Protocol
BEMÆRK: Alle patientprøver blev opnået med informeret samtykke, og eksperimentelle protokoller blev gennemgået og godkendt af Stanford University Institutional Review Board (Protokol # 2188 og # 9999).
1. celleisolering og Kultur:
- Opnå human subkutant fedtvæv fra raske kvindelige patienter, der gennemgår elektiv lipoaspiration af maven, flanke, og / eller låret region under lokal / generel anæstesi. Sørg for, at Institutional Review Board (IRB) godkendelsen er opnået for protokollen at isolere ASC'er fra humane væv og følge institutionelle sikkerhedsforanstaltninger, mens du arbejder med disse materialer.
- For at opnå SVF fra lipoaspirated fedtvæv, først vaskes lipoaspirate tre gange med lige store volumener 1x sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Aspirere forsigtigt og kassér det nederste vandige lag.
- Forbered collagenasefordøjelse buffer: 0,075% Type I collagenase i HanksBalanced Salt Solution (HBSS). Forbered FACS buffer: 2% FBS, 1% P188 og 1% pen-strep i PBS. Filtrer begge opløsninger under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt 0,22 um porestørrelse hurtigt flow polyethersulfon filter.
- At fordøje den vaskede fedtvæv, tilsættes et lige volumen af collagenasefordøjelse buffer og placere fordøjelse fartøj sikkert i et rystevandbad i 60 minutter ved 37 ° C (ca. 180 shakes / min).
BEMÆRK: Det er bedst at bruge et større volumen fordøjelse fartøj end påkrævet, da dette giver mulighed for maksimal fordøjelse under rystning (dvs. 250 ml collagenasefordøjelse buffer, 250 ml vaskede fedtvæv i en 1L steril kolbe). - Neutraliser enzymatisk aktivitet ved tilsætning af et lige volumen af FACS buffer og giver mulighed for at sidde ved stuetemperatur i 5 min. Dernæst centrifugeres ved 233 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Aspirere forsigtigt og kassér supernatanten, pas på ikke at forstyrre den high-density SVF pellet.
- Pellet resuspenderes i 5-10 ml RT rødcellelyse-buffer baseret på pellet størrelse. Lad opløsningen sidde ved stuetemperatur i 5 minutter og centrifugeres ved 233 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer supernatanten og resuspender pellet ved tilsætning 5-10 ml traditionelle vækstmedier, baseret på pillestørrelse (Dulbeccos Modified Eagle Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% penicillin-streptomycin-opløsning [pen-strep]).
- Filtreres suspensionen gennem en 100 um nylon cellefilter at fjerne cellerester.
- Centrifuger ved 233 x g i 5 min ved 4 ° C, og supernatanten fjernes uden at forstyrre pellet.
- Pellet resuspenderes i 5-10 ml traditionelle vækstmedium, baseret på pellet størrelse.
- Placer 2 x 10 6 celler i en 15 cm standard dyrkningsskål og etablere primære kulturer O / N ved 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2. Oprethold ved sub-sammenflydende niveauer for at forhindre spontan differentiering ved 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 i vækstmedier.
BEMÆRK: Cell densitet i en fuldtkonfluerende 15 cm plade er ca. 4-6 x 10 6 celler.
2. Farvning
- Kultur ASC'er i traditionelle vækstmedium ved 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 til 36 timer før farvning / sortering.
- Lift ASC'er fra dyrkningsplader hjælp Accutase (ifølge producentens protokol).
- Vask cellerne en gang med FACS-buffer (PBS med 2% FBS og 1% pen-strep).
- Centrifuger ved 233 x g i 5 min ved 4 ° C.
- Supernatanten uden at forstyrre pellet. Opblande cellerne i 0,5-1 ml FACS buffer (afhængig af celleantal og mængde antistof ønskes).
BEMÆRK: Volumenet af cellesuspensionen i overensstemmelse med FACS antistof producentens anbefalinger, bestemmer antistofkoncentration. Imidlertid titrering af antistofkoncentration ved anvendelse af en startkoncentration på 1: 100, er normalt anbefales, hvis det er første gang at anvende et antistof. - Tæl det samlede antalceller under anvendelse af et hæmocytometer.
- Reserve 100 ul alikvoter i 1,5 ml centrifugerør skal anvendes til en ufarvet prøve og ensfarvede kontroller (i forhold til antallet af fluorescerende antistoffer anvendes).
- Tilsæt passende fluorescens-mærkede monoklonale antistoffer (ved forudbestemte koncentrationer, ifølge producentens anvisninger) og inkuberes i 20-30 min på is, afskærmet fra lys.
- For at mærke osteogen subpopulation: Fortynd anti-CD90 (APC anti-human CD90 (Thy1)) eller anti-CD105 (FITC anti-human CD105 (endoglin)) i FACS-buffer til en koncentration på 1:50.
- For at mærke andre cellepopulationer (fx hæmatopoietiske og endothelceller): Fortynd anti-CD45 (anti-human CD45 Pacific Blue), anti-CD34 (anti-human CD34 APC), og / eller anti-CD31 (anti-human CD31 PE ) i FACS-buffer til en koncentration på 1:50.
- Hvis du ikke bruger direkte konjugerede antistoffer, brug en biotinyleret primært antistof med en passende streptavidin-konjugeret sekundAry antistof, såsom Streptavidin PE-Cy7, ved en fortynding på 1: 100.
- Efter inkubation vaskes cellerne to gange: fylde rør med FACS-buffer og centrifugeres ved 233 xg i 5 min ved 4 ° C, opsugning supernatant.
- Opblande cellerne i 400-500 pi FACS buffer og filter prøver gennem en 70 pm nylon cellefilter at fjerne celleklumper.
- Overfør mærkede celler i FACS-rør med filter top og holde prøverne på is for varigheden af analysen.
3. fluorescensaktiveret cellesortering
BEMÆRK: Følgende trin mandat forkundskaber i fluorescens-cellesortering (FACS) eller bistand fra en dygtig tekniker.
- Brug af passende FACS software, design analyse plots til at undersøge forward scatter (FSC), side scatter (SSC), Phycoerythrin (PE) -Texas Rød, Pacific Blue, fluoresceinisothiocyanat (FITC), allophycocyanin (APC) og enhver anden fluorofor brugd at mærke celler.
- Før du lægger ind i cellen sorteringsanlæg, kortvarigt vortex hver prøve at opblande cellerne.
- Begynd med analyse af den ufarvede prøve for at sætte porte for den samlede cellepopulation, at udelukke cellerester, og til at bestemme baseline autofluorescens.
- Tilføj propidiumiodid (PI) til den ufarvede prøve og analysere det med henblik på at visualisere population af levende celler i den totale cellepopulation. Konstruer en gate omkring denne population.
- Analysere en enkelt farveprøve for hver fluorokrom kontrol for at sætte fluorescens kompensation.
- Analyser farvede prøve at indstille positionen af porte til sortering.
- Tilføj PI til den farvede prøve for at farve døde celler.
- Sortere de mærkede cellepopulationer. Sorter til enten 1,5 ml centrifugerør eller koniske rør (15 ml) indeholdende dyrkningsmedium.
- Manuelt ophøre sortering, når der er opnået den nødvendige mængde celler.
- Osing FACS, udføre en renhed kontrol ved at analysere en lille brøkdel (f.eks., 500 celler) af den erhvervede cellepopulation.
BEMÆRK: Dette trin bekræfter renheden af de sorterede cellepopulationer. Ideelt set bør renhed være større end 90-95%. - Centrifuger cellerne ved 233 x g i 5 min ved 4 ° C umiddelbart efter afslutningen af sortering og resuspender i 1 ml frisk medium indeholdende 10% FBS.
BEMÆRK: Mængden af anvendte medier kan øges baseret på størrelsen af cellepellet. - Plade på gelatine-overtrukne plader for at forbedre cellelevedygtighed. Afhængigt af den endelige celleudbytte, plade 300.000 celler per brønd i en 6-brønds plade, 100.000 celler per brønd i en 12-brønds plade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug CD90 som markør for celler med forbedrede osteogenese resulterer i isolering af et højt berigede populationer af humane ASC'er (figur 1A, 1B). ASC'er blev farvet med Pacific Blue-konjugeret anti-humant CD45, FITC-konjugeret anti-humant CD105 og APC-konjugeret anti-humant CD90. Efter sortering, niveauet af renheden var større end 98%, som kvantificeret ved post-slags analyse.
Definition grupper af celler baseret på transkriptionelle profiler tilladt for potentielle isolation af to hidtil ukendte subpopulationer. For at karakterisere det osteogene potentiale af hvert lovende subpopulation (CD90 + og CD105 lav), såvel som af den usorterede population in vitro, celler blev dyrket i osteogen differentiering medium i 14 dage, som tidligere beskrevet 6,8,9. Alkalisk phosphatase farvning (bruges til tidlig opdagelse af knogledannelse 10) på dag 7 blev signifikant forøget i CD90 + (figur 2A). Dette blev observeret både groft og efter kvantificering (figur 2A). Tilsvarende alizarinrødt farvning (et assay anvendes til at detektere ekstracellulær matrix mineralisering og en metrik for slutterminalen osteogen differentiering 9) på dag 14, viste, at CD90 + ASC'er var i stand til at mineralisere en betydeligt større mængde af ekstracellulær matrix (figur 2B). Isolerede ASC'er bevarer evnen til at undergå osteogen differentiering efter sortering men kan kræve nogle dage at komme sig. Det er vigtigt at udføre alle yderligere forsøg med lave passage celler, som ASC'er bliver senescent under formering i kultur.
Figur 1: (A) porte for cellestørrelse og kompleksitet blev trukket for at udelukke cellerester og isolere en population of enkeltceller til yderligere analyse. (B) FACS-analyse af single-sorteres CD90 (venstre) og single-sorteres CD105 (til højre) ASC'er 36 timer efter ASC høst. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: (A) alkalisk phosphatase-farvning (øverst) og kvantificering (nederst) af ASC'er efter 7 dages dyrkning i osteogen differentiering medium (B) alizarinrødt farvning (øverst) og kvantificering af farvning (nederst) af ASC'er efter 14 dage. af kultur i osteogen differentiering medium. CD90 + ASC'er og CD105 lave celler viser øget alkalisk phosphatase farvning og ekstracellulær matrix mineralisering sammenlignet med usorterede celler (* p <0,05, to-tailed Studentst-test). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I øjeblikket isoleringen af homogene subpopulationer af ASC'er fra SVF af human fedtvæv fortsat en udfordring, selvom ønskværdigt mål. Isolering af pro-osteogene ASC subpopulationer er særligt ønskeligt, da sådanne celler kan anvendes til at studere dannelsen og homeostase af skelet væv. Men SVF af fedtvæv rummer betydelig heterogenitet med hensyn til stamceller kapacitet og differentiering potentiale. 11 Den molekylære basis for denne heterogenitet ikke kan forstås fra puljede populationer af celler, og i stedet kræver enkelt celle analyse. 12 med denne tilgang overflademarkører tæt forbundet med kan identificeres osteogene differentiering kapacitet ASC'er.
Den mest kritiske faktor for vellykket berigelse af ASC'er, som beskrevet i den ovennævnte fremgangsmåde, er relateret til de anvendte for FACS antistoffer. Man skal være forsigtig for at vælge et antistof med en høj affinitet for cell-overflade markør pågældende. Ideelt bør det være en primær konjugeret antistof i modsætning til en indirekte farvning metode, som kræver flere trin og dermed øget risiko for celledød, tab og fejl periodisering. Endvidere kan mindre ændringer i løbet FACS øger cellernes levedygtighed. Disse omfatter sortering i en kølig beholder, holde celler på is hele tiden, sortering celler i beholdere, der indeholder dyrkningsmedier og også, plating de erhvervede cellepopulationer på dyrkningsplader, der er blevet præ-overtrukket med 10% gelatine. Det er vigtigt at udføre en post-slags renhed analyse for at sikre renheden af de sorterede celler.
Denne teknik er begrænset af tilgængeligheden af FACS udstyr og ekspertise inden for et anlæg. Som de primære prøver er heterogene, vil ekspressionen af overflademarkører ændre på et individuelt grundlag. Som nævnt ovenfor er det vigtigt at udføre alle eksperimenter med lavpassage celler som ASCs bliver senescent under formering i kultur. Desuden er det kendt, at ASC'er udviser et skift i fænotypisk ekspression under in vitro betingelser, hvilket kan ændre stamcellebiologi. Således til klinisk oversættelse, ville det være optimalt at opnå et højt oprenset cellepopulation til direkte transplantation eller cellepodning til et stillads uden behov for in vitro dyrkning. Desuden de store mængder lipoaspirate som det er nødvendigt behandles for at isolere SVF kan være besværligt at dem bekendt med teknikken, som diskuteret og behandlet af Zuk og kolleger i en nylig publikation 13. Pr beskrevet af Zuk et al., Kan denne protokol let skaleres op eller ned for at rumme volumenet af lipoaspirate og kan tilpasses til at isolere ASC'er fra fedtvæv opnået ved abdominoplasties og lignende procedurer.
CD90 og CD105 er tidligere blevet identificeret så tidligt mesenkymale stamceller cell markører, både i BM-MSC og ASC befolkninger. I tråd med tidligere forskning, at CD90 + befolkning udgjorde ca. 50% af den frisk isoleret SVF. 14. I modsætning hertil kun omkring 5-10% af den oprindelige SVF udtrykte CD105. 6 Især med successive passager, CD105 ekspressionen hurtigt steget fra næsten nul til næsten allestedsnærværende udtryk efter 4-7 dage i kultur. Det er kendt, at ASC'er udviser betydelig fænotypisk afdrift under in vitro ekspansion, hvilket kan ændre biologi stamceller. 15-17 Ideelt kliniske anvendelser for stamceller indebærer øjeblikkelig anvendelse af oprensede cellepopulationer til direkte transplantation eller podning på et stillads uden behov for in vitro dyrkning. Procentdelen af CD90 + celler kan variere mellem forskellige lipoaspirate prøver i et fedt depot-afhængig oprindelse eller alder-afhængig måde. Alligevel anvendelse CD90 som en celleoverflademarkør muliggør berigelse ofa delpopulation af menneskelige ASC'er med forøget osteogent potentiale. Denne metode til osteogen berigelse har potentiale til at fungere som en hidtil ukendt middel til at fremme en hurtig og robust knogledannelse hos patienter med kritiske størrelse skelet defekter. Vi rutinemæssigt konstatere, at omtrentlige celleudbytte fra standard lipoaspirate er 5 x 10 7 kerneholdige celler / 500 ml lipoaspirate ved hjælp af den førnævnte høst metode, selv om som beskrevet ovenfor det kan variere baseret på fedt depot oprindelse eller patientdemografika. 18 Yoshimura og kolleger rapporterede, at ASC'er udgør 10-35% af befolkningen i kerneholdige celler i SVF. 19 Der er derfor store muligheder for direkte såning af et stillads for gennemførelsen af knoglevæv engineering strategier efter osteogent berigelse af ASC'er hjælp af FACS.
Stem cellebaserede tissue engineering til forsøg og kliniske anvendelser kræver ofte stærkt oprensede cellepopulationer. Andre high-throughput metoder til oprensning eksistere som enklere alternativer til FACS, omfatter panorering, komplement udtømning, og magnetisk cellesortering (MACS). Men i visse situationer, FACS er både nødvendig og fordelagtig: når isoleringen af meget rene subpopulationer er ønsket, når måloverfladen markør forekommer sjældent i cellepopulationen, eller når celler skal adskilles baseret på varierende ekspressionsniveauer af den samme overflade markør.
Brug både microfluidic baseret enkelt celle transkriptionel analyse og fluorescensaktiveret cellesortering, endoglin (CD105) og Thy-1 (CD90) blev fundet at være associeret med forskellene i ASC ekspression af osteogene gener. Statistisk analyse af enkelt celle transkriptionelle profiler viste, at lav ekspression af CD105 og høj ekspression af CD90 beskriver undergrupper af ASC'er med øget osteogen kapacitet. Disse proteiner blev efterfølgende anvendt til at berige for osteogene subpopulationer af celler derived fra humant subkutant fedtvæv. 6,20
Tilsammen udgør disse data illustrerer effektiviteten af sortering ASC'er baseret på specifikke celleoverflademarkører, der korrelerer med osteogen transkriptionsaktivitet. Selv om muligheden af denne fremgangsmåde demonstreres her ved hjælp af CD90 og CD105 som eksempler, der skal gøres for at inkludere alle lovende kombinationer af overfladeantigen udtryk, der i høj grad korrelerer med osteogen transkriptionsaktivitet yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har en økonomisk interesse i nogen af de produkter, enheder eller narkotika, der er nævnt i dette manuskript. Ingen af forfatterne har nogen konkurrerende økonomisk interesse at rapportere.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health Research tilskud R01-DE021683-01 og National Institutes of Health Research tilskud R01-DE019434 til MTL; Howard Hughes Medical Institute Research Fellowship til MTCDCW blev støttet af ACS Franklin Martin Faculty Research Fellowship, The Hagey Laboratoriet for Pediatric regenerativ medicin, og Stanford University Child Health Research Institute Fakultet Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable 250 ml Conical Tubes | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE Cell Detachment Solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II instrument | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
References
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
- Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
- Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
- Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
- Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
- Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
- James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720 (2009).
- Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
- Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211 (2011).
- Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585 (2013).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
- Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
- McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
- Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8 (2014).
- Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
