안한다.도 1a는 MEFs에의 층에 STEMCCA 방식으로 재 프로그래밍 후, 세 가지 사전 절개 hiPSC 라인의 대표 사진을 보여준다. STEMCCA 재 프로그래밍 접근 방법의 주요 장점은 다른 연구 그룹 및 위치에, 여러 과학자들에 의해 달성 일관된 재 프로그램의 성공에있다. 그림 1B는 포스트 절제 역전사 중합 효소 연쇄 반응 젤을 선물, 완전 무료입니다 하나의 특정 서브 클론 (2.3)를 표시 STEMCCA의 렌티 바이러스로부터, 특정 시퀀스 STEMCCA.도 2a 내인성 특정 앰플 리콘 대역의 부족에 의해 입증되는 바와 같이 합성 행렬에 행렬 및 포스트 절제 이종 프리 GMP 급 hiPSCs를 포함한 이종의 변환 전의 hiPSCs를 도시 . 표준 만능 관련 요인의 정량 (SOX2는 QPCR을 사용하여 인 Oct4, 및 NANOG)는도 2b에 도시되어있다. 도 2c에 도시 된 바와 같이, GMP 수준의 사전 조건 및 사후 변환 hiPSCs 변환은, 비 - 인간 항원 나타내는 시알 산 N-glycolylneuraminic 산에 대한 유세포 분석기를 통해 시험 하였다.
그림 1 : 대표 인간 다 능성 줄기 세포 카세트 (hSTEMCCA) 유래 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 라인. (A) 모든 세 도출 라인은 nrLAM-PCR 기술을 이용하여 분석하고, 단지 제시된 C8 라인 PRPF39 유전자로 통합 한 것으로 밝혀졌다. 만 인해 안전 인트론 STEMCCA 통합이 라인, Cre 호텔 - 중재 절단 용 아데노 Cre 호텔 - PuroR 선택을 받아야하는 선정되었다. (B) 아데노 Cre 호텔은 C8 라인에서 STEMCCA 절제를 매개. 피STEMCCA - 엔도-Myc와-S와 A-WPRE-에서 발견 된 독특한 염기 서열에 대한 rimers는 하나의 서브 클론이 (2.3 iPSCs를 후 절제)가 제대로 절제와 통합 된 프로 바이러스에서 유전자 전사 인자없는 것으로 나타났다. 바는 100 μm의 =. 이 그림은 경외감 등. (10)에서 수정되었습니다.
그림 2 : 이종 함유 임상 수준의 GMP의 이종없는 조건 및 특성에에서 hiPSCs의 전환. (A) 이종 함유 (연구 학년 매트릭스)에서 변환 된 대표 hiPSC 라인 이종없는 수 (합성 기판) 현재 우수 제조 기준 (GMP) 조건에서 조건. (B) 적절한 능성에 대한 분석에 정량적 중합 효소 연쇄 반응 GMP 등급의 조건에 관련된 유전자 발현 변환 후. (C)와 T에서표준 멸균 시험을 이온 GMP 호환성을 보장하기 위해, 비 - 인간 항원, N -glycolylneuraminic 산을위한 유동 세포 계측법 기반 분석 시험은, 사후 - 변환 hiPSCs이 포스트와 (1 % 전체 시알 산 검출을 없앨 것을 보여주기 위해 사용되는 매트릭스에 적출 세포 합성 기판에 사후 적출 세포)로 0 %에 비해. 마우스 배아 섬유 아세포 및 GMP 조건 하에서 유도 hiPSC 라인은이 실험에서, 각각 양성 및 음성 대조군을 역임. 바는 100 μm의 =. hESC의, 인간 배아 줄기 세포; PESS는, 합성 기판을 후 절제; PEM, 후 절제 행렬. 이 그림은 경외감 등. (10)에서 수정되었습니다.
| 유전자 이름 | 정방향 프라이머 5'-3 ' | 역방향 프라이머 5'-3 ' | 프로브 # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | (13) |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | (65) |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | (55) |
표 1 : 정량적 PCR 분석을 위해 사용 된 프라이머.
