Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52173
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1KY Spinal Cord Injury Research Center, Department of Neurological Surgery, University of Louisville, 2Hotchkiss Brain Institute, Department of Clinical Neurosciences, University of Calgary

Abstract

Пострадавшие аксоны ЦНС не восстановить, и часто отказаться от места повреждения. Аксоны избавлены от первоначальной травмы в дальнейшем могут подвергаться вторичной дегенерацию аксонов. Отсутствие образования конуса роста, регенерации, и потери дополнительных миелиновых аксонов прогнозов в спинном мозге значительно ограничивает неврологического восстановления после травмы. Для оценки центрального миелиновые аксоны спинного мозга реагировать на травмы, мы разработали экс естественных условиях живут спинного модель мозга с использованием трансгенных мышей, которые выражают желтый флуоресцентный белок в аксоны и очаговых и хорошо воспроизводимый лазерно-индуцированной травмы спинного мозга к документу судьбу аксонов и миелина (липофильные флуоресцентный краситель Нил красный) с течением времени с использованием двух-фотонной возбуждения покадровой микроскопии. Динамические процессы, такие как острый аксонов травмы, аксонального втягивания и миелиновой дегенерации лучше всего изучать в реальном времени. Тем не менее, без очаговый характер контузии основе травм и артефактов движения столкнулсяво в естественных условиях спинного изображения шнур марки дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы, используя микроскопия высокого разрешения сложной задачей. Экс естественных условиях модель спинного мозга, описанный здесь имитирует некоторые аспекты клинически значимых контузии / сжатия, вызванного аксонов патологий, включая аксонов отек, сфероида образования, аксонов перерезки и пригородных аксонов отек обеспечивая полезную модель для изучения этих динамических процессов в режиме реального времени. Основные преимущества этой модели отлично пространственно-временной резолюции, который позволяет дифференцировать между первичной оскорбление, которые непосредственно повреждает аксоны и механизмы вторичного повреждения; контролируется вливания реагентов непосредственно в перфузат купания мозга; точные изменения в экологическом среде (например, кальция, ионы натрия, известные вкладчики аксонов травмы, но практически невозможно манипулировать в естественных условиях); и мышиные модели также имеют преимущество, поскольку они обеспечивают возможность визуализации иманипулировать генетически определенных популяций клеток и субклеточных структур. Здесь мы опишем, как изолировать и изображение живых спинного мозга у мышей, чтобы захватить динамику острого аксонов травмы.

Introduction

Вырождение аксонов из основных причин заболеваемости охватывающих несколько неврологических заболеваний, включая нейротравме, инсульта, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний. В отличие от периферической нервной системы (ПНС), центральной нервной системы (ЦНС) аксоны имеют ограниченные возможности к регенерации однажды ранил из-за как внутренних, так и внешних барьеров (например, тормозные молекул рост аксонов, образующихся при формировании рубцовой и выделяющейся при миелиновой дегенерации) 1 -7. Хотя некоторые из этих барьеров были широко изучены, терапевтические мероприятия, направленные на предотвращения ЦНС дегенерацию аксонов, способствуют надежной регенерацию аксонов, и восстановить функциональную соединительно, остаются ограниченными.

Аксоны После отделения от их сомы пройти стереотипное процесс перерождения известного как валлеровский дегенерации, которая характеризуется аксонов отек, сфероида образования и в конечном итоге фрагментации (обзор 8). Вконтраст, проксимальный культи, что остается в непрерывности с сомы о пересечённого периферической аксона, формирует отек на его конце, отмирает до ближайшей перехвата Ранвье, а затем может инициировать образование роста конуса, жизненно необходимым условием необходимым для последующей регенерации аксонов 9-11. В отличие от этого, проксимальные аксонов окончаний многих центральных аксонов образуют характерные "endbulbs" или луковицы отвода не образуют конусы роста, и вместо того, чтобы убрать от места повреждения, где они остаются в течение нескольких месяцев после травмы 12-15. В дополнение к основной аксонов травмы, дополнительное повреждение аксонов / потери могут также происходить в аксонов, которые были в значительной степени избавлены от начальной травмы. Это задержка аксонов потери изначально избавлены аксонов называют вторичной дегенерации аксонов. Это неотъемлемое ответ ЦНС аксонов травмы оказывает функциональных регенерации аксонов еще более труднодостижимой целью достижения в головном и спинном мозге.

Хотя гаllmarks аксонов травмы (например, сфероида образования, луковицы отвода) были охарактеризованы с посмертной ткани и экспериментальных моделей дегенерации аксонов, выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих динамических процессов была ограничена. Большинство этих исследований использовали такие статические конечных наблюдений, которые по своей сути не смогли захватить отдельные аксонов ответов с течением времени. Хотя экзогенно применяется аксонов индикаторы оказались полезными для выяснения ответов аксонов от статических разделов и во время живого изображения, наличие генетически кодируемых аксонов маркеров значительно улучшили нашу способность визуализировать аксоны в режиме реального времени с помощью флуоресцентной микроскопии. Действительно, основополагающем докладе от Kerschensteiner и коллег-первых условии прямых доказательств дегенерации аксонов и регенерацию в естественных условиях с использованием Thy1 -GFP-S мышей, которые кодируют зеленый флуоресцентный белок в подмножеств нейронов, которые посылают свои прогнозы в спинной колонкам позвоночникашнур 16. Живая съемка подходов с использованием двух фотонных лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM) и генетических флуоресцентный белок маркировки клеток, представляющих интерес продолжает оказывать прямое доказательство и механических понимание многих различных динамических процессов, таких как дегенерации аксонов, Ca 2+ сигнализации, регенерации аксонов, астроцитов физиологии, микроглии физиологии и ответ на повреждение 17-25.

В отличие от аксонов, очень мало известно ответов миелиновых травмы в режиме реального времени. Миелин является жизненно важным компонентом белого вещества создан и поддерживается олигодендроцитах в клетках ЦНС и Шванновских в ПНС. Миелин изолирует 99% поверхности аксонов и тем самым обеспечивает высокую сопротивления, малой емкости защитное покрытие, которое поддерживает быстрое и эффективное Сальтаторные распространение импульса, недавно рассматривался Buttermore и др. 26. Чтобы захватить динамические характеристики миелина на повреждение, мы используем сольватохромные, липофильныхфлуоресцентный краситель Нила Red 27. Сольватохромных свойства этого витальной окраски позволяют спектральные сдвиги его спектра излучения, которая зависит от физико-химической среде 28,29. Эти свойства полезны, чтобы разобраться в механизмах axomyelinic травмы и может быть визуализированы с помощью соответствующим образом выбранных дихроичными и фильтры выбросов или разрешено с помощью спектрального микроскопа 27. Например, спектр излучения Найл Ред является сине-смещается в менее полярных липидов богатых средах, таких как те, что в адипоцитах и нормальной миелина ЦНС (максимум излучения ~ 580-590 нм) 27. В отличие от этого, пики спектра излучения этой жизненно важной красителя по крайней ~ 625 нм endbulbs, образующихся в аксонов подвергаются аксонов отмирание 27. Хотя точные механизмы, лежащие в основе этих спектральных сдвигов в частности, в endbulbs по сравнению с нормальной миелина остаются неясными, такие спектральные изменения могут выявить основные изменения в накоплении белка или дезорганизации, ведущего квоздействие гидрофобных сайтов связывания 27.

В то время как изображения в естественных это конечная метрика для наблюдения спинного мозга динамику аксонов травмы в их родной среде, это технически сложным и требует значительных хирургического опыта, и часто повторяют операции, чтобы разоблачить спинной колонки, которые могут представить экспериментальные артефакты (например, воспаление рубцовой формирование). Кроме того, дорогостоящего оборудования часто требуется, чтобы подвески и позиционирование интактного животного под микроскопом объектива. Животные должны быть тщательно проверены, а чтобы они оставались теплыми, чтобы обеспечить жидкости пополняется, и гарантировать, что нет никаких признаков гипоксии из-за длительного наркозом сессий визуализации. Последнее чрезвычайно важно, так как аксоны и миелиновых абсолютно требует постоянного перфузии и адекватные уровни кислорода, чтобы оставаться жизнеспособными. Тем не менее, это часто не сообщается или контролируются в наиболее естественных условиях исследования вДата. Кроме того, артефакты движения из-за сердечного ритма и дыхания (ИФ анестезии взрослой мыши: ~ 300-450 ударов в минуту (BPM) является оптимальным для поддержания 97-98% насыщения кислородом (нормальная скорость ~ 632 BPM) и ~ 55-65 вдохов в мин (нормальная скорость составляет ~ 163 вдохов в минуту), соответственно)) 30 столкнулись во время в естественных условиях спинного марки изображений шнур дифференциации первичных и вторичных аксонов ответов травмы при высоком разрешении флуоресцентной микроскопии трудно, так как даже самые быстрые лазерного сканирования неизбежно подчиняются этим движением артефакты. Успехи в сверхбыстрых резонансных сканеров в сочетании с имплантируемого твердого позвоночника в рамке окна может позволить визуализации мышиного спинного мозга у бодрствующих животных, но раз быстрее сканирования неизбежно уменьшить отношение сигнал-шум качество изображения унижающие. Дальнейшие улучшения в методах визуализации спинного мозга, в настоящее время используются для визуализации головного мозга может преодолеть многие из этих препятствий и ограничить потенциальные смешивает вносимые INAdequate тканевой перфузии, например, 31-33.

Многое из того, что известно о белого вещества физиологии и механизмов белого травмы вещества была определена с использованием в пробирке или бывших естественных препаратов белого вещества из зрительного нерва, периферического нерва, и полоски спинного мозга белом веществе 34-41. Эти препараты продолжают продвигать наши знания о белых механизмов травмы от того, как они позволяют контролируются изменения в экологических факторов, контролируемое применение лекарственных препаратов и реагентов, функциональные оценок с использованием электрофизиологии, а прямые флуоресцентной микроскопии наблюдения аксонов и миелина в живой ткани. Тем не менее, некоторые прежние подходы наблюдать аксоны от спинного мозга полос спинной колонки или брюшной полос белого вещества неизбежно травмировать поверхности аксонов на стадии удаления, которые могут повлиять на реакцию тесно отличие аксонов. Чтобы воспользоваться экспериментальными манипуляции над и избежать повреждения веRy волокна под следствием, мы используем Экс Vivo шейного отдела спинного модель мозга, так как предотвращает непосредственный контакт спинной части мозга. Таким образом, архитектура мягкой мозговой оболочки и прилегающих поверхностной дорсальной аксонов столбцов остаются жизнеспособными и невозмутимо во время изоляции.

Здесь мы описываем относительно простой подход, который позволяет непосредственно наблюдать центральных миелиновых аксонов, как они динамически реагировать на фокальной травмы в режиме реального времени до 8 - 10 + часов после травмы. Травмы спинного мозга (Lisci) модель лазерно-индуцированной позволяет дифференцировать между первичными и вторичными механизмов аксонов травмы, первичное поражение (абляции сайта) остается пространственно ограниченных во времени. Изображения камеры открытым ванна доступна терапевтического вмешательства, доставка реагентов и экологических манипуляций. Предполагаемые axomyelinic защитные агенты могут быть быстро оценены в реальном времени с помощью прямых наблюдений по сравнению с длительных и дорогостоящих экспериментов, связанных с процессом тканейING, секционирования, иммуноокрашивания, захват изображения, и анализ, и, следовательно, обеспечивает полезную суррогатной модели для оценки острых ответов и защитные манипуляции перед тестированием экспериментальные агентов в живых животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными уходу и использованию комитета Институциональная животных в университете Луисвилля, придерживаясь федеральных нормативных актов.

1. Подготовка Низкий Са 2+ и 2 мМ Са 2+ Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) Perfusates

  1. Подготовка 2x низким Ca 2+ (0,1 мм) со С буфер, 2x нормально Ca 2+ (2 мм) со буфер и буфер 2x Stock B, как описано в таблице 1. Отдельные исходные растворы возможности изменения содержания ионов (например, низкий или нулевой Са 2+) и может храниться при 4 ° С в течение до одного месяца.
  2. Для внутрисердечного перфузией при вскрытии, добавить 100 мл 2 раза низкой Ca 2+ со С и 100 мл 2 раза со В в пластиковой бутылке, чтобы 1x низкой Ca 2+ ACSF. Смешивать и хранить в течение ночи при 4 ° С или сделать свежий.
  3. Для перфузии Экс Vivo спинного мозга во время ИМАГING, добавить 500 мл 2 раза нормальной Ca 2+ запасе и 500 мл 2 раза со B в стеклянный флакон 1 л генерировать 1x ACSF. Смешивать и хранить в течение ночи при комнатной температуре или сделать свежий.
  4. Отрегулируйте рН ACSF буферов до 7,4. При поддержании ACSF при комнатной температуре, поместить низкой Ca 2+ ACSF на льду, а затем пузырь как буферы с карбогена газа (95% O 2, 5% СО 2) в течение 30 мин перед использованием, и непрерывно в процессе перфузии.

2. Подготовка Ex естественных изображений палаты

  1. Оберните одеяло отопления (без автоматического выключение) вокруг бутылки ACSF и отрегулируйте температуру до низкого / среднего обстановке.
  2. Вставьте специальный ACSF перфузии линии в бутылку, подключенного к перфузии насоса и в он-лайн нагревателем, который управляется с помощью биполярного регулятора температуры и обратной связи датчика температуры, как показано на рисунке 1А.
  3. Прикрепите с плоским микроскопа этап вставки (152 х 102 мм) с 2-фотонного возбуждения / конфOcal микроскоп этап оснащены разлива контейнера.
  4. Место большой открытой ванной перфузии камеры (Ш х Д х В, 12 х 24 х 8 мм) в сливной контейнер для размещения и обеспечения непрерывного потока свежего кислородом ACSF экс естественных спинного мозга (рис 1B подходящего экс естественных изображений конструкции камеры).
  5. Подключите металлический порт выхода в линию отопительного экс естественных изображений камеры с помощью подходящую трубку. Место тонкий абсорбирующей прокладки под экс виво изображения камеры, чтобы помочь поддерживать температуру буферного / ткани во время съемки.
  6. Придерживайтесь экс естественных изображений камеры в нижней части разлива контейнер / Stage вставки с помощью съемного липкий тактику. Податливость липкой липкости позволит камере быть скорректированы по мере необходимости, чтобы обеспечить путь света Цель состоит перпендикулярно к поверхности ткани. Если необходимо, используйте уровень бычий глаз, чтобы отрегулировать камеру.
  7. Безопасныйв линию Датчик температуры обратной нагреватель вблизи впускной камеры жидкости и нержавеющей стали всасывающая трубка соединена с вакуумной линией на выходе из камеры. Магнитной ленте и необходимости микропипетка держатели полезны в этом отношении. Включите источником вакуума.
  8. Включите перфузии насоса, чтобы начать заполнение изображения камеры с кислородом ACSF. Установите перфузии насос 1,5-2 мл в минуту.
  9. Контроль объема ACSF в камере формирования изображения путем регулировки вакуумную линию. Важно, что есть достаточно ACSF в камере формирования изображения для покрытия спинного мозга сегмента и обеспечить достаточное рабочее расстояние между водой погружением цели и поверхностью ткани. Миелин и аксоны могут быть отрицательно затронуты, если сегмент ткани не полностью погружается в свежем кислородом ACSF приводит к экспериментатор-индуцированных артефакты.
  10. Регулировка регулятор температуры нагревателя в линию таким образом, чтобы температура перфузат в камере формирования изображения находится вблизи комнатной температуры.
<P CLASS = "jove_title"> 3. Вскрытие взрослых мышиный шейного отдела спинного мозга

