Abstract
Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) se pueden generar con las metodologías de reprogramación a base de lentivirus. Sin embargo, los rastros de genes potencialmente oncogénicos restantes en regiones activamente transcrito del genoma, limitan su potencial para su uso en aplicaciones terapéuticas humanas 1. Además, los antígenos no humanos derivados de la reprogramación de células madre o la diferenciación en derivados terapéuticamente relevantes se oponen a estas hiPSCs se utilicen en un contexto clínico humano 2. En este vídeo, se presenta un procedimiento para la reprogramación y analizar hiPSCs factoriales libre libres de transgenes exógenos. Estos hiPSCs se pueden analizar para detectar anomalías de expresión génica en el intrón específico que contiene el lentivirus. Este análisis puede llevarse a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa sensible (PCR), que tiene una ventaja sobre técnicas menos sensibles utilizado anteriormente para detectar diferencias de expresión génica 3. La conversión total enbuenas prácticas de fabricación de grado clínico (GMP), permite relevancia clínica humana. Nuestro protocolo ofrece otra metodología, siempre que los criterios actuales de salvaguarda ampliarán e incluir los derivados basados en hiPSC caracterizados factoriales libre para aplicaciones fines terapéuticos humanos derivadas hiPSCs GMP-grado, que debe eliminar cualquier riesgo inmunogenicidad debido a antígenos no humanos. Este protocolo es ampliamente aplicable a lentiviral reprogramado células de cualquier tipo y proporciona un método reproducible para la conversión de células reprogramadas en condiciones GMP grado.
Protocol
NOTA: Este método se utilizó en la investigación publicada en Awe et al 10..
1. Reprogramación Humana Adulto fibroblastos dérmicos con STEMCCA
- Fibroblastos dérmicos Descongele adultos humanos (HUFS), paso 4 o inferior, en un 37 ° C baño de agua durante 2 minutos, teniendo cuidado de no sumergir la parte superior del vial con agua.
- Coloque la suspensión 1 ml de fibroblastos humanos en un vial cónico de 15 ml y colocar lentamente 4 ml de medios estándar HUF, pre-calentado a 37 ° C, de una forma gota a gota, para diluir a cabo sulfóxido de dimetilo (DMSO) y volver a suspender las células.
- Centrifugar el vial a 200 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en un volumen adecuado de los medios de comunicación para crear una suspensión de 100 000 células / ml y a continuación, añadir 2 ml en un pocillo de una placa de seis pocillos, pre-recubierto durante 20 minutos con 0,2% de gelatina.
NOTA: Una hermana bien con un número igual de células por línea y el estado necesita ser sembrado for el recuento de células / multiplicidad de infección (MOI) de cálculo. - Rock the lado de la placa a lado y lado a otro para distribuir uniformemente las células. Incubar durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.
- En el día de la transducción, obtener el recuento de células (s) de la hermana así (s) de aproximadamente 24 hr después de la siembra inicial HUF.
- Descongelar 2 x 10 8 TU, o, concentrado lentiviral equivalente (STEMCCA) y diluir a 1 x 10 8 TU / ml en medio HUF.
- Transducir células en una proporción 10-MOI en medios HUF suplementado con agente de transfección 8 mg / ml. Mezclar pozos transducidas de manera uniforme y se incuba durante la noche a 37 ° C, 5% de CO2 en un incubador humidificado.
- Aproximadamente 24 horas después de la transducción lentiviral, cambiar los medios de comunicación HUF a células madre pluripotentes humanas (PSC) medio estándar.
- En los días 2 al 6, cambiar los medios de comunicación todos los días con medio PSC humano.
- El día 6, la placa dos 0,2% recubierto de gelatina placas de 10 cm de1,5 a 1,75 x 10 6 MEFs derivados de ratones CF1 en HUF medios 12.
