Introduction
Aynı anda doğal olmayan kirlenme özellikleri korurken kovalent bağlı biyokimyasal ligandlar görüntülemek için PEG-aşılı yüzeylerin yeteneği, onları kültürü yüzeylerin 1,2,3 mühendislik özel mikro ortamlar için ideal bir seçimdir. Ligand konjüge PEG fırça tarafından aracılık biyospesifik etkileşimlerin tek hücre fenotipleri in vivo doku mikroçevrelerde kompleksi içinde bulunan biyokimyasal işaretlerin etkilerinin indirgeyici analizi sağlar. Ayrıca, biyo-dik bir "klik" kimyaları da yerel konformasyonun 4-6'da sunulmuştur, böylece ligand yönsel hareketsiz kılınmasını temin etmek için kullanılabilir. Böylece, PEG mikro mekansal desenlendirme fırçalar hareketsiz biyokimyasal ipuçları 6,7 ile uyarılan hücre sinyallerini araştırmak için in vitro nişler tasarımcısı oluşturmak için çok yönlü bir araçtır.
Biyokimyasal cu mekansal kalıplarını üretmek için ortak bir yöntemes PEG konjuge alkanetiollerin desenleri ile microcontact baskı (μCP) altın kaplı yüzeylerde gerektirir. Daha sonra, PEG-açillenmiş alkanetiollerin micropatterned kendinden düzenlenen tek tabakaları (SAMs), sadece alt-tabaka 8,9 olmayan desenli bölgelere, biyokimyasal moleküllerin, örneğin, protein fiziksel adsorpsiyon kısıtlar. Bununla birlikte, bu teknikle üretilen SAMs uzun vadeli hücre kültür ortamında oksidasyona duyarlı olan. Böylece, SAMs alkantiyol μCP'd genellikle daha fazla bölgenin olmayan kirlenme istikrarı 10 arttırmak için yüzey başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP) kullanılarak PEG polimer fırçalar ile aşılanmış. Özellikle, μCP alkantiyol polimerizasyon başlatıcı, poli SI-ATRP (etilen glikol) metil eter metakrilat (PEGMEMA) monomerlerin ve ardından altın kaplı yüzeylerde ω-meraptoundecyl bromoizobutirat micropatterned uzun süreli, istikrarlı, ve non yüzeyleri oluşturur kirlenme PEG fırçalar. Ayrıca, bu bundan başka çeşitli kimyasal kısımların 11 sağlamak için modifiye edilmiş olma yeteneğine sahiptir.
Bu özellik, Sha et yararlanarak. ark. dik "tık" kimyaları sunulması çok bileşenli PEGMEMA fırçalar ile kültür substratları mühendisi için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, bunlar sıralı sodyum azid, etanolamin serpiştirilmiş μCP / SI ATRP bir dizi aşama kullanmak, ve birden fazla hareketsizleştirilmiş ligand 6 mikro desen gösteren kültür tabakaları oluşturmak için nükleofilik sübstitüsyonu propargilamin. Yeni kültür sübstratları mühendislikten geçirilmesi için indirin μCP ile bağlantılı olarak, kimyasallar kullanıldığında potansiyel büyük olsa da, çok sayıda μCP aşamalar, tek bir alt-tabaka üzerinde düzenlenebilir hangi kesinlik ve doğruluğu sınırlıdır. Hassasiyet ve doğruluk yüksek düzeyde tekrarlanabilir bu çok yönlü teknikler kullanılarak in vitro nişler kompleksi üretimi için gerekli olacaktır.
e_content "> Bu sınırlama çözmek için, bazı otomatik ve yarı-otomatik μCP sistemleri al.. Çakra ve diğ. üretilen özel pulları bir ray sistemi üzerindeki izlenerek ve altın-kaplı slaytlar konformal temas ettirildiği bir μCP sistemi geliştirilmiştir Bir bilgisayar kontrollü pnömatik aktüatör. Bununla birlikte, bu yöntem, özel damga tasarımlar hassas imalat gerektirir ve çok μCP 12 adım yaparken elde doğruluğunda bir rapor ile birlikte 10 mikron hassas bildirir. Daha yeni olarak, entegre bir kinematik bağlantı sistemini kullanan bir metodu rapor, tek bir desen kullanarak 1 um altında hassas, ama nedeniyle 13 kalıp kalıp damga özelliklerin hassas kontrol eksikliği doğru birden çok desen hizaya koyamadık. Ayrıca, önceki yöntemlerin her ikisi de desenlendirme adımları arasında sabit kalmasını tabakayı gerektirir , böylece önemli ölçüde olabilir yüzey modifikasyonu kimyaları çeşitliliğini sınırlayıcıkullandı. Damga tasarım ve üretim maksimal esneklik verirken Burada, birden çok μCP adımların doğru ve kesin bir uyum otomatik R-μCP sistem yetenekli açıklar. Ayrıca, desenli yüzeyler defalarca böylece sıralı nükleofilik değiştirmelerin dahil olmak üzere çeşitli substrat modifikasyonu kimyaları, kullanımına izin veren, stampings arasındaki sistemden kaldırılabilir. Bu tür kimyasallar kullanıldığında mühendislik Yüzeyleri hem de bize 6,14 ve diğerleri 7 tarafından önceden hücre kültürü için kullanılmıştır. Böylece, karmaşık ve micropatterned biyokimyasal ipuçları ile kültürü yüzeylerin ölçeklenebilir üretimi için bir yöntem geliştirmek için Ar-μCP ve sıralı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonları birleşti.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yaratma Elastomerik Pullar
- PDMS damgası en silikon ustaları oluşturmak için, bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak PhotoMask metraj desenleri.
- 300 mikron iç çapı (ID) ve 1,200 mikron merkez-merkez aralığı ile 600 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ilk desen tasarlayın.
- 600 mikron kimliği ve 1200 mikron merkez-merkez aralığı ile 900 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ikinci desen tasarlayın.
- Ayrıca, 45 ° açıyla 1,200 mikron merkez-merkez köşe desen aralıklı her dizi tasarım dört köşe 1 x 1 mm 2 kare referans işaretlerini yerleştirin.
- Mikroakışkan dökümhane ile başka bir yerde, 15 veya işbirliği detaylı olarak, standart litografi teknikleri kullanarak bir 300 um özelliği derinliğe ilişkilendirerek, 1 boy oranları: 1 Bu deneyde kullanılmak üzere silikon ustaları imal.
Not: Özellik daha düşük 100 um alt-tabaka yüzeyi ile temas etmeden önce pul anormal deformasyonuna neden olan vuruş derinlikleri.
NOT: Bu protokol, özel ekipman ve yaratmak için temiz odalar gerektiren Fotorezist tarif desenleri, zaten elde silikon ustaları sahip başlar. Bu desenli ustaları oluşturmak için bir fabrikatör veya çekirdek tesisi ile danışmak en iyisidir.
- Silanize silikon ustaları (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorosilan buharı ile inkübasyon O / N.
NOT: Silan buharı son derece toksik ve sadece kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. - PDMS nin önceden polimer ve 60 ° C'de bir petri kabı O / N olarak silanize edilmiş silikon ustaların üstüne sertleştirme maddesi PDMS: 1 oranında, bir 10 sertleştirme ile silikon ustaların ters kopyaları oluşturun.
- Silikon ustalardan PDMS pulları kaldırmak ve akrilonitril bütadien stiren damgalar (ABS) arkaları veya diğer herhangi bir sert malzeme bağtutkal kullanarak s.
Not: seçim malzemenin şeffaf veya biyolojik olarak uyumlu olmak zorunda değildir. Bununla birlikte, PDMS daha robotik kalıp ve yüksek sağlamlığa sahip olan bir arayüz için düz bir yüzeyin sağlanması gerekir.
2. hazırlanması Coverslides
- Durulama mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) hafif bir azot akımı altında, etanol ile durulanır ve kurutulur edilmeden önce 1 dakika süre ile, aseton içinde, toluen, metanol ve sonikasyon.
NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz toluen ve aseton tutun. - Odaklanmış bir elektron ışını buharlaştırıcı kullanılarak 18.0 nm altın (Au), ardından ~ 3.5 mil titanyum (Ti) ile kaplayın coverslides.
NOT: Bu prosedür silikon ve polistiren altın dahil kaplı yüzeylerde çeşitli uyumludur. Bu yerinde oluşturmak mümkün olsa da, altın kaplanmış alt tabakalar aynı zamanda ticari tedarikçilerden yoluyla ulaşılabilir.
NOT: yüzeylerde Au tabakalar olması gerekirken, Ti tabakalar, en az 3 mil kalınlığında olmalıdırı en az 5 nm kalınlığında ve son alt-tabakanın 16,17 doğru optik özelliklerine bağlı olarak kalınlığı 1 mm tüm yol arasında olabilir. Yüzeyleri imalatı için optik açık olması gerekli değildir; Bununla birlikte, imal edilen alt-tabakaların mikroskopik analizi kolaylaştırır. - Kullanımdan hemen önce yumuşak azot altında etanol ve kuru ile altın kaplı coverslides durulayın.