  1. Эвтаназии взрослого 6-10 недель старый Thy1 -YFP трансгенной мыши (использование соответствующего штамма, который имеет флуоресцентный экспрессию белка в заднекорешковых ганглиев) путем введения передозировки в анестезии пентобарбиталом натрия (200 мг / кг) через внутрибрюшинного введения.
  2. После того, как под должном уровне анестезии (например, никакой реакции до пят крайнем случае и утрате мерцания рефлекса), осторожно побрить кожа, покрывающая спинного и головного мозга при хирургическом клиперов. Очисти кожу с помощью бетадин и 70% этанола колодки.
  3. Спрей груди / живота с 70% этанола, а затем заливать тему транскардиальную использованием охлажденной, карбогена-ыми низкий Ca 2+ ACSF. (Смотрите рисунок 1С для предложенной вскрытия НАСТОЛЬНАЯ настроить).
  4. Как бледнеет печени, обеспечить перфузии иглу в сердце с помощью небольшой клип. Поверните объект, чтобы получить доступ бритая спинной сторонеПредмет и протрите бритая зона с 70% этанола.
  5. Сделайте надрез спинной кожи вдоль средней линии, начиная от носа до тазобедренного сустава с использованием рассечение ножницами, чтобы разоблачить мозга и позвоночного столба (рис 2а). Безопасный препарат путем размещения контакты в нос и бедро.
  6. Использование рассечение микроскоп с этой точки зрения, твердо пересекают спинной поверхности черепа на уровне обонятельных луковиц. Вставка один из ножниц наконечниками в боковых краев разреза и разрезать вдоль краев тюбетейке билатерально до мозжечка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не полностью иссечь тюбетейку, как это понадобится в дальнейшем поднять лежащего ткани от спинного мозга на протяжении вскрытия (рис 2б).
  7. Поднимите тюбетейку, чтобы разоблачить мозга. Аккуратно разрезать слева и справа края Кость инков (находится в мозжечке) и вытащить его обратно каудально, чтобы разоблачить ствола мозга / спинного мозга (рис 2С
  8. Используйте точная наклоненная ножницы, проводимых под углом 45 ° к поверхности стола и разрезать позвонки на двусторонней основе только уступает корней задней нерва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегать контакта с яркими белыми колоннами спинных. Эти волокна являются те, которые будут в образ (рис 2D) и могут быть легко повреждены.
  9. Поднимите тюбетейке и спинной поверхности позвоночного столба с тонкими наконечником пинцетом, осторожно потянув лежащего ткани в одно целое, как разрезы, чтобы обнажить спинного мозга. Продолжить, чтобы сократить позвонков к верхней грудной уровне, чтобы изолировать 1-2 см сегмент шейного шнура для последующей визуализации (рис 2E).
  10. Используйте ножницы, чтобы вырезать ткань / кости параллельно позвоночнику и чистой ткани под колонны. Сделайте надрезы как можно ровнее. Очень важно, что ткань лежит плоско в камере таким образом, чтобы шнур уровня для визуализации.
  11. Используйте # 11 скальпель, чтобы секут ствол головного мозга (в прошломпрекращение грацильных пучке волокон) и на верхнем уровне грудной изолировать шейного отдела спинного мозга (см рис 2F). Используйте ножницы, чтобы вырезать ткань / кость при тех же двух точках. Выделенную ткань должна содержать 2/3 позвоночного столба, охватывающей хвостовой ствол головного мозга, увеличение шейки и верхней грудного отдела спинного мозга (рис 2G).
  12. Поместите изолированный позвоночник в чашку Петри с карбогена-ыми, охлажденной низкой Ca 2+ ACSF. При необходимости, обрезать ткань под позвоночника, пока он не станет плоской в ​​блюдо.
  13. Передача изолированный позвоночник экс естественных изображений камеры и постепенно увеличивать Перфузат температуры в течение 1 часа до 36 - 37 ° C. Поддерживать эту температуру во время съемки.

4. Размещение Ex Vivo спинного мозга в визуализации палаты и миелина маркировки с видом на Нил красный

  1. Тщательно закрепите позвоночный столб в Imaging камера с соответствующей арматуры ломтик удерживайте нажатой изменены с вертикальной сетки платформы, состоящей из мелких лайкры нитей (удалить средние нити сетки платформы, чтобы пространство для спинного мозга; рис 3а).
  2. Оттепель аликвоту Нила Красный (5 мМ наличии в ДМСО и 0,22 мкм фильтруют; можно хранить в течение 1 месяца при 4 ° С, либо 6 месяцев при -20 ° C в темноте). Прежде, чем добавить Нила красного до изображения камеры, уменьшить поток перфузии насоса и отрегулируйте вакуумную линию, чтобы жидкость в камере всегда покрывает спинной мозг.
  3. Добавить 5-10 мкл Найл Ред маточного раствора в камере формирования изображения вблизи хвостового конца шнура (фиг.3В). Используйте 1 мл пипетки осторожно перемешать Нила Красный всей камере. Разрешить Нила Red остаться в камере в течение 1-2 мин, затем поместите вакуумную линию возврата и регулировки перфузии насос 1,5-2 мл в минуту непрерывно заливать спинного мозга.
  4. Осторожно поднимите столик микроскопаи выровнять цели с центром спинного мозга сегмента и медиально по столбцам спинных, пока вода не иммерсионный объектив примерно 10 мм от поверхности ACSF в камере. Использовать микроскоп револьверная головка фокусировки колесо медленно довести цели, пока она слегка касалась поверхности ACSF. Используйте эпифлуоресцентной источник света, чтобы сосредоточиться столбцы спины в поле зрения (рис 3C).

5. Ex Vivo Визуализация мозга мыши спинного с TPLSM и лазерно-индуцированной повреждением спинного мозга (Lisci)

Примечание: Задняя вены обеспечивает полезный маркер для центрирования ткани, как грацильными пучке волокон (происходят из тела клетки из ганглиях задних корешков и подниматься из Т6 и ниже вдоль средней линии спинного мозга) проходят параллельно этой кровеносного сосуда. Более толстые YFP ​​+ шейки зуба прогнозы спинные также обеспечивают полезный маркер, как поднимаются волокон и спуститься с боков к YFP + грацильный пучке волокон, которые меньше в диаметре.

  1. После того, как ткани спинного мозга выравнивается надлежащим образом, переключение в режим лазерного сканирования для выполнения базовой визуализации восходящих худой пучке миелиновых волокон. Для возбуждения как YFP и Найл Ред, использовать двухфотонный лазерный источник, настроенный на длину волны 950 нм (~ 17 мВт, измеренного на выходе из 25X, 1,1 Н. объективной) и соответствующих дихроичными (СД) и полосовых фильтров для изоляции флуоресцентное излучение флуорофоров (мы используем 525/50 DM560, DM640 600/60 и 685/70, отделить YFP, и Найл Ред в желто-оранжевый, и расширенные красного каналов, соответственно).
    1. Если более чем на 3% из аксонов показать аксонов сфероидов в течение базового томографии (30-60 мин), отбросить подготовку за счет экспериментатора-индуцированной артефактов.
  2. Вызвать Lisci, увеличивая поле зрения до 30.3X (для создания диаметр абляции ~ 20 мкм). Tune лазер 800 нм, а также увеличить мощность лазера до ~ 110 мВт приобразец. Разрешить 5 полное поле зрения лазерного сканирования для обеспечения волокна полностью перерезана.
  3. Подтвердите Lisci, изменив настройки лазерные вернуться к настройкам визуализации (950 нм, 17 мВт на образец, 2.08X) и сканировать ткани для визуализации абляции. Проверка диаметр абляции и что первичные удалена аксоны полностью перерезана (рис 3D). Используйте настройки покадровой на микроскопе в сочетании с захватом г для записи динамических характеристик аксонов и миелина-за травмы до 8-10 + часов после травмы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если удаление является неполной (то есть, неполная рассечение волокон), отказаться от подготовки, как определение механизмов первичного и вторичного повреждения будут посрамлены. Кроме того, отдельные сегменты спинного мозга могут быть отображены до 24 ч после Lisci только с легкой до умеренной Lisci независимую повреждения тканей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подробная информация о соответствующем лаборатории, созданной необходимого для изоляции, поддерживать жизнеспособность, и изображения экс естественных спинного мозга показано на рисунке 1. Микроскоп должен быть оборудован настраиваемым импульсным фемтосекундного лазера, соответствующих dicroics и фильтров выбросов, а также водо- погружения объектив с высокой числовой апертурой (≥1.0). Для обеспечения жизнеспособности спинного мозга во время вскрытия, процедура должна быть выполнена в присутствии охлажденного кислородом низкой ACSF Ca 2+, что позволяет достаточно Ca 2+ для изолированных аксонов мембраны для герметизации 42. Невыполнение этого требования может привести к axomyelinic ущерб, включая отделения миелина от аксолемма и аксонов формирования сфероида видном во время базового изображения. Характерные изображения процессе вскрытия и изоляции экс естественных спинного мозга показано на рисунке 2. После выделения жизнеспособность спинного мозга мaintained непрерывной перфузии кислородом ACSF, который хранится в 36-37 ° C. Миелина пятна Найл Ред 27,43 затем может быть добавлен к перфузионной камеры, и исходные записи в пучке грацильного мякотных аксоны может начаться (рисунок 3).

