Abstract
Skadade CNS axoner inte regenerera och ofta dras bort från skadeplatsen. Axoner förskonade från den ursprungliga skadan kan senare genomgå sekundär axonal degeneration. Brist på tillväxt konen bildning, regeneration, och förlust av ytterligare myeliniserade axonal prognoser inom ryggmärgen begränsar kraftigt neurologisk återhämtning efter skada. För att bedöma hur centrala myeliniserade axoner i ryggmärgen svarar på skada, utvecklade vi en ex vivo levande ryggmärgen modell använder transgena möss som uttrycker gula fluorescerande protein i axoner samt en kontaktpunkt och mycket reproducerbar laserinducerad ryggmärgsskada att dokumentera öde axoner och myelin (lipofila fluorescerande färg Nile Red) över tid med hjälp tvåfotonexcitering time-lapse mikroskopi. Dynamiska processer såsom akut axonal skada, axonal retraktion och myelin degenerering bäst studeras i realtid. Emellertid, den icke-fokal karaktär kontusion baserade skador och rörelseartefakter påträffasunder in vivo ryggmärgen avbildning gör differentiera primära och sekundära axonal skada svar via högupplösta mikroskopi utmanande. Den ex vivo ryggmärgen modell som beskrivs här härmar flera aspekter av kliniskt relevanta kontusion / kompressions-inducerad axonal patologier inklusive axonal svullnad, sfäroid formation, axonal transection, och peri-axonal svullnad ger en användbar modell för att studera dessa dynamiska processer i realtid. Stora fördelar med denna modell är utmärkta Spatiotemporal upplösning som tillåter differentiering mellan primär förolämpning som direkt skadar axoner och sekundära skademekanismer; kontrollerad infusion av reagenser direkt till perfusatet bad sladden; exakta förändringar av miljö miljön (t.ex. kalcium, natriumjoner, kända bidragsgivare till axonal skada, men nära omöjligt att manipulera in vivo); och musmodeller erbjuder också en fördel eftersom de ger en möjlighet att visualisera ochmanipulera genetiskt identifierade cellpopulationer och subcellulära strukturer. Här beskriver vi hur du isolera och bild levande ryggmärgen från möss att fånga dynamiken i akut axonal skada.
Introduction
Degeneration av axoner är en framträdande orsak till sjuklighet spänner flera neurologiska tillstånd inklusive neurotrauma, stroke, autoimmuna och neurodegenerativa sjukdomar. Till skillnad från det perifera nervsystemet (PNS), centrala nervsystemet (CNS) axoner har en begränsad förmåga att regenerera en gång skadade på grund av både inre och yttre hinder (dvs hämmande molekyler till axonal tillväxt produceras under ärrbildning och frigörs under myelin degeneration) 1 -7. Även om flera av dessa hinder har genomgått omfattande utforskas, till terapeutiska interventioner som syftar förhindra CNS axonal degeneration, främja robust axonal regeneration, och återställa funktionell connectively, fortfarande begränsade.
Axoner gång separerade från deras soma genomgår en stereotyp urartningsprocess kallas Wallerian degeneration som kännetecknas av axonal svullnad, sfäroid bildning och eventuell fragmentering (översikt i 8). IDäremot proximala stubbe som finns kvar i kontinuitet med soma av en transected perifer axon, bildar en svullnad vid dess slut, dör tillbaka till närmaste Ranviers nod, och kan sedan initiera tillväxt konen bildning, en viktig förutsättning är nödvändig för efterföljande axonal regeneration 9-11. Däremot de proximala axonal ändelser av många centrala axoner bildar karakteristiska "endbulbs" eller indragnings lökar, misslyckas med att bilda tillväxt kottar, och istället dra ifrån skada plats där de stannar i månader efter skada 12-15. Utöver den primära axonal skada, kan ytterligare axonal skada / förlust också uppstå till axoner som till stor del skonades från den ursprungliga skadan. Detta försenade axonal förlust av initialt skonade axoner kallas sekundär axonal degeneration. Denna inneboende respons av CNS axoner till skada gör funktionell axonal regeneration en ännu svårare mål att uppnå i hjärnan och ryggmärgen.
Fastän hektarllmarks av axonal skada (t.ex. sfäroid formation, indragnings glödlampor) har väl karakteriserats från obduktion vävnad och experimentella modeller av axonal degeneration, har belysning av de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa dynamiska processer begränsats. De flesta av dessa studier förlitat sig på statiska endpoint observationer som i sig misslyckats med att fånga enskilda axonal svar över tiden. Även exogent tillämpade axonal spårämnen har varit användbara för att belysa axonal svar från statiska sektioner och under live-avbildning, har tillgången på genetiskt kodade axonal markörer förbättrats avsevärt vår förmåga att visualisera axoner i realtid med hjälp av fluorescens mikroskopi. Faktum en sädes- rapport från Kerschensteiner och kollegor först förutsatt direkta bevis för axonal degeneration och regeneration in vivo med hjälp Thy1 -GFP-S möss som kodar grönt fluorescerande protein i delmängder av nervceller som skickar sina prognoser i de dorsala kolumnerna i spinalsladd 16. Live avbildning med två photon laserskanning mikroskopi (TPLSM) och genetisk fluorescerande proteinet märkning av celler av intresse fortsätter att ge direkta bevis och mekanistisk insikt i många olika dynamiska processer såsom axonal degeneration, Ca2 + signalering, axonal regeneration, astrocyternas fysiologi, microglial fysiologi, och svar på skada 17-25.
I motsats till axoner, är mycket lite känt om myelin svar på skada i realtid. Myelin är en viktig del av vit substans som produceras och upprätthålls av oligodendrocyter i CNS och Schwann celler i PNS. Myelin isolerar 99% av ytan av axoner och därigenom ger en hög motståndskraft, låg kapacitans skyddande hölje som stöder en snabb och effektiv saltatorisk impulsutbredning, som nyligen granskats av Buttermore et al. 26. För att fånga den dynamiska responsen av myelin på skada vi använder solvatochromic, lipofilafluorescerande färgämne Nilrött 27. De solvatochromic egenskaper denna viktiga fläcken möjliggöra spektrala förskjutningar av dess emissionsspektrum som är beroende av fysikalisk-kemiska miljön 28,29. Dessa egenskaper är användbara för att få insikt i mekanismer för axomyelinic skada och kan visualiseras med hjälp av lämpligt utvalda dikroiska och utsläppsfilter eller lösas med hjälp av spektral mikroskopi 27. Till exempel är Nile Reds emissionsspektrum blå-skiftat i mindre polära, lipid rika miljöer såsom de som finns i adipocyter och normal CNS myelin (peak emission ~ 580-590 nm) 27. Däremot denna vitala färgämnet s utsläppsspektrumtoppar vid ~ 625 nm i endbulbs formade som axoner genomgår axonal skogsskador 27. Även om de exakta mekanismerna bakom dessa spektrala skift specifikt i endbulbs kontra normal myelin fortfarande oklara, kan sådana spektrala förändringar avslöja underliggande förändringar i protein ackumulering eller desorganisation som leder tillexponering av hydrofoba bindningsställen 27.
Medan in vivo imaging är den ultimata måttet för att observera ryggmärg axonal skada dynamiken i sin ursprungliga miljö, är det tekniskt utmanande och kräver betydande kirurgisk expertis, och ofta upprepar operationer för att exponera den dorsala kolumnen som kan introducera experimentella artefakter (t.ex. inflammation och ärr bildning). Dessutom behövs ofta kostsam utrustning för att möjliggöra suspension och positionering av ett intakt djur under mikroskop objektivlins. Djuren måste noga övervakas samt att se till att de förblir varma, för att säkerställa vätskor fylls, och för att se till att det inte finns några tecken på hypoxi på grund av långvarig sövda avbildning sessioner. Det senare är mycket viktigt eftersom axoner och myelin kräver absolut konstant perfusion och tillräckliga syrenivåer att förbli livskraftig. Detta är dock ofta inte rapporteras eller övervakas i de flesta in vivo-studier tilldatum. Dessutom rörelse artefakter pga puls och andning (isofluran sövda vuxen mus: ~ 300-450 slag per minut (BPM) är optimalt att hålla 97-98% syremättnad (normal hastighet ~ 632 BPM) och ~ 55-65 andetag per minut (normala skattesatsen är ~ 163 andetag per minut), respektive)) 30 påträffas under in vivo ryggmärgen avbildning gör differentiera primära och sekundära axonal skada svar använder hög upplösning fluorescensmikroskopi utmanande eftersom även de snabbaste laserskanningar oundvikligen är föremål för dessa rörelser artefakter. Framsteg inom ultrasnabba resonans skannrar kombination med en implanterbar styv vertebrala inramade fönster kan tillåta avbildning av den murina ryggmärgen i vakna djur, men snabbare avsökningstider minskar oundvikligen det signalbrusförhållandet nedbrytande bildkvalitet. Ytterligare förbättringar i ryggmärgsavbildningstekniker som för närvarande används för hjärnavbildning kan övervinna många av dessa hinder och begränsa potentiella blandar ihop införts av inadequate vävnadsperfusion, t.ex. 31-33.
Mycket av vad som är känt om vita substansen fysiologi och mekanismer för vit substans skada har fastställts med hjälp av in vitro eller ex vivo beredningar av vit substans från synnerven, perifer nerv, och remsor av ryggmärgen vit substans 34-41. Dessa preparat fortsätter att avancera vår kunskap om vita mekanismer materia skade eftersom de möjliggör kontrollerade förändringar i miljöfaktorer, kontrollerad tillämpning av droger och reagenser, funktionella bedömningar som använder elektrofysiologi, och direkta fluorescensmikroskopi observationer av axoner och myelin i levande vävnad. Men att vissa tidigare metoder observera axoner från ryggmärgs dorsala kolonnremsor eller passagerar vita substans remsor oundvikligen skada ytan axoner under avlägsnandet skedet som kan påverka svaret på nära motsatta axoner. För att tillvarata de experimentella manipulationer ovan och undvika skador på very fibrer under utredning, använder vi en ex vivo cervikal ryggmärgsmodellen eftersom den förhindrar direkt kontakt med rygg aspekten av sladden. Således arkitekturen i pia mater och angränsande ytliga dorsala kolonn axoner förbli livskraftig och oberörd under isoleringen.
Här beskriver vi en relativt enkel metod som möjliggör direkt visualisering av centrala myeliniserade axoner som de dynamiskt svara på en fokal skada i realtid på upp till 8 - 10+ timmar efter skada. Den laserinducerad ryggmärgsskada (Lisci) modellen möjliggör differentiering mellan primära och sekundära axonal skademekanismer som den primära lesionen (ablation plats) förblir spatialt begränsade tiden. Den öppna badet avbildning kammare är tillgänglig för terapeutisk intervention, reagensleverans, och miljö manipulationer. Förmodade axomyelinic skyddande medel kan snabbt utvärderas i realtid genom direkta observationer kontra långa och kostsamma experiment med vävnadsprocessning, sektione, immunfärgning, bildfångst, och analys och ger därför en användbar surrogat modell för att bedöma akuta reaktioner och skydds manipulationer innan du testar de experimentella agenter med levande djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök utfördes under riktlinjer som fastställts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Louisville, ansluter sig till federala bestämmelser.
1. Beredning av låg Ca 2 + och 2 mM Ca2 + artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) Perfusates
- Förbered 2x låg Ca2 + (0,1 mM) Lager C-buffert, 2x normala Ca 2 + (2 mM) Lager En buffert och 2x Lager B-buffert som beskrivs i tabell 1. De enskilda stamlösningar tillåter modifiering av joninnehåll (t.ex., låg eller noll Ca2 +) och kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
- För intrakardiell perfusion under dissektion, tillsätt 100 ml 2x låg Ca 2 + Lager C och 100 ml 2x Stock B i en plastflaska att göra 1x låg Ca 2 + aCSF. Blanda och förvara över natten vid 4 ° C eller göra färskt.
- För perfusion av ex vivo ryggmärgen under imagIng, tillsätt 500 ml 2x normala Ca2 + massa A och 500 ml av 2x lager B i ett 1 liters glasflaska för att generera 1x aCSF. Blanda och förvara över natten i rumstemperatur eller göra färskt.
- Justera pH i aCSF buffertar till 7,4. Under det att aCSF vid rumstemperatur, placera låg Ca2 + aCSF på is och bubbla sedan båda buffertar med carbogen gas (95% O2; 5% CO2) under 30 min före användning och kontinuerligt under perfusionen.
2. Beredning av Ex vivo Imaging avdelningen
- Vira en värmefilt (ingen automatisk avstängning) runt aCSF flaskan och justera värmen till låg / medelhög inställning.
- Sätt i en dedicerad aCSF perfusionsledningen i flaskan förbunden med en perfusion pump och in-line-värmare som styrs av en bipolär temperaturregulator och temperaturåterkoppling sond som visas i figur 1A.
- Bifoga en platt mikroskop skede insats (152 x 102 mm) till 2-foton-excitation / confOCAL mikroskop scenen utrustad med en spillbehållare.
- Placera en stor öppen-bad perfusionskammare (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) i spillbehållaren att rymma och tillhandahålla kontinuerligt flöde av färsk oxygenerad aCSF till ex vivo ryggmärgen (se figur 1B för en lämplig ex vivo imaging kammardesign).
- Anslut in-line värmarens metallutgångsport för att ex vivo avbildning kammaren med användning av lämpliga slangar. Placera en tunn absorberande dyna under ex vivo avbildning kammaren för att upprätthålla temperaturen hos buffert / vävnad under avbildning.
- Fäst ex vivo avbildning kammare till botten av överströmningsbehållaren / stadium insatsen med hjälp av flyttbara klibbiga klibb. Den formbarhet av klibbiga please tillåter kammaren justeras efter behov för att säkerställa målet ljusvägen är vinkelrät mot vävnadsytan. Om det behövs, använd en bullseye nivå för att justera kammaren.
- Säkra enin-line återkopplings värmartemperatur sond nära kammarens fluidinlopp och ett rostfritt stål sugrör anslutet till en vakuumledning vid kammarens utlopp. Magnetband och lämplig mikropipett innehavare är användbara i detta avseende. Slå på vakuumkällan.
- Slå på perfusion pumpen att börja fylla avbildning kammare med syresatt aCSF. Ställ perfusionen pumpen till 1,5-2 ml per min.
- Styr volymen aCSF i avbildning kammare genom att justera vakuumledningen. Det är viktigt att det finns tillräckligt med aCSF i bildbehandling kammaren för att täcka ryggmärgen segmentet och tillåta tillräcklig bearbetning avståndet mellan en vatten doppa objektiv och vävnadsytan. Myelin och axoner kan påverkas negativt om mjukpapper inte är helt nedsänkt i färskt syresatt aCSF leder till försöks-inducerade artefakter.
- Justera in-line värmare temperaturregulator så att perfusat temperaturen i bildbehandling kammaren är nära rumstemperatur.
- Euthanize en vuxen 6-10 veckor gamla thy1 -YFP transgen mus (användning lämplig stam som har fluorescerande proteinuttryck i dorsala ganglieneuroner) genom att injicera en överdos av anestesi natriumpentobarbital (200 mg / kg) via intraperitoneal injektion.
- En gång under rätt nivå av anestesi (t.ex. ingen reaktion till tå nypa och förlust av blinkreflex), försiktigt raka huden överliggande ryggmärgen och hjärnan med kirurgiska Clippers. Rengör huden med Betadine och 70% etanol dynor.
- Spray bröst / mage område med 70% etanol, sedan BEGJUTA ämnet transcardially använder kyld, carbogen-bubblade låg Ca 2 + aCSF. (Se figur 1C för föreslagna dissektion bänk inrättat).
- Som levern bleknar, säkra perfusion nålen i hjärtat med en liten klämma. Vänd ämnet för att komma åt rakade ryggsidaämnet och torka det rakade området med 70% etanol.
- Gör en dorsal hudsnitt längs mittlinjen med början från näsan till höften med hjälp dissektion sax för att exponera hjärnan och ryggraden (Figur 2A). Säkra förberedelserna genom att placera stiften på näsan och höft.
- Med hjälp av en dissektion mikroskop från denna punkt på, fast spänner över den dorsala ytan av skallen på samma nivå som de lukt glödlampor. För in en av sax tips in i de laterala kanterna av snittet och skär längs kanterna av kalott bilateralt tills cerebellum.
OBS: Ta inte helt skära ut kalott som det behövs senare för att lyfta den överliggande vävnad från ryggmärgen hela dissektion (se figur 2B). - Lyft kalott att exponera hjärnan. Skär försiktigt vänster och höger kanter interparietal benet (placerad vid lillhjärnan) och dra den tillbaka kaudalt att exponera hjärnstammen / ryggmärgen (Figur 2C
- Använd fint tippade sax som hålls i 45 ° vinkel mot bordsytan och skär kotorna bilateralt bara underlägsen de bakre nervrötterna.
OBS: Undvik kontakt med ljusa vita rygg kolumner. Dessa fibrer är de som kommer att avbildas (Figur 2D) och kan lätt skadas. - Lyft kalott och dorsala ytan av ryggraden med fin spets pincett, försiktigt dra den överliggande vävnaden i ett stycke som nedskärningar görs för att exponera ryggmärgen. Fortsätt att skära kotor till den övre bröstkorg nivå för att isolera en 1-2 cm segment av livmoderhalscancer sladden för efterföljande avbildning (Figur 2E).
- Använd en sax för att klippa vävnaden / ben parallellt med ryggraden och tydlig vävnad under kolumnen. Gör dessa nedskärningar så plant som möjligt. Det är mycket viktigt att vävnaden ligger plant i kammaren så att sladden är nivån för avbildning.
- Använd en # 11 skalpell för att transekt hjärnstammen (förbiupphörande av de gracila fasciculus fibrer) och vid den övre thorax nivå för att isolera den cervikala ryggmärgen segmentet (se figur 2F). Använd en sax för att klippa vävnad / ben vid dessa samma två punkter. Den isolerade vävnaden bör innehålla 2/3 av ryggraden som omfattar svanshjärnstammen, livmoderhalscancer utvidgningen, och övre bröstkorg ryggmärgen (Figur 2G).
- Placera den isolerade ryggraden i en petriskål med karbogen-bubblade, kylt låg Ca 2 + aCSF. Om det behövs, trimma vävnaden under ryggraden tills den ligger plant i skålen.
- Överför den isolerade ryggraden till ex vivo avbildning kammaren och gradvis öka perfusatet temperatur över 1 h till 36-37 ° C. Behåll denna temperatur under avbildning.
4. Placering av Ex vivo ryggmärgs in Imaging avdelningen och Myelin Märkning med Nile Red
- Försiktigt säkra ryggraden i den i:maging kammare med en lämplig montering skiva håll ned modifierad med ett vertikalt rutnät plattform som består av fina Lycra trådar (ta bort mellan trådar av grid plattform för att ge utrymme för ryggmärgen, se figur 3A).
- Tina en alikvot av Nile Red (5 mM lager i DMSO och 0,22 pm filtrerad, kan lagras i 1 månad vid 4 ° C, eller 6 månader vid -20 ° C i mörker). Strax före tillsats Nilrött till avbildningskammaren, minska flödet av perfusionen pumpen och justera vakuumledningen för att säkerställa att vätskan i kammaren täcker alltid ryggmärgen.
- Lägg 5-10 l Nile Red stamlösning till avbildning kammaren nära kaudala änden av sladden (Figur 3B). Använd en 1 ml pipett för att försiktigt blanda Nile Red hela kammaren. Tillåt Nile Red bo i kammaren under 1-2 minuter, sedan placera vakuumledningen tillbaka och justera perfusion pump till 1,5-2 ml per minut för att kontinuerligt BEGJUTA ryggmärgen.
- Försiktigt höja mikroskop scenenoch rikta in målet med centrum av ryggmärgen segmentet och medialt över de dorsala kolonnerna tills vattenimmersionsobjektiv är approximativt 10 mm från ytan av aCSF i kammaren. Använd mikroskop STRÅLRÖR fokushjulet för att långsamt föra målet nedåt tills den vidrör ytan på aCSF. Använd en epifluorescerande ljuskälla för att fokusera de dorsala kolonnerna i synfältet (figur 3C).
5. Ex vivo Imaging av Mouse Spinal Cord med TPLSM och Laser-inducerad ryggmärgsskada (Lisci)
OBS: Den bakre ven ger en användbar markör för att centrera vävnaden som gracila fasciculus fibrerna (härrör från cellkroppen dorsalrotsganglier och stiga från T6 och nedanför längs mittlinjen av ryggmärgen) löper parallellt med denna blodkärl. De tjockare YFP + livmoderhalscancer dorsalrot prognoser ger också en användbar markör som fibrerna stiga och sjunka i sidled till YFP + smäckert fasciculus fibrer som är mindre i diameter.
- När ryggmärgsvävnad är inriktad på lämpligt sätt, för att växla till laserskanning läget utför baslinjen avbildning av de stigande smäckert fasciculus myeliniserade fibrer. Att excitera både YFP och Nile Red, använd en två-foton laserkälla inställd på 950 nm våglängd (~ 17 mW mätt vid utfarten av en 25X, 1,1 NA mål) och lämpliga dikroiska (DM) och bandpassfilter för att isolera den fluorescerande emission av fluoroforema (vi använder 525/50 DM560, 600/60 DM640 och 685/70, för att separera YFP och Nile Red i gul-orange, och utökade röda kanaler, respektive).
- Om mer än 3% av axoner visar axonal spheroids under baslinjen imaging (30-60 min), kassera preparatet på grund av försöksledaren-inducerad artefakter.
- Inducera en Lisci genom att förstora synfältet till 30.3X (för att skapa en diameter ablation ~ 20 | im). Tune lasern till 800 nm, och öka kraften i lasern till ~ 110 mW vidprovet. Låt 5 komplett synfält laserskanningar för att säkerställa fibrer helt transected.
- Bekräfta Lisci genom att ändra laser inställningar till avbildningsinställningar (950 nm, 17 mW vid provet, 2.08X) och skanna vävnaden att visualisera ablation. Verifiera diameter ablation och att de primära vävnad avlägsnats axoner är helt transected (se figur 3D). Använd tidsförlopp inställningarna på mikroskopet kombineras med z fånga för att spela in dynamiska svaret av axoner och myelin till skada upp till 8-10 + hr efter skada.
OBS: Om ablation är ofullständig (dvs ofullständig transection av fibrer), kassera preparatet, som bestämning av primära och sekundära skademekanismer kommer komma på skam. Dessutom kan isolerade ryggmärgssegment avbildas upp till 24 timmar efter Lisci med endast mild till måttlig Lisci oberoende vävnadsskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uppgifter om en lämpligt laboratorium inrättades behövs för att isolera, upprätthålla lönsamheten, och bild ex vivo ryggmärgen visas i figur 1. Mikroskopet måste vara utrustad med en avstämbar pulsad femtosecond laser, lämpliga dicroics och utsläppsfilter, och ett vatten- doppa objektiv med hög numerisk apertur (≥1.0). För att säkerställa lönsamheten av ryggmärgen under dissektion, bör förfarandet utföras i närvaro av kylda syresatt låg Ca 2 + aCSF som gör nog Ca2 + för de isolerade axonal membran för att täta 42. Underlåtenhet att göra detta kan orsaka axomyelinic skada inklusive separation av myelin från axolemma och axonal sfäroid bildning syns tydligt under baslinjen avbildning. Representativa bilder av dissektion processen och isolering av ex vivo ryggmärgen visas i figur 2. Efter isolering livskraft ryggmärgen är maintained genom kontinuerlig perfusion av syresatt aCSF som hålls vid 36-37 ° C. Myelin fläcken Nile Red 27,43 kan sedan läggas till perfusionskammaren, och utgångs inspelningar av smäckert fasciculus myeliniserade axoner kan påbörjas (Figur 3).
Representativa bilder av gracila fasciculus myeliniserade axoner visas i figur 4. Under utgångsförhållanden Timelapse TPLSM inspelningar avslöjar parallelljusterad YFP + axoner ensheathed i myelin (Nile Red) med i stort sett konstant diameter längs med axonet. Några axonala sfäroider eller andra morfologiska tecken på axonal degenerering är närvarande. På grund av de solvatochromic egenskaper Nile Red och lipid och proteinhalt av myelin, är myelin färgas gul-orange, medan rader av förmodad oligodendrocyt cellkroppar mörkare apelsin (Figur 4A). Fina detaljer såsom Ranviers noder kan också lösas (t.ex. pilar i Vid 10 min efter Lisci omedelbart avskurna axoner (primär skada) belägna rostralt och kaudalt ablationsområdet börja dra bort från skadeplatsen och bildar sigmoidal liknande spolar inom svullna ballong myelin. Myelin ensheathing axoner fjärrkontrollen till ablation verkar oförändrade vid denna tidpunkt. Genom 40 min efter Lisci mest primära avskurna axoner och axoner genomgår sekundär degeneration (dvs initialt förskonade från förolämpning men senare degenererad) bildar karakteristiska endbulbs när de dras från skadestället (Figur 4B). Ungefär en tredjedel av dessa avskurna axoner genomgå pan-fragmentering där proximala segmentet första sväller, bildar axonal sfäroider, och så småningom transekter axonet i flera oregelbundna längder av Axon 43. Separation av myelin från axoner (peri-axonal svullnad) och vesikulär degeneration av myelin är också tydligt. Med tiden primär och sekundär transected axoner fortsätter återdragning bort från skadestället, axoner omedelbart flankerar ablationsområdet genomgå sekundär degeneration och peri-axonal svullnad blir mer framträdande liksom myelin svullnad och vesikulär degeneration (Figur 4D-G, se även 43). En tydlig skillnad i graden av axonal dementi blir uppenbart mellan proximala axonal stubbar (stjärtfenan till skada) och deras distala segment (rostralt lesion) som är avsedda att genomgå Wallerian degeneration (Figur 4D-G). Axoner initialt skonas av Lisci genomgår fördröjd sekundär degeneration (figur 4H). Ett representativt kontrollexperiment utan Lisci, tyder på att långa avbildning sessioner (upp till 13 timmar efter sladd isolering i detta exempel) är möjliga utan att orsaka skadliga effekter på vita substansen integritet (Figur 4I, J). Företrädare på hög resolution bilder av axomyelinic förändringar efter Lisci visas i figur 5. Genom 3 timmar efter Lisci har flera proximala (stjärtfenan) axoner indragna ifrån lesionsstället där de håller sig inom svullna myelin rör som har separerade ifrån axonet. Andra axonal endbulbs verkar tillslutas med myelin (Figur 5A). Axoner intill ablation platsen genomgår sekundär degeneration medan andra verkar opåverkad. YFP låga / negativa förmodade vesiklar (blek blå) inom axonet och axonal endbulbs är också närvarande. I motsats till kaudalt indrag fibrer, är majoriteten av de rostrally infällbara axonal endbulbs och sfäroider vid 3 h efter Lisci starkt märkt med Nile Red (mindre blå skiftat) tyder på en miljöförändringar axonet (figur 5B). Nile Red-märkta områden inom aktivt upprullnings axoner verkar huvudsakligen omge eller tak för axonal kärnan. Även om den exakta lokalisering och identity av dessa inom axonal Nile Red-märkta strukturer är för närvarande okända, kan de representerar täta vesikler ackumulering via axonal transport och / eller kluvna proteiner som exponerar sin hydrofoba kärnan 27. Nile Red märkt myelin förblir huvudsakligen gul-orange i normalt visas myelin. Till skillnad, sonde Nile Red vesikulär myelin verkar gult (dvs blå skiftat) som indikerar miljöförändringar inom dessa strukturer. Genom 7 timmar efter Lisci axoner fortsätter dra tillbaka ifrån lesionsstället; Men är detta tydligare i rostral (figur 5D) kontra kaudala (Figur 5C) endbulbs. Andra axoner genomgå fullständig eller partiell sönderfall lämnar ett tomt myelin rör eller en tunn stjälk flera mikrometer bort från degenererande segmentet. Fördröjd tillämpning av Nile Red efter Lisci avslöjar liknande axonal märkning som pre-tillämpning av Nile Red suggestiv att ablationen i sig och potentiella termiska effekter på proteindenaturering ärosannolikt ansvarig för Nile Red spektrala förändringar i myelin och axoner efter skada (Figur 5E, F). Sammantaget visar dessa data illustrerar användbarheten av ex vivo Lisci modell för att efterlikna välkända men dåligt förstådda mekanismerna av akut axomyelinic skada i realtid. Modellen kan därför vara lämpligt att ytterligare vår kunskap om patofysiologin vid vita substansen skada, och avslöja viktiga molekylära mål för att bevara vita substansen integritet. 
Figur 1: Översikt av dissekering och avbildnings setup. (A) Ett förslag set-up för ex vivo imaging av ryggmärgen. Den större utrustning nödvändig innefattar en karbogen (95% O2 / 5% CO2) gasledningen att syresätta aCSF, en perfusion pump för att leverera karbogen-bubblödde aCSF genom en in-line värmare / temperaturregulator enheter som har en återkoppling temperaturgivare, och en öppen-bad utformad avbildning kammare försedd med en vakuumkälla. (B) En högre förstoring av bild badkammaren visas. (C) En föreslagen installation för perfusion och dissektion av ex vivo ryggmärgen. Kyld låg Ca 2 + aCSF syresätts med karbogen och används för att upprätthålla livskraften i ryggmärgen under dissektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2:. Isolering av ryggmärgen för avbildning (A) Under kontinuerlig kylda, syresatt låg Ca2 + perfusion av skullcap exponeras. (B) Ett snitt görs genom den dorsala ytan av skallen vid nivån för de lukt glödlampor (streckad linje). (C) Bilaterala incisioner görs sedan genom de laterala gränser kalott tills den kan vara försiktigt lyfts och dras kaudalt (i pilens riktning) för att exponera hjärnstammen. (d) fortsätta bilaterala snitt med fin spets sax för att klippa de laterala aspekterna av kotorna och exponerar de dorsala kolonnerna (pilspets). (E) Den exponerade hjärnstammen och hela livmoderhalscancer utvidgning till den övre bröstkorg segmentet av ryggmärgen visas. (F) Två snitt med ett antal 11-skalpellblad är gjorda för att isolera ryggmärgen på hjärnstammen, utöver de gracila fasciculus axonal uppsägningar och övre bröstkorg nivå ( streckade linjer). (G) Den isolerade ryggmärgen sedan överförs till en petriskål med kylt låg Ca 2 + aCSF bubblade medkarbogen gas. Hals- rötter (t.ex. pilspetsar), dorsalrotganglia och ryggmärgen från den övre bröstkorg segmentet till hjärnstammen (~ 15-20 mm) lämnas intakta. Skala bar i G:. 2 mm Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3:. Imaging ex vivo ryggmärgen (A) När placeras i kammaren, är ryggmärgsvävnad säkras med hjälp av en modifierad vävnad / slice håll ner utrustad med Lycra gängor (B) Den myelin fläcken Nile Red läggs direkt till. avbildning kammaren. (C) En vattenimmersionsobjektiv är nedsänkt i aCSF och placeras under de gracila fasciculus fibrerna. 
Figur 4:. Lisci modell av centrala myeliniserade axon skada TPLSM användes för att fånga dynamiken i axon och myelin svar efter Lisci (*). Representativa bilder visas som maximala intensitet projektioner av fem 1 ìm tjocka optiska sektioner tagna vid 0,24 um / pixel med en Nikon A1RMP + multifoton / konfokalmikroskop utrustad med en 25X; NA: 1,1; WD: 2 mm vattenimmersionsobjektiv. Standard dikroiska och utsläppsfilter användes för att separera YFP + axoner (525/50 DM560, som visas i blått) och solvatochromic lipofila fluorescerande färg Nile Red till kortare (600/60 DM640, visas i grönt) och längre (685/70 nm, som visas i rött) utsläppskanaler. De två sistnämnda filterkombinationer är fördelaktiga eftersom de fångar Nile Red: s kända spektrala förändringar i olika fysikalisk-kemiska miljöer. (A) I utgångsläget axoner (YFP +, blå) och myelin (NR, gul-orange) verkar normalt orienterad med få sfäroider eller andra tecken på axomyelinic skada. Rader av glia med karakteristisk morfologi av vita substans oligodendrocyter (NR, mörkorange, t.ex. pilspetsar) är också synliga (vissa markerade för tydlighet), och fina strukturer såsom noder Ranvier också lösas (t.ex. pilar). (B) Vid 10 min efter Lisci, avskurna axoner belägna rostralt och kaudalt om skade börja att dra bort från skadestället och bildar sigmoidala liknande spolar (pilar) inom svullen myelin. Myelin ensheathing axoner på avstånd från ablationen förefalla oförändrade vid denna tidpunkt. (C) By 40 min efter Lisci mest primära avskurna axoner och axoner genomgår sekundär degeneration bildar karakteristiska endbulbs när de dras från skadestället (pilspetsar). Vissa avskurna axoner bildar också sfäroider längs längden av deras axoner (pilar). Separation av myelin från axonet (peri-axonal svullnad) och vesikulär degeneration av myelin är också tydligt (+). (GD). Med tiden primära och sekundära skadade axoner fortsätter dra tillbaka ifrån lesionsstället, och som visas i yz prognoser av Lisci, ursprungligen skonade axoner flankerar ablation platsen genomgår fördröjd sekundär degeneration (H, vänstra panelen innan Lisci, mellersta panel 10 minuter efter Lisci och högra panelen 7 tim efter Lisci, vita prickar markerar den inledande Lisci, röda prickar indikerar förlust av axoner efter 10 min och gröna punkter ange omfattningen av fördröjd sekundär degeneration av axoner genom 7 h). Peri-axonal svullnad blir mer framträdande vid senare tidpunkter efter Lisci. Omfattningen of axonal indragning och morfologi axonal endbulbs mellan proximala axon stubbar och deras distala segment blir också tydligt (se även figur 5 för högre förstoring bilder). Skala bar:. 50 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 5:. Representativa högupplösta bilder av axomyelinic förändringar efter Lisci TPLSM användes för att fånga intrikata detaljer av axon och myelin ändrar caudal (A, C) och rostrala (B, D) till skada vid 3 h (A, B) och 7 tim (C, D) efter Lisci. Representativa bilder visas som maximala intensitet projektioner av tre 1 ìm tjocka optiska sektionerfångades på 0,0832 pm / pixel med en Nikon A1RMP + multifoton / konfokalmikroskop. (A) kaudalt om Lisci (*), flera axoner (blå) är infällbara bort från skadestället (stora pilspetsar) inom svullna myelinrören (gul-orange ) som har separerat ifrån axonal endbulb. Vissa axoner intill ablation platsen genomgår sekundär degeneration (små pilspetsar) medan andra verkar opåverkad. YFP låga / negativa förmodade vesiklar (ljusblå) inom axon och axonal endbulbs är närvarande (pilar). En central nod i Ranvier (n) är också tydligt att använda denna avbildning och märkningsteknik. (B) I motsats till kaudalt indrag fibrer, är majoriteten av de rostrally infällbara axonal endbulbs och sfäroider på 3 timmar efter Lisci starkt märkt med Nile Röd (rosa). Nile Red-märkta områden i upprullnings axoner verkar huvudsakligen omge eller keps YFP märkta axoner (blå, stora pilspetsar). Även om karaktären av dessa Nilrött märkeed strukturer är för närvarande okänt, får de representerar täta vesikler ackumulering via axonal transport och / eller kluvna proteiner som exponerar sin hydrofoba kärnan. Till skillnad, Nile Red märkt vesikulär myelin (pilar) visas gul (dvs spektrum är blå skiftade) jämfört med normal myelin (gul-orange), som indikerar förmodade miljöförändringar inom den förra. Peri-axonal svullnad är också uppenbara (små pilspetsar). Vid 7 timmar efter Lisci, axoner fortsätter dra tillbaka ifrån lesionsstället; emellertid är detta mer uppenbart i rostralt (D) versus kaudala (C) endbulbs. Vissa axoner genomgå fullständig eller partiell sönderfall lämnar ett tomt myelin rör (pilen i C) eller en tunn stjälk flera mikrometer bort från degenererande segmentet (små pilar i D), respektive. Fördröjd tillämpning av Nile Red producerar liknande spektrala förändringar i caudal kontra rostralt centrala myeliniserade axoner (E och F
| 2x Stock A (2 mM Ca2 +) | Reagens | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCl | 6 | |
| CaCl2 • 2 H2O | 4 | |
| 2x Lager B | NaH 2 PO 4 | 2,5 |
| MgSO 4 | 4 | |
| NaHCOs 3 | 52 | |
| Dextros (D-glukos) | 20 | |
| 2x låg Ca 2 + Stock C (0,1 mM Ca2 +) | NaCl | 252 |
| KCl | 6 | |
| MgClj • 6 H2O | 3,8 | |
| CaCl2 • 2 H2O | 0,2 |
Tabell 1: artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) buffertar.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