- El día 7, con cuidado de no centrifugar más de 100 xg, uso tripsina temperatura ambiente para levantar los días 7 fibroblastos reprogramados de un pocillo de la placa de seis pocillos y el paso a una relación 01:16, en placas de todas las células de manera uniforme entre dos placas de 10 cm, con los medios de comunicación PSC humana fresca, que se sembraron con MEFs el día anterior. Distribuir los agregados de células en un movimiento en espiral hacia la derecha y colocar en un 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado incubadora durante la noche.
- Aproximadamente 48 horas después de la siembra de las células reprogramadas en MEFs y todos los días a partir de entonces, cambie a cabo gastados medios PSC humanos por medio fresco.
- Después de 3 a 4 semanas, recoger las colonias individuales con la típica morfología ESC como con una aguja de calibre 21 y subclonar a cabo en una placa de 24 pocillos mediante la colocación de aproximadamente 8 a 10 piezas individuales de colonias específicas en pocillos individuales en un 0,2% de gelatina recubierta placa de 24 pocillos pre-semillaed con MEFs derivados de ratones CF1 en medio PSC humano.
NOTA: Después de la expansión de las colonias escogidas, las colonias tienen que caracterizarse como pluripotentes de una formación corporal embrioide y análisis de la expresión de marcadores de pluripotencia a nivel de proteínas.
2. Integración de análisis vectorial de Sitio y STEMCCA Excision
- Analizar el sitio de integración STEMCCA por amplificación lineal no restrictiva PCR como se ha descrito 10.
- Después de someter a ensayo para garantizar una integración en un área deseada del genoma, STEMCCA especial mediante la aspiración del viejo medio ESC humana. Entonces, se combinan 45 l de virus adeno-Cre-PuroR concentrado con 8 g agente de transfección / ml en 3 ml de medio PSC estándar durante 24 h.
- Después del período de incubación de 24 horas, aspirar el sobrenadante viral mixta y se lavan las células dos veces con los medios de comunicación del PSC humanos. Coloque frescas medios PSC humanos junto con 2 mg / ml de puromicina por un período de 5 días, cambiando el ingenio diaria mediosh medios de comunicación y los antibióticos frescas.
- Después de 5 días, subclón colonias con una aguja de calibre 21 restante sobre 0,2% pozos recubiertos de gelatina, en una placa de 12 pocillos pre-recubierto con MEFs derivados de CF1mice y ampliar como se detalló anteriormente.
NOTA: Después de una expansión suficiente para obtener una solución madre congelada, se requiere conversión en condiciones libres de alimentador. Espere al menos el 95% de muerte de colonias de células madre como la mayoría de las células no se transducidas con éxito y sucumbirán a los antibióticos durante el período de 5 días de incubación. Aunque adeno-Cre-PuroR integra con una eficiencia de 0,001 a 1% en los cromosomas de acogida de las células infectadas, reexposing una muestra de las colonias factor libre de puromycin para asegurar la muerte celular 100% confirmará ninguna integración se ha producido 13. - Descongelar un vial de matriz de membrana basal pre-alícuota en hielo, durante un período de aproximadamente 2 hr (recomendaciones del fabricante) hasta que la matriz es un líquido y se diluye a una concentración final de 1:30 de medios basales frío. Coen el número deseado de pozos en una placa de seis pocillos con 1 ml por pocillo. Deje reposar a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Cross-Hatch (usando una aguja de calibre 18, o una "punta" de vidrio o de plástico) al menos 20 a 30 colonias de un pozo previamente recubierto con MEFs. Tenga cuidado para reducir MEF edificante y traslado del plato.
- Generar el dispositivo de sombreado cruzado a través de una serie de enfoques diferentes, desde el calentamiento más complicado, tirando, y acabado de una pipeta Pasteur de vidrio sobre una llama abierta, al simple uso de una punta de pipeta de plástico estéril o, como en nuestro caso, 21- y / o calibre 18 agujas.
- Aspirar la matriz desde el pocillo recubierto después de la incubación.
- Retire piezas de las colonias por raspado suave de la placa de edad con una pipeta de 200 l y se coloca cuidadosamente en 3 ml de los medios de comunicación combinados frescas 1 en la placa de matriz recubiertos. Incubar toda la noche en un 37 ° C, 5% de CO 2 humidificado incubadora. Cambiar medios 48 horas después de los pases.
