Introduction
Способность ПЭГ-привитых поверхностей для отображения ковалентно связанные биохимические лиганды, одновременно поддерживая присущие не-обрастания свойства делают их идеальным выбором для инженерных пользовательских сред микромасштабных на культуральных субстратах 1,2,3. Биоспецифического взаимодействия, опосредованные лигандов конъюгировали PEG щеток позволяет упрощенное анализ последствий биохимических сигналов, обнаруженных в комплексе в естественных условиях микросреды тканей на отдельных фенотипов клеток. Кроме того, био-ортогональное "щелчок" химические соединения могут быть использованы для облегчения направленного иммобилизацию лигандов так, что они представлены в нативных конформаций 4-6. Таким образом, микромасштабная пространственное структурирование ПЭГ щетки является универсальным инструментом для создания дизайнера в нишах пробирке расследовать сигнализацию клеток, вызванную иммобилизованных биохимических сигналов 6,7.
Общий метод генерации пространственных моделей биохимических у.е.эс влечет микроконтактная печати (μCP) позолоченные субстраты с узорами PEG сопряженных алкантиолов. Затем micropatterned самоассоциированные монослоя (Sams) ПЭГ-ylated алкантиолов ограничивает физическую адсорбцию биохимических молекул, например, белков, только для не-рисунком регионах подложки 8,9. Тем не менее, ЗРК, генерируемые этой техники чувствительны к окислению в долгосрочной клеточной культуральной среде. Таким образом, μCP'd алкантиол ЗРК часто дополнительно привиты с ПЭГ полимерных щеток, используя поверхность инициативе переноса атома радикальной полимеризации (SI-ATRP), чтобы увеличить не обрастания стабильность в регионе 10. В частности, μCP из алкантиол инициатора полимеризации, ω-meraptoundecyl бромизобутирата, на золотым покрытием поверхностей с последующим SI-ATRP поли (этиленгликоля) метилового эфира метакриловой (PEGMEMA) мономеров генерирует поверхностей с micropatterned долгосрочной перспективе, стабильное, и не- Загрязнение ПЭГ щетки. Более того, эти способны быть дополнительно модифицированы, чтобы представить разнообразны химические группы 11.
Воспользовавшись этой собственности, Ша и др. др. разработал метод спроектировать культуры субстратов с многокомпонентных PEGMEMA кистей, представляющих ортогональных "щелчок" химии. В этом методе используют серию μCP / SI-ATRP шагов перемежаются с азидом натрия последовательный, этаноламина, и пропаргиламин нуклеофильные замен для создания культуральных субстратах, представляющие микромасштабная образцы нескольких иммобилизованных лигандов 6. В то время как потенциал с помощью таких химических процессов в сочетании с ручным μCP проектировать новые культуральные субстраты огромна, она ограничена точностью и аккуратностью, с которой несколько шагов μCP могут быть выровнены на одной подложке. Высокий уровень точности и аккуратности необходимо будет воспроизводимо производство комплекс в пробирке ниш, использующих эти универсальные методы.
e_content "> Для решения этого ограничения, несколько автоматизированных и полуавтоматических систем μCP были получены. Чакра и др. др. разработали систему μCP, в котором пользовательские марки размещаются на железнодорожной системы и приводят в конформной контакте с золотым покрытием слайдов с использованием Пневматический привод с компьютерным управлением. Тем не менее, этот метод требует точного изготовление нестандартных конструкций марок и сообщает о точности 10 мкм, без доклада достигнутой точности при выполнении нескольких μCP шаги 12. Совсем недавно, метод, использующий комплексный кинематической системы сцепления сообщили точность ниже 1 мкм с использованием одного шаблона, но не смогли точно выравнивать несколько шаблонов из-за отсутствия точного управления марке из пресс-формы для формования 13. Кроме того, оба из предыдущих методов требует, чтобы субстрат остаются фиксированными между шагами паттерна , тем самым значительно ограничивая разнообразие модификации поверхности химических, которые могут бытьиспользован. Здесь мы опишем автоматизированная система R-μCP способны точной и точного выравнивания нескольких шагах μCP, позволяя максимально гибко марки проектирования и изготовления. Кроме того, узорчатые субстраты могут быть многократно удален из системы между штамповок, тем самым позволяя использование различных химических модификаций субстрат, в том числе последовательных нуклеофильными замен. Основания инженерные используя такие химические были использованы для клеточной культуры ранее как нас 6,14 и др 7. Таким образом, мы слились R-μCP и последовательные реакций нуклеофильного замещения в разработке метода для масштабируемого производства культуральных субстратах со сложными и micropatterned биохимических сигналов.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание эластомерных Марки
- Для создания кремниевых мастеров в PDMS штампа, шаблоны проектирования художественных фотошаблона, используя системы автоматизированного проектирования программного обеспечения.