Характерные изображения грацильных пучке миелиновые аксонов показаны на рисунке 4. Под исходными условиями Интервальная TPLSM записи показывают параллельные краю YFP + аксоны ensheathed в миелина (Нил красный) в основном с постоянными диаметрами по всей длине аксона. Несколько аксонов сфероидов или других морфологических признаков дегенерации аксонов присутствуют. В связи с сольватохромных свойств Нила красный и липидного и белкового содержания миелина, миелин окрашивали желто-оранжевый в то время как ряды органов предполагаемый олигодендроцитов темнее, оранжевый (рис 4а). Мелкие детали, такие как Ранвье также может быть решена (например, стрелки в

В 10 минут после Lisci, сразу перерезают аксоны (первичный травмы), расположенные ростральная и каудально по отношению к абляции сайта начинаются отказаться от места повреждения и образуют сигмовидной подобные катушки внутри опухшие воздухоплавания миелина. Миелин оболочечная аксоны пульт дистанционного управления для удаления приведены без изменений в этот момент времени. По 40 мин после Lisci Большинство первичных перерезана аксонов и аксонов, проходящих вторичную дегенерацию (т.е. изначально избавлен от обиды, но позже, вырожденные) образуют характерные endbulbs как они убрать с сайта поражения (рис 4В). Примерно треть этих перерезанных аксонов подвергаются пан-фрагментации, где проксимальный сегмент первые набухает, образует аксонов сфероидов, и в конце концов разрезов аксона на несколько нерегулярных длины аксона 43. Разделение миелина из аксонов (пригородных аксонов отек) и везикулярного дегенерации миелина также очевидно. Со временем, первичный и вторичный Tranпересекаемое аксоны Продолжайте задвигать от поражения сайта, аксоны сразу фланговые абляции сайт подвергать вторичной дегенерации и пригородных аксонов опухоль становится более заметным, а также миелина отек и везикулярного дегенерации (рис 4D-G, также см 43). Ясно различие в степени аксонов втягивания становится очевидным, между проксимальных аксонов пней (каудально поражения) и их дистальных сегментов (ростральнее поражения), которые предназначены для прохождения валлеровский дегенерации (рис 4D-G). Аксоны изначально избавлен от Lisci пройти задержка вторичный дегенерация (рис 4H). Представитель контрольный эксперимент без Lisci, предполагает, что длинные сеансы визуализации (до 13 часов после изоляции шнура в данном примере) возможно без негативного воздействия на белом целостности материи (Рис 4I, J).

Представитель высокого расценкилюции изображения axomyelinic изменений после Lisci показаны на рисунке 5.

По 3 ч после Lisci несколько проксимальных (хвостовой) аксоны отходя от поражения месте, где они остаются в течение опухшие миелиновых трубок, которые, отделенных друг от аксона. Другие аксонов endbulbs по-видимому, будет ограничен миелиновой (рис 5А). Аксоны, прилегающих к абляции сайте подвергать вторичной дегенерации в то время как другие, кажется, не влияет. YFP низкие / отрицательные предполагаемые везикулы (бледно-голубой) в течение аксона и аксонов endbulbs также присутствуют. В отличие от каудально втягивания волокон, большинство рострально втягивания аксонов endbulbs и сфероидов в 3 ч после Lisci сильно помечены красным Нила (менее синий смещен) свидетельствует об изменении окружающей течение аксона (фиг.5В). Нил Red-меченные области внутри активно втягивания аксонов появляются в основном окружают или ограничить аксонов ядра. Хотя точное местоположение и язьntity из этих внутри аксонов Нила Red-меченых структур в настоящее время неизвестны, они могут представлять плотную накопление пузырьков через аксонов транспортировки и / или расщепленных белков, подвергая их гидрофобного ядра 27. Нил Красный помечены миелина остается в основном желто-оранжевого нормального появления миелина. В отличие, Нил Red исследовали везикулярного миелина появляется желтый (т.е. синий смещается), указывающий изменений в окружающей среде в рамках этих структур. К 7 ч после Lisci аксоны Продолжайте задвигать от поражения сайта; Однако, это более очевидно в ростральной (фиг 5D) по сравнению с хвостовыми (5С) endbulbs. Другие аксоны проходят полное или частичное разрушение, оставляя пустую миелина трубку или тонкий стебель несколько микрон вдали от вырождающейся сегменте. Задержка применение Нила красный после Lisci показывает аналогичный аксонов маркировке предварительной заявки Нила Red наводящий, что абляция сама по себе и потенциальные тепловые эффекты на денатурации белков являетсявряд ли ответственность за Нила Red спектральных сдвигов в миелина и аксонов после травмы (рис 5E, F).

В совокупности эти данные иллюстрируют полезность экс естественных Lisci модели для имитации хорошо известны, но мало изученных механизмов острой axomyelinic травмы в режиме реального времени. Поэтому модель может быть полезна для дальнейшего наше знание патофизиологии белого травмы вещества, и раскрыть основные молекулярные мишени для сохранения белого целостность вещества.

Рисунок 1
Рисунок 1: Обзор установки вскрытия и обработки изображений. () Предложил установка для экс естественных изображений спинного мозга. Основным оборудованием, необходимым включает карбогена (95% O 2/5% CO 2) к газопроводу с кислородом ACSF, перфузии насос для доставки карбогена-Бабкровь ACSF через в линии контроллера нагреватель / температура устройства, оснащенного обратной температуры зонда и открытой ванной предназначены изображений камеры, снабженной источником вакуума. (B) выше, увеличение изображающего ванной камеры показано на рисунке. (C) предложил установка для перфузии и рассечение экс естественных спинного мозга. Охлажденная низким Ca 2+ ACSF в кислородом с карбогена и используется для поддержания жизнеспособности мозга при вскрытии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2:. Выделение спинного мозга для визуализации (А) При непрерывном охлажденной, насыщенный кислородом низкой Ca 2+ перфузии в SkulLCAp подвергается. (B) разрез делается через спинной поверхности черепа на уровне обонятельных луковиц (пунктирная линия). (C) Двусторонние разрезы затем сделал через боковые границы тюбетейке, пока он не может быть аккуратно поднял и вытащил каудально (по направлению стрелки), чтобы выставить ствол головного мозга. (D) Продолжать двусторонние разрезы с прекрасными наконечником ножницы, чтобы вырезать боковые стороны позвонков и выставить колонки спинной (стрелки). (Е) подвергается ствола мозга и вся расширение шейки матки в верхнюю грудного сегмента спинного мозга показаны. (F), два разреза с рядом 11-скальпелем сделаны, чтобы изолировать спинного мозга в стволе головного мозга, за грацильных пучке аксонов окончаний и верхней грудной уровне ( пунктирные линии). (G) изолированного спинного мозга затем переносят в чашку Петри, содержащую охлажденный низкой Ca 2+ ACSF барботироваликарбогена газа. Корни шейки спинной (например, наконечники стрел), спинной ганглий корень, и спинной мозг от верхнего грудного отдела до мозга (~ 15-20 мм) остаются нетронутыми. Бар Шкала в G:. 2 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Визуализация Экс Vivo спинной мозг () После размещения в камере, ткани спинного мозга крепится с помощью модифицированного ткани / срез удерживайте оснащены лайкры нитей (B) миелин пятно Нила Red добавляется непосредственно в. изображений камеры. (С) погружением в воду Цель погружен в ACSF и расположены над грацильных пучке волокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4:. Lisci модель центрального миелинизированы травмы аксонов TPLSM был использован для захвата динамики аксонов и миелиновых ответов следующие Lisci (*). Типичные изображения отображаются в виде максимальных прогнозов интенсивности пять толстых оптических срезов 1 мкм, снятых при 0,24 мкм / пиксель с Nikon A1RMP + многофотонное / конфокальной микроскопии, оснащенной 25X; НС: 1,1; WD: 2 мм погружением в воду цель. Стандартный дихроичными и фильтры выбросов были использованы для разделения YFP + аксоны (525/50 DM560, показанные в синий цвет) и сольватохромных липофильный флуоресцентный краситель Нил Rред в короткий (600/60 DM640, показанные в зеленом цвете) и более (685/70 нм, как показано красным) каналов выбросов. Два комбинации последних фильтр выгодны, как они захватывают известные спектральные сдвиги Найл Ред в в различных физико-химических средах. (А) В исходных условий аксонов (YFP +, синий) и миелина (NR, желто-оранжевый) появляются обычно ориентированы с несколькими сфероидов или другие признаки axomyelinic травмы. Ряды глии с характерной морфологией белых олигодендроцитов вещества (NR, темно-оранжевого, например стрелок) также видны (некоторые отмечены для ясности), и мелкие структуры, такие как Ранвье также решена (например, стрелки). (В) В 10 мин после Lisci, перерезана аксоны, расположенные ростральная и хвостовой к поражению начинают втягиваться от места повреждения и образуют сигмоидальных, как катушки (стрелки) в опухшие миелина. Миелин оболочечная аксоны, удаленной от уноса приведены без изменений в этот момент времени. (С) Bу 40 мин после Lisci Большинство первичных перерезана аксонов и аксонов, проходящих вторичная форма дегенерации характерные endbulbs, как они отходить от поражения сайта (стрелки). Некоторые аксоны пересекали также образуют сфероидов вдоль длины их аксонов (стрелки). Разделение миелина от аксона (пригородных аксонов опухоль) и везикулярного дегенерации миелина также очевидно (+). (ГД). В течение долгого времени, первичные и вторичные поврежденные аксоны продолжают втягивания от повреждений месте, и, как показано на YZ выступов в Lisci, изначально избавлены аксоны фланговые абляции сайт подвергаются задерживается среднее дегенерации (H, левая панель перед Lisci, средняя панель 10 минут после Lisci, и правая панель 7 ч после Lisci; белые точки отметить начальное Lisci, красные точки показывают потеря аксонов на 10 мин и зелеными точками отражают степень задержки вторичной дегенерации аксонов на 7 часов). Пери-аксонов опухоль становится более заметным в более поздние моменты времени после Lisci. Степень OF аксонов отвода и морфология аксонов endbulbs между проксимальных аксонов пней и их дистальных сегментов также становится очевидным (Также см Рисунок 5 изображение более высокого увеличения). Масштабная линейка:. 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Представитель изображения с высоким разрешением axomyelinic изменений после Lisci TPLSM был использован для захвата сложных деталей из аксона и миелина меняет хвостовой (A, C) и ростральной (B, D) на повреждение на 3 часа (A, B) и 7 ч (С, D) в соответствии с Lisci. Типичные изображения отображаются в виде максимальных прогнозов интенсивности трех толстых оптических срезов 1 мкмзахвачен в 0,0832 мкм / пиксель с Nikon A1RMP + МФ / конфокальной микроскопии. () Хвостовой к Lisci (*), несколько аксонов (синем) блоке втягивания от поражения сайта (большие стрелки) в опухших миелиновых трубок (желто-оранжевый ), которые разделены от аксонов endbulb. Некоторые аксоны, прилегающих к абляции сайте подвергать вторичной дегенерации (маленькие стрелки) в то время как другие, кажется, не влияет. YFP низкие / отрицательные предполагаемые везикулы (бледно-голубой) в аксона и аксонов endbulbs присутствуют (стрелки). Центральный узел Ранвье (п) также хорошо видны с помощью этого изображений и маркировка техники. (B) В отличие от каудально втягивания волокон, большинство из рострально втягивания аксонов endbulbs и сфероидов в 3 часа после Lisci сильно помечены Нила Красный (розовый). Нил Red-меченные области в втягивания аксонов появляются в основном окружают или колпачок YFP меченых аксонов (синие, большие стрелки). Хотя природа этих Нила Красной меткиред структуры в настоящее время неизвестно, они могут представлять плотную накопление пузырьков через аксонов транспортировки и / или расщепленных белков, подвергая их гидрофобного ядра. В отличие, Нил Красный помечены везикулярного миелин (стрелки) появляется желтый (т.е. спектр синий смещается) по сравнению с нормальным миелина (желто-оранжевый), что свидетельствует о предполагаемых изменений окружающей среды в рамках первого. Пери-аксонов опухоль проявляется также (для небольших наконечники стрел). В 7 часов после Lisci, аксоны Продолжайте задвигать от поражения сайта; Однако, это более очевидно в ростральной (D) по сравнению с хвостовыми (C) endbulbs. Некоторые аксоны проходят полное или частичное разрушение, оставляя пустую миелина трубки (стрелка в C) или тонкий стебель несколько микрон от вырождающейся сегменте (маленькие стрелки в D), соответственно. Задержка применение Нила Red производит аналогичные спектральные сдвиги в каудальной в сравнении Ростральные центральные миелиновые аксонов (E и F (C, D). Масштабная линейка:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

2x Stock (2 мМ Ca 2+) Реагент мМ
NaCl 252
KCl 6
CaCl 2 • 2H 2 O 4
2x Stock B NaH 2 PO 4 2,5
MgSO 4 4
NaHCO 3 52
Декстроза (D-глюкозы) 20
2x низким Ca 2+ со C (0,1 мМ Ca 2+) NaCl 252
KCl 6
MgCl • 6H 2 O 3,8
CaCl 2 • 2H 2 O 0,2

Таблица 1: Искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) буферы.

Name Company Catalog Number Comments
Large bath chamber with slice supports Warner Instruments RC-27L For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports Warner Instruments SS-3 For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers Warner Instruments SHD-27LP/10 For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed Warner Instruments ST-1L For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler Warner Instruments SC-20 To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller Warner Instruments CL-100 To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System Warner Instruments LCS-1 To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers Warner Instruments CC-28 To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable Warner Instruments TS-70B To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing Bioscience Tools MTH-S To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder Bioscience Tools MTH To hold the temperature probe
clear silicone sealant For ex vivo imaging chamber
superglue For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips For ex vivo imaging chamber
nile red Life Technologies N-1142 For labeling myelin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
  3. McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
  4. Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
  5. Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
  6. Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
  7. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
  8. Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
  9. Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
  10. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
  11. Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
  12. Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
  13. Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
  14. McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
  15. Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
  16. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  17. Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
  18. Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
  19. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
  20. Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
  22. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  23. Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
  24. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  25. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
  26. Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
  27. Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
  28. Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
  29. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  30. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
  31. Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
  32. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
  33. Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
  34. Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
  35. Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
  36. Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
  37. Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
  38. Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
  39. Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
  40. Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
  41. Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
  42. Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
  43. Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).

Tags

Neuroscience выпуск 93 повреждение спинного мозга аксона миелиновой Двухфотонный лазерный микроскоп Нил красный дегенерация аксонов аксонов отмирание аксонов отвод
<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Лазерно-индуцированное Травма спинного мозга модель для оценки Механизмы дегенерации аксонов в режиме реального времени
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okada, S. L. M., Stivers, N. S.,… More

Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. J. Vis. Exp. (93), e52173, doi:10.3791/52173 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter