Abstract
Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) kan genereras med lentivirala baserad omprogrammering metoder. Men spår av potentiellt onkogena gener kvar i aktivt transkriberade regioner av genomet, begränsa deras potential för användning i humana terapeutiska tillämpningar 1. Dessutom kan icke-humana antigener härledda från stamceller omprogrammering eller differentiering till terapeutiskt relevanta derivat hindra dessa hiPSCs från att användas i ett humant kliniskt sammanhang 2. I den här videon, presenterar vi ett förfarande för omprogrammering och analysera faktorfria hiPSCs fria från exogena transgener. Dessa hiPSCs sedan kan analyseras för genuttryck avvikelser i specifika intron innehåller lentivirus. Denna analys kan utföras med hjälp av känsliga kvantitativ polymerase chain reaction (PCR), som har en fördel framför mindre känsliga tekniker som tidigare använts för att detektera genuttryck skillnader 3. Full konvertering tillklinisk kvalitet god tillverkningssed (GMP) förhållanden, tillåter mänsklig klinisk relevans. Vår protokoll erbjuder en annan metodik-förutsatt att nuvarande säkerhetsavgift kriterier kommer att expandera och inkludera faktorfria karaktäriserade hiPSC-baserade derivat för mänskliga terapeutiska tillämpningar-för härledning GMP-grade hiPSCs, vilket bör eliminera eventuella immunogenicitet risk på grund av icke-mänskliga antigener. Detta protokoll är brett tillämpbar på lentivirala omprogrammeras celler av något slag och ger en reproducerbar metod för att omvandla omprogrammerade celler till GMP-grade förhållanden.
Protocol
OBS: Denna metod användes i forskningen redovisas i Awe et al 10..
1. Omprogrammering Vuxen humana dermala fibroblaster med STEMCCA
- Tina vuxen dermala humana fibroblaster (HUFs), passage 4 eller lägre, i ett 37 ° C vattenbad under 2 minuter, se till att inte dränka toppen av flaskan med vatten.
- Placera 1-ml slam av mänskliga fibroblaster i en 15-ml konisk flaska och långsamt placera 4 ml ställd HUF media, förvärmda till 37 ° C, i ett droppvis mode, för att späda ut dimetylsulfoxid (DMSO) och återsuspendera cellerna.
- Centrifugera flaskan vid 200 xg under 10 min vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och slamma cellerna i en tillräcklig volym av media för att skapa en suspension av 100.000 celler / ml och tillsätt sedan 2 ml i en brunn i en sex-brunnar, pre-belagd för 20 min med 0,2% gelatin.
ANMÄRKNING: En syster väl med ett lika stort antal celler per rad och tillstånd måste ympas for cellräkning / mångfald av infektion (MOI) beräkning. - Rock plattan sida till sida och fram och tillbaka för att fördela cellerna. Inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- På dagen för transduktion, erhålla celltal (er) från syster väl (er) cirka 24 h efter initial HUF plätering.
- Tina upp 2 x 10 8 TU, eller motsvarande, lentiviral koncentrat (STEMCCA) och späd till 1 x 10 8 TU / ml i HUF medier.
- Transduce celler vid en 10-MOI-förhållande i HUF media kompletterat med 8 mikrogram / ml transfektion agent. Blanda transducerade brunnar jämnt och inkubera över natten vid 37 ° C, 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- Ungefär 24 timmar efter lentiviral transduktion, växla HUF media till standard human pluripotenta stamceller (PSC) medium.
- På dagarna 2 till 6, byta media dagligen med mänskligt PSC medium.
- På dag 6, plattan två 0,2% gelatinbelagda 10-cm plattor av1,5-1,75 x 10 6 MEF härrör från CF1 möss i HUF media 12.
