Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle

Summary

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Abstract

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (μCP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual μCP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-μCP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal ‘click’ chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Introduction

La capacité des surfaces PEG greffées à afficher ligands biochimiques liés de manière covalente tout en maintenant les propriétés inhérentes non-fouling font un choix idéal pour les environnements à micro-ingénierie personnalisés sur des substrats de culture ^1,2,3. Les interactions biospécifiques à médiation par un ligand conjugué PEG permet de brosses analyse réductrice des effets des signaux biochimiques qui se trouvent dans des micro-environnements complexes dans des tissus in vivo sur des phénotypes cellulaires individuelles. En outre, la chimie bio-orthogonal «clic» peut être utilisé pour faciliter l'immobilisation de ligands directionnel de sorte qu'ils sont présentés dans les conformations natives ^6.4. Ainsi, la structuration spatiale microscopique de PEG brosses est un outil polyvalent pour créer concepteur dans des niches in vitro pour étudier la signalisation cellulaire induite par ^6,7 signaux biochimiques immobilisés.

Une méthode courante pour générer des motifs spatiaux de cu biochimiquees entraîne l'impression par microcontact (uCP) substrats d'or revêtu avec des motifs de PEG alcanethiols conjugués. Ensuite, les monocouches microélectrodes auto-assemblées (SAM) d'alcane-thiols de PEG-ylated restreint adsorption physique des molécules biochimiques, par exemple, des protéines, uniquement à des régions non-motif du substrat ^8,9. Cependant, les SAM générés par cette technique sont sensibles à l'oxydation à long terme des milieux de culture cellulaire. Ainsi, μCP'd alkanethiol SAM sont souvent plus greffé avec brosses de polymères de PEG par transfert d'atomes de surface initié polymérisation radicalaire (SI-ATRP) pour augmenter la stabilité non-fouling ¹⁰ de la région. Plus précisément, uCP de l'initiateur de polymérisation alcanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutyrate, sur des surfaces revêtues d'or, suivie par SI-ATRP de poly (éthylène glycol) méthyl méthacrylate de l'éther (PEGMEMA) monomères génère des surfaces ayant une longue durée microélectrodes, stable et non encrassement PEG brosses. En outre, ceux-ci sont susceptibles d'être davantage modifiée pour présenter des fractions chimiques divers ^11.

Profitant de cette propriété, et Sha. al. développé une méthode pour concevoir des substrats de culture avec des brosses de PEGMEMA plusieurs composants chimiques présentant orthogonales "clic". Dans ce procédé, on utilise une série d'étapes uCP / SI-ATRP intercalées avec de l'azoture de sodium séquentiel, l'éthanolamine, la propargylamine et substitutions nucléophiles pour créer des substrats de culture présentant des motifs micrométriques de plusieurs ligands immobilisés ^6. Bien que la possibilité d'utiliser de telles compositions chimiques, en liaison avec uCP manuel pour concevoir de nouveaux substrats de culture est immense, elle est limitée par la précision et l'exactitude avec laquelle de multiples étapes de uCP peuvent être alignés sur un même substrat. Un niveau élevé de précision et d'exactitude serait nécessaire à la fabrication reproductible complexe dans des niches in vitro utilisant ces techniques polyvalents.

e_content "> Pour remédier à cette limitation, plusieurs systèmes de uCP automatiques et semi-automatiques ont été générés. Chakra et. al. développé un système uCP dans laquelle timbres personnalisés sont placés sur un système de rail et mis en contact conforme avec lames d'or revêtue par un vérin pneumatique commandé par ordinateur. Cependant, cette méthode nécessite la fabrication précise des motifs de timbres personnalisés et signale une précision de 10 um sans rapport de la précision obtenue lors de l'exécution multiple uCP étapes ^12. Plus récemment, une méthode utilisant un système intégré de couplage cinématique précision indiquée au-dessous de 1 um en utilisant un modèle unique, mais ont été incapables d'aligner avec précision plusieurs motifs en raison d'un manque de contrôle précis des caractéristiques de timbre de moule pour mouler ^13. En outre, les deux procédés antérieurs exigent le substrat reste fixe entre les étapes de mise en forme , ce qui limite considérablement la diversité des compositions chimiques de modification de surface qui peuvent êtreutilisé. Ici, nous décrivons un système R-uCP automatisé capable d'alignement exacte et précise de plusieurs étapes de uCP tout en permettant une flexibilité maximale dans la conception et la fabrication timbre. En outre, les substrats peuvent être retirés à motifs à plusieurs reprises à partir de pièces estampées entre le système, ce qui permet l'utilisation de diverses compositions chimiques de modification du substrat, y compris les substitutions nucléophiles séquentielles. L'utilisation de tels substrats modifiés chimiques ont été utilisées pour la culture de cellules préalablement à la fois par nous et d'autres ^{6,14 7.} Par conséquent, nous avons fusionné R-uCP et des réactions de substitution nucléophiles séquentielles de développer un procédé de fabrication évolutive de substrats de culture avec des indices biochimiques complexes et microélectrodes.

Protocol

1. Génération élastomères Timbres Pour générer les maîtres de silicium du timbre de PDMS, concevoir les modèles de fonction du photomasques en utilisant un logiciel de conception assistée par ordinateur. Concevoir le premier motif comme une matrice 20 x 20 d'anneaux de 300 um de diamètre interne (ID) et de 600 um à 1200 um OD espacement centre-à-centre. Concevoir le second modèle en tant que matrice de 20 x 20 avec des anneaux 600 de ID 900 um um …

Representative Results

L'utilisation de techniques manuelles alignement de uCP à l'ingénieur des substrats de culture avec des tableaux de brosses PEG-greffons fonctionnalisés avec orthogonal "clic" chimiques a été démontrée dans des travaux antérieurs 6. Cependant, cette offre un contrôle minimal de l'orientation du motif et se traduit souvent par un chevauchement des zones fonctionnalisés. Ici, un système R-uCP roman est utilisé pour surmonter cette limitation, et sa capacité à motif avec préc…

Discussion

Substrats Idéal pour l'ingénierie tissulaire seraient bioinspirée et ainsi récapitulent la répartition spatiale des ligands bioactifs essentiels trouvés dans les tissus natifs. Ils seraient également posséder des propriétés dynamiques qui permettent des ajustements temporels des ligands et les structures spatiales dans lequel elles sont présentées pour permettre la morphogenèse du tissu réalisé et l'espace restreint induction du destin cellulaire. Fabrication de ces substrats nécessite l'immo…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	Higher end models with increased precision are available if desired.
(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE	Gelest	SIT8174.0	CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesive Co	NC9020938	Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides	Fisher Scientific	48393106	These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator	Telemark	SEC-600-RAP	Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate	Prochimia	FT 015-m11-0.2	Store at -20°C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities.
Schlenk Tube Flask 50 mL	Synthware	60003-078	Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate	Sigma Aldrich	447943	Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS)	Fisher Scientific	A412-4	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide	Sigma Aldrich	437867	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2',2-Bipyridine	Sigma Aldrich	D216305	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate	Sigma Aldrich	A4034
20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodium Azide	Sigma Aldrich	S2002	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide	Sigma Aldrich	227056	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine	Sigma Aldrich	T0886	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	276855	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol	University of Wisconsin Material Distribution Services	2292	CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate	Sigma Aldrich	C1297	CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A7506
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	14190144
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663	Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate	Thermo Scientifit – NUNC	07-200-81	Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate	Life Technologies	S-11223	Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	S-11225	Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.