Fabrikere Komplekse Kultur Underlag Bruke Robotic mikro utskrift (R-μCP) og sekvensiell Nukleofil Innbytte

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

Evnen til PEG-podet overflater for å vise kovalent bundne biokjemiske ligander og samtidig beholde iboende ikke-begroing egenskaper gjør dem til et ideelt valg for ingeniør tilpassede mikroskala miljøer på kultur underlag ^1,2,3. De biospesi interaksjoner mediert av ligand konjugert PEG børster gjør det mulig reductionistic analyse av virkningene av biokjemiske signaler innenfor komplekset in vivo microenvironments vev på enkeltcelle-fenotyper. Videre kan bio-ortogonale "klikk" kjemi brukes til å lette retnings immobilisering av ligander, slik at de blir presentert i native conformations ^4-6. Dermed mikro romlige fordelingen av PEG børster er et allsidig verktøy for å lage designer in vitro nisjer å undersøke cellesignalisering indusert av immobilisert biokjemiske signaler ^6,7.

En vanlig fremgangsmåte for å generere romlige mønstre av biokjemisk cues innebærer mikro utskrift (μCP) gullbelagt underlag med mønstre av PEG konjugerte alkanethiols. Så, de micropatterned selv montert monolayers (SAMS) av PEG-ylated alkanethiols begrenser fysisk adsorpsjon av biokjemiske molekyler, f.eks, proteiner, bare for ikke-mønstrede regioner av underlaget ^8,9. Imidlertid Sams som genereres ved denne teknikk er følsomme for oksydasjon i langtidscellekulturmedier. Dermed μCP'd alkantiol Sams er ofte videre podet med PEG polymer børster ved hjelp av overflate initiert atom transfer radikalpolymerisering (SI-ATRP) for å øke regionens ikke-begroing stabilitet ^10. Konkret μCP av alkantiol polymeriseringsinitiator, ω-meraptoundecyl bromisobutyrat, på gullbelagt flater etterfulgt av SI-ATRP av poly (etylenglykol) metyl eter metakrylat (PEGMEMA) monomerer genererer overflater med micropatterned langsiktig, stabil og ikke- begroing PEG børster. Dessuten, disse er istand til å bli ytterligere modifisert for å presentere forskjellige kjemiske grupper ^11.

Å dra nytte av denne egenskapen, Sha et. al. utviklet en metode for å konstruere kultur substrater med multikomponent PEGMEMA børster presentere ortogonale "klikk" kjemi. I denne metoden, bruker de en rekke μCP / SI-ATRP skritt ispedd sekvensiell natriumazid, etanolamin, og propargylamin nucleofile erstatninger for å skape kultur underlag presentere mikroskala mønstre av flere immobilisert ligander ^6. Mens potensialet i å bruke slike kjemikalier i forbindelse med manuell μCP til ingeniør nye kultur underlag er enorm, er det begrenset av presisjon og nøyaktighet som flere μCP trinn kan justeres på et enkelt substrat. Et høyt nivå av presisjon og nøyaktighet ville være nødvendig for å fremstille reproduserbart kompleks in vitro nisjer ved hjelp av disse teknikker anvendelige.

e_content "> For å møte denne begrensningen, har flere automatiserte og semi-automatisert μCP systemer blitt generert. Chakra et. utviklet en μCP system der definerte stempler er plassert på et skinnesystem og brakt inn konformal kontakt med gull-belagt lysbilder ved hjelp al. en datastyrt pneumatisk aktuator. Men denne metoden krever presis fabrikasjon av tilpassede stempler og rapporterer en 10 mikrometer presisjon med ingen rapport om nøyaktigheten oppnås når du utfører flere μCP trinn ^12. Mer nylig en metode å benytte en integrert kinematisk koblingssystem rapporterte presisjon under 1 um ved å bruke et enkelt mønster, men var ikke i stand til å nøyaktig innrette flere mønstre på grunn av en mangel på nøyaktig styring av stempel funksjoner fra støpeformen for å forme ^13. I tillegg har begge de tidligere metoder krever substratet til å ligge fast mellom mønstringstrinn , dermed vesentlig begrenser mangfoldet av overflatemodifikasjons kjemi som kan væreutnyttet. Her beskriver vi en automatisert R-μCP system i stand til nøyaktig og presis justering av flere μCP trinn samtidig som maksimal fleksibilitet i stempel design og fabrikasjon. Videre kan de mønstrede underlag være gjentatte ganger fjernet fra systemet mellom stampings, for derved å tillate bruk av forskjellige substrat modifikasjonskjemi, inkludert sekvensielle nukleofile substitusjoner. Substrater konstruert ved anvendelse av slike kjemikalier har vært benyttet for cellekultur tidligere av oss både ^6,14 og andre ^syv. Derfor har vi slått sammen R-μCP og sekvensielle nukleofil substitusjon reaksjoner å utvikle en metode for skalerbar produksjon av kultur underlag med komplekse og micropatterned biokjemiske signaler.

Protocol

1. Generering Elastomeriske Frimerker For å generere PDMS stempel silisium mestere, designe fotomaske inneholder alle funksjonene mønstre ved hjelp av dataassistert design software. Utforme det første mønsteret som en 20 x 20 matrise av ringrom med 300 um indre diameter (ID) og 600 um med utvendig diameter 1,200 um sentrum-til-senteravstanden. Designe den andre mønsteret som en 20 x 20 matrise av ringrommene med 600 mikrometer ID og 900 mikrometer OD med 1200…

Representative Results

Bruken av manuelle justerings μCP teknikker for å konstruere kultur substrater med matriser av PEG-podet børster functionalized med ortogonal "klikk" kjemi har blitt vist i tidligere arbeid 6. Imidlertid tilbyr denne minimal kontroll av mønster orientering og ofte resulterer i overlapping av funksjon områder. Her blir en ny r-μCP system som brukes for å overvinne denne begrensning, og dens evne til å nøyaktig mønster en matrise av PEG børste ringrom med 300 um ID 600 um og OD presentere t…

Discussion

Ideelle substrater for vevsteknologi ville bli bioinspired og derved rekapitulere den romlige fordelingen av bioaktive ligander kritiske innenfor de native vev. De ville også ha dynamiske egenskaper som gjør at tidsmessige justeringer av ligandene og de romlige mønster i hvilket de er presentert for å tillate rettet vev morfogenese og romlig begrenset induksjon av celle skjebne. Fabrikasjon av slike underlag krever immobilisering av flere biokjemiske signaler i komplekse og høyt bestilt orienteringer på underlag. …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Higher end models with increased precision are available if desired.
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE	Gelest	SIT8174.0	CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides	Fisher Scientific	48393106	These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator	Telemark	SEC-600-RAP	Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities.
Schlenk Tube Flask 50 mL	Synthware	60003-078	Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate	Sigma Aldrich	447943	Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS)	Fisher Scientific	A412-4	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide	Sigma Aldrich	437867	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine	Sigma Aldrich	D216305	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate	Sigma Aldrich	C1297	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A7506
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190144
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663	Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate	Thermo Scientifit – NUNC	07-200-81	Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.