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Discussion
우리는 인자없는 hiPSCs를 유도하고 미래의 인간 치료제 하류 세포 분화에 대한 GMP 수준의 조건으로 이들 세포를 변환하여이를 임상 적으로 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 종류의 세포에 광범위하게 적용 할 수 있지만, 우리는 인해 환자에서 추출의 용이성과 개인화 된 인간의 치료제에의 적용에 인간 피부 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하기로 결정했습니다. 제한이 임상 적으로 관련된 세포 유도체로 전체 분화로까지 해결할되면 GMP 수준의 조건으로 제시된 변환이 다른 다양한 종류의 세포에 더 많은 관련이 될 것이다, 걱정 (14)이다.
본 연구의 첫 번째 부분은 STEMCCA의 렌티 바이러스와 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그램이 포함됩니다. 이 기술은 인해 재현성, 상대적으로 높은 재 프로그래밍 효율 (0.02 %), 그리고 사람을 통해 재 프로그램하는 강력한 능력을 상당 부분에 선정되었다y를 다른 세포 유형 (10). 이 기술은 하부 리 프로그래밍 효율과 재현성 10 고통 등 센다이 바이러스, 에피 좀 플라스미드와 mRNA를 합성 기반 재 프로그래밍과 같은 다른 리 프로그래밍 방법론 우수하다. 증가 된 유전자 활성 핫스팟 (15)에 통합 HIV 기반 벡터 사이의 상관 관계가 있지만, 그들은 유전자 인트론의 안전한 영역으로 훨씬 적은, 유전자에 통합 않는다고 보장 할 수는 없습니다. 따라서이 장애물이 접근 방식에 주목할만한 제한을 나타냅니다. 또한, 안전한 게놈 위치에 이러한 통합 사이트 기본 설정은 게놈 전반에 걸쳐보다 통합 감소한다. 따라서, 적절한 렌티 바이러스의 프로 바이러스 통합 부위와 통합 번호 등이 적절히 nrLAM-PCR 기술과 같은 기술에 의해 구분 심문하는 것이 필수적이다. 미래의 재 프로그래밍 활용 아연 핑거 뉴 클레아 기술, TALEN, 또는 CRISPR / Cas9 기반 유전자는 homologou를 통해 (대상의 재결합은) 더 (16)를 재 프로그래밍에 대한 특정 유전자좌에이 분야를 안내 할 수 있습니다.
인간의 섬유 아세포가 제대로 재 프로그래밍하고 식민지가 파생되고 나면,이 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 후 절제 hiPSCs의 선택을위한 아데노 Cre 호텔 - PuroR 식이다. 그것은 모든 아데노 바이러스가 세포 복제를 통해 희석 된 산발적으로 게놈 내로 통합되지 않았는지 확인하기 위해, 세포 배양의 몇 주 후에 푸로 마이신에 콜로니를 재 노광 고려하는 것이 중요하다. 아데노 바이러스의 게놈에 부적절한 통합 맞춤형 세포 치료제에 대한 안전성 문제를 나타내는 것입니다.
GMP 수준의 조건으로 변환 이러한 요인이없는 hiPSCs에 임상 적용 가능성을 소개하는 중요한 단계이다. 이는 이종이없는 조건을 통해 이러한 셀들을 변환 할 때 한 번에 하나의 조건을 변경하는 것이 중요하다; 이종의 세포로 변환함으로써 시작느린 변환 방법을 통해 언론의 자유. hiPSCs는 미디어 변화와 동시에 기판 상 변화를 용인 할 수 없다. 세포는 새로운 미디어 환경에서 정상적인 형태로 규칙적으로 계대되면, 이종 기판 상에없는 전환을 시작한다. 특정 세포 유형 권장 기판에 이상 전송하는 데 문제가있는 경우, 시장에 다른 이종 무료 기판을하려고 고려하는 것이 가능하다.
결론적으로, GMP 수준의 변환과 함께이 프로그램을 다시 만들 기술의 강력하고 폭 넓은 적용이 용이 재현성을 허용해야하고 인간의 치료제에 대한 미래 hiPSC 기반의 파생 세포 배양을위한 기초 역할을합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
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