- Дизайн первый рисунок в виде 20 х 20 массива колец с 300 мкм внутренний диаметр (ID) и 600 мкм ОД с 1200 мкм от центра до центра расстояния.
- Дизайн второй схеме, 20 х 20 массива колец с 600 мкм ID и 900 мкм ОД с 1200 мкм от центра до центра расстояния.
- Кроме того, место 1 х 1 мм 2 квадратных контрольные метки на всех четырех углах каждой конструкции массива расстоянии 1200 мкм от центра до центра от углового шаблона под углом 45 °.
- Изготовление кремниевых мастеров для использования в этом эксперименте с 1: 1 пропорций, соотносить с глубиной художественного 300 мкм с использованием стандартных методов литографии, описанные в другом месте 15 или в сотрудничестве с микрожидкостных литейного,
Примечание: Характеристика глубины меньше, чем 100 мкм, может привести к аномальной деформации марок до контакта с поверхности подложек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается с того, уже полученные кремниевые мастеров с описанными моделями фоторезиста, что требует специального оборудования и чистые номера, чтобы создать. Лучше всего проконсультироваться с изготовителем или основной объект, чтобы создать эти узорчатые мастеров.
- Silanize кремния мастера O / N в ходе инкубации с (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) трихлорсилана паров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Силан пар является высокотоксичным и следует обращаться только в химическом вытяжном шкафу. - Создание обратную реплики из кремниевых мастеров путем отверждения 10: соотношение PDMS предварительного полимера и PDMS отвердителя на верхней части Силанизированные кремния мастеров в чашке Петри O / N при 60 ° C 1.
- Удалить марки PDMS от кремния мастеров, и скрепления штампы акрилонитрил-бутадиен-стирол (ABS) подкладок или любой другой жесткий материалс с помощью клея.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материал выбора не должно быть прозрачным или биологически совместимым. Тем не менее, он должен обеспечить плоскую поверхность для взаимодействия с роботизированной оснастки и более высокой жесткостью, чем PDMS.
2. Подготовка Coverslides
- Промыть микроскопа coverslides (24 мм х 50 мм # 1) в толуола, метанола и разрушать ультразвуком в ацетоне в течение 1 мин перед промывкой этанолом и сушки в слабом потоке азота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь толуол и ацетон только в химическом вытяжном шкафу. - Пальто coverslides с ~ 3,5 нм титана (Ti), а затем 18,0 нм золота (Au), используя сфокусированный испаритель электронно-лучевой.
Примечание: Эта процедура совместима с различными золотым покрытием подложек, включая кремния и полистирола. Хотя можно генерировать их на месте, золота, покрытые субстраты можно также получить через коммерческих поставщиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ti слои должны быть не менее 3 нм, в то время как слои Au на подложках должны бытьт мере 5 нм, и может быть в диапазоне вплоть до 1 мм по толщине в зависимости от идеальных оптических свойств конечного субстрата 16,17. Подложки не обязаны быть оптически прозрачными для изготовления; Однако, это облегчает микроскопический анализ изготовленных подложках. - Промыть позолоченные coverslides с этанолом и сушат при нежной азота непосредственно перед использованием.
3. R-μCP из внешнее кольцо
- Перед R-μCP с избирательно совместимой сформулированы манипулятор (SCARA) системы, калибровки роботов эффекторы инструмента и сопутствующих систем Двойная камера, используя программное обеспечение системы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти орудия изображены на рисунке 1.
Рисунок 1. R- μCP система и Robotic Arm Инструменты. (B) Роботизированная рука оснастки изображением (е) алмазный инструмент травления и (г) пневматический всасывающий инструмент проведения (H) ABS спинкой PDMS штамп.
- Вручную разместить PDMS штамп с 600 мкм ID и 900 мкм OD выступающие кольца лицом вниз в печать гнездования приспособление. Вручную разместить свежеочищенной золотым покрытием coverslide в верхней части вакуумной патрона, показанной на фиг.1А, и иммобилизации его с помощью подключенного лабораторный вакуум.
- Использование элементов управления робота, выровнять ведущего вниз камеру над центральной точки золотым покрытием coverslide, как на рисунке 2А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пункт может быть изначально определены путем визуального осмотра и не требует большой точности, как PDMS штамп гораздо крупэ, чем золотым покрытием слайд. - Поручить роботизированную руку для травления четыре ссылку "X" знаки в вершинах квадрата с размерами 3,8 мм на 3,8 мм с центром на покрытой золотом coverslide используя алмазный инструмент травления, прикрепленный к руке робота. (Изображенные на рисунке 2B; автоматизированный процесс)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что все четыре контрольные точки находятся в одной визуальной рамках нисходящего фронтальная камера. - Использование роботов пневматический всасывающий инструментов, пикап и удерживайте в PDMS штамп 1 мм выше марка гнездования приспособление как на рисунке 2C. (Автоматизированный процесс)
- Использование вверх камеру по ходу движения и светодиодной подсветки кольцо на фото на рисунке 2D и Е, визуализировать справочные квадратный знаки штампа и идентифицировать их с помощью программного обеспечения камеры 10 раз для того, чтобы определить среднюю X штампа, Y, и угловое смещение от центра Ось робот оснастки. (Автоматизированный процесс)
- Как и в
- 3.8) Поместите штамп в ванну с алкантиол ATRP инициатора, ω-mercaptoundecyl бромизобутирата (2 мМ в этаноле), как изображено на рисунке 2F. (Автоматизированный процесс)
- Снимите отметку с алкантиол решения и поместите его над потоком азота под давлением до 0,48 бар (5 фунтов на квадратный дюйм), чтобы испарить этанола как показано на рисунке 2G. После 1 мин увеличить давление в потоке азота является 1,03 бар (15 фунтов на квадратный дюйм) для обеспечения равномерного сухость. (Автоматизированный процесс)
ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное сушки приведет к полной или частичной потере образов верности. - После высыхания, переместить штамп над расчетной центральной позицией с золотым покрытием стекло и опустите его с шагом в 100 мкм, контролируя Z-оси мотора силы, как показано на рисунке 2 полугодие.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это передается как крутящий момент, с которыми сталкивается Z-оси двигателя и отображается в программе робота наведения. (Автоматизированный процесс) - Остановка снижения штамп раз заданное давление 79,2 кПа достигнутый, и поддерживать контакт с горкой золотым покрытием в течение 15 сек. (Автоматизированный процесс)
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения давления здесь оптимизированы для текущего штамп дизайна и художественного высоте. Если дизайн печать изменяется, специально для большого удлинения марок, мелодии них соответственно по проб и ошибок. - Медленно снимите отметку с золотым покрытием слайд и поместите штамп назад в печать гнездования приспособление. (Автоматизированный процесс) 4. SI-ATRP из PEGMEMA на Micropatterned Coverslides
- Отпустите давление вакуума, удерживающий micropatterned coverslide, и перенести его на 50 мл шленк. Уплотнение и дегазации колбу Шленка с использованием вакуумного насоса.
- Добавить 5.5 мл ATRP реакционной смеси, содержащей макромономера PEGMEMA (208,75 ммоль), воду (34,4 мл), метанол (43,8 мл), меди (II), бромид (1 ммоль) и 2 ', 2-бипиридин (3 ммоль), колбу Schlenk.
- Добавить 0,5 мл аскорбата L-натрия (454,3 мМ) в воде, чтобы инициировать реакцию, и дать ему возможность продолжаться в течение 16 ч при комнатной температуре в атмосфере инертного газа.
Примечание: После того аскорбата L-натрия, цвет реакции будет смещаться от светло-зеленого до темно-коричневого, как показано на фигуре 3А-В.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция может продолжаться и после 16 часов, но это не будет существенно увеличить длину щеток PEG. - Снимите micropatterned coverslide из колбы Шенк и промывают этанолом, водой и этанолом и сушат при слабом потоке азота.
Примечание: После SI-ATRP, модификации поверхности должна быть видна глазу и могут быть отображены и анализировали под микроскопом, как на фиг.3С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый простой способ, чтобы проверить точность суде, как это устраняет необходимость immunostain подложек. - Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
- Добавить 6 мл N, N-диметилформамид (ДМФ), содержащим 100 мМ азид натрия в реакционную пробирку. Поддержание этой реакции при 37 ° С в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь DMF только в химическом вытяжном шкафу. Соблюдайте осторожность при взвешивании азид натрия. - По завершении удалить micropatterned coverslide из реакционной ампуле и промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.
- Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционных стеклянных флаконах.
- Добавить 6 мл диметилсульфоксида (ДМСО), содержащем 100 мМ этаноламина и 300 мМ триэтиламина в реакционный сосуд. Удерживая эту реакцию при 40 ° С в течение 24 ч.
Примечание: Ручка ДМСО, этаноламин, триэтиламин и лишь в химическом вытяжном шкафу. - После завершения удаления micropatterned coverslIDE из реакционной ампуле, промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.
- Провести R-μCP шаги, как описано ранее в шагах 3,2 и 3,6 - 3,12, заменив PDMS штамп с 300 мкм ID и 600 мкм OD выступающей колец, таким образом, что кольца с меньшими функциями размещены внутри ранее micropatterned колец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговое давление для этой марки является 132,0 кПа. Как упоминалось ранее, эти параметры давления оптимизированы для На марке, используемых в этом эксперименте. - Провести SI-ATRP шаги, как описано выше в пунктах 4.1 - 4.4.
- Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
- Добавить 6 мл ДМСО, содержащего 100 мМпропаргиламин в реакционную пробирку. Поддержание этой реакции при комнатной температуре в течение 24 ч.
Примечание: Ручка ДМСО и пропаргиламин только в химическом вытяжном шкафу. - По завершении удалить micropatterned coverslide из реакционной ампуле и промывают этанолом, затем водой и сушат в потоке азота.
- Поместите micropatterned coverslide в 20 мл реакционной стекло флакона.
- Добавить 6 мл сульфата меди (15 мм) / Трис [(1-бензил-1Н-1,2,3-триазол-4-ил) метил] амина (TBTA, 30 мМ) (1: 1 об / об Вода / DMF), содержащей 562 мкМ азид-PEG 4 биотин, сопряженный с реакционную пробирку. Добавить 1,2 мл L-аскорбиновой кислоты (0,15 мМ) в воде к смеси, чтобы инициализировать реакции.
- Пузырь азот через реакционный раствор в течение 10 сек, печать флакон с Parafilm, и реагировать в течение 24 ч при комнатной температуре.
- По completioп удалить micropatterned coverslide от реакции флакона, промыть водой и поместить его в полистирольной блюдо 12-а.
- Блок micropatterned coverslide в DPBS (3% осел сыворотки) в течение 1 ч при комнатной температуре. Пятно для биотинилированных ацетиленовых групп со стрептавидин-546 конъюгата (2 мкг / мл) в ППД (3% осел сыворотки в PBS) в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Промыть micropatterned coverslide 5 раз с DPBS в течение 10 мин при осторожном перемешивании.
Примечание: На рисунке 4B изображает изображение на слайде после этот шаг завершен. - Оставьте micropatterned coverslide в 12-а рolystyrene блюдо следующее ППД полоскания.
- Добавить 2 мл ППД (или клеточной культуральной среде), содержащей 20 мкМ DBCO-ПЭГ 4 биотин, и эта реакция позволит продолжать в течение 24 ч при комнатной температуре (или при 37 ° С в инкубаторе).
- По окончании, промойте micropatterned coverslide 5 раз DPBS (или просто выполнить изменение медиа).
- Пятно для биотинилированных групп азида со стрептавидин-488 конъюгата (2 мкг / мл) в 2 мл DPBS (3% осел сыворотки) в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Промыть micropatterned coverslide 5 раз в DPBS в течение 10 мин при легком помешивании.
- Изображение micropatterned coverslide помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии. 4А-C изображает образы слайде после этот шаг завершен.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подложек для культивирования тканей анализов, пропустите разделы 10 и 12 настоящего Протокола. После желаемого degreэлектронной функционализации, стерилизовать инженерии coverslide путем промывки обеих сторон 100% -ным этанолом и сушки в токе азота. Трансфер слайд в стерильную бокс биологической безопасности и промойте слайд с PBS пять раз, прежде чем приступить посева клеток и культуры.
5. Azide Функционализация Micropatterned PEGMEMA цепи
6. пассивация Бром Функционализированный PEGMEMA цепи
7. R-μCP внутреннего кольцевого пространства и SI-ATRP из PEGMEMA
8. Ацетилен Функционализация Micropatterned PEGMEMA цепи
9. Медь катализируемой "Нажмите" Биотинилирование ацетилена Прекращено PEGMEMA цепи
10. Иммунофлуоресцентное Обнаружение Биотинилированные ацетилена групп
11. Медь-бесплатно "Нажмите" Биотинилирование азида Прекращено PEGMEMA цепи
Примечание: Если желательно, эта подложка модификация стадия может быть осуществлена на месте во время культивирования клеток.
12. Иммунофлуоресцентное Обнаружение Биотинилированные азида групп
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование ручных методов выравнивания μCP спроектировать культуральных субстратах с массивами ПЭГ-привитых щеток функционализированных с ортогональным "щелчок" химические была продемонстрирована в предыдущей работе 6. Тем не менее, это дает минимальный контроль ориентации потоков и часто приводит к перекрытию областей функционализированных. Здесь, новая система R-μCP используется, чтобы преодолеть это ограничение, и его способность точно шаблон массив ПЭГ щетки колец с ID 300 мкм и 600 мкм OD представляя концевые группы алкиновых в отдельном массиве ПЭГ щетки колец с 600 мкм ID и 900 мкм OD представляя концевые группы азидного продемонстрировали 14. После реакции алкина, представляющего ПЭГ щетки с азидом три-ПЭГ биотин и реакцию азида представляя ПЭГ щетки с DBCO-PEG 4 биотин, подложка была иммунному окрашиванию с флуоресцентных зондов и визуализируют с помощью конфокальной микроскопии (Figure 4). Анализ этих изображений с помощью пользовательской программы MATLAB подсчитали, что две кисти массивы ПЭГ были выровнены с точностью суб-10 мкм, т.е. X ~ 6,4 мкм, Y ~ 1,7 мкм, и θ ~ 0,02 °, которая находится на производителя привел предел нашей модели SCARA (т.е. ~ 10 мкм) и свидетельствует о предварительной работы системы R-μCP в 14. Таким образом, мы считаем, что использование более дорогих SCARAs в этой системе будет обеспечивать еще более низкую, разрешение субмикронную. Эти результаты показывают, универсальные субстрат инженерные возможности, связанные с комбинированным использованием системы R-μCP и последовательных реакций нуклеофильного замещения. Минимальный перекрестной реактивности свидетельствует флуоресцентного мечения ортогональных поверхностных химических служит для иллюстрации потенциал этой системе для точного иммобилизации биохимических сигналов, чтобы генерировать сложные культуральных субстратах для тканевой инженерии. </ Р>
Рисунок 2. Схема R- μCP процесса. (A) вниз фронтальная камера с визуализацией иммобилизованную золотым покрытием слайд, (B) ссылка травления следов на покрытой золотом coverslide, (в) удаление PDMS штамп от штампа гнездования приспособление, (D - E) визуализация PDMS штамп контрольные метки с лицевой стороной вверх камеры , (F) размещения PDMS штамп в бане инициатора алкантиол, (G), сушка алкантиол инициатора растворителя над потоками азота, и (Н) тиснение алкантиол с покрытием PDMS штамп на золото с покрытием coverslide.
Рисунок 4. иммуноокрашиванию Изображения MicroPatterned Slide. (A) азида и (б) алкиновых группы, биотинилированный с использованием меди, свободной от меди и опосредованного щелчок химии, и детектировали со стрептавидин-488 и -546 соответственно. (С) Наложение обоих флуоресцентных каналов. Все масштабные линейки 500 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Идеальные субстраты для тканевой инженерии будет биоинспирированных и тем самым воспроизводят пространственное распределение критических биологически активных лигандов, найденных в пределах родных тканей. Они также обладают динамические свойства, которые позволяют временные корректировки лигандов и пространственных структур, в котором они представлены, чтобы обеспечить направленный ткани морфогенез и пространственно ограниченных индукцию клеточной судьбы. Изготовление таких субстратов требует иммобилизации многочисленных биохимических сигналов в сложных и высокоупорядоченных ориентаций на подложках. При моделировании все эндогенные факторы нише клетки в пробирке является необоснованным, система R-μCP описано здесь позволяет иммобилизации нескольких регионах ортогональных биологически активных химических с микромасштабной контроля пространственной ориентации.
