Introduction
La capacité des surfaces PEG greffées à afficher ligands biochimiques liés de manière covalente tout en maintenant les propriétés inhérentes non-fouling font un choix idéal pour les environnements à micro-ingénierie personnalisés sur des substrats de culture 1,2,3. Les interactions biospécifiques à médiation par un ligand conjugué PEG permet de brosses analyse réductrice des effets des signaux biochimiques qui se trouvent dans des micro-environnements complexes dans des tissus in vivo sur des phénotypes cellulaires individuelles. En outre, la chimie bio-orthogonal «clic» peut être utilisé pour faciliter l'immobilisation de ligands directionnel de sorte qu'ils sont présentés dans les conformations natives 6.4. Ainsi, la structuration spatiale microscopique de PEG brosses est un outil polyvalent pour créer concepteur dans des niches in vitro pour étudier la signalisation cellulaire induite par 6,7 signaux biochimiques immobilisés.
Une méthode courante pour générer des motifs spatiaux de cu biochimiquees entraîne l'impression par microcontact (uCP) substrats d'or revêtu avec des motifs de PEG alcanethiols conjugués. Ensuite, les monocouches microélectrodes auto-assemblées (SAM) d'alcane-thiols de PEG-ylated restreint adsorption physique des molécules biochimiques, par exemple, des protéines, uniquement à des régions non-motif du substrat 8,9. Cependant, les SAM générés par cette technique sont sensibles à l'oxydation à long terme des milieux de culture cellulaire. Ainsi, μCP'd alkanethiol SAM sont souvent plus greffé avec brosses de polymères de PEG par transfert d'atomes de surface initié polymérisation radicalaire (SI-ATRP) pour augmenter la stabilité non-fouling 10 de la région. Plus précisément, uCP de l'initiateur de polymérisation alcanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutyrate, sur des surfaces revêtues d'or, suivie par SI-ATRP de poly (éthylène glycol) méthyl méthacrylate de l'éther (PEGMEMA) monomères génère des surfaces ayant une longue durée microélectrodes, stable et non encrassement PEG brosses. En outre, ceux-ci sont susceptibles d'être davantage modifiée pour présenter des fractions chimiques divers 11.
Profitant de cette propriété, et Sha. al. développé une méthode pour concevoir des substrats de culture avec des brosses de PEGMEMA plusieurs composants chimiques présentant orthogonales "clic". Dans ce procédé, on utilise une série d'étapes uCP / SI-ATRP intercalées avec de l'azoture de sodium séquentiel, l'éthanolamine, la propargylamine et substitutions nucléophiles pour créer des substrats de culture présentant des motifs micrométriques de plusieurs ligands immobilisés 6. Bien que la possibilité d'utiliser de telles compositions chimiques, en liaison avec uCP manuel pour concevoir de nouveaux substrats de culture est immense, elle est limitée par la précision et l'exactitude avec laquelle de multiples étapes de uCP peuvent être alignés sur un même substrat. Un niveau élevé de précision et d'exactitude serait nécessaire à la fabrication reproductible complexe dans des niches in vitro utilisant ces techniques polyvalents.
e_content "> Pour remédier à cette limitation, plusieurs systèmes de uCP automatiques et semi-automatiques ont été générés. Chakra et. al. développé un système uCP dans laquelle timbres personnalisés sont placés sur un système de rail et mis en contact conforme avec lames d'or revêtue par un vérin pneumatique commandé par ordinateur. Cependant, cette méthode nécessite la fabrication précise des motifs de timbres personnalisés et signale une précision de 10 um sans rapport de la précision obtenue lors de l'exécution multiple uCP étapes 12. Plus récemment, une méthode utilisant un système intégré de couplage cinématique précision indiquée au-dessous de 1 um en utilisant un modèle unique, mais ont été incapables d'aligner avec précision plusieurs motifs en raison d'un manque de contrôle précis des caractéristiques de timbre de moule pour mouler 13. En outre, les deux procédés antérieurs exigent le substrat reste fixe entre les étapes de mise en forme , ce qui limite considérablement la diversité des compositions chimiques de modification de surface qui peuvent êtreutilisé. Ici, nous décrivons un système R-uCP automatisé capable d'alignement exacte et précise de plusieurs étapes de uCP tout en permettant une flexibilité maximale dans la conception et la fabrication timbre. En outre, les substrats peuvent être retirés à motifs à plusieurs reprises à partir de pièces estampées entre le système, ce qui permet l'utilisation de diverses compositions chimiques de modification du substrat, y compris les substitutions nucléophiles séquentielles. L'utilisation de tels substrats modifiés chimiques ont été utilisées pour la culture de cellules préalablement à la fois par nous et d'autres 6,14 7. Par conséquent, nous avons fusionné R-uCP et des réactions de substitution nucléophiles séquentielles de développer un procédé de fabrication évolutive de substrats de culture avec des indices biochimiques complexes et microélectrodes.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Génération élastomères Timbres
- Pour générer les maîtres de silicium du timbre de PDMS, concevoir les modèles de fonction du photomasques en utilisant un logiciel de conception assistée par ordinateur.
- Concevoir le premier motif comme une matrice 20 x 20 d'anneaux de 300 um de diamètre interne (ID) et de 600 um à 1200 um OD espacement centre-à-centre.
- Concevoir le second modèle en tant que matrice de 20 x 20 avec des anneaux 600 de ID 900 um um et 1200 um OD avec un espacement de centre à centre.
- En outre, placer 1 x 1 mm 2 points de référence carrés aux quatre coins de la conception de chaque réseau espacé 1200 um centre-à-centre du motif de coin à un angle de 45 °.
- Fabriquer les maîtres de silicium utilisés dans cette expérience avec 1: 1 ratio d'aspect, en corrélation avec une fonction profondeur de 300 um en utilisant des techniques de lithographie standard présentés ailleurs 15 ou en collaboration avec une fonderie microfluidique.
Remarque: La fonction profondeurs inférieure à 100 um peuvent entraîner une déformation anormale de timbres avant contact avec des surfaces de substrat.
NOTE: Ce protocole commence par avoir des maîtres de silicium déjà obtenues avec les modèles décrits de résine photosensible, qui nécessite un équipement spécialisé et des chambres propres à créer. Il est préférable de consulter un centre de fabricant ou de base pour créer ces maîtres motifs.
- Maîtres de silicium silaniser O / N par incubation avec (tridécafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) la vapeur d'trichlorosilane.
REMARQUE: Silane vapeur est hautement toxique et ne doit être manipulé dans une hotte chimique. - Créez des répliques inverse des maîtres de silicium par durcissement d'un ratio de 10: 1 de PDMS pré-polymère et PDMS agent sur le dessus des maîtres de silicium silanisés durcissement dans un plat de Pétri O / N à 60 ° C.
- Retirez les timbres de PDMS par les maîtres de silicium, et coller les timbres à l'acrylonitrile butadiène styrène (ABS) supports ou tout autre matériau rigides en utilisant de la colle.
REMARQUE: Le matériau de choix ne doit pas être transparent ou biocompatible. Toutefois, il doit fournir une surface plane pour l'interface avec l'outillage robotique et une plus grande rigidité que le PDMS.
2. Préparation Couvre-objets
- Couvre-objets de microscope de rinçage (24 mm x 50 mm n ° 1) dans du toluène, du methanol et de traitement par ultrasons dans de l'acétone pendant 1 min avant de le rincer avec de l'éthanol et séchage sous un léger courant d'azote.
REMARQUE: Manipulez le toluène et l'acétone que dans une hotte chimique. - Couvre-objets Coat avec ~ 3,5 nm de titane (Ti), suivie par 18,0 nm d'or (Au) à l'aide d'un évaporateur à faisceau d'électrons focalisé.
Remarque: Cette procédure est compatible avec une grande variété de substrats d'or revêtu, y compris le silicium et le polystyrène. Bien qu'il soit possible de générer celles-ci sur le site, des substrats revêtus d'or sont également disponibles par l'intermédiaire de fournisseurs commerciaux.
REMARQUE: couches Ti devrait être d'au moins 3 nm d'épaisseur, tandis que Au couches sur des substrats devraient être unt moins 5 nm d'épaisseur, et peut aller jusqu'au bout de 1 mm d'épaisseur en fonction des propriétés optiques idéales du substrat final 16,17. Substrats sont pas tenus d'être optiquement clair pour la fabrication; Cependant, il facilite l'analyse microscopique de substrats fabriqués. - Rincer Couvre-objets revêtues d'or avec de l'éthanol et sèche sous azote doux immédiatement avant utilisation.
3. R-uCP de couronne extérieure
- Avant R-uCP avec le système conforme sélective bras de robot articulé (SCARA), calibrer les effecteurs d'outils robotiques et des systèmes à double caméra d'accompagnement en utilisant le logiciel du système.
NOTE: Ces outils sont illustrés dans la Figure 1.
Figure 1. R- système uCP et le bras robotique Outillage. (A) de vue à grande échelle de système R-uCP avec tout l'outillage et des accessoires, (a) ventouse, (b) un bain de réactif, (c) face à la caméra vers le bas, (d) timbre de nidification appareil, (e) robotique outil. (B) outillage de bras robotique représentant (f) outil de gravure diamantée et (g) de l'outil d'aspiration pneumatique tenant un (h) PDMS timbre ABS adossés.
- Placer manuellement un timbre de PDMS avec 600 ID um et 900 um OD saillie anneaux face vers le bas dans l'appareil timbre de nidification. Placer manuellement un coverslide revêtu d'or fraîchement nettoyée au-dessus du mandrin à vide, affiché dans la figure 1A, et l'immobiliser à l'aide du vide de laboratoire connecté.
- Utilisation des commandes de robots, aligner la caméra vers le bas sur le point de le coverslide revêtu d'or centre, comme dans la figure 2A.
NOTE: Ce point peut d'abord être défini par inspection visuelle et ne nécessite pas une grande précision, comme le timbre de PDMS est beaucoup plus larger que la lame d'or revêtu. - Demandez le bras robotique de graver quatre référence "X" marque aux sommets d'un carré avec des dimensions de 3,8 mm par 3,8 mm centré sur le coverslide revêtu d'or en utilisant l'outil de gravure diamantée fixée au bras robotique. (Représentée à la figure 2B; processus automatisé)
REMARQUE: Ceci assure aux quatre marques de référence sont à l'intérieur d'une image visuelle de la caméra vers le bas. - En utilisant les robots outillage d'aspiration pneumatique, pick-up et détiennent les PDMS timbre de 1 mm au-dessus du luminaire timbre de nidification comme dans la figure 2C. (Processus automatisé)
- Utilisation de la caméra vers le haut et anneau d'éclairage LED illustré à la figure 2D et E, de visualiser les repères de la place de la vignette et les identifier avec le logiciel de la caméra 10 fois afin de déterminer X moyenne du timbre, Y, et décalage angulaire du centre de la axe robot outillage. (Processus automatisé)
- Comme dans
- 3.8) Placer le tampon dans un bain de alcanethiol initiateur ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutyrate (2 mM dans l'éthanol) tel que représenté sur la figure 2F. (Processus automatisé)
- Enlevez le tampon de la solution de alkanethiol et placez-le sur courant d'azote sous pression à 0,48 bar (5 psi) pour faire évaporer l'éthanol comme dans la figure 2G. Après 1 min d'augmenter la pression du courant d'azote est de 1,03 bar (15 psi) pour assurer la sécheresse uniforme. (Processus automatisé)
REMARQUE: séchage incomplet entraînera la perte totale ou partielle de modèle fidélité. - Après séchage, le timbre se déplacer au-dessus de la position centrale calculée de la lame d'or revêtu et de l'abaisser à 100 um incréments tout en contrôlant la force du moteur d'axe Z comme illustré sur la figure 2H.
NOTE: Ce communiqué est aussi connu par le couple moteur de l'axe Z et affiché dans le logiciel de guidage de robot. (Processus automatisé) - Arrêter l'abaissement du timbre une fois la pression prédéterminée de 79,2 kPa a été atteint, et maintenir le contact avec la lame d'or revêtu pendant 15 sec. (Processus automatisé)
REMARQUE: Les valeurs de pression ici sont optimisés pour la conception du timbre et fonction hauteur actuelle. Si la conception du timbre est modifié, en particulier pour le rapport d'aspect élevé timbres, régler ces en conséquence par un processus d'essais et d'erreurs. - Retirer lentement le cachet de la lame d'or revêtu et placer le timbre de retour dans la fixation timbre de nidification. (Processus automatisé) 4. SI-ATRP de PEGMEMA sur microélectrodes Couvre-objets
- Relâchez la pression du vide en maintenant la coverslide microélectrodes, et de la transférer à un ballon de Schlenk de 50 ml. Seal et dégazer le ballon de Schlenk l'aide d'une pompe à vide.
- Ajouter 5,5 ml de mélange réactionnel ATRP contenant le macromonomère PEGMEMA (208,75 mmol), de l'eau (34,4 ml), du methanol (43,8 ml), de cuivre (II), le bromure de (1 mmol) et de 2 ', 2-bipyridine (3 mmol) de le ballon de Schlenk.
- Ajouter 0,5 ml d'ascorbate L-sodium (454,3 mM) dans de l'eau pour amorcer la réaction, et lui permettre de continuer pendant 16 heures à température ambiante sous gaz inerte.
REMARQUE: Après l'ajout d'ascorbate L-sodium, couleur de réaction se déplacera du vert clair au brun foncé, comme illustré sur la figure 3A-B.
NOTE: La réaction peut continuer au-delà de 16 heures, mais il ne sera pas augmenter de manière significative la longueur des brosses de PEG. - Retirez le coverslide microélectrodes du ballon Schenk et rincer avec de l'éthanol, de l'eau et de l'éthanol et sécher sous un léger courant d'azote.
NOTE: Après SI-ATRP, les modifications de surface doit être visible à l'œil et peut être imagé et analysé au microscope comme dans la figure 3C.
NOTE: Ceci est la méthode la plus simple pour tester la précision de l'essai car il évite d'avoir à immunocoloration les substrats. - Placez le coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre.
- Ajouter 6 ml de N, N-diméthylformamide (DMF) contenant de l'azoture de sodium à 100 mM dans le flacon de réaction. Maintenir cette réaction à 37 ° C pendant 24 heures.
REMARQUE: Manipulez DMF que dans une hotte chimique. Faites preuve de prudence lors de la pesée à l'azoture de sodium. - À la fin, retirez le coverslide microélectrodes du flacon de réaction et rincer avec de l'éthanol puis à l'eau et à sec sous un courant d'azote.
- Placez coverslide microélectrodes en flacons de 20 ml de réaction de verre.
- Ajouter 6 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 100 mM d'éthanolamine et de la triéthylamine 300 mM dans le flacon de réaction. Maintenez cette réaction à 40 ° C pendant 24 heures.
REMARQUE: Manipulez DMSO, l'éthanolamine, la triéthylamine et seulement dans une hotte chimique. - À la fin enlever le coversl microélectrodeside du flacon de réaction, rincer avec de l'éthanol puis à l'eau et à sec sous un courant d'azote.
- Effectuer les étapes uCP-R tel que précédemment décrit dans les étapes 3.2 et 03.06 à 03.12, en substituant un timbre de PDMS à 300 um et 600 um ID OD anneaux en saillie, de telle sorte que les anneaux de petits éléments sont placés à l'intérieur des anneaux précédemment microélectrodes.
REMARQUE: Le seuil de pression pour ce timbre est de 132,0 kPa. Comme mentionné précédemment, ces réglages de pression sont optimisés pour les caractéristiques de timbre utilisés dans cette expérience. - Effectuer les étapes SI-ATRP comme précédemment décrit dans les étapes 04.01 à 04.04.
- Placez coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre.
- Ajouter 6 ml de DMSO contenant 100 mMpropargylamine dans le flacon de réaction. Maintenir cette réaction à température ambiante pendant 24 h.
REMARQUE: Manipulez DMSO et propargylamine seulement dans une hotte chimique. - À la fin enlever le coverslide microélectrodes du flacon de réaction et rincer avec de l'éthanol puis à l'eau et à sec sous un courant d'azote.
- Placez coverslide microélectrodes dans 20 ml de réaction flacon en verre.
- Ajouter 6 ml de sulfate de cuivre (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1 H -1,2,3-triazole-4-yl) méthyl] amine (TBTA, 30 mM) (1: / v 1 v eau / DMF) contenant 562 uM de l'azoture de PEG-4 -Biotin conjugué dans le flacon de réaction. Ajouter 1,2 ml d'acide L-ascorbique (0,15 mM) dans de l'eau au mélange pour initialiser la réaction.
- Bubble azote à travers la solution de réaction pendant 10 sec, sceller la fiole avec du parafilm, et réagir pendant 24 heures à température ambiante.
- Lors des achèvementsn enlever coverslide microélectrodes du flacon de réaction, rincer avec de l'eau et placez-le dans une boîte en polystyrène de 12 puits.
- Bloquer coverslide microélectrodes dans DPBS (3% âne sérum) pendant 1 heure à température ambiante. Teinture pour les groupes acétylène biotinylés avec de la streptavidine-546 conjugué (2 pg / ml) dans SPD (3% de sérum d'âne dans PBS) pendant 2 heures à température ambiante.
- Rincer coverslide microélectrodes 5 fois avec DPBS pendant 10 min avec agitation douce.
REMARQUE: la figure 4B représente une image de la diapositive après cette étape est terminée. - Laissez coverslide microélectrodes dans 12 puits pplat olystyrene SPD après rinçage.
- Ajouter 2 ml de SPD (ou milieux de culture cellulaire contenant 20 uM) DBCO PEG-4 -Biotin, et laisser cette réaction se poursuivre pendant 24 heures à température ambiante (ou à 37 ° C dans un incubateur).
- À la fin, rincer coverslide microélectrodes 5 fois avec DPBS (ou simplement effectuer un changement de support).
- Teinture pour les groupes azide biotinylés avec un conjugué streptavidine-488 (2 pg / ml) dans 2 ml de DPBS (3% de sérum d'âne) pendant 2 h à température ambiante.
- Rincer coverslide microélectrodes 5 fois dans DPBS pendant 10 min avec agitation douce.
- Image microélectrodes coverslide utilisant la fluorescence confocale microscope. Figure 4A-C représente les images de la diapositive après cette étape est terminée.
REMARQUE: Lors de l'utilisation de substrats pour des essais de culture de tissus, sauter des sections 10 et 12 du présent protocole. Après le degre souhaitéee de fonctionnalisation, stériliser le coverslide conçu par rinçage les deux faces avec 100% d'éthanol et le séchage sous un courant d'azote. Placer les lames dans une enceinte de sécurité biologique stérile et rincer la lame avec PBS cinq fois avant de procéder à l'ensemencement et à la culture cellulaire.
5. La fonctionnalisation des chaînes azoture de microélectrodes PEGMEMA
6. passivation des chaînes de brome fonctionnalisés PEGMEMA
7. R-uCP de anneau intérieur et SI-ATRP de PEGMEMA
8. acétylène fonctionnalisation des chaînes microélectrodes PEGMEMA
9. Cuivre catalysée "Cliquez sur" Biotinylation d'acétylène Terminé Chaînes PEGMEMA
10. immunofluorescence détection biotinylé Groupes d'acétylène
11. cuivre-libre "Cliquez sur" Biotinylation d'azoture Terminé Chaînes PEGMEMA
Remarque: Si on le souhaite, cette étape de modification du substrat peut être réalisé in situ au cours de la culture cellulaire.