- På dag 7, försiktigt så att inte centrifugera mer än 100 xg, användning rumstemperatur trypsin för att lyfta bort dag 7 omprogrammerade fibroblaster från en brunn på sex brunnar och passage vid ett 1:16 förhållande, genom plätering alla celler jämnt mellan två 10 cm plattor, med färsk mänsklig PSC medier, som ströks med MEF dagen innan. Fördela cellaggregat i en medurs spiralrörelse och lägg i en 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator över natten.
- Cirka 48 timmar efter sådd de omprogrammerade cellerna på MEF och varje dag därefter byta ut förbrukade mänskliga PSC medier med färska medier.
- Efter 3 till 4 veckor, plocka enskilda kolonier med typisk ESC som morfologi med en 21-gauge nål och subklona ut i en 24-brunnar genom att placera ca 8 till 10 enskilda delar av specifika kolonier i enskilda brunnar i en 0,2% gelatin-belagd 24-brunnar före sådded med MEF härledda från CF1 möss i människans PSC medium.
OBS: Efter utbyggnaden av plockade kolonier, kolonierna måste karakteriseras som pluripotenta av embryoid kroppsbildning och expressionsanalys av pluripotens markörer på proteinnivå.
2. Vector Integration Site Analys och STEMCCA Excision
- Analysera integrations webbplatsen STEMCCA av icke-restriktiv linjär förstärkning PCR som beskrivs 10.
- Efter analys för att säkerställa en integration i ett önskat område av genomet, punkt STEMCCA genom att aspirera bort den gamla humana ESC-medium. Kombinera sedan 45 | il koncentrerad Adeno-Cre-PuroR virus med 8 ug / ml transfektion agent i 3 ml standard PSC media för 24 h.
- Efter 24-timmars inkubationstid, aspirera bort blandade virala supernatanten och tvätta cellerna två gånger med humana PSC medier. Placera färska humana PSC medier tillsammans med 2 | ig / ml puromycin under en period av 5 dagar, bytt media dagliga with färskt media och antibiotikum.
- Efter 5 dagar, subklon återstående kolonier med en 21-nål på 0,2% gelatinbelagda brunnar, i en 12-brunnar förväg belagd med MEF härrör från CF1mice och expandera enligt ovan.
OBS: Efter tillräcklig expansion för att få en frusen lager, är omvandling till matarfria förhållanden krävs. Räkna minst 95% stamcellskoloni döden som de flesta celler inte kommer att lyckas transduceras och kommer ge efter för antibiotika under inkubationstiden 5 dag. Även Adeno-Cre-PuroR integrerar på ett 0,001-1% verkningsgrad i värd kromosomer av infekterade celler, återexponering ett prov av faktorfria kolonier att puromycin att garantera 100% celldöd kommer att bekräfta ingen integration har skett 13. - Tina ut en flaska av pre-alikvoteras basalmembranmatris på is, under en period av approximativt 2 h (tillverkarens rekommendationer) tills matrisen är en vätska och späda ut till en slutlig koncentration av 1:30 i kallt basalmedier. Covid önskat antal brunnar i en sex-brunnar med 1 ml per brunn. Låt stå vid rumstemperatur under 1 timme.
- Kors lucka (med användning av en 18-gauge nål, eller en glas- eller plast "tips") åtminstone 20 till 30 kolonier från en brunn som tidigare belagts med MEFs. Var noga med att reducera MEF upplyftande och flytta från plattan.
- Generera korsstreckning anordning genom ett antal olika metoder, från den mer komplicerade värme, drar, och färdigställande av ett glas pasteurpipett på en öppen flamma, till den enkla användningen av en steril plastpipett spetsen eller, som i vårt fall, 21- och / eller 18-gauge nålar.
- Sug matrisen från belagda väl efter inkubation.
- Ta bitar av kolonierna genom försiktig skrapning från den gamla plattan med en 200-xl pipett och försiktigt placera i 3 ml färskt kombinerade media 1 i matrisen belagda plåten. Inkubera över natten i en 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator. Ändra media 48 timmar efter passage.
- Utdrag iskt DNA från efter utskurna och matarfria konverterade hiPSCs, på mer än 80% konfluens, med hjälp av kommersiella DNA extraktion kit.
- Analysera för riktig excision med primrar som är specifika för exogena integrationer av STEMCCA lentivirus: gDNA-Hendo-MycS-framåt, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-omvänd, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Bered lyofiliserade primrar med PCR-kvalitet vatten till en 10-iM stamlösning.
- Kör en PCR med följande fem-stegsprotokoll: initial denaturering vid 95 ° C under 3 min; 35 cykler av vardera av följande: denaturering vid 98 ° C under 20 sek, primerhybridisering vid 62 ° C under 15 sek och extension vid 72 ° C under 15 sek; följt av en enda cykel slutlig förlängning vid 72 ° C under 3 min.
- Gör en 3% agarosgel genom att väga ut 1,5 gram agaros och placera den i 50 ml 1x Tris-acetat-EDTA-buffert. Mikrovågsugn tills agaros upplöses och placera i DNA gel fläcken vid pRoper utspädning, blanda och dispensera korrekt volym in gelkassett stelna under 1 timme vid rumstemperatur.
- Belastning 12 | il av PCR-produkt blandades med 3 pl av laddningsfärg i en 3% agarosgel. Kör gelén under 30 minuter vid 80 V.
- Visualisera med ultraviolett ljus för frånvaron av ett band anger korrekt excision.
3. Kvantifiering av genuttryck Skillnader med hjälp Kvantitativ PCR från för- och efter utskurna hiPSCs
- Utdrag totala RNA från efter utskurna och matarfria konverterade hiPSCs genom kommersiella RNA extraktion kit.
- Omvänd-transkribera upp till 1 pg av totalt RNA med hjälp kommersiella kit i enlighet med tillverkarens anvisningar. Använd förankrade-oligo (dT) 18 och slump hexamer primers.
OBS: Se till att PCR-protokollet är skräddarsydd för gentranskript på mer än eller mindre än 4 kb. Specifika primers kommer att behöva göras för beroende gen STEMCCA ursprungligen integrerade into. - Bered den frystorkade primer med PCR-grade vatten till en 20 iM stamlösning.
- Använd 5 ng prov per 20 pl reaktion som består av 10 iM UPL sond, 2x LightCycler 480 Probes Mästare, och 20 ^ M framåt och bakåt primers.
4. Omvandling till GMP-grade Villkor
- På den första dagen av övergår de efter utskurna hiPSCs över till GMP-grade förhållanden, gör en blandning av media bestående av humant PSC kombinerad media 1 (kombinerad media 1) och klinisk kvalitet god tillverkningssed (GMP) kompatibel media (kombinerade media 2 ) vid ett förhållande 80:20.
- Sug bort de gamla kombinerade media 1 och placera 3 ml av nya kombinerade media 1 och 2, förvärmda, vid 80:20 förhållandet. Ändra media dagligen i 3 dagar med denna specifika förhållandet. Placera cellerna tillbaka in i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- På dag 4, gör den kombinerade media 1 och 2 vid en 50:50 förhållandet. Sug bort den gamla mediet och ersäte med förvärmda media, med de kombinerade media 1 och 2 vid 50:50 förhållandet. Ändra medier för tre dagar med denna specifika förhållandet. Placera cellerna tillbaka in i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- På dag 7, gör den kombinerade media 1 och 2 vid en 20:80 förhållandet. Sug bort den gamla mediet och ersätta med förvärmda media, med de kombinerade media 1 och 2 vid 20:80 förhållandet. Ändra medier för tre dagar med denna specifika förhållandet. Placera cellerna tillbaka in i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- På dag 10, gör de kombinerade media 1 och 2 vid en 0: 100-förhållande. Sug bort den gamla mediet och ersätta med förvärmda media, med den kombinerade media 1 och 2 vid 0: 100-förhållande. Ändra media varje dag vid denna specifika förhållandet. Celler är nu i helt definierad xeno-fria medier. Placera cellerna tillbaka in i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
OBS: Under hela denna omvandlingsprocess, krävs rutin aging med en 18-gauge nål för att upprätthålla korrekt koloni storlek och täthet. Plan på passaging celler var 4 till 5 dagar på basis av kolonistorlek, sammanväxning, och differentiering. - Coat en brunn i en sex-brunnar med en definierad xeno-fria substrat som rekommenderas av tillverkaren.
