Summary

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

Published: October 31, 2014
doi:

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

Die Fähigkeit von PEG-gepfropften Oberflächen kovalent gebunden biochemischen Liganden angezeigt während gleichzeitig inhärente Nicht-Fouling-Eigenschaften machen sie zu einer idealen Wahl für Engineering individuelle Mikroumgebungen auf Kultursubstraten 1,2,3. Die biospezifische Wechselwirkungen von Liganden konjugiert PEG vermittelte Bürsten ermöglicht reductionistic Analyse der Wirkungen von biochemischen Hinweisen im Komplex in vivo Gewebemikroumgebung über einzelne Zell Phänotypen gefunden. Weiterhin kann bio-orthogonal "auf" Chemie verwendet werden, um Richt Immobilisierung von Liganden zu erleichtern, so dass sie im nativen Konformationen 4-6 dargestellt werden. So mikroskaligen räumlichen Strukturierung von PEG Bürsten ist ein vielseitiges Werkzeug, um Designer in vitro Nischen schaffen, um Zellsignalisierung durch immobilisierte biochemischen Cues 6,7 induzierte untersuchen.

Ein übliches Verfahren zur Erzeugung von räumlichen Mustern der biochemischen cues bringt Mikrokontakt-Drucken (mCP) gold-beschichteten Substrate mit Mustern von PEG konjugierten Alkanthiole. Dann werden die mikroselbstorganisierte Monoschichten (SAMs) von PEG-ylated Alkanthiole schränkt die physikalische Adsorption von biochemischen Molekülen, zB Proteine, nur für die nicht gemusterten Bereiche des Substrats 8,9. , Die durch diese Technik erzeugt SAMs sind jedoch empfindlich gegenüber Oxidation in der Langzeitzellkulturmedien. Somit μCP'd Alkanthiol SAMs häufig weiter mit PEG Polymerbürsten mit oberflächeninitiierte Atom Transfer Radical Polymerisation (ATRP-SI), um die Region nicht-Fouling-Stabilität 10 zu erhöhen gepfropft. Insbesondere mCP der Alkanthiol Polymerisationsinitiator erzeugt ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, auf Gold-beschichteten Oberflächen, gefolgt von SI-ATRP von Poly (ethylenglycol) methylethermethacrylat (PEGMEMA) Monomere Oberflächen mikro langfristig stabil und nicht Fouling PEG Bürsten. Darüber hinaus sind diese sind in der Lage, die weiter modifiziert, um diverse chemische Einheiten 11 zu präsentieren.

Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft, Sha et. al. eine Methode entwickelt, um Kultursubstrate mit Mehrkomponenten PEGMEMA Bürsten präsentiert orthogonal "auf" Chemie-Ingenieur. Bei diesem Verfahren verwendet man eine Reihe von & mgr; CP / SI-ATRP Schritten mit sequentieller Natriumazid, Ethanolamin vermischt und Propargylamin nucleophile Substitutionen Kultursubstrate präsentiert Mikromuster mehrere immobilisierte Liganden 6 zu erstellen. Während das Potential der Verwendung solcher Chemikalien in Verbindung mit manuellen mgr; CP neue Kultursubstrate Ingenieur ist immens, es wird von der Präzision und Genauigkeit, mit welcher mehrere & mgr; CP Schritte können auf einem einzigen Substrat ausgerichtet werden, beschränkt. Ein hohes Maß an Präzision und Genauigkeit erforderlich wäre, um reproduzierbar herzustellen Komplex in vitro Nischen mit diesen vielseitigen Techniken werden.

e_content "> Um diese Einschränkung zu begegnen, haben mehrere automatisierte und halbautomatisierte mCP Systemen erzeugt wurden. Chakra et. al. eine mCP System, in dem kundenspezifische Stempel sind auf einem Schienensystem platziert und mit Gold-beschichtete Objektträger mit in konformen Kontakt gebracht entwickelt ein computergesteuertes pneumatisches Stellglied. Allerdings erfordert dieses Verfahren die präzise Herstellung von kundenspezifischen Stempel entwickelt und berichtet über eine Präzisions 10 um ohne Bericht der erreicht wird, wenn die Durchführung mehrerer Schritte 12 & mgr; CP Genauigkeit. Vor kurzem wurde ein Verfahren unter Verwendung eines integrierten kinematischen Kopplungssystem berichteten Genauigkeit unterhalb von 1 um unter Verwendung eines einzigen Musters, waren aber nicht in der Lage, mehrere Muster genau auszurichten aufgrund des Fehlens einer präzisen Steuerung der Stempelfunktionen von Form zu Form 13. Zusätzlich beiden vorhergehenden Verfahren erfordern das Substrat zwischen den Strukturierungsschritten fest bleiben und damit deutlich die Vielfalt der Oberflächenmodifizierung Chemie, die sein kann, begrenztverwendet. Hier beschreiben wir eine automatisierte R-mCP System in der Lage genau und präzise Ausrichtung mehrerer mCP Schritte und ermöglicht maximale Flexibilität bei der Briefmarkenentwurf und Fertigung. Weiterhin können die gemusterten Substraten wiederholt aus dem System zwischen Stanz entfernt werden, wodurch die Verwendung von verschiedenen Substratmodifikation Chemien, einschließlich sequentieller nucleophile Substitutionen erlaubt. Substrate entwickelt unter Verwendung solcher Chemikalien wurden für Zellkultur zuvor sowohl von uns 6,14 und andere 7 verwendet. So haben wir R-mgr; CP und sequenzielle nukleophile Substitutionsreaktionen zusammengeführt, um ein Verfahren zur Herstellung von skalierbaren Kultursubstrate mit komplexen biochemischen und mikro Signale zu entwickeln.

Protocol

1. Gene Elastomere Briefmarken Um Silizium Meister der PDMS-Stempel zu erzeugen, Design-Merkmal-Muster der Photomaske ist mit Computer-Aided-Design-Software. Gestalten Sie das erste Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 300 & mgr; m Innendurchmesser (ID) und 600 & mgr; m OD mit 1200 & mgr; m von Mitte zu Mitte-Abstand. Gestalten Sie das zweite Muster als 20 x 20 Anordnung von Kreisringen mit 600 um ID und 900 & mgr; m OD mit 1200 & m…

Representative Results

Der Einsatz von manuellen Ausrichtung mCP Techniken, um Kultursubstrate mit Arrays von PEG-gepfropft Bürsten mit orthogonaler funktionalisiert Engineer "klicken Sie auf" Chemie hat in früheren Arbeiten 6 nachgewiesen. Allerdings bietet diese minimale Steuerung der Musterausrichtung und führt oft zu einer Überlappung von funktionalisierten Bereichen. Hier wird eine neue R-mgr; CP-System verwendet, um diese Beschränkung zu überwinden, und ihre Fähigkeit, genau Muster eine Anordnung von PEG Bür…

Discussion

Ideale Substrate für das Tissue Engineering Bioinspiriertes würde und dadurch die räumliche Verteilung der kritischen bioaktiven Liganden innerhalb der nativen Geweben zu rekapitulieren. Sie würden auch dynamische Eigenschaften besitzen, die zeitliche Änderungen der Liganden und die räumlichen Muster in der sie präsentiert gerichtet Morphogenese ermöglichen und räumlich begrenzte Induktion von Zellschicksal zu ermöglichen. Herstellung solcher Substrate erfordert die Immobilisierung von mehreren biochemischen S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 mL Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit – NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

References

  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
  3. Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
  4. Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
  5. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
  6. Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
  7. Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
  8. Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
  9. Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
  10. Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
  11. Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
  12. Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  13. Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
  14. McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
  15. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  16. Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
  17. Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
  18. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
  19. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
  20. Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
  21. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  22. Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
  23. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  24. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  25. Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).

Play Video

Cite This Article
Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

View Video