3. R-μCP dış çevresinin
- Seçici uyumlu mafsallı robot kolu (SCARA) sistemi ile R-μCP önce, sistemin yazılımını kullanarak robotik araç efektörler ve beraberindeki çift kamera sistemleri kalibre.
NOT: Bu aletler Şekil 1'de resmedilmiştir.
Şekil 1. R μCP Sistemi ve Robotik Kol İşleme. (A) tüm takım ve demirbaşlar ile R-μCP sisteminin Büyük ölçekli görünümü, (a) vakumla mandren, (b) reaktif banyo, (c) aşağı bakan kamera, (d) damga yuvalama fikstür, (e) robotik aracı. (B) Robotik kol takım resmeden (f) elmas uçlu dağlama aracı ve (g) pnömatik emme aracı (h) ABS destekli PDMS damga tutarak.
- Elle 600 mikron ID ve 900 mikron OD halkasal bölge damga yuvalama fikstür aşağı yüz çıkıntılı bir PDMS damga yerleştirin. Elle Şekil 1A görüntülenen vakum aynası, üstüne taze temizlenmiş altın kaplamalı coverslide yerleştirin ve bağlı laboratuar vakum kullanarak hareketsiz.
- Robot denetimleri kullanarak, Şekil 2A gibi, altın kaplı coverslide merkez noktasının üzerinde aşağı bakan kamera hizalayın.
NOT: Bu nokta başlangıçta görsel muayene ile tanımlanabilir ve büyük hassasiyet gerektirmez, PDMS damga çok larg olduğu gibialtın kaplı slayt daha er. - Dört başvuru etch robot kolu talimat "X" boyutları ile bir kare köşelerinde işaretleri robot koluna bağlı elmas uçlu aşındırma aracını kullanarak altın kaplı coverslide merkezli 3.8 mm 3.8 mm. (Şekil 2B'de tasvir; OTOMATİK SÜRECİ)
NOT: Bu dört referans işaretleri aşağı bakan kamera bir görsel çerçevesinde olmasını sağlar. - Robotların pnömatik emme takım kullanarak, pick-up ve PDMS Şekil 2C olarak damga yuvalama fikstür üzerinde 1 mm damga basılı tutun. (OTOMATİK SÜRECİ)
- Damganın kare referans işaretleri görselleştirmek ve damgası ortalama X, Y belirlemek için kamera yazılımı ile 10 kez onları tanımlamak, ve açısal merkezinden ofset, Şekil 2D ve E resimde yukarı bakan kamera ve LED aydınlatma halkası kullanılması robot takım ekseni. (OTOMATİK SÜRECİ)
- Olduğu gibi
- Şekil 2F'de de gösterildiği gibi 3.8)) alkantiyol bir ATRP inisiyatör, ω-mercaptoundecyl bromoizobutirat (etanol içinde 2 mM bir banyoda damga yerleştirin. (OTOMATİK SÜRECİ)
- Alkantiyol çözeltiden damga çıkarın ve Şekil 2G olarak etanolün buharlaştırılması 0.48 bar (5 psi) basınçlandı azot akımı üzerine yerleştirin. 1 dakika sonra, azot akışı basınç üniform bir kuruluğa gelene sağlamak için 1.03 bar (15 psi) kadar arttırmaktadır. (OTOMATİK SÜRECİ)
NOT: Eksik kurutma desen sadakat tamamen veya kısmen kaybına neden olur. - Kurutma işleminden sonra, altın kaplamalı slayt hesaplanan merkez pozisyonu üzerindeki pul taşımak ve Şekil 2H'de gösterildiği gibi Z eksenine motor gücünü izlerken 100 um artışlarla indirin.
NOT: Bu Z-ekseni motoru yaşadığı ve robot rehberlik yazılımında görüntülenen tork iletilir. (OTOMATİK SÜRECİ) - 79.2 kPa önceden belirlenmiş bir basınç elde edildikten sonra damga düşürücü durdurmak, ve 15 saniye için altın kaplı sürgü ile temas sağlamak. (OTOMATİK SÜRECİ)
NOT: basınç değerleri burada mevcut damga tasarım ve özellik yüksekliği için optimize edilmiştir. Damga tasarım deneme ve yanılma süreci bu doğrultuda özellikle boy oranı yüksek pul, ayarlamak için, değiştirilir. - Yavaşça altın kaplamalı slayt damga kaldırmak ve geri damga yuvalama fikstür damgası yer. (OTOMATİK SÜRECİ) Micropatterned Coverslides ilgili PEGMEMA 4. SI-ATRP
- Vakum basıncı micropatterned coverslide tutarak serbest bırakın ve bir 50 ml'lik bir Schlenk şişesine aktarın. Mühür ve degas savurma bir vakum pompası kullanılarak şişeyi.
- Ekleme makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), su (34.4 mi), metanol (43.8 mi), bakır (II) bromür (1 mmol) ve 2 ', 2-bipiridin (3 mmol) ihtiva eden ATRP Reaksiyon karışımı 5.5 mi Schlenk şişesi.
- Reaksiyonu başlatmak için su içinde L-sodyum askorbat (454,3 mM) 0.5 ml ilave edilir, ve atıl gaz altında, oda sıcaklığında 16 saat süre ile devam etmesini sağlar.
NOT: Şekil 3A-B'de gösterildiği gibi, L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra, tepkime rengi koyu kahverengiye doğru açık yeşil yönelecektir.
NOT: Reaksiyon 16 saat ötesine devam edebilirsiniz, ancak önemli ölçüde PEG fırçaların uzunluğunu artırmak olmayacaktır. - Schenk şişeden micropatterned coverslide çıkarın ve hafif bir azot akımı altında, etanol, su, ve etanol ve kuru ile durulayın.
Not: SI-ATRP sonra, yüzey değişiklikleri gözle görünür olmalıdır ve Şekil 3C'de olduğu gibi, bir mikroskop altında görüntülenmiş ve analiz edilebilir.
Not: Bu, bu alt-tabakaların immunostain ihtiyacını ortadan kaldıran şekilde deneme hassas test etmek için basit bir yöntemdir. - 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin.
- N, 6 ml ilave edilir, reaksiyon şişesine, 100 mM sodyum azit ihtiva eden N-dimetilformamid (DMF). 24 saat boyunca 37 ° C 'de bu reaksiyon koruyun.
NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMF taşıyınız. Sodyum azid tartıp dikkatli olun. - Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın.
- 20 ml'lik bir cam reaksiyon şişelerine Micropatterned coverslide yerleştirin.
- 100 mM etanolamin ve reaksiyon şişesine, 300 mM trietilamin ihtiva eden, dimetil sülfoksit (DMSO) ve 6 ml ilave edilir. 24 saat süre ile, 40 ° C'de, bu reaksiyonu tutun.
NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO, etanolamin ve trietilamini tutun. - Tamamlandığında micropatterned coversl kaldırmakReaksiyon şişesinden ide, bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın.
- Küçük özellikleri ile halkasal bölge önceden micropatterned anülleri içine yerleştirilir şekilde 300 mikron ID ve 600 mikron OD çıkıntılı anülleri, bir PDMS damga ikame, 3.12 - Daha önce Adımlar 3.2 ve 3.6 de açıklandığı gibi R-μCP adımları uygulayın.
NOT: Bu damga basıncı eşik 132,0 kPa. Daha önce de belirtildiği gibi, bu basınç ayarlarının en düşük mühür özellikleri bu deneyde kullanılmak üzere optimize edilmiştir. - 4.4 - aşamalarında daha önce 4.1 de açıklandığı gibi SI-ATRP'si adımları uygulayın.
- 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin.
- DMSO mM 100 ihtiva eden 6 ml ekleyinReaksiyon şişesine propargilamin. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bu reaksiyona koruyun.
NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO ve propargilamin tutun. - Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın.
- 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin.
- Bakır sülfat (15 mM) / tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA, 30 mM) içinde 6 ml (ekleme 1: 1 h / h su Reaksiyon şişesine 562 uM azit-PEG 4 -Biotin konjugat ihtiva / DMF). Reaksiyonu başlatmak için bu karışıma su içinde L-askorbik asit (0.15 mM) ve 1.2 ml ilave edilir.
- 10 sn için, reaksiyon çözeltisi içinden kabarcık olarak, azot, Parafilm ile şişenin kapatılması, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca reaksiyona girer.
- Completio üzerineN, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide kaldırmak, su ile yıkayın ve bir 12-yuvalı polistiren tabağa koyun.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS (% 3 eşek serumu) micropatterned coverslide bloke eder. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca HAA içinde Streptavidin-546 konjugatı (2 ug / ml) (PBS içerisinde% 3 eşek serumu) ile biyotinile asetilen grupları için leke.
- Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS ile 5 kez yıkayın.
Not: Bu adım tamamlandıktan sonra, Şekil 4B, sürgünün bir görüntüsünü göstermektedir. - 12-çukurlu, s micropatterned coverslide boşolystyrene çanak aşağıdaki HAA durular.
- 20 uM DBCO-PEG 4 -biotin ihtiva HAA (ya da hücre kültür ortamı) olarak 2 ml ilave edilir, ve bu reaksiyon oda sıcaklığında 24 saat boyunca devam etmesine izin vermek (ya da bir inkübatör içinde 37 ° C'de).
- DPBS (ya da sadece bir ortam değişikliği yapılması) ile tamamlandıktan sonra, micropatterned coverslide 5 kez çalkalayın.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 ml DPBS içinde Streptavidin-488 konjugatı (2 ug / ml) (% 3 eşek serumu) ile biyotinile azid grupları için leke.
- Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS içinde 5 kez yıkayın.
- Resim konfokal floresan mikroskobu kullanılarak coverslide Micropatterned. Bu adım tamamlandıktan sonra Şekil 4A-C sürgünün görüntüleri yer almaktadır.
NOT: doku kültürü deneyleri için alt tabakalar kullanırken, bölümleri 10 ve bu protokolün 12 atlayın. İstenen açıda sonraişlevsellik e, bir azot akımı altında% 100 etanol ve kurutulması her iki tarafa da durulama işlenmiş coverslide sterilize edin. Steril bir biyolojik güvenlik kabini için slayt aktarın ve hücre tohumlama ve kültürü ile geçmeden önce PBS ile beş kez slayt durulayın.
Micropatterned PEGMEMA Chains 5. Azit Functionalization
Brom Fonksiyonlu PEGMEMA Chains 6. Pasivasyon
İç anulus 7. R-μCP ve PEGMEMA SI-ATRP'si
Micropatterned PEGMEMA Chains 8. Asetilen Functionalization
9. Bakır-katalize "Click" Asetilen biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı
Biyotinilat Asetilen Grupların 10. Immunofluorescent Algılama
11. Bakır-free "Click" Azide'da biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı
NOT: Arzu edildiği takdirde, bu alt-tabaka tadilat aşaması, hücre kültürü esnasında in situ gerçekleştirilebilir.
Biyotinilat Azit Grupların 12. Immunofluorescent Algılama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manuel hizalama μCP tekniklerinin kullanılması dik işlevselleştirüerek PEG-aşılı fırçaları Dizilerle kültür substratları mühendisi kimyaları önceki çalışmalarında 6 kanıtlanmıştır "tıklayın". Bununla birlikte, bu desen yönlendirme minimum kontrol sağlar ve genellikle fonksiyonalize alanlarında örtüşme ile sonuçlanır. Burada, yeni bir Ar-μCP sistemi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için kullanılır ve onun yetenek için doğru model 300 mikron ID ve 600 mikron OD 600 mikron ile PEG fırça annuli ayrı bir dizi içinde terminal alkin grupları sunulması ile PEG fırça annuli bir dizi Terminal azid gruba sunulması kimliği ve 900 mikron OD 14 gösterilmiştir. PEG sunma Alkinin reaksiyonunu takiben 3 -Biyotin Azit-PEG ile fırçalar ve PEG sunma azitin reaksiyon DBCO-PEG 4 -Biyotin ile fırçalar, alt tabaka F (floresan probları ile boyanmış ve bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendiigure 4). Hesaplanan özel bir MATLAB programı kullanılarak bu görüntülerin analizi iki PEG fırça dizileri X ~ 6.4 mikron, Y ~ 1.7 mikron, alt-10 mikron doğruluk, yani hizalanmış ve θ ~ 0.02 °, üreticinin de hangi sınırı atıf olduğunu Bizim SCARA modeli (yani, ~ 10 mikron) ve R-μCP sistemin geçmiş performansı 14 göstergesi olan. Böylece, bu sistemde yüksek uç SCARAs kullanımı daha da düşük, alt-mikron çözünürlük sağlayacağını inanıyoruz. Bu sonuçlar R μCP sistemi ve sıralı nükleofilik ikame reaksiyonlarının birlikte kullanımı ile mümkün olan çok yönlü bir alt-tabaka mühendislik yeteneklerini gösterir. Ortogonal yüzey kimyaları floresan etiketleme ile kanıtlandığı az çapraz reaktiflik doku mühendisliği uygulamaları için karmaşık bir kültür alt-tabakaların üretilmesi için biyokimyasal işaretlerin tam hareketsiz hale getirmek için bu sistemin potansiyel göstermeye hizmet eder. </ P>
Şekil 2. R μCP Süreci şematik. Yukarı bakan kamera ile PDMS damga referans işaretleri görselleştirme - (A) Aşağıya doğru kamerayı hareketsiz altın kaplamalı slayt görüntülenmesi, damga yuvalama fikstür PDMS damgası kaldırarak altın kaplı coverslide (B) aşındırma referans işaretleri, (C), (E D) karşı karşıya , alkantiyol başlatıcı banyosu PDMS damga yerleştirme (F), (G) kurutma azot akarsu üzerinde solvent başlatıci alkanetiyol ve altın kaplı coverslide on (H) damgalama alkantiyol kaplı PDMS damgası.
Micropatterned Slide Şekil 4. İmmüno Görüntüler. (A), azid ve (B) 'alkin grupları sunmak için fonksiyonalize bakır içermeyen ve bakır aracılı tıklama kimyası kullanılarak biyotinile edilmiş, sırasıyla streptavidin-488 ve -546 ile tespit edilir. Hem fluoresan hem kanal (C) Kaplama. Tüm ölçek 500 mikron barlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doku mühendisliği için ideal bir alt-tabakalar Biyolojik Tabanlı Akıllı ve böylece doğal dokuların içinde bulunan kritik bir biyolojik olarak aktif ligandlann uzamsal dağılımını özetlemek olacaktır. Ayrıca, ligandların zamansal ayarlamaları ve yönlendirilmiş doku morfojenezini izin vermek için sunulan ve mekansal olarak hücre akıbetinde indüksiyon sınırlandırıldığı uzamsal desen etkinleştirmeniz dinamik özelliklere sahip olacaktır. Bu gibi maddelerin imalatı yüzeylerde karmaşık ve son derece düzenli yönlerde birden fazla biyokimyasal ipuçlarının immobilizasyonunu gerektirmektedir. In vitro olarak, bir hücre niş tüm endojen faktörleri simüle makul olmasına rağmen, burada tarif edilen R-μCP sistemi mekansal yönlenmelerinin mikro kontrol ortogonal biyoaktif kimyaları birçok bölgesinde hareketsiz hale getirmek için sağlar.
Bu alt-tabakalar artar kullanımı ayrıca, PEG fırça dizileri hareketsizleştirilmiş ligand ile bağlı iken bu göz önüne alındığındabiyospesifik etkileşimlerin ortaya çıkarabilir, bağlanmamış PEG fırçalar protein adsorpsiyonu direnç gösterir ve böylece hücre yapışmasını ve göçünü kontrol etmek için hizmet edebilir. Hücre dışı matris (ECM), protein ya da polimer-PEG konjugatlarının pasif micropatterned adsorpsiyon hücre yapışmasını ve göçünü kontrol edilmesi için basit bir yöntemdir, ancak yüzeyinde tutma tersinir 11 olduğu için, bu teknik sadece geçici bir kontrol sağlar. Aynı zamanda, moleküller öngörülemeyen yönlerde içindeki yüzeylere ve böylece kalitesini ve biyospesifik etkileşimlerin kontrolünün azaltılması rastgele konsantrasyonlarda adsorbe eder. Ayrıca, tipik olarak in situ modifikasyon sonrası yüzerme sınırlayıcı daha işlevselleştirilmesi için belirlenmiş çok reaktif bölgeye sahip olmayan, örneğin büyükbaş hayvan serum albümini veya Pluronik F127 olmayan kirlenme bölgeleri oluşturmak için kullanılan bileşikler. Alkanetiollerin SAMs ek yüzey modifikasyonu için bu tip aktif gruplar ile oluşturulan, ancak çok doku kültürü iklimlendirme sınırlı dayanıklılık sahip olabilirbağlı olarak aşılanmış PEG ile elde oksidatif koruyucu eksikliği iyonları 10,11 fırçalar. Bunun aksine olarak, PEG-fırça aşılama ve ardışık nükleofilik yer değiştirme reaksiyonları ile Ar-μCP platformların birleşme biyo-ortogonal fonksiyonları ile a priori olarak veya in situ olarak da değiştirilebilir, dayanıklı mikro cytophobic bölgeleri ile alt-tabakaların mühendisi yeteneği sağlar. Bu in vitro doku morfolojisi ve büyüme düzenler biyospesifik etkileşimlerin daha fazla kontrol izin verecektir.
Sıralı mikrokontak baskılar hizalanması için, diğer sistemlere göre R μCP bir anahtar mukavemeti hala yüksektir hizalama doğruluğu 12,13 koruyarak tekrar preslenmiş arasındaki sistemi tabakayı kaldırmak için yeteneğidir. Bu, sonradan im yoğunluklarını uygulanabilir yüzey kimyaları tiplerinde daha büyük bir çeşitlilik sağlar ve yüzey modifikasyonu reaksiyonların süresi ayarlamak için değiştirilebilirseferber ligandlar 6. Bu nedenle R-μCP biyospesifik etkileşimlerin 14 aracılık biyokimyasal kuyruklarının fokal konsantrasyon değişimlerini belirlemek için kullanılabilir. Tam yerini ve biyospesifik etkileşimlerin derecesini hem kontrol kapasitesi sayesinde, R-μCP sistem doku morfogenezindeki biyoaktif ligandların rollerini araştırmak için benzersiz bir yöntem sunuyor ve biyolojik ipuçlarının sunum olarak simüle kültür substratları oluşturmak için sağlam bir sistem kurar in vivo niş.
Hücresel niş bir kritik yönü, özellikle gelişme içinde, sinyalizasyon zamanmekansal modülasyonu 18 faktörleri olduğunu. Çözünür biyokimyasal işaretler zamansal olarak tanımlanmış bir şekilde kültür ortamına ilave edilebilir olsa da, hücrelerin bu ipuçlarını karşılaşanlardır boyunca uzaysal kontrolü yoktur sınırlıdır. Burada açıklandığı gibi R-μCP sistem ile terminal olarak functionaliz ile micropatterned kültür tabakaları oluşturmak mümkündüred PEG kültürde hücre kaderi üzerinde hiçbir etkisi yoktur azid fonksiyonel grupları sunmak fırçalar. Azid gruplarını alkin gösteren moleküller ile bakır ile katalize edilen bir "klik" reaksiyonları geçirebilen birlikte, bu bakır toksisite kültürde hücrelerin varlığında gerçekleştirilemez. Ancak, dibenzocyclooctyne gibi yüksek gerilme molekülleri (DBCO) son derece seçici ve biyouyumlu bakır serbest azid-alkin Siklokatılma reaksiyonuna 19,20 uğrar. DBCO içeren bağlayıcıların konjügasyonu yoluyla micropatterned kültür alt-tabakalar, yeni biyolojik ligandlar 21 ile in situ olarak da değiştirilebilir. Cytophilic cytophobic bölgeler oluşturmak ya da çok aşamalı bir sinyalleme prosedürlerinde kullanım için farklı biyokimyasal ipuçlarını ekleme yeteneğine sahip olan, bu yöntem ile üretilen bir kültür alt-tabakalar yeni bir uyum özelliğine sahiptir ve bu nedenle, in vitro doku morfojenezini talimat için daha sağlam bir sistem sağlar.
Muazzam pot rağmenential ve R-μCP platformu yarar, bazı dezavantajları var. PEG-aşılı tabakaları oluşturmak için çok sayıda SI ATRP adımların kullanımı büyük ölçüde mürekkep püskürtmeli baskı ya da ECM proteinlerinin Mikrodamlacık çökeltme gibi yöntemleri ile karşılaştırıldığında üretim süresini uzatır. Mürekkep püskürtmeli baskı tekniklerinin hassas mevcut R μCP sistemi rakipleri birlikte, ECM proteinlerinin adsorpsiyon dolayısıyla hücre-protein etkileşimlerinin daha az kontrol temin tersine çevrilebilir. Ayrıca, mürekkep püskürtmeli baskı teknikleri ile üretilen yüzeyler dolayısıyla uzamsal yerinde substrat değişiklikler 22 kısıtlı örneğin izin farklı substrat modifikasyonu kimyalarına, kullanımını engelleyen, imalat sırasında kaldırılamaz. R-μCP sistemi çok bette oysa Bu sınırlamalar nedeniyle mürekkep püskürtmeli teknikleri kültür kısa süreli öncelikle ilgili yüzeylerde, biyomoleküllerin statik düzenlemeleri ve hücre tipleri 23 hızlı nesil için daha uygundurr uzun vadeli, farklı biyolojik ligandlar ile 2D hem mekansal ve zamansal hücresel etkileşimleri üzerinde dinamik kontrolünü sergilemek üzere tasarlanmış çok yönlü tabakaları üreten doğru uygundur.
Microcontact baskı 'mürekkep' olarak geniş yüzey alanları vardır, ancak her zaman çökelmiş 'mürekkebin maddelerin konsantrasyonu önemli farklılıklar bulunmaktadır olmuştur nano-için-mikroölçeklerde hızlı birikmesini sağlar. Şekil 4 'de görüleceği üzere, bu, aynı zamanda R-μCP platformun bir akım kısıtlamasıdır. Biz PEG floresan modifikasyonunda heterojenlik fırçalar varsayımında nedeniyle bütün PDMS damga üzerinden düzgün olmayan bir normal kuvvetin robotun uygulama için hangi aynı zamanda büyük olasılıkla mükemmel düz değil. Bu sayede, alkantiyol başlatıcı düzensiz çökelmesini ve aşılı PEG fırçanın daha sonra kalınlaşmasına sebep mührü ve alt-tabakanın tüm bölgeleri arasında homojen olmayan bir temas basıncı ile sonuçlanır. Içindealkanetiollerin da birikimi ve dolayısıyla yüzey işlevselliği olan PEG-aşılı tabakaları imal etmek amacıyla, presleme aracı dizayn bütün PDMS damga boyunca dağıtılmış ve homojen bir normal kuvvet uygulamak için optimize edilmesi gerekir. Bu damga kusurların tüm arabirim bağımsız genelinde altın kaplı slaytlar ile devamlı temas kolaylaştıracaktır. Aynı zamanda, Şekil 4B'de, bir azid sona PEG fırça üzerinde asetilen gruplarının hafif çapraz bulaşma gözlemleyebiliriz. Daha önce 6 gösterildiği gibi çapraz kontaminasyon nedeniyle hareketsizleştirilmiş ligand yüzey yoğunluğu amaçlanan PEG fırça üzerinde edilene az karşılaştırılır olsa da, bu etanolamin pasivasyon reaksiyon süresini uzatmak suretiyle arttırmak sıfıra yakın indirgenebilir (Bölüm 6'ya bakınız).
Burada açıklandığı gibi R-μCP sisteminin ana uygulama uzaysal ve zamansal kontrolünün o uygulamak için kullanılabilir karmaşık doku kültür sübstratları imalinde kullanılması olupf hücre kaderi. Ancak, R-μCP platformun yüksek hassasiyet ve kesinlik bunun yanı sıra başka uygulamalar için çekici bir yöntem sağlar. Daha önce atıl olan, cytophobic bölgelerin yerinde modifikasyonunda ardından diferansiyel bağ kimyasalları ile model cytophilic alanları yeteneği bunların uzaysal üzerinde sıkı bir kontrolü ile birden fazla hücre hatlarının ko-kültür için izin verir. Micropatterning doğasında yüksek verimli bir doğası ile bu tek hücreler ve çok hücreli kombinasyonları 24 her ikisi de, yüksek miktarda madde taraması için mevcut yöntemlere bir alternatif sunmaktadır. R-μCP sistem biyolojisi alanında büyük bir potansiyele sahip olmakla birlikte, aynı zamanda mikro-elektromekanik sistemler (MEMS) alanında tatbik edilebilir. MEMS üretiminde, seri üretim için yüksek hassasiyet ve doğruluk ile MEMS bileşenleri aktarmak için arzu edilir. Yeni bir kinetik damgalama teknikleri ile, burada tarif edilen R-μCP sistemi etkin compone yazdırmak için uyarlanabilirMEMS 25 oluşturulmasında kullanılmak üzere silikon gofret üzerinde silikon veya galyum nitrür NTS. Bu durumda, R-μCP platformu potansiyel geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir.
Sonuç olarak, R-μCP sisteminin kullanılması, dikey olarak arka arkaya, nükleofilik ikame etme reaksiyonları kullanılarak işlevselleştirilmiş kültür sübstratları, PEG-aşılı oluşturmak için sunulur, potansiyel olarak, in vitro doku morfolojisi ve büyümesini kontrol etmek için ideal bir platform, ancak birden fazla rollerini araştırmak için mükemmel bir sistem, sadece hücre kaderi üzerinde biyoaktif ligandlar. Farklı ve çok iyi düzenlenmiş bir desen kalıbı birden fazla biyokimyasal ipuçlarına yeteneği mikron ölçeğinde düzenlenen birden fazla hücre tipleri ile doku yapılarının oluşumunu talimat edebilen kültür substrat oluşturmak için temel oluşturur. Bu, yerinde micropatterned substratlar değiştirme yeteneği ile birleştiğinde, doku morfojenezinin ve cel eşsiz kontrolü için izin verebilirkültür l kader. Burada anlatılan desenlendirme teknikleri bir gün vitro organotipik doku yapılarının rasyonel ve tekrarlanabilir üretim kolaylaştırabilir kültür tabakaları imalatı için çok yönlü bir sistem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A.
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
