強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Protocol

注：すべての患者の試料はインフォームドコンセントを得て、実験的なプロトコルは、スタンフォード大学の治験審査委員会（プロトコル＃2188と＃9999）によって審査され、承認された。

1.細胞の単離および培養：

1. 一般/局所麻酔下で腹部、脇腹、および/または大腿部領域の選択科目lipoaspirationを受けた健康女性患者からのヒト皮下脂肪組織を入手します。治験審査委員会（IRB）の承認は、人間の組織からのASCを単離するプロトコルのために得られていることを確認し、そのような材料での作業中に制度的安全上の注意に従ってください。
2. lipoaspirated脂肪組織からSVFを得るために、最初の1倍の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等容量の脂肪吸引物を3回洗浄する。慎重に吸引し、底の水層を捨てる。
3. 私はハンクのコラゲナーゼ0.075％の種類：コラゲナーゼ消化緩衝液を準備平衡塩類溶液（HBSS）。 FACS緩衝液を準備します。PBS中の2％FBS、1％のP188と1％のペニシリン - ストレプトマイシンを。市販の0.22μmの細孔サイズ速い流れのポリエーテルスルホンフィルターを使用して両方のソリューションをフィルタリングします。
4. 洗浄した脂肪組織を消化するために、37°C​​（約180シェイク/分）で60分間、振盪水浴中でしっかりと消化槽をコラゲナーゼ消化緩衝液の等量を追加して配置する。
   注：これは、必要とされるよりも、これは（ すなわち 、コラゲナーゼ消化緩衝液の250ミリリットル、1リットルの滅菌フラスコ内の洗浄した脂肪組織の250ミリリットル）しながら中に最大の消化を可能にするので、より大きな容積消化容器を使用するのが最適です。
5. FACS緩衝液の等量を添加し、室温で5分間静置させることによって酵素活性を中和する。次に、4℃で20分間233×gで遠心。
6. 慎重に吸引し、高密度SVFペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨てる。
7. RT赤5〜10mlの中でペレットを再懸濁ペレットサイズに基づいて、細胞溶解緩衝液。 RTで5分間233×gで5分間遠心分離を室温で座って解決のままにしておきます。
8. 上清を吸引し、ペレットの大きさに基づいて、伝統的な増殖培地5〜10mlの添加することによりペレットを再懸濁（ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] / 10％FBS / 1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液[ペンストレプトマイシン]）。
9. 細胞破片を除去するためには100μmナイロン細胞ストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングします。
10. 4℃で5分間233×gで遠心分離し、ペレットを中断することなく、上清を捨てる。
11. ペレットサイズに基づいて、伝統的な増殖培地5-10中にペレットを再懸濁。
12. 15センチメートル標準培養皿に2×10 ^6個の細胞を配置し、O / N 37°C / 21％O _{2、5％CO 2}で初代培養を確立する。増殖培地中で37℃/ 21％O _{2、5％CO 2}での自発的な分化を防止するために、サブコンフルエントなレベルに維持する。
    注：完全に中の細胞密度コンフルエント15cmのプレートは、約4-6×10 ⁶細胞である。

