Abstract
Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) kan worden gegenereerd met lentivirale gebaseerd herprogrammering methodieken. Echter, sporen van potentieel oncogene genen resterende actief getranscribeerde gebieden van het genoom, beperken hun potentieel voor toepassing in humane therapeutische toepassingen 1. Bovendien, niet-menselijke antigenen afgeleid van stamcellen herprogrammering of differentiatie in therapeutisch relevante derivaten belet deze hiPSCs wordt gebruikt in een klinische context 2. In deze video, presenteren we een procedure voor het herprogrammeren en analyseren-factor vrij hiPSCs vrij van exogene transgenen. Deze hiPSCs kunnen vervolgens worden geanalyseerd op genexpressie afwijkingen in de specifieke intron bevat het lentivirus. Deze analyse kan worden uitgevoerd met gevoelige kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR), die voordeel minder gevoelige technieken vroeger gebruikt om genexpressie 3 verschillen te detecteren is. Volledige omzetting inklinisch-grade goede fabricagemethoden (GMP) voorwaarden, laat de menselijke klinische relevantie. Ons protocol biedt een andere methode op voorwaarde dat de huidige veilige haven criteria zullen uitbreiden en onder-factor vrij gekarakteriseerde iPSC-gebaseerde derivaten voor menselijke therapeutische toepassingen-voor het afleiden van GMP-grade hiPSCs, die elke immunogeniciteit risico moet elimineren als gevolg van niet-menselijke antigenen. Dit protocol is breed toepasbaar lentivirale geherprogrammeerd cellen van elk type en verschaft een reproduceerbare werkwijze voor het omzetten geherprogrammeerd cellen in GMP-grade omstandigheden.
Protocol
LET OP: Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Awe et al. 10.
1. herprogrammeren volwassen menselijke dermale fibroblasten met STEMCCA
- Ontdooi volwassen dermale humane fibroblasten (HUFs), doorgang 4 of lager, in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min, verzorgen de bovenkant van de flacon met water te dompelen.
- Plaats de 1 ml suspensie van humane fibroblasten in een 15 ml conische flacon en langzaam 4 ml standaard HUF media, voorverwarmd tot 37 ° C, in een druppelsgewijze manier, verdund uit dimethylsulfoxide (DMSO) en opnieuw te schorten cellen.
- Centrifugeer het buisje bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in een voldoende hoeveelheid media aan een suspensie van 100.000 cellen / ml te maken en voeg vervolgens 2 ml in een putje van zes-well plaat, pre-coating gedurende 20 min met 0,2% gelatine.
OPMERKING: Een zuster goed met een gelijk aantal cellen per lijn en conditie moet worden gezaaid for de cel tellen / multipliciteit van infectie (MOI) berekening. - Rock de plaat van links naar rechts en weer terug en weer naar de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
- Op de dag van transductie, verkrijgen celgetal (s) van de zus goed (s) ongeveer 24 uur na de eerste HUF plating.
- Ontdooien 2 x 10 8 TU, of gelijkwaardig, lentivirale concentraat (STEMCCA) en vul aan tot 1 x 10 8 TU / ml in HUF media.
- Transduceren cellen bij 10 MOI verhouding HUF medium aangevuld met 8 ug / ml transfectie agens. Meng getransduceerde putjes gelijkmatig en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
- Ongeveer 24 uur na lentivirale transductie, schakelt de HUF media om standaard menselijke pluripotente stamcellen (PSC) medium.
- Op dag 2 tot en met 6, veranderen media dagelijks met menselijke PSC medium.
- Op dag 6, plaat twee 0,2% gelatine beklede 10-cm platen van1,5-1,75 x 10 6 MEFs ontleend CF1 muizen HUF media 12.
- Op dag 7, dat evenwel niet tot meer dan 100 xg, gebruik kamertemperatuur trypsine centrifuge op te heffen van de dag 7 geherprogrammeerd fibroblasten van de ene put van de zes-well plaat en doorgang aan een 01:16 verhouding, door platen alle cellen gelijkmatig tussen twee platen van 10 cm, met verse menselijke PSC media, die zijn bedekt met MEF de dag ervoor. Verdeel celaggregaten in wijzerzin spiraalvormige beweging en plaats in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator 's nachts.
- Ongeveer 48 uur na het zaaien de geherprogrammeerd cellen op MEF en elke dag daarna, uit verandering bracht menselijk PSC media met verse media.
- Na 3 tot 4 weken, pick individuele kolonies met typische ESC morfologie met een 21-gauge naald en subkloneren uit in een 24-well plaat door het plaatsen van ongeveer 8 tot 10 individuele stukken van specifieke koloniën in afzonderlijke putjes in een 0,2% gelatine beklede 24-wells plaat pre-seeded met MEF ontleend CF1 muizen menselijke PSC medium.
OPMERKING: Na expansie van geplukt kolonies, de kolonies moeten worden gekarakteriseerd als pluripotente bij embryoiden-vorming en expressie analyse van pluripotentie markers op eiwitniveau.
2. Vector Integratie Site Analyse en STEMCCA Excisie
- Analyseer de STEMCCA intergratieplaats door niet-restrictieve lineaire amplificatie PCR zoals beschreven 10.
- Na het testen van een integratie te waarborgen in een gewenst gebied van het genoom, accijnzen STEMCCA door opzuigen uit de oude menselijke ESC medium. Vervolgens combineer 45 pi geconcentreerd Adeno-Cre-PuroR virus met 8 ug / ml transfectie agens in 3 ml standaard PSC media gedurende 24 uur.
- Nadat de 24-uur incubatietijd, zuigen uit de gemengde virale supernatant en was de cellen tweemaal met menselijke PSC media. Plaats verse humane PSC medium met 2 ug / ml puromycine gedurende 5 dagen, veranderen de media dagelijks with verse media en antibioticum.
- Na 5 dagen subkloon overblijvende kolonies met een 21-gauge naald op 0,2% gelatine beklede putjes in een 12-well platen vooraf bekleed met MEFs ontleend CF1mice en vergroten zoals hierboven beschreven.
OPMERKING: Na voldoende uitbreiding naar een bevroren voorraad te verkrijgen, wordt de omzetting in-feeder-vrije omstandigheden vereist. Verwacht ten minste 95% stamcellen kolonie dood meeste cellen niet met succes wordt getransduceerd en bezwijkt antibiotica gedurende de periode van 5 dagen incubatie. Hoewel adeno-Cre-PuroR integreert op een ,001-1% rendement in gastheerchromosomen van geïnfecteerde cellen, reexposing een steekproef van-factor vrije kolonies te puromycine om ervoor te zorgen 100% celdood zal bevestigen geen integratie heeft plaatsgevonden 13. - Ontdooien één flacon vooraf in porties basaalmembraan matrix op ijs, gedurende een periode van ongeveer 2 uur (aanbevelingen van de fabrikant) tot de matrix is een vloeistof en verdunnen naar een uiteindelijke concentratie van 1:30 in koude basale media. Coop gewenste aantal putten in een zes-well plaat met 1 ml per putje. Laat op kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Cross-hatch (met behulp van een 18-gauge naald, of een glas of plastic "tip") ten minste 20 tot 30 kolonies van een goed voorheen bekleed met MEF. Wees voorzichtig om te verminderen MEF opbeurend en overbrengen van de plaat.
- Genereer de arcering inrichting via een aantal verschillende benaderingen van de meer gecompliceerde verwarming, trekken en het polijsten van een glazen Pasteur pipet op een open vlam, het eenvoudige gebruik van een steriele plastic pipet tip of, zoals in ons geval, 21- en / of 18-gauge naalden.
- Zuig de matrix van de beklede put na incubatie.
- Verwijder stukken van de kolonies door voorzichtig schrapen van de oude plaat met een 200 ul pipet en zorgvuldig geplaatst in 3 ml vers gecombineerde medium 1 in de matrix beklede plaat. Incubeer overnacht op 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. Verandering media 48 uur na passage.
- Uittreksel genomisch DNA uit post-uitgesneden en voedingsvrije omgezette hiPSCs op meer dan 80% confluentie met commerciële DNA-extractie kits.
- Analyseren voor een goede excisie met primers specifiek voor exogene integraties van de STEMCCA lentivirus: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Reconstrueren gevriesdroogde primers met PCR-grade water om een 10-uM stockoplossing.
- Voer een PCR met de volgende vijf stappen protocol: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van elk van de volgende: denaturatie bij 98 ° C gedurende 20 seconden, primer annealing bij 62 ° C gedurende 15 sec en verlenging bij 72 ° C gedurende 15 seconden; gevolgd door één cyclus laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 3 min.
- Voeg een 3% agarosegel door weging uit 1,5 g agarose en te plaatsen in 50 ml 1x Tris-acetaat-EDTA-buffer. Magnetron totdat agarose is opgelost en plaats in het DNA gel vlek op ptouwslager verdunning, mengen, en afzien juiste volume in gelcassette te stollen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Belasting 12 pi PCR product gemengd met 3 pl geladen kleurstof in een 3% agarose gel. Laat de gel gedurende 30 minuten bij 80 V.
- Visualiseren met ultraviolet licht voor het ontbreken van een band aangeeft juiste excisie.
3. Kwantificering van Gene Expression Verschillen met behulp van kwantitatieve PCR uit pre- en post-weggesneden hiPSCs
- Uittreksel totaal RNA van post-uitgesneden en voedingsvrije geconverteerde hiPSCs met behulp van commerciële RNA-extractie kits.
- Omgekeerde transcriptie tot 1 ug totaal RNA met gebruik van commerciële kits volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik verankerd-oligo (dT) 18 en random hexameer primers.
OPMERKING: Zorg dat de PCR-protocol is op maat gemaakt voor gentranscripten van meer dan of minder dan 4 kb. Specifieke primers moeten worden gemaakt welke genen STEMCCA oorspronkelijk geïntegreerd into. - Reconstrueren de gevriesdroogde primer met PCR-grade water om een 20 uM stockoplossing.
- Gebruik 5 ng monster per 20 pi reactie die bestaat uit 10 uM UPL sonde, 2x LightCycler 480 Probes Meester, en 20 uM forward en reverse primers.
4. Omzetting in GMP-grade Voorwaarden
- Op de eerste dag van de overgang van de post-weggesneden hiPSCs over aan GMP-grade omstandigheden, maken een mix van media, bestaande uit de menselijke PSC gecombineerd media 1 (gecombineerd media 1) en de klinische kwaliteit goede fabricagemethoden (GMP) compatibele media (gecombineerde media 2 ) in een 80:20 verhouding.
- Zuig de oude gecombineerde media 1 en plaats 3 ml van de nieuwe gecombineerde media 1 en 2, voorverwarmd op de 80:20 verhouding. Verander media dagelijks gedurende 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Op dag 4, maken de gecombineerde media 1 en 2 met een 50:50 verhouding. Zuig de oude medium en replace met voorverwarmde media, de gecombineerde media 1 en 2 aan de 50:50 verhouding. Verander media voor 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Op dag 7, maken de gecombineerde media 1 en 2 met een 20:80 verhouding. Zuig de oude medium en vervang voorverwarmde media, met de gecombineerde media 1 en 2 aan de 20:80 verhouding. Verander media voor 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Op dag 10, maakt de gecombineerde media 1 en 2 met een 0 100 ratio. Zuig de oude medium en vervang voorverwarmde media, met de gecombineerde media 1 en 2 bij de 0: 100 verhouding. Wijzig de media elke dag op deze specifieke verhouding. De cellen zijn nu in totaal toegezegde xeno vrije media. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
OPMERKING: Tijdens dit hele conversie proces, wordt routinematige passage met een 18-gauge naald nodig om een goede kolonie grootte en dichtheid te behouden. Plan op het passaging cellen elke 4 tot 5 dagen op basis van koloniegrootte, confluentie en differentiatie. - Jas een goed in een zes-well plaat met een gedefinieerde-xeno gratis substraat, zoals aanbevolen door de fabrikant.
- Mechanisch passage een samenvloeiing goed, al omgezet naar xeno-vrije media voorwaarden, van een zes-well plaat met een 18-gauge naald. Belangrijker is, plaatst u de nieuwe media (gecombineerd media 2) op de cellen met 1x ROCK-remmer gedurende 1 uur, vóór passage van een pre-conditie de media.
- Zuig het synthetische substraat oplossing van de nieuwe plaat die de cellen worden overgebracht naar. Verwijder alle media die de stamcellen klonten uit de oude plaat en over te dragen aan nieuwe plaat.
- Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 2 dagen met minimale fysieke verstoringen (idealiter platen eenmaal binnen incubator, niet rechtstreeks geraakt aan uit) om maximale hechting mogelijk.
OPMERKING: Cellen zal dagelijks media veranderingen vereisen. Voortdurende passaging om de 4 dagen zal belangrijk zijn. Met behulp van een 21-gauge naald, passage alleen de delen van de kolonies met een optimale ESC-achtige morfologie (hoog nucleocytoplasmatische ratio). Dit zorgt voor een juiste keuze iPSC kolonies die goed groeien en uiteindelijk verkregen homogene kolonies. Totale tijd om afleiding van ESC-achtige kolonies is tussen de 15-20 dagen na de eerste gecombineerde media verandering. - Bevriezen door het GMP-grade achteraf weggesneden hiPSCs door eerste cross-hatch alle kolonies met behulp van een 18-gauge naald. Til alle stukken af met 200 ul pipet geheel overgaat medium dat de cellen een 15 ml conische flacon en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Terwijl de cellen centrifugeren, maak een koude medium bestaat uit gelijke volumina koude gecombineerde media 2 en invriesmedium met een uiteindelijke DMSO-concentratie van 7,5%.
- Na cellen worden afgedraaid, zuigen uit oude medium en drop-wijs opnieuw op te schorten de pellet met de bevriezing media. Onmiddellijk transfer te bevriezen flesjes en in een -80 ° C vriezer.
5. Kenmerkend GMP-grade Post-weggesneden hiPSCs
- Voor juiste expressie van de pluripotentie markers na de conversie te waarborgen, gebruik QPCR expressie van belangrijke pluripotentie markers (SOX2, OCT4 en NANOG) met de in tabel 1 vermeld met dezelfde stappen primers kwantificeren zoals in stap 3 QPCR methoden volgen Dezelfde stappen als vermeld in stap 3.
- Gebruik stromingscytometrie de niet-humane siaalzuur Neu5Gc (N -glycolylneuraminic zuur) volgens in de kit die als eerder gepubliceerd 10 standaard ziektebeelden.
- Voorzichtig wassen de celkweek platen met cellen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Distantiëren kolonies met 1x dissociatie reagens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Tijdens de 5 minuten incubatietijd van stap 5.4 Bereid de blockingbuffer (verstrektkit) door een 0,5% Blocking Agent in ijskoude PBS.
- Label de volgende set van buizen voor flowcytometrieanalyse: ongekleurd; 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) DAPI; Controle antilichaam 1: 200; Primair antilichaam 1: 200; Secundair antilichaam 1: 200 Donkey Anti-kip IgG (H + L); Monster MEF; Monster post-weggesneden cellen op matrix; en Sample post-weggesneden cellen op synthetische ondergrond.
- Voorzichtig los celaggregaten uit stap 5.4 door het toevoegen van 2 ml van het blokkeren oplossing en overdracht inhoud naar een 15-ml conische buis. Centrifugeer bij 80 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Was de cellen tweemaal met blokoplossing en gecentrifugeerd zoals in stap 5.7.
- Voorzichtig resuspendeer ongeveer 1 x 10 6 cellen in 100 pl blokkeeroplossing de overeenkomstige verdunningsvolume van elk antilichaam. Incubeer met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Herhaal wast driemaal in stap 5.8.
- Re-schorten de cel pellet in 400 ul van Verdunningsmiddel Buffer (van kit) met 1: 100 DAPI voor buizen 2, 6, 7, en 8 genoemd in stap 5.6.
- Stam cellen door een 40 uM zeef en lopen door doorstroomcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We presenteren een protocol voor het afleiden van klinisch-grade-factor vrij hiPSCs met behulp van de STEMCCA lentivirale-gebaseerde herprogrammering aanpak. Figuur 1A toont een representatief beeld van drie verschillende pre-weggesneden iPSC lijnen, na herprogrammering met de STEMCCA aanpak op een laag van MEF. Het belangrijkste voordeel van de STEMCCA herprogrammering aanpak ligt bij de consistente herprogrammering succes bereikt door meerdere wetenschappers, in verschillende onderzoeksgroepen en locaties. Figuur 1B presenteert de post-excisie reverse transcriptie-PCR-gel, die één bepaalde subkloon (2.3), die is volledig gratis van de STEMCCA lentivirus, zoals blijkt uit het ontbreken van een amplicon band specifiek voor een bepaalde sequentie endogeen is STEMCCA. Figuur 2A toont de vooraf omgezet hiPSCs op Xeno bevattende matrix en post-uitgesneden-xeno vrij GMP-grade hiPSCs on kunststofmatrix . Kwantificering van standaard-pluripotency geassocieerde factoren (SOX2, OCT4 en NANOG) met QPCR is geïllustreerd in figuur 2B. Pre-omgezette en na omgezet hiPSCs GMP kwaliteit condities werden getest door doorstroomcytometrie voor siaalzuur N-glycolylneuraminezuur, indicatie van niet-menselijke antigenen, zoals weergegeven in figuur 2C.
Figuur 1: Vertegenwoordiger van de menselijke pluripotente stamcellen cassette (hSTEMCCA) -afgeleide humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) lijnen. (A) Alle drie afgeleid lijnen werden geanalyseerd met nrLAM-PCR-technologie en alleen de gepresenteerde C8 lijn werd gevonden op een integratie in de PRPF39 gen hebben. Alleen deze lijn, vanwege de veilige intronic STEMCCA integratie, aangenomen Adeno-Cre-PuroR selectie voor Cre gemedieerde excisie ondergaan. (B) Adeno-Cre gemedieerde excisie STEMCCA uit de C8 lijn. Primers tegen unieke nucleotide sequenties gevonden in STEMCCA-endo-Myc-s en A-WPRE- gevonden dat slechts één subkloon (2.3 post-weggesneden iPSCs) correct werden uitgesneden en vrij van transgene transcriptiefactoren van het geïntegreerde provirus. Bars = 100 urn. Dit cijfer is gewijzigd van Awe et al. 10.
Figuur 2: Conversie van hiPSCs uit-xeno bevatten om klinische kwaliteit GMP-xeno-vrije omstandigheden en karakterisering. (A) Vertegenwoordiger iPSC lijn die is omgezet van xeno-bevattende (onderzoek leerjaar matrix) aan xeno-vrije (synthetische ondergrond) de voorwaarden waaronder de huidige goede fabricagemethoden (GMP) omstandigheden. (B) kwantitatieve polymerase kettingreactie om te testen op de juiste pluripotency geassocieerd genexpressie na de omzetting in GMP leerjaar voorwaarden. (C) In Addition de standaard steriliteitstesten GMP compatibiliteit, een flowcytometrie gebaseerde bepaling getest voor de niet-humane antigeen, N -glycolylneuraminic zuur, wordt aangetoond dat het gebruik na omgezet hiPSCs elimineren alle siaalzuur detectie (1% met post- uitgesneden cellen op matrix vergeleken met 0% met post-uitgesneden cellen op een synthetisch substraat). Muis embryonale fibroblasten en een iPSC lijn afgeleid onder GMP omstandigheden diende als positieve en negatieve controles, respectievelijk, in dit experiment. Bars = 100 urn. hESC, menselijke embryonale stamcellen; PESS, post-weggesneden synthetische substraat; PEM, post-weggesneden matrix. Dit cijfer is gewijzigd van Awe et al. 10.
| Gene Naam | Forward primer 5'-3 ' | Reverse Primer 5'-3 ' | Sonde # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabel 1: Primers gebruikt voor de kwantitatieve PCR-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een methodiek voor het afleiden-factor vrij hiPSCs en waardoor ze klinisch relevant door het omzetten van deze cellen in het GMP-grade voorwaarden voor downstream celdifferentiatie in de toekomst menselijke geneeswijze. Hoewel dit protocol is breed toepasbaar op een verscheidenheid van celtypen, kozen we humane dermale fibroblasten herprogrammeren, wegens het gemak van extractie van de patiënt en hun toepasbaarheid op maat menselijke therapeutica. Zodra beperkingen wat worden verholpen volledige differentiatie in klinisch relevante celderivaten betreft 14 de gepresenteerde omzetting in GMP-grade voorwaarden nog relevanter om een verscheidenheid van verschillende celtypen worden.
Het eerste deel van deze studie omvat het herprogrammeren van menselijke fibroblasten met de STEMCCA lentivirus. Deze techniek werd gekozen voor een groot deel te wijten aan de reproduceerbaarheid, relatief hoge herprogrammering efficiëntie (0,02%), en robuust vermogen om te herprogrammeren in heel de mensy verschillende celtypen 10. Deze techniek is superieur aan andere herprogrammering methodes zoals Sendai-virus, episomale plasmiden, synthetische mRNA gebaseerde herprogrammering die lijden lagere herprogrammering efficiëntie en reproduceerbaarheid 10. Hoewel er een correlatie tussen HIV-gebaseerde vectoren integreren in verhoogde genactiviteit hotspots 15, is er geen garantie dat deze in een veiliger gebied van een gen, het intron zal integreren in een gen, veel minder. Dus dit obstakel vormt een opmerkelijke beperking van deze aanpak. Bovendien, deze integratieplaats voorkeur in een veiligere genomische locatie af met meer integraties gehele genoom. Daarom is het noodzakelijk dat de juiste lentivirale provirus integratie plaats en integratie nummer goed uitgelezen worden met gevoelige technieken zoals nrLAM-PCR technologie. Toekomstige herprogrammeren gebruik zinkvinger nuclease technologie, TALEN, of CRISPR / Cas9-gebaseerde gen-targeting (via homologous recombinatie) kunnen verder begeleiden dit gebied in specifieke loci voor het herprogrammeren 16.
Zodra de humane fibroblasten behoren worden geprogrammeerd en kolonies afgeleid, een cruciaal aspect van dit protocol is de Adeno-Cre-PuroR uitdrukking voor selectie van na uitgesneden hiPSCs. Het is belangrijk om te zijner tijd opnieuw blootstellen van de koloniën puromycine na enkele weken van celkweek, om te waarborgen dat alle adenovirus is verdund uit door celdeling en niet sporadisch geïntegreerd in het genoom. Oneigenlijke integratie in het genoom van het adenovirus zou geen gevaar voor de gepersonaliseerde cellulaire therapieën vertegenwoordigen.
Omzetting in GMP-grade omstandigheden is een belangrijke stap bij de invoering van de klinische toepasbaarheid van deze factor vrij hiPSCs. Het is belangrijk om alleen één voorwaarde tegelijk veranderen wanneer via omzetting van deze cellen naar xeno-vrije omstandigheden; start door omzetting van de cellen in xeno-vrije media door de trage omzetting methodologie. De hiPSCs kan wisselen van media en een substraat verandering tegelijkertijd niet tolereren. Zodra de cellen regelmatig passage normale morfologie in de nieuwe media omstandigheden begint de overgang op de xeno-vrij substraat. Als specifieke celtypen problemen hebben met het overdragen tot over de aanbevolen substraat, is het mogelijk om overwegen te proberen andere xeno gratis substraten op de markt.
Tot slot moet de robuuste en brede toepasbaarheid van deze herprogrammering techniek samen met de GMP-grade conversie eenvoudig reproduceerbaarheid mogelijk en dient als basis voor toekomstige iPSC-gebaseerde afgeleide celcultuur voor menselijke geneeswijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