12. immunofluorescence détection biotinylé groupes azoture
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Representative Results
L'utilisation de techniques manuelles alignement de uCP à l'ingénieur des substrats de culture avec des tableaux de brosses PEG-greffons fonctionnalisés avec orthogonal "clic" chimiques a été démontrée dans des travaux antérieurs 6. Cependant, cette offre un contrôle minimal de l'orientation du motif et se traduit souvent par un chevauchement des zones fonctionnalisés. Ici, un système R-uCP roman est utilisé pour surmonter cette limitation, et sa capacité à motif avec précision une gamme de PEG brosse anneaux avec 300 um et 600 um ID OD présentant alcyne terminaux dans un réseau séparé de PEG brosse anneaux avec 600 um ID et 900 um OD présentant des groupes azoture terminaux est démontrée 14. Après la réaction d'un alcyne présentant des brosses de PEG-PEG avec l'azoture de 3 -Biotin et la réaction de l'azoture de brosses présentant PEG-PEG 4 DBCO -Biotin, le substrat a été immunocolorée avec des sondes fluorescentes et imagée en utilisant un microscope confocal (Figure 4). L'analyse de ces images à l'aide d'un programme MATLAB personnalisé calculé que les deux rangées de brosses de PEG ont été alignées avec une précision inférieure à 10 um, à savoir, X ~ 6,4 um, Y ~ 1,7 um, et θ ~ 0,02 °, ce qui est chez le fabricant cité limite de notre modèle SCARA (par exemple, ~ 10 um) et une indication du rendement avant du système R-uCP 14. Ainsi, nous croyons que l'utilisation de SCARAs haut de gamme dans ce système permettrait encore plus faible, une résolution submicronique. Ces résultats démontrent la capacité d'ingénierie polyvalents de substrat activé par l'utilisation combinée du système R-uCP et des réactions de substitution nucléophiles séquentielles. La réactivité croisée minimale en témoigne le marquage fluorescent des chimies de surface orthogonales sert à illustrer le potentiel de ce système d'immobilisation précise de signaux biochimiques pour générer des substrats de culture complexes pour des applications de génie tissulaire. </ P>
Figure 2. Schéma de processus R- uCP. (A) vers le bas caméra visualiser lame d'or revêtu immobilisé, les marques (B) de référence de gravure sur coverslide revêtu d'or, (c) éliminer PDMS timbre de timbre de nidification appareil, (D - E) de visualisation des repères PDMS de timbre avec l'appareil photo orienté vers le haut (F) la mise en tampon PDMS alcanethiol bain d'initiateur, (G) le séchage alcanethiol initiateur de solvant sur un courant d'azote, et (H) l'estampage alcanethiol timbre de PDMS revêtu sur coverslide revêtu d'or.
Figure 4. immunocolorées Images de microélectrodes diapositive. (A) d'azide et (B) les groupes alcyne, biotinylé en utilisant exempt de cuivre et de cuivre à médiation par click chemistry, et détecté avec de la streptavidine-respectivement 488 et -546. (C) Superposition de deux canaux fluorescents. Toutes les barres échelle de 500 um.
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Discussion
Substrats Idéal pour l'ingénierie tissulaire seraient bioinspirée et ainsi récapitulent la répartition spatiale des ligands bioactifs essentiels trouvés dans les tissus natifs. Ils seraient également posséder des propriétés dynamiques qui permettent des ajustements temporels des ligands et les structures spatiales dans lequel elles sont présentées pour permettre la morphogenèse du tissu réalisé et l'espace restreint induction du destin cellulaire. Fabrication de ces substrats nécessite l'immobilisation de plusieurs signaux biochimiques dans des orientations complexes et hautement ordonnés sur des substrats. Pendant la simulation de tous les facteurs endogènes de la niche d'une cellule in vitro est déraisonnable, le système R-uCP décrit ici permet d'immobilisation de plusieurs régions de la chimie bioactifs orthogonales avec contrôle microscopique de l'orientation spatiale.
L'utilité de ces substrats augmente encore si l'on considère que tout PEG tableaux de pinceau lié à des ligands immobiliséspeuvent provoquer des interactions biospécifiques, brosses de PEG non liés restent résistant à l'adsorption des protéines et peuvent donc servir à contrôler l'adhérence et la migration cellulaires. Bien que passive, l'adsorption à motif de la matrice extracellulaire (ECM) des protéines ou des conjugués polymère-PEG est un procédé simple pour contrôler l'adhérence et la migration cellulaires, ces techniques ne permettent de contrôler transitoire depuis adsorption est un processus réversible 11. En outre, les molécules sont adsorbées aux surfaces en orientations imprévisibles et à des concentrations aléatoires limitant ainsi la fidélité et le contrôle des interactions biospécifiques. En outre, les composés typiquement utilisés pour créer des régions de non-salissures, telles que l'albumine de sérum bovin ou le Pluronic F127, ne possèdent pas de sites réactifs désignés pour une fonctionnalisation supplémentaire de limitation de post-adsorption des modifications in situ. SAM de alcanethiols peut être généré avec ces groupes réactifs pour la modification de surface supplémentaire, mais ils ont trop durée de vie limitée dans le tissu culture conditions en raison du manque de protection accordée par oxydation greffé PEG brosses 10,11. A l'inverse, la fusion de nos plates-formes R-uCP avec PEG-brosse greffage et des réactions de substitution nucléophiles séquentielles permet de concevoir des substrats avec, régions cytophobic microscopique durables qui peuvent être modifiés a priori ou in situ avec des fonctionnalités de bio-orthogonal. Cela permettra un meilleur contrôle des interactions biospécifiques qui peuvent réguler la morphologie des tissus in vitro et la croissance.
Une des principales forces de R-uCP par rapport à d'autres systèmes pour aligner impressions microcontact séquentielles est la possibilité de supprimer le substrat du système entre estampages répétés, tout en conservant une grande précision d'alignement 12,13. Cela permet une plus grande diversité dans les types de la chimie de surface qui peuvent être appliquées, et la durée des effets de modification de surface peut être modifiée pour ajuster les densités de suite imligands mobilisés 6. Ainsi, R-uCP peut être utilisé pour établir des gradients de concentration correspondants dans les signaux biochimiques qui assurent la médiation des interactions biospécifiques 14. Avec la capacité de contrôler précisément la fois l'emplacement et le degré d'interactions biospécifiques, le système R-uCP offre une méthode unique pour étudier le rôle de ligands bioactifs dans la morphogenèse des tissus et établit un système robuste pour générer des substrats de culture simulant la présentation d'indices biologiques la niche in vivo.
Un aspect essentiel de niches cellulaires, en particulier dans le développement, est la modulation spatio-temporelle de la signalisation des facteurs 18. Bien que les indices biochimiques solubles peuvent être ajoutées au milieu de culture d'une manière temporellement défini, il ya peu de contrôle spatial sur lequel les cellules rencontrent ces indices. Avec le système R-uCP décrit ici, il est possible de construire des substrats de culture avec des microélectrodes terminale functionalized PEG brosses présentant des groupes fonctionnels azoture qui sont sans effet sur le destin des cellules en culture. Bien que les groupes azides sont capables de subir des réactions catalysées par du cuivre "clic" avec des molécules présentant des alcynes, cela ne peut pas être effectuée en présence de cellules en culture étant donné la toxicité du cuivre. Cependant, les molécules à haute contrainte comme dibenzocyclooctyne (DBCO) subissent un sans cuivre azoture-alcyne réaction très sélective et biocompatible cycloaddition 19,20. Grâce à la conjugaison des groupes de liaison contenant DBCO, des substrats de culture microélectrodes peuvent être modifiées in situ avec de nouveaux ligands biologiques 21. Avec la possibilité de rendre les régions cytophobic cytophile ou ajouter différents signaux biochimiques pour utilisation dans des procédures de signalisation multi-étapes, substrats de culture générés avec cette méthode ont de nouvelles capacités d'adaptation et de fournir ainsi un système plus robuste pour instruire la morphogenèse des tissus in vitro.
Malgré l'immense pottielle et l'utilité de la plate-forme R-uCP, il présente certains inconvénients. L'utilisation de nombreuses étapes SI-ATRP pour générer des supports greffés PEG augmente considérablement le temps de fabrication par rapport aux procédés impliquant l'impression à jet d'encre ou le dépôt de micro-gouttelettes de protéines de la MEC. Bien que la précision des techniques d'impression à jet d'encre rivalise avec celle du système R-courant uCP, l'adsorption de protéines de la MEC est réversible offrant ainsi moins de contrôle des interactions cellule-protéine. En outre, les substrats générés par des techniques d'impression à jet d'encre ne peuvent pas être retirées pendant la fabrication, empêchant ainsi l'utilisation de diverses chimies de modification du substrat qui permettent, par exemple, l'espace restreint dans les modifications de substrat in situ 22. En raison de ces limitations techniques à jet d'encre sont mieux adaptés pour la génération rapide de substrats de culture principalement concernés par courte durée, les arrangements statiques de biomolécules et de types 23 cellulaires tandis que le système R-uCP est beaucoup better adapté vers la génération de substrats multiples facettes visant à exposer à long terme, un contrôle dynamique sur les deux interactions cellulaires spatiales et temporelles en 2D avec divers ligands biologiques.
L'impression par microcontact permet un dépôt rapide de nano à micro-«encre» dispose de plus grandes surfaces, mais il a toujours été hétérogénéité significative de la concentration de substances déposées "d'encre". Ceci est aussi une limitation du courant de la plate-forme R-uCP comme on peut le constater dans la figure 4. Nous émettons l'hypothèse que l'hétérogénéité dans la modification de fluorescence du PEG brosses est due à la demande du robot d'une force normale inégale sur l'ensemble du timbre en PDMS, qui est également probablement pas parfaitement plat. Il en résulte une pression de contact non uniforme entre toutes les régions du timbre et le substrat provoquant ainsi le dépôt irrégulier de l'initiateur et alkanethiol épaisseur ultérieure de la brosse PEG greffé. Danspour la production de substrats PEG greffées avec même le dépôt de alcanethiols et ainsi la fonctionnalité de surface, la conception d'outils d'emboutissage devra être optimisé pour appliquer une force normale répartie et uniforme sur l'ensemble du timbre en PDMS. Cela facilite un contact uniforme avec les lames d'or revêtu à travers toute l'interface indépendant des imperfections de timbre. En outre, la figure 4B, on peut observer une légère contamination croisée des groupes acétylène sur l'azoture fin PEG brosse. Bien que la densité de surface de ligands immobilisés en raison de la contamination croisée est minime par rapport à celle de la PEG-brosse prévue, ce peut être réduite presque à zéro en augmentant la durée de la réaction d'éthanolamine de passivation (voir la section 6) comme montré précédemment 6.
L'application principale du système R-uCP décrite ici est la fabrication de complexes de substrats de culture de tissu qui peuvent être utilisés pour exercer un contrôle spatial et temporel of sort de la cellule. Cependant, la haute précision et l'exactitude de la plate-forme R-uCP rend une méthode intéressante pour d'autres applications. La capacité de configuration des zones cytophiles avec la chimie de ligand différentielles suivie d'une modification in situ des régions, cytophobic précédemment inertes permet de co-culture de plusieurs lignées cellulaires avec un contrôle serré sur leur orientation spatiale. Ceci, couplé avec la nature inhérente à haut débit de micromodelage présenter une alternative aux méthodes actuelles de criblage à haut débit à la fois des cellules individuelles et des combinaisons multi-cellulaires 24. Bien que le système R-uCP a un grand potentiel dans le domaine de la biologie, il pourrait également être appliquée dans le domaine des systèmes micro-électromécaniques (MEMS). En fabrication des MEMS, il est souhaitable de transférer des composants MEMS de haute précision et d'exactitude pour la production de masse. Avec les nouvelles techniques de marquage cinétiques, le système R-uCP décrite ici pourrait être adapté pour imprimer efficacement components de silicium ou de nitrure de gallium sur des plaquettes de silicium pour l'utilisation dans la génération de MEMS 25. Ainsi, la plate-forme R-uCP pourrait être utilisée pour une large gamme d'applications possibles.
En conclusion, l'utilisation du système R-uCP à générer PEG-greffé substrats de culture orthogonale fonctionnalisés par des réactions de substitution nucléophile séquentielles présente non seulement une plate-forme idéale pour le contrôle potentiellement la morphologie des tissus et la croissance in vitro, mais un excellent système pour étudier le rôle des multiples ligands bioactifs sur le devenir de la cellule. La capacité de motifs multiples signaux biochimiques dans des modèles distincts et très ordonnées établit les bases pour la construction de substrats de culture capables d'instruire la formation de structures de tissu avec plusieurs types de cellules organisées à l'échelle du micron. Ceci, couplé avec la possibilité de modifier substrats microélectrodes in situ, pourrait permettre un contrôle sans précédent de la morphogenèse des tissus et celL sort dans la culture. Les techniques de mise en forme décrits ici fournissent un système polyvalent de fabrication des substrats de culture qui pourraient un jour faciliter une production rationnelle et reproductible des structures de tissu organotypiques in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A.
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