- Mekaniskt passage en sammanhängande väl, redan omvandlats till xeno-fria medier förhållanden, från en sex-brunnar med en 18-gauge nål. Viktigt placera nya medier (kombinerade media 2) på cellerna med 1x ROCK-hämmare under 1 timme, innan passage till pre-condition media.
- Aspirera den syntetiska substratlösningen utanför den nya plåten att cellerna överförs till. Ta bort alla media som innehåller stamcells klumpar från den gamla plåten och överföra till nya plattan.
- Placera cellerna tillbaka in i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 2 dagar med minimal fysisk störning (helst plattor, väl inne inkubator, inte direkt berörs på något sätt) för att tillåta maximal fastsättning.
OBS: Celler kommer att kräva dagliga medieförändringar. Kontinuerligt passaging var 4 dagar kommer att vara viktigt. Med hjälp av en 21-gauge nål, passage endast de delar av kolonier med optimal ESC-liknande morfologi (högt nucleocytoplasmic förhållande). Detta kommer att säkerställa urvalet för korrekt hiPSC kolonier som växer bra och så småningom ger homogena kolonier. Totalt tid till härledning av ESC liknande kolonier är mellan 15-20 dagar efter den första kombinerade medieförändring. - Frys ner GMP-grade efter utskurna hiPSCs genom att först korsmönstrat alla kolonier med hjälp av en 18-gauge nål. Lyft alla bitar utanför med hjälp av en 200 l pipett och överföra alla media som innehåller cellerna till en 15 ml konisk flaska och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Medan cellerna centrifugering, gör en frysmedia bestående av lika stora volymer av kall kombinerade medier 2 och frysmedium med en slutlig DMSO-koncentration av 7,5%.
- Efter Cellerna pelleteras, aspirera bort gammalt medium och drop-wise återsuspendera pelleten med frysmediet. Omedelbart transfer för frys flaskor och sätta i en -80 ° C frys.
5. karakterisera GMP-grade Post-utskurna hiPSCs
- För att säkerställa korrekt uttryck för pluripotens markörer efter konvertering, använd QPCR att kvantifiera uttrycket av viktiga pluripotens markörer (Sox2, Oct4 och NANOG) genom att använda primers som anges i tabell 1 med samma steg som nämns i steg 3. QPCR metoder följer samma steg som anges i steg 3.
- Använd flödescytometri för att detektera icke-mänskliga sialinsyra Neu5Gc (N -glycolylneuraminic syra) i enlighet med standardförhållanden som anges i satsen som tidigare publicerats 10.
- Försiktigt tvätta cellodlingsplattor med celler genom användning av 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Dissociera kolonier med hjälp 1x dissociation reagens för 5 minuter vid rumstemperatur.
- Under 5-min inkubation Tiden i steg 5,4, förbereda den blockerande lösningen (tillhandahålls isats) genom att göra en 0,5% blockerande medel i iskall PBS.
- Märk följande uppsättning av rör för flödescytometrianalys: Obehandlat; 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DAPI; Kontrollantikropp 1: 200; Primär antikropp 1: 200; Sekundär antikropp 1: 200 åsne-anti-kyckling-IgG (H + L); Exempel MEF; Exempelefter excideras celler på matrisen; och prov efter utskurna celler på syntetiskt substrat.
- Skaka försiktigt cellaggregat från steg 5,4 genom att tillsätta 2 ml blockerande lösningen och överförings innehåll till en 15-ml koniska rör. Centrifugera vid 80 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med blockeringslösning och centrifugera såsom anges i steg 5.7.
- Försiktigt återsuspendera cirka 1 x 10 6 celler i 100 | il blockeringslösning med motsvarande spädningsvolymen av varje antikropp. Inkubera med försiktig skakning vid 4 ° C under 1 h.
- Upprepa tvättar tre gånger som i steg 5.8.
- Återuppslamma cellpelleten i 400 pl Diluent Buffer (från kit) med ett: 100 DAPI för rören 2, 6, 7, och 8 och som anges under steg 5,6.
- Strain celler genom en 40 iM sil och köra igenom flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar ett protokoll för att härleda kliniskt-grade faktorfritt hiPSCs genom att använda STEMCCA Lentiviral baserade omprogrammering tillvägagångssätt. Figur 1A visar en representativ bild av tre olika pre-excideras hiPSC rader, efter omprogrammering med STEMCCA tillvägagångssätt på ett lager av MEF. Den främsta fördelen med den STEMCCA omprogrammering strategi är att man konsekvent omprogrammering framgång uppnås genom flera vetenskapsmän, i olika forskargrupper och platser. Figur 1B visar den efter excision omvänd transkription-PCR-gel, som visar ett särskilt subklon (2,3) som är fullständigt fri från STEMCCA lentivirus, såsom bevisas av avsaknaden av en amplikon-bandet som är specifik för en särskild sekvens endogen för STEMCCA. Figur 2A visar de i förväg omvandlas hiPSCs på en xeno innehållande matris och post exciderade xeno fria GMP-grade hiPSCs på syntetiskt matris . Kvantifiering av standard pluripotens-associerade faktorer (SOX2, Oct4 och NANOG) genom användning av QPCR illustreras i figur 2B. Pre-omvandlade och post konverterade hiPSCs om GMP-grade betingelser testades genom flödescytometri för sialinsyra N-glykolylneuraminsyra, indikativ av icke-humana antigener, såsom visas i fig 2C.
Figur 1: Representativa human pluripotenta stamceller kassett (hSTEMCCA) -härledda människa inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer. (A) Alla tre härledda linjer analyserades med nrLAM-PCR-teknik och endast den presenterade C8 linjen befanns ha en integrering i PRPF39 genen. Endast denna linje, på grund av den säkra introniska integrations STEMCCA, valdes för att genomgå Adeno-Cre-PuroR selektion för Cre-medierad excision. (B) Adeno-Cre-medierad STEMCCA excision ur C8 linjen. Primers mot unika nukleotidsekvenser funna i STEMCCA-endo-Myc-s och A-WPRE- fann att endast en underklon (2,3 efter utskurna iPSCs) var ordentligt ut och fri från transgena transkriptionsfaktorer från den integrerade provirus. Staplar = 100 um. Denna siffra har modifierats Awe et al. 10.
Figur 2: Omvandling av hiPSCs från xeno-innehållande kliniska grade GMP xeno fria förhållanden och karakterisering. (A) representant hiPSC linje som har omvandlats från xeno-innehållande (forskningskvalitet matris) till xeno-fria (syntetiskt substrat) villkor enligt rådande god tillverkningssed (GMP) förhållanden. (B) Kvantitativ polymerase chain reaktion till analys för korrekt pluripotens associerade genuttryck efter omvandling till GMP grade förhållanden. (C) I Additjon till de standardsterilitetstest för att säkerställa GMP kompatibilitet, en flödescytometri-baserad analys testning för den icke-humana antigenet, N -glycolylneuraminic syra, används för att visa att postomvandlade hiPSCs eliminera alla sialinsyra detektering (1% med Post- utskurna celler på matrix jämfört med 0% med efter utskurna celler på ett syntetiskt substrat). Mouse embryonala fibroblaster och en hiPSC linje härledd under GMP villkor tjänade som positiva och negativa kontroller, respektive, i detta experiment. Staplar = 100 um. hESC, mänskliga embryonala stamceller; Offentliga arbetsförmedlingarna, efter utskurna syntetiskt substrat; PEM, efter exciderades matris. Denna siffra har modifierats Awe et al. 10.
| Gene Namn | Framåt primern 5'-3 ' | Omvänd primer 5'-3 ' | Prob # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabell 1: Primrar som används för kvantitativ PCR-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metod för att härleda faktorfria hiPSCs och göra dem kliniskt relevant genom att omvandla dessa celler i GMP-grade förutsättningar för nedströms celldifferentiering i framtida humanläkemedel. Även om detta protokoll är brett tillämpbar på en mängd olika celltyper, valde vi att programmera humana dermala fibroblaster, på grund av den enkla extraktion från patienten och deras tillämplighet på personlig humanläkemedel. När begränsningar åtgärdas så långt som full differentiering till kliniskt relevanta cellderivat är bekymrad 14, den presenterade omvandlingen till GMP-grade förhållanden kommer att bli ännu mer relevant för en mängd olika celltyper.
Den första delen av denna studie innebär omprogrammering humanfibroblaster med STEMCCA lentivirus. Denna teknik valdes till stor del på grund av dess reproducerbarhet, relativt hög omprogrammering verkningsgrad (0,02%), och robust förmåga att programmera om hela människany olika celltyper 10. Denna teknik är överlägsen andra omprogrammeringar metoder såsom Sendaivirus, episomala plasmider, och syntetiskt mRNA baserade omprogrammering som lider av lägre omprogrammering effektivitet och reproducerbarhet 10. Även om det finns ett samband mellan hiv-baserade vektorer integreras i ökad gen aktivitet hotspots 15, finns det ingen garanti för att de kommer att integreras i en gen, än mindre i ett säkrare område av en gen, den intron. Således detta hinder utgör en betydande begränsning till detta tillvägagångssätt. Dessutom denna integrations site företräde till en säkrare genomisk plats minskar med fler integrationer hela genomet. Därför är det absolut nödvändigt att korrekt lentivirala provirus integrationsstället och integration nummer vara ordentligt avfrågas av känsliga tekniker såsom nrLAM-PCR-teknik. Framtida omprogrammering utnyttjar zinkfinger nukleas teknologi, talen eller CRISPR / Cas9 baserade genmålinriktning (via homologous rekombination) kan dessutom styra detta fält i specifika loci för omprogrammering 16.
När humanfibroblaster är ordentligt omprogrammeras och kolonier har härletts är Adeno-Cre-PuroR uttryck för val av post-utskurna hiPSCs annan kritisk aspekt av detta protokoll. Det är viktigt att tänka på åter utsätta kolonierna till puromycin efter några veckor av cellodling, för att se till att all adenovirus har spätts ut genom cellreplikation och har inte sporadiskt integrerats i genomet. Felaktig integrering in i genomet hos adenoviruset skulle utgöra en säkerhetsrisk för personifierade cellulära terapeutika.
Omvandling till GMP-grade förhållanden är ett viktigt steg i att införa klinisk tillämplighet på dessa faktorfria hiPSCs. Det är viktigt att ändra bara ett villkor i en tid när du konverterar dessa celler över till xeno fria förhållanden; starta genom att omvandla cellerna till främlings-fria medier genom den långsamma omvandlingen metodik. De hiPSCs kan inte tolerera en medieförändring och ett substrat förändring samtidigt. När cellerna passage regelbundet med normal morfologi i de nya medie förutsättningar, inleda övergången på xeno-fria substrat. Om specifika celltyper har problem att överföra över på den rekommenderade underlaget, är det möjligt att överväga att prova andra xeno-fria substrat på marknaden.
Sammanfattningsvis bör den robusta och breda tillämpligheten av detta omprogrammering teknik tillsammans med GMP-grade konvertering möjliggör enkel reproducerbarhet och fungerar som en grund för framtida hiPSC Baserade derivat cellodling för humanläkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
