Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.
In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.
Förmågan hos PEG-ympade ytor för att visa kovalent bundna biokemiska ligander samtidigt bibehålla inneboende icke-fouling egenskaper gör dem till ett idealiskt val för ingenjörs anpassade mikroskala miljöer på odlingssubstrat 1,2,3. De biospecifika interaktioner medierade av ligand konjugerad PEG borstar möjliggör reduktionistisk analys av effekterna av biokemiska signaler som finns inom komplex in vivo vävnadsmikromiljöer på enskilda cellfenotyper. Vidare kan bio-ortogonala "klick" kemi användas för att underlätta riktad immobilisering av ligander så att de presenteras i nativa konforma 4-6. Således mikroskala rumsliga mönstring av PEG borstar är ett mångsidigt verktyg för att skapa designer in vitro nischer för att undersöka cellsignalering inducerad av immobiliserade biokemiska signaler 6,7.
En vanlig metod för att generera rumsliga mönster för biokemisk cues innebär micro utskrift (μCP) guldbelagda substrat med mönster av PEG konjugerade alkantioler. Sedan de micropatterned själv monterade monolager (SAMS) av PEG-ylated alkantioler begränsar fysisk adsorption av biokemiska molekyler, t.ex., proteiner, endast för icke-mönstrade regioner av substratet 8,9. Emellertid SAMS genereras av denna teknik är känsliga för oxidation i långtidscellkulturmedia. Således är μCP'd alkantiol SAMs ofta vidare ympade med PEG polymerborstar använder ytan initierad atomöverföring radikalpolymerisation (SI-ATRP) för att öka regionens icke-fouling stabilitet 10. Specifikt μCP av alkantiolen polymerisationsinitiator, ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, på guldbelagda ytor följt av SI-ATRP av poly (etylenglykol) metyleter-metakrylat (PEGMEMA) monomerer genererar ytor med micropatterned långvarig, stabil, och icke- påväxt PEG borstar. Dessutom är dessa är i stånd att modifieras ytterligare för att presentera skiftande kemiska delar 11.
Med utnyttjande av fastigheten, Sha et. al. utvecklat en metod att konstruera odlingssubstrat med fler PEGMEMA borstar som utgör ortogonala "klick" kemi. I denna metod använder de en rad μCP / SI-ATRP steg varvat med sekventiell natriumazid, etanolamin, och propargylamin nukleofila substitutioner för att skapa odlingssubstrat som uppvisar mikroskala mönster av multipla immobiliserade ligander 6. Även möjligheterna att använda sådana kemiska sammansättningar i kombination med manuell μCP att konstruera nya odlingssubstrat är enorm, det är begränsad av den precision och noggrannhet med vilken flera μCP steg kan anpassas på ett enda substrat. En hög grad av precision och noggrannhet skulle krävas för att reproducerbart tillverka komplexa in vitro nischer som använder dessa mångsidiga tekniker.
e_content "> För att hantera denna begränsning har flera automatiska och halvautomatiska μCP system genererats. Chakra et. al. utvecklat ett μCP system där egna stämplar placeras på ett skensystem och bringas i anpassad kontakt med guldbelagda bilder med hjälp en datorstyrd pneumatiskt manöverdon. Detta kräver dock att metoden exakt tillverkning av egna frimärksmotiv och redovisar ett 10 mikrometer precision med ingen rapport av noggrannheten uppnås vid utförande av flera μCP steg 12. På senare tid har en metod som utnyttjar ett integrerat kinematiska kopplingssystem rapporterade precision under 1 um med hjälp av ett enda mönster, men kunde inte exakt rikta flera mönster på grund av brist på noggrann kontroll av stämpel funktioner från mögel att forma 13. Dessutom har båda de tidigare metoderna kräver att substratet förblir fast mellan mönstring steg , vilket avsevärt begränsar mångfalden av ytan modifieringskemi som kan varautnyttjas. Här beskriver vi en automatiserad R-μCP system som kan noggrann och exakt inriktning av flera μCP steg samtidigt maximal flexibilitet i stämpel design och tillverkning. Dessutom kan de mönstrade substrat upprepade gånger bort från systemet mellan stans, vilket möjliggör användning av olika substratmodifieringskemi, inklusive sekventiella nukleofila substitutioner. Substrat konstruerade med hjälp av sådana verksamma ämnen har använts för cellodling tidigare av både oss 6,14 och övriga 7. Därför har vi slagit samman R-μCP och sekventiella nukleofila substitutionsreaktioner att utveckla en metod för skalbar framställning av odlingssubstrat med komplexa och micropatterned biokemiska signaler.Perfekt substrat för tissue engineering skulle Bioinspired och därmed sammanfatta den rumsliga fördelningen av kritiska bioaktiva ligander som finns inom de naturliga vävnader. De skulle också ha dynamiska egenskaper som gör att tids justeringar av ligander och de rumsliga mönster som de presenteras för att möjliggöra riktade vävnadsmorfogenes och rumsligt begränsade induktion av cell öde. Tillverkning av sådana substrat kräver immobilisering av flera biokemiska signaler i komplexa och mycket beställda r…
The authors have nothing to disclose.
Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
Schlenk Tube Flask 50 mL | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
2',2-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit – NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |