Introduction
Förmågan hos PEG-ympade ytor för att visa kovalent bundna biokemiska ligander samtidigt bibehålla inneboende icke-fouling egenskaper gör dem till ett idealiskt val för ingenjörs anpassade mikroskala miljöer på odlingssubstrat 1,2,3. De biospecifika interaktioner medierade av ligand konjugerad PEG borstar möjliggör reduktionistisk analys av effekterna av biokemiska signaler som finns inom komplex in vivo vävnadsmikromiljöer på enskilda cellfenotyper. Vidare kan bio-ortogonala "klick" kemi användas för att underlätta riktad immobilisering av ligander så att de presenteras i nativa konforma 4-6. Således mikroskala rumsliga mönstring av PEG borstar är ett mångsidigt verktyg för att skapa designer in vitro nischer för att undersöka cellsignalering inducerad av immobiliserade biokemiska signaler 6,7.
En vanlig metod för att generera rumsliga mönster för biokemisk cues innebär micro utskrift (μCP) guldbelagda substrat med mönster av PEG konjugerade alkantioler. Sedan de micropatterned själv monterade monolager (SAMS) av PEG-ylated alkantioler begränsar fysisk adsorption av biokemiska molekyler, t.ex., proteiner, endast för icke-mönstrade regioner av substratet 8,9. Emellertid SAMS genereras av denna teknik är känsliga för oxidation i långtidscellkulturmedia. Således är μCP'd alkantiol SAMs ofta vidare ympade med PEG polymerborstar använder ytan initierad atomöverföring radikalpolymerisation (SI-ATRP) för att öka regionens icke-fouling stabilitet 10. Specifikt μCP av alkantiolen polymerisationsinitiator, ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, på guldbelagda ytor följt av SI-ATRP av poly (etylenglykol) metyleter-metakrylat (PEGMEMA) monomerer genererar ytor med micropatterned långvarig, stabil, och icke- påväxt PEG borstar. Dessutom är dessa är i stånd att modifieras ytterligare för att presentera skiftande kemiska delar 11.
Med utnyttjande av fastigheten, Sha et. al. utvecklat en metod att konstruera odlingssubstrat med fler PEGMEMA borstar som utgör ortogonala "klick" kemi. I denna metod använder de en rad μCP / SI-ATRP steg varvat med sekventiell natriumazid, etanolamin, och propargylamin nukleofila substitutioner för att skapa odlingssubstrat som uppvisar mikroskala mönster av multipla immobiliserade ligander 6. Även möjligheterna att använda sådana kemiska sammansättningar i kombination med manuell μCP att konstruera nya odlingssubstrat är enorm, det är begränsad av den precision och noggrannhet med vilken flera μCP steg kan anpassas på ett enda substrat. En hög grad av precision och noggrannhet skulle krävas för att reproducerbart tillverka komplexa in vitro nischer som använder dessa mångsidiga tekniker.
e_content "> För att hantera denna begränsning har flera automatiska och halvautomatiska μCP system genererats. Chakra et. al. utvecklat ett μCP system där egna stämplar placeras på ett skensystem och bringas i anpassad kontakt med guldbelagda bilder med hjälp en datorstyrd pneumatiskt manöverdon. Detta kräver dock att metoden exakt tillverkning av egna frimärksmotiv och redovisar ett 10 mikrometer precision med ingen rapport av noggrannheten uppnås vid utförande av flera μCP steg 12. På senare tid har en metod som utnyttjar ett integrerat kinematiska kopplingssystem rapporterade precision under 1 um med hjälp av ett enda mönster, men kunde inte exakt rikta flera mönster på grund av brist på noggrann kontroll av stämpel funktioner från mögel att forma 13. Dessutom har båda de tidigare metoderna kräver att substratet förblir fast mellan mönstring steg , vilket avsevärt begränsar mångfalden av ytan modifieringskemi som kan varautnyttjas. Här beskriver vi en automatiserad R-μCP system som kan noggrann och exakt inriktning av flera μCP steg samtidigt maximal flexibilitet i stämpel design och tillverkning. Dessutom kan de mönstrade substrat upprepade gånger bort från systemet mellan stans, vilket möjliggör användning av olika substratmodifieringskemi, inklusive sekventiella nukleofila substitutioner. Substrat konstruerade med hjälp av sådana verksamma ämnen har använts för cellodling tidigare av både oss 6,14 och övriga 7. Därför har vi slagit samman R-μCP och sekventiella nukleofila substitutionsreaktioner att utveckla en metod för skalbar framställning av odlingssubstrat med komplexa och micropatterned biokemiska signaler.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generera Elastomera Stämplar
- För att generera PDMS stämpel är kisel mästare, utforma fotomask s funktionsmönster med hjälp av datorstödd design mjukvara.
- Designa det första mönstret som en 20 x 20 matris med ringarna med 300 um innerdiameter (ID) och 600 pm OD med 1.200 um centrum till centrumavstånd.
- Utforma andra mönster som en 20 x 20 matris med ringarna med 600 pm-ID och 900 um OD med 1.200 um centrum till centrumavstånd.
- Dessutom, placera 1 x 1 mm 2 kvadratreferensmärken i alla fyra hörnen av varje uppsättning designen åtskilda 1.200 um centrum till centrum från hörnet mönstret i 45 ° vinkel.
- Tillverka kisel mästare för användning i detta experiment med 1: 1 bildformat, korrelera med en 300 pm funktion djup med hjälp av standardlitografitekniker i andra delar 15 eller i samarbete med en mikroflödes gjuteri.
OBSERVERA: Feature djup lägre än 100 | im kan leda till onormal deformation av stämplar före kontakt med substratytor.
OBS: Detta protokoll börjar med att redan ha erhållits kisel mästare med de beskrivna mönster av fotoresist, vilket kräver specialutrustning och rena rum för att skapa. Det är bäst att rådgöra med en Fabricator eller core facility för att skapa dessa mönstrade mästare.
- Silaniseras kisel mästare O / N genom inkubation med (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorsilan ånga.
OBS: Silan ånga är mycket giftigt och bör enbart hanteras i ett dragskåp. - Skapa inverterad repliker av de kisel masters genom härdning av en 10: 1-förhållande av PDMS-prepolymer och PDMS härdningsmedel ovanpå de silaniserade kisel mästare i en petriskål O / N vid 60 ° C.
- Ta bort PDMS frimärken från kisel mästarna, och binda frimärken till akrylonitrilbutadienstyren (ABS) underlag eller annat styvt materials med lim.
OBS: material val behöver inte vara transparent eller biokompatibla. Man måste dock ge en plan yta för gränssnitt till robot verktyg och högre styvhet än PDMS.
2. Förbereda Coverslides
- Skölj mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) i toluen, metanol och sonikeras i aceton under 1 min före sköljning med etanol och torkning under en försiktig kvävgasström.
OBS: Hantera toluen och aceton endast i ett dragskåp. - Coat coverslides med ~ 3,5 nm titan (Ti), följt av 18,0 nm guld (Au) med användning av en fokuserad elektronstråle stare.
NOTERA: Detta förfarande är förenligt med en variation av guldbelagda substrat inklusive kisel och polystyren. Även om det är möjligt att alstra dessa på plats, guldbelagda substraten är också tillgängliga via kommersiella leverantörer.
NOTERA: Ti skikten bör vara minst 3 nm tjockt, medan Au skikt på substrat bör vara ent stone 5 nm tjockt och kan sträcka sig hela vägen till 1 mm i tjocklek, beroende på de ideala optiska egenskaperna hos det slutliga substratet 16,17. Substrat behöver inte vara optiskt klar för tillverkning; Men, det underlättar mikroskopisk analys av tillverkade substrat. - Skölj guldbelagda coverslides med etanol och torka under försiktig kvävgas omedelbart före användning.
3. R-μCP av yttre ringen
- Innan R-μCP med selektivt kompatibel ledad robotarm (SCARA) systemet, kalibrera robotverktygs effektorerna och medföljande dubbla kamerasystem som använder systemets programvara.
OBS! Dessa redskap är avbildade i figur 1.
Figur 1. R- μCP System och Robotic Arm Tooling. (A) i stor skala av R-μCP systemet med alla verktyg och fixturer, (a) vakuumchuck, (b) reagens bad, (c) nedåt inför kamera, (d) stämpel häckande fixtur, (e) robot verktyg. (B) Robotic arm tooling föreställande (f) diamantbestyckade etsningsverktyg och (g) pneumatiskt sug verktyg som håller en (h) ABS-stödda PDMS stämpel.
- Placera manuellt en PDMS stämpel med 600 pm-ID och 900 um OD utskjutande ringarna sidan nedåt i stämpel häckande fixturen. Placera manuellt en nyrengjord guldbelagd coverslide ovanpå vakuumchuck, som visas i fig 1A, och immobilisera den med hjälp av anslutna lab vakuum.
- Med hjälp av robotkontroller, rikta den nedåtvända kamera över mittpunkten av den guldbelagda coverslide, som i figur 2A.
OBS: Denna punkt kan initialt definieras genom visuell inspektion och som inte kräver stor noggrannhet, såsom PDMS stämpeln är mycket larger än guldbelagda slide. - Instruera robotarmen för att etsa fyra referens "X" varumärkena hörn i en kvadrat med måtten 3,8 mm x 3,8 mm centrerad på den guldbelagda coverslide hjälp av diamantbestyckade etsning verktyg fäst vid robotarmen. (Visad i figur 2B; automatiserad process)
OBS: Detta säkerställer alla fyra referensmärken är inom en visuell ram nedåtvända kameran. - Genom att använda robotarna pneumatiska sug verktyg, pick-up och hålla PDMS stämpel 1 mm ovanför stämpeln häckande fixturen som i figur 2C. (Automatiserad process)
- Använda uppåtvänd kamera och LED-belysning ring avbildas i figur 2D och E, visualisera stämpel torg referensmärken och identifiera dem med kameran programvara 10 gånger för att fastställa stämpeln genomsnittliga X, Y och vinkelförskjutning från centrum robotverktygsaxeln. (Automatiserad process)
- Såsom i
- 3.8) Placera stämpel i ett bad av alkantiol ATRP initiator, ω-mercaptoundecyl bromisobutyrat (2 mM i etanol) som visas i figur 2F. (Automatiserad process)
- Ta bort stämpeln från alkantiol lösningen och placera den över kväveström under tryck till 0,48 bar (5 psi) för att förånga etanol som i figur 2G. Efter 1 min öka kväveflödet s tryck är 1,03 bar (15 psi) för att säkerställa en enhetlig torrhet. (Automatiserad process)
OBS: Ofullständig torkning leder till total eller partiell förlust av mönster trohet. - Efter torkning, flytta stämpel över den beräknade mittposition guldbelagda slide och sänk ner den i steg 100 um under övervakning Z-axelns motor kraft som visas i figur 2H.
OBS: Detta kommuniceras som vridmoment upplevs av Z-axeln motor och visas i robotguidning programvaran. (Automatiserad process) - Sluta sänka stämpeln när den förutbestämda tryck av 79,2 kPa har uppnåtts, och hålla kontakt med den guldbelagda bild för 15 sek. (Automatiserad process)
OBS: tryckvärden här är optimerade för den aktuella stämpel design och funktion höjd. Om stämpel designen ändras, speciellt för högt sidoförhållande frimärken, ställa dessa i enlighet därmed genom en trial and error process. - Sakta ta bort stämpeln från guldbelagda bild och placera stämpeln tillbaka i stämpel häckande fixturen. (Automatiserad process) 4. SI-ATRP av PEGMEMA på Micropatterned Coverslides
- Släpp vakuumtryck håller micropatterned coverslide, och överföra den till en 50 ml Schlenkkolv. Seal och avgasa Schlenk-kolv med användning av en vakuumpump.
- Lägg 5,5 ml ATRP reaktionsblandning innehållande makromonomeren PEGMEMA (208,75 mmol), vatten (34,4 ml), metanol (43,8 ml), koppar (II) bromid (1 mmol) och 2 ', 2-bipyridin (3 mmol) för att Schlenk-kolv.
- Lägg 0,5 ml L-natriumaskorbat (454,3 mM) i vatten för att initiera reaktionen, och låta den fortsätta i 16 h vid rumstemperatur under inert gas.
OBS: Efter tillsats av L-natriumaskorbat, kommer reaktions färg skiftar från ljusgrönt till mörkbrun som visas i figur 3A-B.
OBS: Reaktionen kan fortsätta efter 16 timmar, men det kommer inte att avsevärt öka längden på PEG borstar. - Avlägsna micropatterned coverslide från Schenk kolv och skölj med etanol, vatten och etanol och torka under en försiktig kvävgasström.
OBS: Efter SI-ATRP bör ytförändringsbeläggningar vara synliga för ögat och kan avbildas och analyseras i mikroskop som i figur 3C.
OBS: Detta är den enklaste metoden för att testa noggrannheten av försöket som det undanröjer behovet att immunostain substraten. - Placera micropatterned coverslide i en 20 ml glasreaktionsflaska.
- Lägg 6 ml N, N-dimetylformamid (DMF) innehållande 100 mM natriumazid till reaktionsflaskan. Bibehåll denna reaktion vid 37 ° C under 24 h.
OBS: Hantera DMF endast i ett dragskåp. Var försiktig när du väger ut natriumazid. - Efter fullbordan avlägsna micropatterned coverslide från reaktionsflaskan och skölj med etanol och därefter vatten och torka under en kväveström.
- Placera micropatterned coverslide i 20 ml glasreaktionsrören.
- Lägg 6 ml dimetylsulfoxid (DMSO), som innehöll 100 mM etanolamin och 300 mM trietylamin till reaktionsflaskan. Håll denna reaktion vid 40 ° C under 24 h.
OBSERVERA: Handtag DMSO, etanolamin, och trietylamin endast i en kemisk draghuv. - Vid slutför avlägsna micropatterned coverslide från reaktionsflaskan, skölj med etanol då vatten och torka under en kväveström.
- Utför R-μCP steg som tidigare beskrivits i steg 3.2 och 3,6-3,12, ersätta en PDMS stämpel med 300 pm ID och 600 pm OD utskjutande ringarna, så att ringarna med mindre funktioner är placerade inuti de tidigare micropatterned ringarna.
OBS: Starttrycket för denna stämpel är 132,0 kPa. Såsom tidigare nämnts är dessa tryckinställningar optimerade för stämpel funktioner som används i detta experiment. - Utför SI-ATRP steg som tidigare beskrivits i steg från 4,1 till 4,4.
- Placera micropatterned coverslide i en 20 ml glasreaktionsflaska.
- Lägg 6 ml DMSO innehållande 100 mMpropargylamin till reaktionsflaskan. Bibehåll denna reaktion vid RT under 24 h.
OBS: Hantera DMSO och propargylamin endast i ett dragskåp. - Vid slutför avlägsna micropatterned coverslide från reaktionsflaskan och skölj med etanol och därefter vatten och torka under en kväveström.
- Placera micropatterned coverslide i en 20 ml glasreaktionsflaska.
- Lägg 6 ml kopparsulfat (15 mM) / Tris [(1-bensyl-1 H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (TBTA, 30 mM) (1: 1 volym / volym vatten / DMF) innehållande 562 | iM azid-PEG 4 -Biotin konjugatet till reaktionsflaskan. Lägg 1,2 ml L-askorbinsyra (0,15 mM) i vatten till blandningen för att initiera reaktionen.
- Bubbla kväve genom reaktionslösningen under 10 sek, förslut flaskan med Parafilm, och reagera under 24 h vid RT.
- Upon completion bort micropatterned coverslide från reaktionsflaskan, skölj med vatten och placera den i en 12-brunnars polystyren maträtt.
- Blockera micropatterned coverslide i DPBS (3% Donkey serum) under 1 h vid RT. Fläcken för biotinylerade acetylengrupper med streptavidin-546-konjugat (2 | ig / ml) i DBPS (3% Donkey serum i PBS) under 2 h vid RT.
- Skölj micropatterned coverslide fem gånger med DPBS för 10 min med försiktig omrörning.
OBS: Figur 4B visar en bild av objektglaset efter detta steg är slutfört. - Lämna micropatterned coverslide i 12-bra polystyrene skålen följande DBPS sköljningar.
- Tillsätt 2 ml DBPS (eller cellodlingsmedier) innehållande 20 | iM DBCO-PEG 4 -Biotin och tillåta detta reaktionen fortsätta i 24 h vid RT (eller vid 37 ° C i en inkubator).
- Efter avslutad, skölj micropatterned coverslide 5 gånger med DPBS (eller helt enkelt göra en mediabyte).
- Fläcken för biotinylerade azid grupper med Streptavidin-488-konjugat (2 | ig / ml) i 2 ml DPBS (3% Donkey serum) under 2 h vid RT.
- Skölj micropatterned coverslide 5 gånger i DPBS under 10 min med försiktig omrörning.
- Bild micropatterned coverslide använder konfokalt fluorescensmikroskop. Figur 4A-C visar bilder av objektglaset efter detta steg är avslutat.
OBS: När du använder substrat för vävnadskulturanalyser, hoppa avsnitt 10 och 12 i detta protokoll. Efter att den önskade Degree av funktionalisering, sterilisera engineered coverslide genom sköljning båda sidor med 100% etanol och torkning under en kväveström. Överför bilden till en steril biologisk säkerhet skåp och skölj bilden med PBS fem gånger före cellsådd och kultur.
5. Azid Funktionalisering av micropatterned PEGMEMA Kedjor
6. Passive av Brom funktionaliserad PEGMEMA Kedjor
7. R-μCP i innerringen och SI-ATRP av PEGMEMA
8. Acetylen Funktionalisering av micropatterned PEGMEMA Kedjor
9. Koppar katalyserade "Klicka på" Biotinylering av Acetylen Avslutade PEGMEMA Kedjor
10. Immunofluorescerande detektion av biotinylerat acetylengrupper
11. Kopparfritt "Klicka på" Biotinylering av azid Avslutade PEGMEMA Kedjor
OBS: Om så önskas kan detta substrat modifikation steg utföras in situ under cellodling.
12. Immunofluorescerande detektion av biotinylerat azid Grupper
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Användningen av manuell inriktning μCP tekniker för att modifiera odlingssubstrat med arrayer av PEG-ympade borstar funktionaliserade med ortogonal "klick" kemier har visats i tidigare arbete 6. Emellertid erbjuder detta minimal kontroll av mönsterorientering och ofta resulterar i överlappning av funktionaliserade områden. Här används en ny R-μCP system som används för att övervinna denna begränsning, och dess förmåga att korrekt mönster en matris av PEG borste ringarna med 300 | j, m id och 600 um OD presentera terminala alkyn grupper inom en separat uppsättning av PEG borste ringarna med 600 | j, m ID och 900 um OD presentera terminala azid grupper demonstreras 14. Efter reaktionen av alkyn presenter PEG borstar med azid-PEG 3 -Biotin och reaktionen av azid presenter PEG borstar med DBCO-PEG 4 -Biotin ades substrat immunostained med fluorescerande prober och avbildas med användning av ett konfokalmikroskop (Figure 4). Analys av dessa bilder med hjälp av en anpassad MATLAB program beräknat att de två PEG borst arrayer var i linje med sub-10 mikrometer precision, dvs X ~ 6,4 um, Y ~ 1,7 um, och θ ~ 0,02 °, vilket är på tillverkarens citerade gräns av vår SCARA modell (dvs ~ 10 mikrometer) och tecken på R-μCP systemets tidigare prestationer 14. Således tror vi att användningen av högre slutet SCARAs i detta system skulle ge ännu lägre, submikron resolution. Dessa resultat visar den mångsidiga substrat kapacitet teknik som möjliggörs av den kombinerade användningen av R-μCP systemet och sekventiella nukleofila substitutionsreaktioner. Den minimala korsreaktiviteten framgår av fluorescerande märkning av de ortogonala ytan kemi tjänar till att illustrera potentialen i detta system för exakt immobilisering av biokemiska signaler för att generera komplexa odlingssubstrat för vävnadstekniska tillämpningar. </ P>
Figur 2. Schematisk av R- μCP Process. (A) Nedåtriktad kamera visualisera immobiliserade guldbelagda slide, (B) etsning referensmärken på guldbelagda coverslide, (C) tar bort PDMS stämpel från stämpel häckande fixtur, (D - E) visualisera PDMS stämpel referensmärken med uppåtvänd kamera , (F) placera PDMS stämpel i alkantiol initiator bad, alkantiol (G) torkning initiator lösningsmedel över kväve, och (H) stämpling alkantiol belagd PDMS stämpel på guldbelagda coverslide.
Figur 4. immunostained Bilder från micropatterned Slide. (A) azid och (B) alkyn-grupper, biotinylerades med användning av kopparfritt och kopparmedierad klick kemi, och detekterades med streptavidin-488 och -546 respektive. (C) överlagring av både fluorescerande kanalerna. All skala stänger 500 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perfekt substrat för tissue engineering skulle Bioinspired och därmed sammanfatta den rumsliga fördelningen av kritiska bioaktiva ligander som finns inom de naturliga vävnader. De skulle också ha dynamiska egenskaper som gör att tids justeringar av ligander och de rumsliga mönster som de presenteras för att möjliggöra riktade vävnadsmorfogenes och rumsligt begränsade induktion av cell öde. Tillverkning av sådana substrat kräver immobilisering av flera biokemiska signaler i komplexa och mycket beställda riktlinjer på substrat. Medan simulera alla de endogena faktorer av cellens nisch in vitro är orimligt, R-μCP system som beskrivs här tillåter immobilisering av multipla regioner av ortogonala bioaktiva ämnen med mikrokontroll av rumslig orientering.
Nyttan av dessa substrat ökar ytterligare när man överväger att medan PEG borst arrayer bunden med immobiliserade liganderkan framkalla biospecifika interaktioner, obundna PEG borstar förblir resistenta mot protein adsorption och därmed kan bidra till att styra celladhesion och migration. Även passiv, micropatterned adsorption av extracellulärt matrix (ECM) proteiner eller polymer-PEG-konjugat är en enklare metod för att styra celladhesion och migration, bara dessa Tekniken ger övergående kontroll eftersom adsorption är en reversibel process 11. Även molekyler adsorberas till ytor i oförutsägbara riktningar och med slump koncentrationer därmed begränsar trohet och kontroll av biospecifika interaktioner. Dessutom föreningar vanligtvis används för att skapa icke-påväxt regioner, såsom bovinserumalbumin eller Pluronic F127, inte har utsetts reaktiva platser för ytterligare funktion begränsar efter adsorption in situ förändringar. SAMs av alkantioler kan genereras med sådana reaktiva grupper för ytterligare ytmodifiering, men de har också begränsad hållbarhet i vävnadskultur conditjoner på grund av bristen på oxidativ avskärmning som följer av ympad PEG borstar 10,11. Omvänt, sammanslagningen av våra R-μCP plattformar med PEG-borste ympning och sekventiella nukleofila substitutionsreaktioner ger möjlighet att konstruera substrat med hållbara, mikroskala cytophobic regioner som kan ändras på förhand eller på plats med bio-ortogonala funktioner. Detta kommer att möjliggöra ökad kontroll av biospecifika interaktioner som kan reglera in vitro vävnadsmorfologi och tillväxt.
En viktig styrka R-μCP jämfört med andra system för inriktning sekventiella micro tryckningar är förmågan att ta bort underlaget från systemet mellan upprepade stansrester och samtidigt bibehålla hög anpassning noggrannhet 12,13. Detta möjliggör större variation i de typer av ytan kemi som kan tillämpas, samt hur länge ytförändrande reaktioner kan varieras för att ställa de densiteter senare immobiliserade ligander 6. Således kan R-μCP användas för att fastställa fokala koncentrationsgradienter i de biokemiska signaler som medierar biospecifika interaktioner 14. Med kapacitet att exakt kontrollera både på platsen och graden av biospecifika interaktioner erbjuder R-μCP systemet en unik metod för att undersöka roller bioaktiva ligander i vävnadsmorfogenes och etablerar ett robust system för att generera kultursubstrat simulerar presentationen av biologiska ledtrådar i in vivo-nisch.
En kritisk aspekt av cellulära nischer, speciellt inom utveckling, är spatiotemporal modulering av signalering faktorer 18. Även lösliga biokemiska signaler kan sättas till odlingsmediet i en tidsmässigt definierat sätt, är det begränsade spatiala kontroll över vilka celler stöter på dessa signaler. Med R-μCP systemet som beskrivs här, är det möjligt att konstruera micropatterned odlingssubstrat med terminalt functionalized PEG borstar presentera azid funktionella grupper som inte har någon effekt på cell öde i kultur. Medan azid grupper kan genomgå kopparkatalyserade "klick" reaktioner med alkyn- presentera molekyler, detta kan inte göras i närvaro av celler i kultur med tanke på toxiciteten av koppar. Men hög-töjnings molekyler som dibenzocyclooctyne (DBCO) genomgå ett mycket selektivt och biokompatibel kopparfritt azid-alkyn cykloadditionsreaktionen 19,20. Genom konjugering av DBCO-kopplingsmedel, kan micropatterned odlingssubstrat modifieras på plats med nya biologiska ligander 21. Med möjligheten att göra cytophobic regioner cytophilic eller lägga till olika biokemiska signaler för användning i flera steg signalering förfaranden, kultursubstrat som genereras med denna metod har nya anpassningsförmåga och på så sätt ge en mer robust system för att instruera vävnadsmorfogenes in vitro.
Trots den enorma pottenrential- och nyttan av R-μCP plattform, har det vissa nackdelar. Användningen av många SI-ATRP steg för att generera PEG-ympade substrat ökar kraftigt tillverkningstiden jämfört med metoder som involverar bläckstråleutskrift eller mikrodroppar deposition av ECM-proteiner. Medan precisionen hos bläckstråletrycktekniker rivaler som nuvarande R-μCP system är adsorptionen av ECM-proteiner reversibelt därigenom åstadkomma mindre kontroll av cell-protein-interaktioner. Dessutom kan substrat som genereras via bläckstråletrycktekniker inte tas bort under tillverkningen, och därigenom hindra användningen av olika substrat modifiering kemi som möjliggör till exempel rumsligt begränsade på plats substrat ändringar 22. På grund av dessa begränsningar bläckstråletekniker är bättre lämpade för snabb generering av odlingssubstrat berörs i första hand med kort löptid, statiska arrangemang av biomolekyler och celltyper 23 medan R-μCP systemet är mycket better passar mot generera mångfasetterade substrat som syftar till att uppvisa en långsiktig, dynamisk kontroll över både rumsliga och tidsmässiga cellulära interaktioner i 2D med olika biologiska ligander.
Microcontact utskrift möjliggör snabb avsättning av nano-till-mikroskala "bläck" innehåller över stora ytor, men det har alltid varit betydande heterogenitet i koncentrationen av deponerade "bläck" ämnen. Detta är också en aktuell begränsning av R-μCP plattformen som kan observeras i Figur 4. Vår hypotes är att den heterogenitet i fluorescerande modifiering av PEG borstar beror på robotens tillämpning av en ojämn normalkraft över hela PDMS stämpel, som är också sannolikt inte helt platt. Detta resulterar i olikformiga kontakttryck mellan alla regioner i stämpeln och substratet därmed orsakar ojämn avsättning av alkantiolen initiator och efterföljande tjockleken på ympade PEG borsten. IFör att tillverka PEG-ympade substrat med jämn avsättning av alkantioler och därigenom ytan funktionalitet, kommer stansverktygskonstruktion måste optimeras för att tillämpa en distribuerad och likformig normalkraft över hela PDMS stämpel. Detta kommer att underlätta en enhetlig kontakt med de guldbelagda glider över hela gränssnittet oberoende av stämpel brister. Dessutom, i figur 4B, kan en observera svag korskontaminering av acetylengrupper om aziden terminerad PEG borste. Medan ytors immobiliserade ligander på grund av korskontaminering är minimal jämfört med den på den avsedda PEG-borste, kan detta minskas till nära noll genom att öka varaktigheten av etanolpassive reaktion (se avsnitt 6) som tidigare 6 demonstreras.
Den primära tillämpning av R-μCP system som beskrivs här är för tillverkning av komplexa vävnadsodlingssubstrat som kan användas för att utöva rumsliga och tidsstyrning of cellöde. Men den höga precisionen och noggrannheten hos R-μCP plattformen gör det till en attraktiv metod för andra tillämpningar. Förmågan att mönstret cytophilic områden med differential ligand chemistries följt av in situ modifiering av tidigare inerta, cytophobic regioner möjliggör samtidig odling av olika cellinjer med god kontroll över deras rumsliga orientering. Detta i kombination med den inneboende hög genomströmning karaktär micropatterning presentera ett alternativ till nuvarande metoder för high-throughput screening av både enstaka celler och multicellkombinationer 24. Medan R-μCP systemet har stor potential i sfären av biologi, kan det även tillämpas på området för mikroelektromekaniska system (MEMS). I MEMS-tillverkning, är det önskvärt att överföra MEMS komponenter med hög precision och noggrannhet för massproduktion. Med nya kinetiska stämpling tekniker kunde R-μCP system som beskrivs här anpassas för att effektivt skriva ut componenätter av kisel eller galliumnitrid på kiselskivor för användning i alstring av MEMS 25. Således kan R-μCP plattform användas för ett brett spektrum av potentiella tillämpningar.
Sammanfattningsvis för användning av R-μCP systemet genererar PEG-ympade odlingssubstrat ortogonalt funktion hjälp av sekventiella nukleofila substitutionsreaktioner utgör inte bara en idealisk plattform för potentiellt styra vävnadsmorfologi och tillväxt in vitro, men ett utmärkt system för att utreda de roller som multipel bioaktiva ligander på cell öde. Förmågan att mönstret flera biokemiska signaler i distinkta och mycket beställda mönster etablerar grunden för att bygga odlingssubstrat som kan instruera bildningen av vävnadsstrukturer med flera celltyper som anordnas i micron skala. Detta, i kombination med möjligheten att modifiera micropatterned substrat på plats, kan ge utrymme för oöverträffad kontroll över vävnadsmorfogenes och cell öde i kultur. De mönstringstekniker som beskrivs här ger ett mångsidigt system för tillverkning av odlingssubstrat som en dag skulle underlätta en rationell och reproducerbar produktion av organotypiska vävnadsstrukturer in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A.
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
