Introduction
الشريان الأورطي يلعب دورا محوريا في وظيفة القلب والأوعية الدموية التي تغذي الجسم مع الدم المؤكسج وأجزاء مشابهة للآخرين من الجسم، غير عرضة للإصابة بالأمراض. وتشمل الأمراض الشائعة الأبهر تصلب الشرايين وتمدد الأوعية الدموية، والتي هي نتائج العوامل الوراثية والبيئية بما في ذلك النظام الغذائي والتدخين ونمط الحياة المستقرة 1. تصلب الشرايين هو ترسب من الكالسيوم والبلاك القائم على الدهون على جدار الأبهر التي توجد عادة في المرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم المزمن 2. وتتميز تمدد الأوعية الدموية التي كتبها تدهور المكونات الهيكلية من الشريان الأورطي وترقق جدار الوعاء الدموي، تليها قطر زاد الأمر الذي قد يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق 3.
النماذج الحيوانية هي أدوات هامة تستخدم لدراسة آلية المرض وفعالية من العلاجات المحتملة. النماذج الحيوانية المشتركة المستخدمة في البحوث القلب والأوعية الدموية، والبحث على وجه التحديد التحقيق اضطرابات الأوعية الدموية والتمثيل الغذائيتشمل الفئران المعدلة وراثيا لتغيير مستويات الدهون مثل خروج المغلوب ئي E الجينات والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة الفئران بالضربة القاضية جين مستقبلات 4. ان غالبية الطرق لتقييم آليات المرض وفعالية العلاج تشمل العزلة واستئصال الشريان الأورطي.
مرة واحدة يتم ترجمة الشريان الأورطي ومعزولة، يمكن تحديد تحليل المورفولوجية، مثل وجود تمدد الأوعية الدموية، الذي يعرف عادة باسم زيادة أكبر من 50٪ في قطر 5. بعد ذلك ضروريا التحليل في الموقع هو الكامل، ويمكن رفعه الشريان الأورطي لمزيد من التحليل. والشريان الأورطي المستأصل يمكن فلاش المجمدة لإجراء الدراسات الجزيئية مثل البروتين و / أو المقايسات التعبير الجيني أو الثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ وجزءا لا يتجزأ في وقت لاحق، مقطوع وملطخة للتحليل النسيجي. التحليل النسيجي من الشريان الأورطي يمكن أن تظهر ملامح مشتركة من مرض الأبهر مثل تدهور الهيكلي، وتشكيل لوحة، وتسلل من الكريات البيض <سوب> 6،7. بالإضافة إلى ذلك، الشريان الأورطي المستأصل يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا الأولية بما في ذلك خلايا العضلات الملساء البطانية والتي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات في المختبر 7.
حاليا، لا توجد طرق أخرى لتوفير هذا التوصيف متعمق لمرض الأبهر وكذلك توفير الباحثين بالأدوات اللازمة لمواصلة دراسة أمراض القلب والأوعية الدموية. طرائق التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، والتصوير المقطعي والتصوير بالموجات فوق الصوتية هي أقرب الطرق لتقييم شكليا الشريان الأورطي، ولكن هذا أمر صعب في الحيوانات الصغيرة والحصول على الجهاز مع التكنولوجيا الملائمة مكلفة 8. خطوط الخلايا خلد يمكن شراؤها للتحقيق في الآليات المحتملة من المرض وفعالية من العلاجات، ولكن طبيعة اصطناعية من هذه الخلايا تحد في دراسة الآثار المترتبة على دورة حياة الخلية وموت الخلايا المبرمج 9.
ويتمثل الهدف العام منهذه المخطوطة هي للتدليل على العزلة العقيمة واستئصال الشريان الأورطي الفئران في التحقيق في أمراض القلب والأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة سينسيناتي وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة (NIH المنشور رقم 85-23، منقحة 1996).
1. إعداد ماوس
- الموت ببطء من خلال تعريض الحيوان لجرعة من مخدر supratherapeutic، استنشاق الأيزوفلورين إلى تأثير. تحقق القتل الرحيم الأساسي عن طريق قرصة أخمص قدميه كحافز الضارة. طريقة الثانوي القتل الرحيم، قطع الحجاب الحاجز، وسيحدث في خطوة المقبلة. قد يتم الحصول على استخدامها القتل الرحيم منح طرق بديلة.
- Sanitizie السطح الخارجي من الفأرة عن طريق الرش الفراء على طول منطقة البطن، حيث سيتم إجراء التخفيضات الأولية، مع 70٪ من الإيثانول إلى درجة الرطوبة بحيث الفراء هو الرطب مع الإيثانول وأي / الشعر الجاف فضفاضة لا تدخل المنطقة.
- وضع الماوس من على سورgical مجلس في موقف ضعيف مع الزوائد العليا والسفلى تمديد الخارج.
- الزوائد آمنة إلى لوحة باستخدام الشريط الجراحية.
2. عزل من القلب والشريان الأبهر
- بعد تحديد المواقع المناسبة من الفأرة، واستخدام ملقط لتحديد وعزل الجلد في منطقة البطن فقط أقل شأنا من عملية الخنجري من القص.
- خلق التوتر من خلال رفع الجلد بشكل مستقيم واستخدام المقص لإزالة الجلد السطحي، ويعرض الجزء العلوي من الصفاق وجزء السفلي للتجويف الصدري.
- أدخل التجويف البريتوني من خلال رفع عملية الخنجري، وجعل الشقوق الجانبية فقط أقل شأنا من عملية على طول هوامش تحت الضلع.
- تشريح يصل الى التجويف الصدري، والذهاب من خلال الحجاب الحاجز، ويجري التأكد من عدم ممزق القلب أو أي الأوعية الدموية الرئيسية.
- توسيع الشقوق الجانبية في الخطوة 2.3 cranially لإزالة الجزء الأمامي من القفص الصدري. إذالزم الأمر، تحرير القلب من جدار الصدر الأمامي باستخدام تشريح حادة.
- تنظيف تجويف الصدر من الدم دخيلة والسوائل باستخدام شاش معقم لاستيعاب المواد. مرة واحدة في المنطقة هي أكثر وضوحا، وإزالة الرئتين لفضح أفضل القلب والشريان الأورطي.
3. الإرواء من القلب والشريان الأبهر
ملاحظة: للحصول على الدم عبر ثقب في القلب، تفعل ذلك فقط قبل هذه الخطوة.
- ملء حقنة 10 سم مع 10 مل من الجليد الباردة العقيمة 1X عازلة الفوسفات الحل (PBS)، ونعلق إبرة قياس 25 إلى الحقنة.
- إدراج بلطف الإبرة في البطين الأيسر من القلب.
- قطع الأذين الأيمن لتخفيف الضغط تراكم من نضح. يروي محتويات الحقنة في الماوس فوق 2-3 دقيقة.
- استخدام الشاش المعقم في افتتاح في الأذين الأيمن لامتصاص السائل نضح.
4. عزل واستئصال الأبهر
- عند الانتهاء من المؤسسة العامةrfusion، استخدم الشاش المعقم لامتصاص أي السائل المتبقية يعكر مجال الرؤية داخل التجويف الصدري.
- كشف محتويات الجهاز الهضمي عن طريق خفض نحو caudally من خلال جدار البطن، وتمتد من شق إلى منطقة فوق العانة. تمديد شق أكثر نحو الأطراف السفلية بشكل ثنائي لخلق اللوحات الجلد والتي يمكن تمركزها أو رفعه.
- إزالة فصوص الكبد والبنكرياس والمعدة والطحال، والأمعاء لتصور أفضل الشريان الأورطي. أخذ الحيطة والحذر عند تشريح بالقرب من منطقة بالكلوة، والشريان الأورطي هو سطحي في فروع الشرايين الكلوية.
ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في دقيقة وتسجيل للجامعة الطريقة مثل الجهاز الهضمي غني مع البكتيريا مما يزيد من الميل للتلوث. - شطف المنطقة مع برنامج تلفزيوني 1X وإزالة جميع السوائل عن طريق امتصاص مع شاش معقم.
- باستخدام microscissors معقمة وmicroforceps، فصل الشريان الأورطي من ظهريا العمود الفقري والمريء البطني.فمن الأفضل لاستخدام تشريح حادة واستخدام المجهر تشريح لهذا الغرض.
ملاحظة: في عزل الشريان الأبهر، وتبدأ نحو caudally في التشعب الحرقفي والتحرك تنظيف cranially وفصل الشريان الأورطي من السطح الظهري للتجويف أو اضافة cranially في السباتية وشرايين عضدي رأسي تشريح نحو caudally. إما الطريقة المناسبة ومتروك للراحة الباحثين. - إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية باستخدام microscissors بخير يجري التأكد من عدم إزالة جزء من جدار الشريان الأورطي. وهذا أمر ضروري لتقليل احتمال تلوث الخلايا الليفية عند زراعة خلايا العضلات الملساء الأبهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وعند الانتهاء من هذا الإجراء، سيكون هناك الشريان الأورطي سليمة النابعة من القلب، وتنازلي في تجاويف الصدر والبطن مع الشرايين الكلوية لا تزال تعلق (الشكل 1A). من هنا، الشريان الأورطي يمكن تصويرها في الموقع لقياس التغيرات المورفولوجية التي هي التشخيص في دراسة تمدد الشريان الأورطى البطنى (1B الشكل و1C). وفي وقت لاحق، يمكن إزالة الشريان الأورطي، ثابتة وملطخة للنظر في التغيرات النسيجية. وصمة عار العامة والمشتركة من الشريان الأبهر هي الهيماتوكسيلين وصمة عار يوزين (الشكل 2A و 2B). بالإضافة إلى ذلك، السلامة الهيكلية للالشريان الأورطي يمكن كميا نوعيا باستخدام Verhoff فان القوس الحاجبية تلطيخ لإلقاء نظرة على العصابات الإيلاستين (الشكل 2C و 2D). بدلا من الحصول على تحليل النسيجي، المحقق قد فلاش تجميد الشريان الأورطي لاحق البروتين وحمض النووي الريبي expression. الخيار النهائي للمحقق هو استخدام الشريان الأورطي للحصول على العزلة الخلية الأولية. يمكن زراعة هذه الخلايا في الثقافة (الشكل 3A) وتستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات في المختبر بما في ذلك دراسات الجدوى (الشكل 3B) والبروتين توطين (الشكل 3C).
الشكل 1. في صور تمثيلية في الموقع من الشريان الأورطي الفئران. (A) تصوير للتشريح الفأر العادي بعد عزل الشريان الأورطي بما في ذلك القلب والكلى. (B) تضخيم صورة الشريان الأورطي البطني الفئران سليمة العادي. (C) تضخيم صورة الأبهر البطني المريضة مع تمدد الأوعية الدموية في الكظر المنطقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الهو الرقم.
الشكل 2. تحليل النسيجي من الشريان الأورطي الفئران. (A) صورة الممثل من الهيماتوكسيلين ويوزين العادية وصمة عار من الشريان الأورطي الكظر صحي في 20X التكبير. (B) صورة الممثل من الشريان الأورطي الكظر aneurismal مع خثرة جماعية بعد الهيماتوكسيلين ويوزين وصمة عار في 20X التكبير. (C) صورة الممثل ل Verhoff فان القوس الحاجبية وصمة عار، وتسليط الضوء على العصابات الإيلاستين من الشريان الأورطي الكظر العادي في 10X التكبير. (D) صورة الممثل من وصمة عار Verhoff فان القوس الحاجبية تسليط الضوء على العصابات الإيلاستين من مرض الشريان الأورطي تطوير الكظر التي أشار إليها رقيق وstriating العصابات الإيلاستين وسماكة طبقة الغلالة البرانية. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. myocytes الأبهر الأولية مثقف من الشريان الأورطي. (A) صورة الممثل من myocytes الأبهر الأولية في الثقافة في 20X التكبير تم الحصول عليها من الشريان الأورطي البطني. (B) صورة الممثل من myocytes الأبهر الأولية خلال التريبان الأزرق فحص الإقصاء بعد علاج 500 ميكرومتر من H 2 O 2 في 20X التكبير تم الحصول عليها من الشريان الأورطي البطني. (C) صورة الممثل من وصمة عار المناعية للالأكتين ألفا في الخلايا الأبهر عزل الأولية العضلات الملساء من الشريان الأورطي البطني. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب ليس لديهم الاعترافات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Med-Vet International | #RXISO-250 | |
| 70% ethanol | Fisher | 07-678-001 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Sterile gauze | Dukal Corporations | 1312 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 10 ml syringe | BD | 309604 |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), 28-292 (2014).
- Ross, R., Harker, L.
- Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79 (2), 176-180 (2004).
- Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
- Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142 (12), 1291-1299 (1995).
- Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5 (3), 229-233 (1991).
- Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
- Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88 (6), 550-551 (2001).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
- Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45 (1), 192-198 (2007).