2.染色

1. ソート/染色前36時間、37℃/ 21％O _{2、5％CO 2、}伝統的な増殖培地中での培養のASC。
2. （製造業者のプロトコルに従って）のAccutaseを用いて培養プレートからリフトのASC。
3. 一度（2％FBSおよび1％のペン - ストレプトマイシンを含むPBS）をFACS緩衝液で細胞を洗浄する。
4. 4℃で5分間233×gで遠心し。
5. ペレットを中断することなく、上清を捨てる。 FACS緩衝液0.5〜1 mlの細胞を再懸濁し（細胞数および所望の抗体の量に依存する）。
   注：細胞懸濁液の体積は、FACS抗体製造業者の推奨に従って、抗体濃度を決定する。しかし、1の開始濃度を用いて抗体濃度の滴定、：それは抗体を使用する最初の時間であれば100は、通常は推奨されている。
6. の合計数血球計数器を用いて細胞。
7. 未染色試料および単色のコントロールのために使用されて1.5 ml遠心管中で予備100μlのアリコート（使用する蛍光抗体の数に応じて）。
8. （製造者の指示に従って、所定の濃度で）適切な蛍光標識されたモノクローナル抗体を追加し、遮光し氷上で20〜30分、インキュベートする。
   1. 骨形成亜集団にラベルを付けるには：1：50の濃度になるようにFACS緩衝液中の抗CD90（APC抗ヒトCD90（はThy1））または抗CD105（FITC抗ヒトCD105（エンドグリン））を希釈します。
   2. 他の細胞集団（ 例えば 、造血および内皮細胞）を標識する：希釈した抗CD45（抗ヒトCD45パシフィックブルー）、抗CD34（抗ヒトCD34 APC）、および/ ​​または抗CD31（抗ヒトCD31 PE ）FACSで1時50分の濃度にバッファー。
   3. 直接結合した抗体を使用していない場合は、適切なストレプトアビジン結合第二に、ビオチン化一次抗体を使用する100：そのような1の希釈でストレプトアビジンPE-Cy7は、などの進の抗体。
9. インキュベーション後、細胞を2回洗浄する。上清を吸引し、4℃で5分間、233×gでFACS緩衝液および遠心機でチューブを埋める。
10. 細胞塊を除去するために70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して400〜500μlのFACSバッファおよびフィルタサンプル中の細胞を再懸濁。
11. フィルタートップでFACSチューブに標識細胞を移し、分析の間、サンプルを氷上で維持する。

3.蛍光活性化細胞ソーティング

注：以下の手順では、蛍光活性化細胞選別（FACS）または熟練した技術者の支援に予備知識を義務付ける。

1. 前方散乱（FSC）、側方散乱（SSC）を調べるために、設計解析プロットを適切なFACSソフトウェアを使用して、フィコエリトリン（PE）-Texasレッド、パシフィックブルー、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、アロフィコシアニン（APC）および任意の他のフルオロフォアの使用dは細胞を標識する。
2. セルソーター、簡単に渦に細胞を再懸濁するために、各サンプルをロードする前に。
3. 細胞破片を排除するために、ベースライン自己蛍光を決定するために、全細胞集団のためにゲートを設定するために、未染色試料の分析を開始する。
4. 未染色試料にヨウ化プロピジウム（PI）を追加し、全細胞集団内の生細胞の集団を可視化するためにそれを分析する。この集団の周りにゲートを構築します。
5. 蛍光補正を行うために、各蛍光色素のための単色対照試料を分析する。
6. ソートにゲートの位置を設定するための染色サンプルを分析します。
7. 死細胞を染色するために、染色されたサンプルにPIを追加します。
8. 標識された細胞集団をソートします。ソート培地を含む1.5 mlの遠心チューブまたは円錐管（15ml）中のどちらかに変換する。
9. 手動での細胞の必要量が得られた後に選別止める。
10. 私達取得された細胞集団のFACS、ごく一部分析することによって、高純度チェックを行う（ 例えば 、500細胞）る。
    注：この手順はソートされた細胞集団の純度を確認した。理想的には、純度が90〜95％より大きくなければならない。
11. 10％FBSを含む新鮮な培地1mlにソートし、再懸濁の4°Cの直後の終了で5分間233×gで遠心分離細胞。
    注：使用される媒体の量は、細胞ペレットのサイズに基づいて増加させることができる。
12. ゼラチン被覆プレート上のプレートは、細胞生存率を改善する。最終的な細胞収量に応じて、6ウェルプレート中の12ウェルプレートでウェル当たり100,000細胞を、ウェル当たり300,000細胞をプレーティング。

Representative Results

ヒトASC（ 図1A、1B）の高濃縮集団の単離に強化された骨形成の結果と細胞のマーカーとしてCD90を使用した。 ASCははパシフィックブルー結合抗ヒトCD45、FITC結合抗ヒトCD105、およびAPC結合抗ヒトCD90で染色した。ポストソート分析によって定量しソートした後、純度のレベルは、98％以上であった。

2つの新規な亜集団の将来の単離のために許可された転写プロファイルに基づいてセルのグループを定義する。以前に^6,8,9のように各有望亜集団（ ^低 CD90 ⁺及びCD105）の骨形成能、ならびにそれのin vitroでのソートされていない集団を特徴付けるために、細胞は、14日間骨形成分化培地で培養した。 7日目（骨形成¹⁰の早期検出のために使用される）、アルカリホスファターゼ染色が有意にCD90 ⁺に増加した図2A）にSUP>人口の相対的。これは、両方の肉眼的および定量（ 図2A）後に観察された。同様に、14日目でアリザリンレッド染色（細胞外マトリックスの石灰化とエンド端末骨形成分化⁹のメトリックを検出するために使用されるアッセイ）は、CD90 ⁺ ASCは、細胞外マトリックス（ 図2B）の有意に多い量の石灰化することができたことを示した。孤立したASCは、ソート後の骨形成分化を受ける能力を保持するが回復するまでに数日必要な場合があります。 ASCを培養での増殖の間に老化するように、それは、低継代の細胞を用いたすべてのさらなる実験を行うことが不可欠である。

図1：細胞の大きさと複雑さのために（A）ゲートは、細胞破片を除外し、oを集団を単離するために描かれたさらなる分析のためにF単一細胞。（B）シングルソートCD90（左）とシングルソートCD105（右）ASCは36時間のASC収穫後のFACS分析。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2（A）アルカリホスファターゼ染色（上）および骨形成分化培地での培養の7日後のASCの定量化（下）（B）14日後のASCのアリザリンレッド染色（上）および染色（下）の定量。骨形成分化培地で培養。 CD90 ⁺のASCとCD105 ^low細胞0.05 * P <（ソートされていない細胞と比較してアルカリホスファターゼ染色および細胞外マトリックスの石灰化を増加を示す。両側スチューデントt検定）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

現在、ヒト脂肪組織のSVFからASCの均質な亜集団の単離は、望ましい目標ものの依然として厳しい。このような細胞は、骨格組織の形成および恒常性を研究するために使用することができるようにプロ骨形成ASC亜集団の単離は、特に望ましい。しかし、脂肪組織のSVFは、セル容量と分化能を食い止めるに関して有意な異質性を保有する^。11この異質性の分子基盤は、細胞のプールされた集団から理解され、その代わりに、単一細胞分析を必要とすることはできない^。12このアプローチでは、表面マーカー密接にASCの骨形成分化能に関連付け識別することができる。

ASCの成功濃縮のための最も重要な要因は、上記の方法に記載のように、FACSのために使用する抗体に関連している。一つは、CELに対して高い親和性を有する抗体を選択することが賢明である必要があります当該リットル表面マーカー。理想的には、このように複数のステップと、細胞死、細胞損失およびエラー発生主義の増加可能性を必要とする間接的な染色方法とは対照的に、一次複合抗体であるべきである。さらに、FACS中の軽微な変更は、細胞の生存率を向上させることができます。これらには、冷たい容器に仕分け常に氷上で細胞を維持し、また、培養培地を含み、レセプタクル内に細胞を選別、10％ゼラチンで予めコーティングされた培養プレート上で取得された細胞集団をメッキ含む。これは、選別された細胞の純度を確保するために、後のソート純度分析を行うことが重要である。

この技術は、施設内のFACS機器と専門知識の利用可能性によって制限される。一次サンプルは不均一であるとしてさらに、表面マーカーの発現は、個別に変更される。前述のように、ASCとして、低継代細胞を全ての実験を行うことが不可欠であるSは、培養中の伝播中に老化する。加えて、ASCは、幹細胞生物学を変化させることができるインビトロ条件下での表現型の発現における変化を示すことが知られている。したがって、臨床の翻訳のために、それはインビトロ培養を必要とすることなく、足場への直接移植または細胞播種のための高度に精製された細胞集団を得るために最適である。最近の刊行物¹³にズクらによって議論され、アドレス指定されたように加えて、SVFを分離するために処理する必要が脂肪吸引物の大量は、技術に精通していないものに負担になることができる。ズクらによって記載された方法に従って、このプロトコルは、容易にスケールアップすることができ、またはダウン脂肪吸引物の体積を収容しabdominoplastiesおよび他の同様の手順により得られた脂肪組織由来のASCを単離するために適合させることができる。

CD90およびCD105は、以前に初期の間葉系幹細胞（c）として同定されているBM-MSCとASC集団における双方のエルマーカー、。これまでの研究を踏まえて、CD90 ⁺集団は、新たに単離したSVFの約50％を占めている。これに対し^、14、初期SVFのわずか約5〜10％がCD105を発現した。 ^図6は、注目すべきは、連続継代し、CD105の発現が急激にほとんどから増加培養液中の4-7日後にほぼ遍在的な発現にゼロ。これは、ASCは、幹細胞の生物学を変化させることができるin vitro増殖の間、かなりの表現型のドリフトを示すことが知られている^。15-17理想的には、幹細胞の臨床応用は、足場上に直接移植または播種のために精製された細胞集団の即時の使用を含むであろうインビトロ培養を必要とせず。 CD90 ⁺細胞の割合は、貯蔵脂肪依存起源、年齢依存的に異なる脂肪吸引サンプル間で変化してもよい。それにもかかわらず、細胞表面マーカーとしてCD90を使用して濃縮oを可能にする強化された骨形成能を持つヒトASCのFA亜集団。骨形成濃縮するこの方法は、新規な臨界サイズの骨欠損を有する患者において迅速かつ強固な骨形成を促進する手段として機能する可能性がある。私たちは日常的に、標準的な脂肪吸引物からおおよその細胞収量は、この上述したが、5×10 ⁷有核細胞/前述の収穫法を用いて、脂肪吸引物の500ミリリットルは、脂肪デポ起源や患者の人口統計に基づいて変化する可能性があることを確認します^。18吉村らは、あることを報告したASCははSVF中の有核細胞の集団10〜35％を占めている^。19そこで、FACSを用いてASCの骨形成濃縮後の骨組織工学戦略の実施のための足場の直播のための大きな可能性がある。

多くの場合、高度に精製された細胞集団を必要とする実験的及び臨床的用途のための細胞ベースの組織工学、幹。その他のHi精製のghとスループット法は、FACSに単純な代替物として存在し、パンニング補体枯渇、および磁気活性化細胞（MACS）選別が含まれる。しかし、特定の状況において、FACSは、必要かつ有利でもある：非常に純粋な集団の単離が所望される場合、ターゲット表面マーカーは、細胞集団にまれに発生した場合、または細胞が同じ表面の変化する発現レベルに基づいて分離されなければならないときマーカー。

マイクロ流体ベースの単一細胞転写解析及び蛍光活性化細胞選別、エンドグリン（CD105）とのThy-1（CD90）の両方を使用することは、骨形成遺伝子のASC発現の差に関連することが見出された。単一の細胞転写プロファイルの統計的分析は、CD105及びCD90高発現の低発現が増加骨形成能力を持つASCのサブグループを記述することを実証した。これらのタンパク質は、その後、D細胞の骨形成亜集団を濃縮するために使用された人間の皮下脂肪組織から^{erived。6,20}

一緒に、これらのデータは、骨形成の転写活性と相関する特異的な細胞表面マーカーに基づいたASCを選別の有効性を示している。このアプローチの実現可能性は、例として、CD90及びCD105の使用を介して、ここで示されているが、さらなる分析は非常に骨形成性転写活性と相関する表面抗原発現のすべての有望な組み合わせを含むように行われる必要がある。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences