Abstract
Menneskelige induceret pluripotente stamceller (hiPSCs) kan genereres med lentivirale-baserede omprogrammering metoder. Men spor af potentielt onkogene gener tilbage i aktivt transkriberede områder af genomet, begrænser deres muligheder for anvendelse i humane terapeutiske anvendelser 1. Derudover ikke-humane antigener afledt fra stamceller omprogrammering eller differentiering i terapeutisk relevante derivater hinder disse hiPSCs fra at blive anvendt i et humant klinisk sammenhæng 2. I denne video præsenterer vi en procedure for omprogrammering og analysere faktor-fri hiPSCs fri af eksogene transgener. Disse hiPSCs kan derefter analyseres for genekspression abnormiteter i specifikke intron indeholdende lentivirus. Kan udføres Denne analyse under anvendelse af følsomme kvantitativ polymerasekædereaktion (PCR), som har en fordel i forhold til mindre følsomme teknikker tidligere er anvendt til at detektere 3 forskelle genekspression. Fuld omdannelse tilklinisk kvalitet god fremstillingspraksis (GMP) forhold, giver mulighed for humane kliniske relevans. Vores protokol tilbyder en anden metode, forudsat at de nuværende safe-harbour kriterier vil udvide og omfatte faktor-fri karakteriserede hiPSC-baserede derivater for humane terapeutiske anvendelser-til afledning GMP-grade hiPSCs, der bør fjerne enhver risiko for immunogenicitet på grund af ikke-humane antigener. Denne protokol er bredt anvendelig til lentivirale omprogrammeret celler af enhver art og giver en reproducerbar metode til konvertering omprogrammerede celler i GMP-grade forhold.
Protocol
BEMÆRK: Denne metode blev brugt i forskning rapporteret i ærefrygt et al 10..
1. Omprogrammering voksent menneske fibroblaster med STEMCCA
- Thaw voksen dermale humane fibroblaster (HUFs), passage 4 eller lavere, i et 37 ° C vandbad i 2 min, pas på ikke at oversvømme toppen af hætteglasset med vand.
- Placer 1-ml opslæmning af humane fibroblaster i en 15 ml konisk hætteglas og langsomt 4 ml af standard HUF medier, opvarmet til 37 ° C, i en dråbevis måde, at fortynde ud dimethylsulfoxid (DMSO) og re-suspendere celler.
- Centrifugeres hætteglasset ved 200 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i et passende volumen af medier til at skabe en suspension af 100.000 celler / ml og derefter tilsættes 2 ml i en brønd i en seks-brønds plade, præ-overtrukket i 20 minutter med 0,2% gelatine.
BEMÆRK: En søster godt med et lige antal celler per linie og tilstand skal podes FOr celletælling / infektionsmultiplicitet (MOI) beregning. - Rock pladen side til side og frem og tilbage for at fordele cellerne. Inkuber natten over ved 37 ° C, 5% CO2 i en befugtet inkubator.
- På dagen for transduktion, få celletal (r) fra søster godt (er) ca. 24 timer efter initial HUF plating.
- Tø op 2 x 10 8 TU, eller tilsvarende, lentiviral koncentrat (STEMCCA) og fortyndes til 1 x 10 8 TU / ml i HUF medier.
- Transducere celler ved 10 MOI forhold i HUF medier suppleret med 8 ug / ml transfektion agent. Bland transducerede brønde jævnt og inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2 i en befugtet inkubator.
- Ca. 24 timer efter lentiviral transduktion, skifte HUF medier til standard human pluripotente stamceller (PSC) medium.
- På dag 2 til 6, ændre medier dagligt med human PSC medium.
- På dag 6 pladen to 0,2% gelatine-coatede 10-cm plader af1,5-1,75 x 10 6 MEF'er afledt fra CF1 mus HUF medier 12.
- På dag 7, og pas på ikke at centrifugere over 100 xg, brug stuetemperatur trypsin til løft dag 7 omprogrammerede fibroblaster fra en brønd i seks brønde og passage ved en 1:16 ratio, ved udpladning alle celler ligeligt mellem to 10 cm plader, med frisk menneske PSC medier, der blev belagt med MEF'er dagen før. Fordel celleaggregater i urets spiralbevægelse og anbringes i en 37 ° C, 5% CO 2 befugtet inkubator natten over.
- Ca. 48 timer efter podning af omprogrammerede celler på MEF'er og hver dag derefter, skifte ud tilbragt humane PSC medier med friske medier.
- Efter 3 til 4 uger, plukke individuelle kolonier med typiske ESC lignende morfologi med en 21-gauge nål og subklone ud i en plade med 24 brønde ved at placere ca. 8 til 10 individuelle stykker af specifikke kolonier i individuelle brønde i en 0,2% gelatine-coatede 24-brønds plade pre-seeded med MEF'er afledt fra CF1 mus i human PSC medium.
BEMÆRK: Efter udvidelsen af plukkede kolonier, kolonierne skulle karakteriseres som pluripotente ved embryoid krop dannelse og udtryk analyse af pluripotens markører på proteinniveauet.
2. Vector integrationssted Analyse og STEMCCA Excision
- Analyser STEMCCA integrationssted af ikke-begrænsende lineær forstærkning PCR som beskrevet 10.
- Efter analyse for at sikre en integration i et ønsket område af genomet, punktafgifter STEMCCA ved sugning fra den gamle menneskelige ESC medium. Derefter kombinere 45 pi koncentreret Adeno-Cre-PuroR virus med 8 ug / ml transfektion agent i 3 ml standard PSC medier i 24 timer.
- Efter 24 timers inkubationstid, aspireres fra den blandede viral supernatanten og vaske cellerne to gange med humane PSC medier. Placer frisk humant PSC medier med 2 ug / ml puromycin for en periode på 5 dage, ændrer mediet dagligt with friske medier og antibiotikum.
- Efter 5 dage subklon resterende kolonier med en 21-gauge nål på 0,2% gelatine-overtrukne brønde i en plade med 12 brønde præcoatet med MEF'er afledt fra CF1mice og udvide som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Efter tilstrækkelig ekspansion til at opnå en frossen bestand, er omdannelsen til feeder-fri betingelser kræves. Forventer mindst 95% stamceller koloni døden som de fleste celler ikke held transduceres og vil bukke under for antibiotika over inkubationsperiode 5 dage. Selvom Adeno-Cre-PuroR integrerer på en 0,001-1% effektivitet i værtskromosomerne af inficerede celler, reexposing en prøve af faktor-fri kolonier til puromycin at sikre 100% celledød bekræfter ingen integration er opstået 13. - Tø et hætteglas af præ-alikvoteret basalmembranmatrix på is i en periode på ca. 2 timer (producentens anbefalinger), indtil matricen er en væske og fortyndes ud til en slutkoncentration på 1:30 i koldt basale medier. Coved ønskede antal brønde i en seks-brønds plade med 1 ml per brønd. Lad sidde ved stuetemperatur i 1 time.
- Cross-hatch (ved hjælp af en 18-gauge nål eller et glas eller plast "tip") mindst 20 til 30 kolonier fra en brønd tidligere overtrukket med MEF'er. Vær omhyggelig med at reducere MEF opløftende og overføre fra pladen.
- Generer krydsskravering enheden via en række forskellige metoder, fra den mere kompliceret opvarmning, trække, og færdiggørelse af en glas Pasteur-pipette på en åben flamme, den enkle anvendelse af en steril plastik pipettespidsen eller, som i vores tilfælde, 21- og / eller 18-gauge nåle.
- Aspirer matricen fra coatet godt efter inkubation.
- Fjern stykker af kolonierne ved forsigtig skrabning fra den gamle plade med en 200 pi pipette og anbring forsigtigt i 3 ml frisk kombinerede medium 1 i matrix-coatede plade. Inkuber natten over i en 37 ° C, 5% CO 2 befugtet inkubator. Skift medier 48 timer efter passage.
- Uddrag genomisk DNA fra post-udskåret og feeder-fri konverterede hiPSCs på mere end 80% konfluens, ved hjælp af kommercielle DNA-ekstraktion kits.
- Analyser for korrekt excision med primere specifikke for exogene integrationer af STEMCCA lentivirus: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Rekonstituer frysetørrede primere med PCR-grade vand til en 10-pM stamopløsning.
- Kør en PCR med følgende fem trin protokol: indledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter; 35 cykler af hver af følgende: denaturering ved 98 ° C i 20 sekunder, primerannealing ved 62 ° C i 15 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 15 sek; efterfulgt af en enkelt cyklus endelig forlængelse ved 72 ° C i 3 min.
- Lav en 3% agarosegel ved at afveje 1,5 g agarose og anbringe det i 50 ml 1x Tris-acetat-EDTA-buffer. Mikroovn indtil agarose opløses og sted i DNA gel plet på pRoper fortynding blandes og dispensere korrekt mængde i gelkassetten at størkne i 1 time ved stuetemperatur.
- Load 12 pi PCR-produkt blandet med 3 pi loading dye i en 3% agarosegel. Kør gelen i 30 minutter ved 80 V.
- Visualiser med ultraviolet lys i mangel af et band der angiver ordentlig excision.
3. Kvantificering af genekspression Forskelle ved hjælp kvantitativ PCR fra før og efter udskårne hiPSCs
- Uddrag total RNA fra post-udskåret og feeder-fri konverterede hiPSCs ved at bruge kommercielle RNA ekstraktion kits.
- Reverse-transskribere op til 1 ug total RNA ved hjælp af kommercielle kits i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Brug forankret-oligo (dT) 18 og tilfældige hexamerprimere.
BEMÆRK: Sørg for, at PCR-protokol er skræddersyet til gentranskripter på mere end eller mindre end 4 kb. Specifikke primere skal være mulighed for alt efter hvilken gen STEMCCA oprindeligt integreret into. - Opløs det frysetørrede primer med PCR-grade vand til en 20 uM stamopløsning.
- Brug 5 ng prøve pr 20 ul reaktion, der består af 10 uM UPL sonde, 2x LightCycler 480 Sonder Master, og 20 uM forward og reverse primere.
4. Konvertering til GMP-grade Betingelser
- På den første dag i overgang post-skåret hiPSCs over til GMP-grade betingelser, lave en blanding af medier, der består af menneskelig PSC kombineret medier 1 (kombineret medier 1) og klinisk kvalitet god fremstillingspraksis (GMP) kompatibel medier (kombinerede medier 2 ) ved en 80:20 ratio.
- Aspirer off de gamle kombinerede medier 1 og Place 3 ml i de nye kombinerede medier 1 og 2, forvarmet, på 80:20 ratio. Skift medier dagligt i 3 dage med denne specifikke forhold. Place celler tilbage i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- På dag 4, gør det kombinerede medier 1 og 2 ved en 50:50 ratio. Aspirer off den gamle medium og replace med forvarmet medier, med de kombinerede medier 1 og 2 på 50:50 ratio. Skift medier til 3 dage med denne specifikke forhold. Place celler tilbage i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- På dag 7, gør det kombinerede medier 1 og 2 ved en 20:80 ratio. Aspirer off den gamle medium og erstatte med foropvarmet medier, med den kombinerede medier 1 og 2 på 20:80 ratio. Skift medier til 3 dage med denne specifikke forhold. Place celler tilbage i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
- På dag 10, gør de kombinerede medier 1 og 2 ved en 0: 100 forhold. Aspirer off den gamle medium og erstatte med forvarmet medier, med de kombinerede medier 1 og 2 ved 0: 100 forhold. Ændre medier hver dag på dette specifikke forhold. Celler er nu i endeligt defineret xeno-frie medier. Place celler tilbage i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
BEMÆRK: Under hele denne konverteringsprocessen, er rutinemæssig passage med en 18-gauge kanyle er nødvendig for at opretholde en ordentlig koloni størrelse og tæthed. Planlægger passaging celler hver 4 til 5 dage på grundlag af koloni størrelse, sammenflydning og differentiering. - Coat en brønd i en seks-brønds plade med en defineret xeno-fri substrat som anbefalet af producenten.
- Mekanisk passage en sammenflydende godt, allerede omdannet til xeno-fri medieforhold, fra en seks-brønds plade med en 18-gauge kanyle. Vigtigere er det, at placere nye medier (kombinerede medier 2) på cellerne med 1x ROCK inhibitor i 1 time, før passage til at pre-tilstand medierne.
- Aspirer det syntetiske substratopløsning fra den nye plade, cellerne overføres til. Fjern alle de medier, der indeholder de stamcelle klumper fra den gamle plade og overføre til ny plade.
- Place celler tilbage i en 37 ° C, 5% CO 2-inkubator i 2 dage med minimal fysisk forstyrrelse (ideelt plader, når inde inkubator er ikke direkte rørt på nogen måde) for at opnå maksimal binding.
BEMÆRK: Celler vil kræve daglige medieændringer. Løbende passaging hver 4 dage vil være vigtigt. Ved hjælp af en 21-gauge kanyle, passage kun de dele af kolonier med optimal ESC-lignende morfologi (høj nucleocytoplasmic ratio). Dette vil sikre valg for korrekte hiPSC kolonier, der vil vokse godt og til sidst afkaster homogene kolonier. Samlet tid til afledning af ESC ligesom kolonier er mellem 15-20 dage efter den første kombinerede forandring medier. - Frys ned GMP-lønklasse-udskåret hiPSCs ved først cross-hatch alle kolonierne ved anvendelse af en 18-gauge nål. Løft alle brikkerne off ved hjælp af en 200 pi pipette og overføre alle medier indeholdende cellerne til et 15 ml konisk hætteglas og centrifugeres ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Mens cellerne centrifugering, lave en frysning medier bestående af lige volumener kold kombinerede medier 2 og frysning medium med en endelig DMSO-koncentration på 7,5%.
- Efter celler pelleteret, aspireres off gamle medium og dråbevis re-suspendere pellet med indefrysning medier. Straks transfer til indefrysning hætteglas og sat i en -80 ° C fryser.
5. karakterisering GMP-grade Post-udskårne hiPSCs
- For at sikre korrekt udtryk for pluripotens markører post-konvertering, kan du bruge QPCR at kvantificere ekspression af centrale pluripotens markører (SOX2, OCT4 og NANOG) ved anvendelse af primerne er anført i tabel 1 med de samme trin som nævnt i trin 3. qPCR metoder følger samme trin som anført i trin 3.
- Brug flowcytometri til påvisning af ikke-humane sialinsyre Neu5Gc (N -glycolylneuraminic syre) i overensstemmelse med standardbetingelser, der er anført i kittet som tidligere offentliggjort 10.
- Forsigtigt vaske cellekulturplader med celler ved anvendelse af 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Dissociér kolonier ved hjælp 1x dissociation reagens i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Under 5-min inkubationstid på trin 5.4, forberede blokerende opløsning (tilvejebragt ikit) ved at gøre en 0,5% blokerende middel i iskold PBS.
- Mærk følgende sæt af rør til flowcytometri analyse: Ufarvet; 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) DAPI; Kontrol antistof 1: 200; Primært antistof 1: 200; Sekundært antistof 1: 200 æsel-anti-kylling IgG (H + L); Sample MEF'er; Sample Post-udskåret celler på matrix; og Sample post-skåret celler på syntetisk underlag.
- Forsigtigt løsne celleaggregater fra trin 5.4 ved tilsætning af 2 ml blokerende opløsning og overføre indholdet til en 15 ml konisk rør. Centrifugeres ved 80 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellerne to gange med blokerende opløsning og centrifugeres som angivet i trin 5.7.
- Forsigtigt resuspenderes ca. 1 x 10 6 celler i 100 pi blokerende opløsning med den tilsvarende fortyndingsvolumen af hvert antistof. Inkuber under forsigtig vipning ved 4 ° C i 1 time.
- Gentag vaske tre gange som i trin 5.8.
- Re-suspendere cellepelleten i 400 pi fortynder Buffer (fra kit) med 1: 100 af DAPI til rør 2, 6, 7 og 8 som angivet under trin 5.6.
- Strain celler gennem en 40 uM si og løbe gennem flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en protokol til udledning klinisk kvalitet faktor-fri hiPSCs ved at bruge STEMCCA lentivirale baserede omprogrammering tilgang. Figur 1A viser et repræsentativt billede af tre forskellige præ-skåret hiPSC linjer, efter omprogrammering med STEMCCA tilgang på et lag af MEF. Den primære fordel ved STEMCCA omprogrammering fremgangsmåde ligger i den konsekvente omprogrammering succes opnås ved flere forskere i forskellige forskergrupper og placeringer. Figur 1B viser post-excision revers transkription-PCR gel, der viser en bestemt subklon (2,3), som er helt fri fra STEMCCA lentivirus, som det fremgår af manglen på en amplicon band specifik for en bestemt sekvens endogen STEMCCA. Figur 2A viser de forud omdannes hiPSCs på en xeno matrix og post-udskårne xeno-free GMP-grade hiPSCs på syntetisk matrix . Kvantificering af standard pluripotens-associerede faktorer (SOX2, OCT4 og NANOG) ved anvendelse QPCR er illustreret i figur 2B. Pre-konverterede og post-konverteret hiPSCs til GMP-grade betingelser blev testet gennem flowcytometri for sialinsyre N-glycolylneuraminsyre, indikerer ikke-humane antigener, som vist i figur 2C.
Figur 1: Repræsentative human pluripotente stamcelle kassette (hSTEMCCA)-afledte menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC) linjer. (A) Alle tre afledte linjer blev analyseret med nrLAM-PCR-teknologi, og kun den præsenterede C8 linje viste sig at have en integration i PRPF39 genet. Kun denne linje som følge af sikker intron STEMCCA integration, blev udvalgt til at undergå Adeno-Cre-PuroR selektion for Cre-medieret udskæring. (B) Adeno-Cre-medieret STEMCCA excision ud af C8 linje. Primers mod unikke nukleotidsekvenser findes i STEMCCA-endo-Myc-s og A-WPRE- fandt, at kun en subklon (2,3 post-udskåret iPSCs) blev korrekt udskåret og fri for transgene transkriptionsfaktorer fra det integrerede provirus. Bars = 100 um. Dette tal er blevet ændret fra Awe et al. 10.
Figur 2: Omdannelse af hiPSCs fra xeno-holdige kliniske kvalitet GMP xeno-fri betingelser og karakterisering. (A) Repræsentant hiPSC linje, der er konverteret fra xeno-holdige (forskning kvalitet matrix) til xeno-fri (syntetisk substrat) betingelserne i henhold gældende god fremstillingspraksis (GMP) forhold (B) kvantitativ polymerase kædereaktion til analyse for korrekt pluripotens. associeret genekspression efter konvertering til GMP kvalitet forhold. (C) i Addition til faste sterilitet test for at sikre GMP kompatibilitet, en flowcytometri-baseret assay test for det ikke-humane antigen, N -glycolylneuraminic syre, anvendes til at vise at post-konverteret hiPSCs fjerne alle sialinsyre detektion (1% med post udskårne celler på matrix i forhold til 0% med post-skåret celler på et syntetisk substrat). Mus embryonale fibroblaster og en hiPSC linje afledt under GMP betingelser tjente som positive og negative kontroller, henholdsvis i dette eksperiment. Bars = 100 um. embryonale, humane embryonale stamceller; Offentlige arbejdsformidlinger, post-udskåret syntetisk substrat; PEM, post-udskåret matrix. Dette tal er blevet ændret fra Awe et al. 10.
| Gene Navn | Forward primer 5'-3 ' | Reverse primer 5'-3 ' | Probe # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabel 1: Primere anvendt til kvantitativ PCR-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode til at udlede factor-fri hiPSCs og gøre dem klinisk relevant ved at konvertere disse celler til GMP-grade betingelser for downstream celledifferentiering i fremtidige humane lægemidler. Selv om denne protokol er bredt anvendelig til en række celletyper, vi valgte at omprogrammere humane dermale fibroblaster, som følge af den lethed af ekstraktion fra patienten og deres anvendelighed til personlige humane lægemidler. Når begrænsninger afhjælpes så vidt fuld differentiering i klinisk relevante cellederivater er bekymret 14 den præsenterede omdannelse til GMP-grade forhold vil blive endnu mere relevant for en række forskellige celletyper.
Den første del af denne undersøgelse indebærer omprogrammering humane fibroblaster med STEMCCA lentivirus. Denne teknik blev valgt for en stor del på grund af sin reproducerbarhed, relativt høje omprogrammering effektivitet (0,02%), og robust evne til at omprogrammere tværs mandy forskellige celletyper 10. Denne teknik er overlegen i forhold til andre omprogrammering metoder såsom Sendai-virus, episomale plasmider, og syntetisk mRNA baseret omprogrammering, der lider af lavere omprogrammering effektivitet og reproducerbarhed 10. Selv om der er en sammenhæng mellem hiv-baserede vektorer integrerer i en øget gen aktivitet hotspots 15, er der ingen garanti for, at de vil blive integreret i et gen, meget mindre i et sikrere område af et gen, intronen. Således denne hindring er en bemærkelsesværdig begrænsning til denne fremgangsmåde. Derudover denne integrationssted præference i et sikrere genomisk placering falder med flere integrationer hele genomet. Derfor er det bydende nødvendigt, at en ordentlig lentiviral proviruset integrationssted og integration nummer korrekt forhørt af følsomme teknikker såsom nrLAM-PCR-teknologi. Future omprogrammering udnytte zinkfinger nuclease teknologi, målretning talen eller CRISPR / Cas9-baserede gen (via homologouS-rekombination) kan yderligere styre dette felt i specifikke loci for omprogrammering 16.
Når humane fibroblaster er korrekt omprogrammeres og kolonier er oparbejdet, andet kritisk aspekt af denne protokol er den Adeno-Cre-PuroR udtryk for udvælgelse af post-udskåret hiPSCs. Det er vigtigt at overveje ny udsætte kolonierne puromycin efter et par ugers cellekultur med henblik på at sikre, at alle adenovirus er blevet fortyndet ud gennem cellereplikation og ikke sporadisk integreret i genomet. Forkert integration i genomet af adenovirus ville udgøre en fare for personlige cellulære lægemidler.
Konvertering til GMP-grade betingelser er et vigtigt skridt i at indføre kliniske anvendelighed af disse faktor-fri hiPSCs. Det er vigtigt at ændre kun én betingelse på et tidspunkt, hvor omdannelse af disse celler over til xeno-fri betingelser; starte med at omdanne cellerne i fremmedhadfrie medier gennem den langsomme konvertering metode. De hiPSCs kan ikke tåle et medie forandring og et substrat ændring på samme tid. Når cellerne passage jævnligt med normal morfologi i de nye medieforhold, begynder overgangen på xeno-fri substrat. Hvis specifikke celletyper har problemer med at overføre over på den anbefalede substrat, er det muligt at overveje at prøve andre xeno-fri substrater på markedet.
Afslutningsvis bør det robuste og brede anvendelighed af denne omprogrammering teknik sammen med GMP-grade konvertering gør det let reproducerbarhed og tjener som et fundament for fremtidig hiPSC-baserede derivat cellekultur for humane lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