Полезность этих субстратов возрастает еще больше, учитывая, что в то время как ПЭГ кисти массивы связаны с иммобилизованными лигандамиможет вызвать биоспецифических взаимодействий, несвязанные щетки PEG-прежнему устойчив к адсорбции белка и, таким образом, может служить для контроля адгезии и миграции клеток. Хотя пассивное, micropatterned адсорбции внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки или полимер-PEG конъюгатов является более простой способ управления клеточную адгезию и миграцию, это техника обеспечивают только кратковременное контроль, так как адсорбция является обратимым процессом 11. Кроме того, молекулы адсорбируются на поверхностях в непредсказуемых направлениях и на случайных концентрациях тем самым ограничивающих точность и контроль биоспецифических взаимодействий. Кроме того, соединения, как правило, используется для создания не-загрязняющие регионы, такие как бычий сывороточный альбумин или Плюроника F127, не обладают назначенные активные центры для дальнейшего функционализации предельного пост-адсорбции в модификациях на места. ЗРК из алкантиолов могут быть получены с такими реакционноспособными группами для дополнительной модификации поверхности, но они также имеют ограниченное долговечность в культуре ткани Conditионы из-за отсутствия окислительного защиты, предоставляемой привитого ПЭГ щетки 10,11. И наоборот, слияние наших R-μCP платформ с PEG-щетки прививки и последовательных реакций нуклеофильного замещения дает возможность спроектировать подложек длительного пользования, микромасштабных регионов cytophobic которые могут быть изменены априори или на месте с био-ортогональным функций. Это позволит лучше контролировать биоспецифических взаимодействий, которые могут регулировать в пробирке морфологии тканей и роста.
Основным преимуществом R-μCP по сравнению с другими системами для выравнивания последовательных микроконтактной печатные является возможность снять подложку из системы между повторными штамповок, сохраняя высокую точность выравнивания 12,13. Это позволяет большее разнообразие в типах химических поверхностных которые могут быть применены, а продолжительность реакции модификации поверхности можно варьировать, чтобы настроить плотностей впоследствии иммобилизованные лиганды 6. Таким образом, R-μCP может быть использован для установления координационных градиенты концентрации в биохимических сигналов, которые обеспечивают биоспецифических взаимодействий 14. С мощностью точно контролировать как местоположение и степень биоспецифических взаимодействия, система R-μCP предлагает уникальный метод для исследования роли биологически активных лигандов в ткани формообразования и устанавливает надежную систему для генерации культуры субстратов, имитирующие презентацию биологических сигналов в в естественных условиях ниша.
Одним из важнейших аспектов сотовых нишах, специально в развитии, является пространственно-временной модуляции сигналов факторы 18. Хотя растворимые биохимические сигналы могут быть добавлены в культуральную среду в временно определенным образом, есть ограниченный пространственный контроль над которыми сталкиваются эти клетки сигналы. С помощью системы R-μCP описанного здесь, можно построить micropatterned культуральных субстратах с терминально functionalizред ПЭГ щетки представляя азида функциональные группы, которые не имеют никакого влияния на судьбу клеток в культуре. В то время как азид группы способны подвергаться медные катализируемой "щелчок" реакции с алкинов, представляющих молекул, это не может быть выполнено в присутствии клеток в культуре данного токсичность меди. Тем не менее, молекулы с высокой деформации как dibenzocyclooctyne (DBCO) пройти весьма избирательный и биосовместимого неомедненная азидного-алкин циклоприсоединения 19,20. Через конъюгации DBCO содержащих линкеров, micropatterned культуральные субстраты могут быть изменены на месте с новыми биологическими лигандами 21. С возможностью визуализации cytophobic регионы cytophilic или добавить различные биохимические сигналы для использования в процедурах сигнализации многоступенчатых, культура субстраты, полученные с помощью этого метода есть новые адаптивные возможности и тем самым обеспечить более надежную систему для инструктирования тканей морфогенез в пробирке.
Несмотря на огромную кастрюлюференциальное и полезность платформе R-μCP, у него есть определенные недостатки. Использование многочисленных стадий SI-ATRP генерировать ПЭГ-привитые субстратов значительно увеличивает время изготовления по сравнению с методами, включающими струйной печати или микрокапли осаждение белков ЕСМ. В то время как точность методов струйной печати может соперничать с нынешней системой R-μCP, адсорбция белков ЕСМ является обратимым, тем самым обеспечивая меньшую контроль клеточного-белковых взаимодействий. Кроме того, субстраты, полученные с помощью методов струйной печати не могут быть удалены в процессе изготовления, тем самым препятствуя применению различных химических модификаций подложки, которые позволяют, например, пространственно ограниченных в модификации 22 Situ подложки. Из-за этих ограничений методы струйных лучше подходят для быстрого поколения культуральных субстратах заинтересованными в первую очередь с кратковременным, статические договоренностей биомолекул и клеточных типов 23, тогда как система R-μCP гораздо Беттт подходит к генерации многогранные подложек, предназначенных для демонстрируют долгосрочное, динамический контроль над обеими пространственных и временных клеточных взаимодействий в 2D с разнообразными биологическими лигандами.
Микроконтактной печати обеспечивает быстрое отложение нано-к-микроуровне "чернила" имеет более большие площади поверхности, но всегда была значительная гетерогенность в концентрации осажденных "чернил" веществ. Это также ограничение тока платформы R-μCP как можно наблюдать на Фиг.4. Мы предполагаем, что гетерогенность в флуоресцентном модификации ПЭГ щетки из-за применения робота неровной нормальной силы по всей штампа PDMS, который Также вероятно, не идеально ровной. Это приводит к неравномерному контактного давления между всех регионов штампом и подложкой, тем самым вызывая неравномерное осаждение алкантиол инициатора и последующей толщину привитого ПЭГ щеткой. ВДля того чтобы изготовить ПЭГ-привитые субстраты с даже осаждения алкантиолов и тем самым поверхностную функциональность, штамповки конструкция инструмента должны быть оптимизированы, чтобы применить распределенную и равномерное нормальную силу по всей штампа PDMS. Это будет способствовать равномерный контакт с золотым покрытием слайды по всей независимо интерфейса марок несовершенства. Кроме того, на фиг.4В, можно наблюдать небольшое перекрестное загрязнение ацетиленовых групп на азида прекращается ПЭГ щеткой. В то время как поверхностная плотность иммобилизованных лигандов из-за перекрестного заражения минимален по сравнению с от предполагаемого ПЭГ-щеткой, это может быть уменьшен практически до нуля при увеличении продолжительности реакции пассивации этаноламина (см раздел 6), как показано ранее 6.
Основная применение системы R-μCP описанной здесь для изготовления сложных тканевых культур субстраты, которые могут быть использованы для оказания пространственную и временную выводоме сотовый судьба. Тем не менее, высокая точность и точность платформе R-μCP делает его привлекательным методом для других приложений, а также. Возможность картина cytophilic области с дифференциальных химических лигандов с последующим в модификации месте ранее инертных, cytophobic регионах позволяет сокультуре нескольких клеточных линий с жестким контролем над их пространственной ориентации. Это в сочетании с присущей высокой пропускной природы micropatterning представить альтернативу текущих методов высокопроизводительного скрининга обеих одиночных клеток и комбинации нескольких клеточных 24. В то время как система R-μCP имеет большой потенциал в области биологии, он также может быть применен к области микроэлектромеханических систем (MEMS). В МЭМС изготовления, желательно, чтобы передавать компоненты MEMS с высокой точностью и аккуратностью для массового производства. С новым кинетических методов штамповки, система R-μCP описано здесь, могут быть адаптированы для эффективной печати componeНТС кремния или нитрида галлия на кремниевых пластин для использования в генерации MEMS 25. Таким образом, платформа R-μCP может быть использован для широкого диапазона возможных применений.
В заключение, использование системы R-μCP генерировать PEG-привитой культуры субстратов ортогонально функциональными помощью последовательных реакций нуклеофильного замещения представляет не только идеальной платформой для потенциально управления тканей морфологию и рост в пробирке, но отличная система для исследования роли кратного биологически активные лиганды на судьбу клеток. Возможность шаблон нескольких биохимических сигналов в различных и весьма заказанных моделей устанавливает основу для построения культуры субстраты, способные инструктаж образование тканевых структур с несколькими типами клеток, организованных в масштабе микрон. Это, в сочетании с возможностью изменения micropatterned субстратов в месте, мог бы позволить беспрецедентной контролем ткани формообразования и челл судьба в культуре. Методы паттерна, описанные здесь представляет собой гибкую систему для изготовления культуры субстраты, которые могут в один прекрасный день облегчения рационального и воспроизводимое производство органотипических тканевых структур в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A.
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