- Extraer el ADN genómico de hiPSCs convertidos post extirpado y libres de alimentador, en más del 80% de confluencia, usando kits de extracción de ADN comercial.
- Analizar por escisión adecuada con primers específicos para las integraciones exógenas del lentivirus STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-inverso, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Reconstituir iniciadores liofilizados con agua de calidad para PCR a una solución madre 10-M.
- Ejecutar una PCR con el siguiente protocolo de cinco pasos: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de cada uno de los siguientes: desnaturalización a 98 ° C durante 20 segundos, hibridación del cebador a 62 ° C durante 15 seg, y extensión a 72 ° C durante 15 s; seguido de un único ciclo de extensión final a 72 ° C durante 3 min.
- Hacer un gel de agarosa al 3% pesando 1,5 gramos de agarosa y colocándolo en tampón 1x 50 ml de Tris-acetato-EDTA. Horno de microondas hasta agarosa se disuelve y el lugar en la mancha de gel de ADN en pdilución Roper, mezclar y dispensar un volumen apropiado en casete de gel para solidificar durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Cargar 12 l de producto de PCR se mezcla con 3 l de colorante de carga en un gel de agarosa al 3%. Ejecutar el gel durante 30 minutos a 80 V.
- Visualizar con luz ultravioleta para la ausencia de una banda que indica la escisión adecuada.
3. La cuantificación de la expresión génica diferencias mediante el uso de PCR cuantitativa de pre y post hiPSCs extirpados-
- Extraer el ARN total de hiPSCs convertidos post extirpado y libres de alimentador usando kits de extracción de ARN comerciales.
- Reverse-transcribir hasta 1 g de ARN total mediante el uso de kits comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use-oligo anclado (dT) 18 y cebadores hexámeros aleatorios.
NOTA: Asegúrese de que el protocolo de PCR se adapta para la transcripción de genes de más o menos de 4 kb. Tendrá que ser hecho para que sea i gen STEMCCA integrado originalmente primers específicosnto. - Reconstituir la imprimación liofilizado con agua de calidad para PCR a una solución de 20 mM.
- Utilice 5 ng de muestra por cada 20 l de reacción que consta de sonda UPL 10 M, 2x LightCycler 480 Sondas Maestro, y 20 mM adelante y atrás primers.
4. La conversión en condiciones GMP grado
- En el primer día de la transición de los hiPSCs post extirpado a condiciones GMP grado, hacer una mezcla de medios de comunicación que consiste en PSC humano combinado de medios de comunicación (1 medios combinado 1) y grado clínico buenas prácticas de fabricación (GMP) de medios de comunicación que pueden utilizarse (medios combinados 2 ) en una relación de 80:20.
- Aspirar los viejos medios combinados 1 y colocar 3 ml de los nuevos medios de comunicación combinados 1 y 2, previamente calentado, en la relación de 80:20. Cambie los medios día durante 3 días con esta relación específica. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2.
- En el día 4, hacer que los medios de comunicación combinado 1 y 2 en una proporción de 50:50. Aspirar la edad media y Replace con los medios de pre-calentado, con los medios de comunicación combinados 1 y 2 en la relación de 50:50. Cambie los medios durante 3 días con esta relación específica. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2.
- El día 7, hacer los medios de comunicación combinada 1 y 2 en una proporción 20:80. Aspirar el medio viejo y reemplazarlo con los medios de comunicación pre-calentado, con los medios de comunicación combinados 1 y 2 en la proporción 20:80. Cambie los medios durante 3 días con esta relación específica. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2.
- El día 10, hacer los medios de comunicación combinados 1 y 2 a una 0: relación de 100. Aspirar el medio viejo y reemplazarlo con los medios de comunicación pre-calentado, con los medios de comunicación combinados 1 y 2 en el 0: relación de 100. Cambie los medios todos los días a esta relación específica. Las células se encuentran ahora en los medios de comunicación-xeno libre completamente definido. Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2.
NOTA: Durante este proceso de conversión, se necesita pases de rutina con una aguja de calibre 18 para mantener tamaño de la colonia y la densidad apropiados. Plan en la passaging células cada 4 a 5 días sobre la base de tamaño de las colonias, la confluencia, y la diferenciación. - Escudo un pocillo de una placa de seis pocillos con un sustrato-xeno libre definido según lo recomendado por el fabricante.
- Pasaje Mecánicamente un confluente bien, ya convertida en Xeno-libre condiciones de comunicación, a partir de una placa de seis pocillos con una aguja de calibre 18. Es importante destacar que colocar nuevos medios de comunicación (medios combinados 2) en las células con inhibidores ROCA 1x durante 1 hora, antes de que pases a pre-condición los medios de comunicación.
- Aspirar la solución de sustrato sintético de la nueva placa que las células están siendo transferidos a. Quite todos los medios que contienen los grupos de células madre de la placa vieja y la transferencia a la nueva placa.
- Coloque las células de nuevo en un 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 días con perturbación física mínima (idealmente placas, una vez dentro de la incubadora, no se tocan directamente en modo alguno) para permitir la unión máxima.
NOTA: Las células requerirán cambios de medio día. Passagin Continuag cada 4 días serán importantes. Usando una aguja de calibre 21, de paso sólo las partes de colonias con morfología ESC-como óptima (alto cociente nucleocytoplasmic). Esto asegurará la selección de colonias hiPSC adecuadas que crecerán bien y eventualmente producir colonias homogéneos. El tiempo total de derivación de ESC como colonias es entre 15 a 20 días después del cambio inicial medios combinado. - Congele por las hiPSCs posteriores a extirpado GMP grado por primera trama cruzada todas las colonias utilizando una aguja de calibre 18. Levantar todas las piezas fuera mediante el uso de una pipeta de 200 l y transferir todos los medios que contienen las células a un vial de 15 ml cónico y centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Mientras que las células están centrifugación, hacer una congelación medios de comunicación que consiste en volúmenes iguales de medios combinados fríos 2 y medio de congelación con una concentración final de DMSO del 7,5%.
- Después las células se sedimentan, aspirar fuera el medio viejo y gota a gota vuelva a suspender el sedimento con el medio de congelación. Inmediatamente transfer a viales de congelación y poner en un congelador a -80ºC.
5. hiPSCs Caracterización GMP grado Publicar extirpados-
- Para asegurar la adecuada expresión de los marcadores de pluripotencia después de la conversión, utilice QPCR para cuantificar la expresión de marcadores de pluripotencia clave (SOX2, OCT4, y NANOG) usando los cebadores listados en la Tabla 1 con los mismos pasos como se ha mencionado en el paso 3. metodologías QPCR seguir el mismos pasos que se indican en el paso 3.
- El uso de citometría de flujo para detectar el ácido siálico no humano Neu5Gc (ácido -glycolylneuraminic N) de acuerdo con las condiciones generales que se indican en el kit según lo publicado previamente 10.
- Lave suavemente las placas de cultivo celular con células mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato de 1x (PBS).
- Disociar colonias mediante el uso de reactivo de disociación 1x durante 5 min a temperatura ambiente.
- Durante la 5-min tiempo de incubación de la etapa 5.4, preparar la solución de bloqueo (proporcionado enkit) haciendo un 0,5% Agente bloqueador en PBS enfriado con hielo.
- Rotula el siguiente conjunto de tubos para citometría de flujo: no teñida; 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) DAPI; El anticuerpo de control 1: 200; Primaria de anticuerpos de 1: 200; Anticuerpo secundario 1: 200 de IgG anti-pollo de burro (H + L); MEFs muestra; Células post extirpado muestra en matriz; y la Muestra células en sustrato sintético puesto extirpada.
- Agitando suavemente los agregados de células de la etapa 5.4 mediante la adición de 2 ml de solución de bloqueo y de transferencia de contenido a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 80 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Lavar las células dos veces con solución de bloqueo y se centrifuga como se ha indicado en el paso 5.7.
- Suavemente volver a suspender aproximadamente 1 x 10 6 células en 100 l de solución de bloqueo con el volumen de dilución correspondiente de cada anticuerpo. Incubar con suave balanceo a 4 ° C durante 1 hora.
- Repita lavados tres veces como en el paso 5.8.
- Vuelva a suspender el sedimento celular en 400 l de diluyente de Buffer (del kit) con 1: 100 de DAPI para tubos de 2, 6, 7, y 8 como se indica en el paso 5.6.
- Células de la cepa a través de un colador de 40 micras y se ejecutan a través de citómetro de flujo.
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Representative Results
Se presenta un protocolo para derivar hiPSCs factor libre de grado clínico utilizando el enfoque basado reprogramación lentiviral-STEMCCA. La figura 1A muestra una imagen representativa de tres diferentes líneas hiPSC previamente extirpada, después de la reprogramación con el enfoque STEMCCA sobre una capa de MEFs. La principal ventaja del enfoque de reprogramación STEMCCA radica en el éxito reprogramación consistente alcanzado por múltiples científicos, en diferentes grupos y las ubicaciones de investigación. Figura 1B presenta el reverso post-escisión gel PCR de transcripción, que muestra un subclón en particular (2,3) que es completamente libre de del lentivirus STEMCCA, como lo demuestra la falta de una banda de amplificación específica para una determinada secuencia endógena para STEMCCA. Figura 2A muestra los hiPSCs previamente convertida en un xeno matriz que contiene y hiPSCs GMP-grado-xeno libre extirpadas post sobre matriz sintética . La cuantificación de los factores de pluripotencia asociada estándar (SOX2, OCT4, y NANOG) mediante QPCR se ilustra en la Figura 2B. HiPSCs pre-y post-convertidos convertido a condiciones GMP grado fueron probados a través de citometría de flujo para el ácido siálico de ácido N-glicolilneuramínico, indicativo de antígenos no humanos, como se muestra en la Figura 2C.
Figura 1: Casete de células madre pluripotentes humanas (hSTEMCCA) de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) líneas -derivado representativos. (A) Las tres líneas derivadas se analizaron con la tecnología nrLAM-PCR y se encuentra sólo la línea C8 presentado a tener una integración en el gen PRPF39. Sólo esta línea, debido a la integración segura STEMCCA intrónico, fue seleccionado para someterse a la selección adeno-Cre-PuroR para la escisión mediada por Cre. (B) adeno-Cre mediada STEMCCA escisión de la línea C8. Primers contra secuencias de nucleótidos únicos que se encuentran en STEMCCA-endo-Myc-s y A-WPRE- encontraron que sólo un subclón (2,3 post-extirpado iPS) fueron extirpados correctamente y libres de factores de transcripción transgénicos desde el provirus integrado. Bares = 100 micras. Esta cifra ha sido modificado desde Awe et al. 10.
Figura 2: Conversión de hiPSCs de las condiciones clínicas-xeno libre GMP grado y caracterización contiene xeno-. (A) Línea hiPSC Representante que se ha convertido a partir de (matriz de grado de investigación) que contiene xeno-a Xeno-libre (sustrato sintético) las condiciones bajo las buenas prácticas de fabricación actuales (BPF) condiciones. (B) de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para analizar la pluripotencia adecuada expresión de genes asociados post-conversión en condiciones de calidad GMP. (C) En Addition a las pruebas estándar de esterilidad para asegurar la compatibilidad GMP, un flujo de pruebas ensayo basado en citometría-para el antígeno no humano, ácido -glycolylneuraminic N, se utiliza para mostrar que hiPSCs post convertido eliminan toda la detección de ácido siálico (1% con post- células extirpadas en matriz comparado con el 0% con células post extirpado en un sustrato sintético). Fibroblastos embrionarios de ratón y una línea hiPSC derivados bajo condiciones GMP sirvió como controles positivos y negativos, respectivamente, en este experimento. Bares = 100 micras. células madre, las células madre de embriones humanos; PESS, post-extirpó sustrato sintético; PEM, matriz-post extirpado. Esta cifra ha sido modificado desde Awe et al. 10.
| Nombre de gen | Cebador 5 '3' | Cebador inverso 5'-3 ' | Sonda # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabla 1: Cebadores utilizados para el análisis de PCR cuantitativa.
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Discussion
Se describe una metodología de derivar hiPSCs factor libre y hacerlos clínicamente relevante mediante la conversión de estas células en condiciones GMP grado de diferenciación celular aguas abajo en futuras terapias humanas. Aunque este protocolo es ampliamente aplicable a una variedad de tipos de células, que elegimos para reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, debido a la facilidad de extracción de la paciente y su aplicabilidad a la terapéutica humana personalizados. Una vez que se subsanen las limitaciones en cuanto a la diferenciación completa en derivados de células clínicamente relevantes en cuestión es 14, la conversión presentado en condiciones GMP grado será aún más relevante para una variedad de diferentes tipos de células.
La primera parte de este estudio implica la reprogramación de fibroblastos humanos con el lentivirus STEMCCA. Esta técnica fue elegido en gran parte debido a su reproducibilidad, eficiencia relativamente alta reprogramación (0,02%), y la capacidad robusta para reprogramar a través de hombreY diferentes tipos de células 10. Esta técnica es superior a otras metodologías de reprogramación tales como el virus Sendai, los plásmidos episomales, y la reprogramación basado mRNA sintético que sufren de eficiencia de reprogramación inferiores y reproducibilidad 10. Aunque existe una correlación entre los vectores basados en VIH de integración en el aumento de actividad de los genes hotspots 15, no hay garantía de que van a integrarse en un gen, y mucho menos en un área más segura de un gen, el intrón. Por lo tanto este obstáculo representa una limitación notable de este enfoque. Además, esta integración sitio de preferencia en una localización genómica más seguro disminuye con más integraciones en todo el genoma. Por lo tanto, es imperativo que los provirus lentiviral adecuada del sitio de integración y el número de integración ser interrogados correctamente mediante técnicas sensibles, tales como la tecnología de nrLAM-PCR. Reprogramación futura tecnología nucleasa dedo utilizando zinc, / génica basada en Cas9 TALEN o CRISPR focalización (vía homologous recombinación) puede orientar mejor este campo en loci específicos para la reprogramación de 16.
Una vez que los fibroblastos humanos estén correctamente reprogramadas y las colonias se han derivado, otro aspecto crítico de este protocolo es la expresión adeno-Cre-PuroR para la selección de hiPSCs post extirpado. Es importante considerar re-exposición de las colonias a puromicina después de unas pocas semanas de cultivo celular, con el fin de asegurar que todo el adenovirus se ha diluido a través de la replicación celular y no se ha integrado de forma esporádica en el genoma. La integración inadecuada en el genoma del adenovirus representaría una preocupación de seguridad para la terapia celular personalizados.
Conversión en condiciones GMP grado es un paso importante en la introducción de aplicabilidad clínica de estos hiPSCs factoriales libre. Es importante cambiar sólo una condición en un momento en la conversión de estas células a condiciones-xeno libre; iniciar mediante la conversión de las células en xenomedios de comunicación libres a través de la metodología de conversión lenta. Los hiPSCs no pueden tolerar un cambio de medio y un cambio de sustrato al mismo tiempo. Una vez que las células se passaging regularmente con morfología normal en las nuevas condiciones de los medios, iniciar la transición sobre el sustrato-xeno libre. Si los tipos de células específicas están teniendo problemas para transferir más sobre el sustrato recomendado, es factible considerar el intentar otros sustratos-xeno libre en el mercado.
En conclusión, la aplicabilidad robusto y amplio de esta técnica de reprogramación junto con la conversión GMP grado debe permitir un fácil reproducibilidad y sirve como base para el cultivo celular derivado basado en hiPSC futuro de la terapéutica humana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
