Introduction
قدرة السطوح PEG المطعمة لعرضه بروابط كيميائية حيوية مرتبطة تساهميا مع الحفاظ في نفس الوقت المتأصلة خصائص غير قاذورات تجعلها خيارا مثاليا لبيئات الميكروسكيل الهندسة الجمركية على ركائز الثقافة 1،2،3. التفاعلات biospecific بوساطة يجند مترافق فرش PEG تتيح تحليل reductionistic من آثار الاشارات البيوكيميائية وجدت داخل المجمع في microenvironments أنسجة الجسم الحي على الظواهر الخلايا الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كيمياء الحيوية متعامد "فوق" لتسهيل تجميد الاتجاه من بروابط بحيث يتم تقديمها في التشكل الأصلي 4-6. وبالتالي، الزخرفة المكانية الميكروسكيل من PEG فرش هو أداة مرنة لخلق مصمم في محاريب المختبر للتحقيق إشارات الخلايا الناجم عن الإشارات البيوكيميائية يجمد 6،7.
وهناك طريقة شائعة لتوليد الأنماط المكانية للمكعب الكيمياء الحيويةوفاق ينطوي microcontact الطباعة (μCP) ركائز المغلفة بالذهب مع أنماط PEG alkanethiols مترافق. ثم، والطبقات الوحيدة الذاتي تجميعها micropatterned (سام) من alkanethiols PEG-ylated تقيد امتصاص المادي للجزيئات الحيوية، مثل البروتينات، إلا أن المناطق غير نمط الركيزة 8،9. ومع ذلك، فإن صواريخ سام التي تولدها هذه التقنية حساسة للأكسدة في المدى الطويل وسائل الإعلام ثقافة الخلية. وبالتالي، μCP'd alkanethiol سام غالبا ما المطعمة كذلك مع فرش PEG البوليمر باستخدام بمبادرة سطح نقل ذرة البلمرة الراديكالية (SI-ATRP) إلى زيادة غير قاذورات الاستقرار في المنطقة 10. على وجه التحديد، μCP من البلمرة البادئ alkanethiol، bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl، على الأسطح المغلفة الذهب تليها SI-ATRP من بولي (جلايكول الإثيلين) ميتاكريليت الميثيل الأثير (PEGMEMA) أحادية يولد الأسطح مع micropatterned طويلة الأجل ومستقرة، وغير فرش قاذورات PEG. وعلاوة على ذلك، فإن هذه هي قابلة للتعديل أيضا على تقديم الأنصاف الكيميائية المتنوعة 11.
الاستفادة من هذه الخاصية، شا آخرون. الله. وضعت طريقة لهندسة ركائز الثقافة مع فرش PEGMEMA المتعددة المكونات تقديم المتعامدة كيمياء "فوق". في هذه الطريقة، فإنها تستخدم سلسلة من الخطوات μCP / SI-ATRP تتخللها أزيد الصوديوم متتابعة، ايثانول، وpropargylamine بدائل أليفة النواة لخلق ركائز ثقافة تقديم أنماط الميكروسكيل من بروابط متعددة يجمد 6. في حين أن احتمال استخدام تلك كيمياء بالتزامن مع μCP اليدوي لهندسة ركائز ثقافة جديدة هائلة، ويقتصر من قبل على الدقة والدقة التي μCP خطوات متعددة يمكن محاذاة على ركيزة واحدة. سوف تكون هناك حاجة لمستوى عال من الدقة والدقة لتصنيع بتكاثر مجمع في محاريب المختبر باستخدام هذه التقنيات تنوعا.
e_content "> ولمعالجة هذا الحد، فقد تم إنشاء العديد من أنظمة μCP الآلية وشبه الآلية. شقرا وآخرون وضع نظام μCP التي توضع الأختام الجمركية على نظام السكك الحديدية وأدى إلى امتثالي اتصال مع الشرائح المغلفة الذهب باستخدام والمحرك الكمبيوتر التي تسيطر عليها الهوائية. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تصنيع الدقيق للتصاميم طابع العرف وتقارير 10 ميكرومتر الدقة مع أي تقرير من دقة تحقيقها عند تنفيذ العديد من الخطوات μCP 12. وفي الآونة الأخيرة، وهي طريقة استخدام نظام اقتران الحركية متكامل ذكرت الدقة أقل من 1 ميكرون باستخدام نمط واحد، ولكن لم تتمكن من محاذاة بدقة أنماط متعددة نظرا لعدم وجود مراقبة دقيقة من الميزات ختم من العفن العفن 13. بالإضافة إلى ذلك، كل من الطرق السابقة تتطلب الركيزة لتظل ثابتة بين الخطوات الزخرفة ، مما يحد بشكل كبير من التنوع في كيمياء تعديل السطح التي يمكن أن تكونالمستخدمة. هنا، نحن تصف نظام R-μCP الآلي قادرة على محاذاة دقيقة ودقيقة من الخطوات μCP متعددة مع السماح بالمرونة القصوى في تصميم الطوابع وتلفيق. وعلاوة على ذلك، فإن ركائز نمط يمكن إزالة مرارا وتكرارا من النظام بين تركيب الجمله، وبالتالي السماح باستخدام المتنوعة كيمياء تعديل الركيزة، بما في ذلك بدائل أليفة النواة متتابعة. وقد استخدمت ركائز هندسيا باستخدام هذه كيمياء للثقافة الخلية من قبل كلا منا 6،14 7 وغيرهم. وبالتالي، فإننا اندمجت R-μCP وردود الفعل استبدال شغوف بالنواة متتابعة لتطوير طريقة لصنع قابلة للمن ركائز الثقافة مع الاشارات الكيميائية الحيوية المعقدة وmicropatterned.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد المرنة طوابع
- لتوليد سادة السيليكون ختم PDMS، وتصميم أنماط الميزة الضوئية باستخدام برمجيات التصميم بمساعدة الكمبيوتر.
- تصميم النمط الأول بمثابة 20 × 20 مجموعة من للحلقة مع 300 ميكرون قطرها الداخلي (ID) و 600 ميكرون OD مع 1200 ميكرون مركز إلى مركز تباعد.
- تصميم النمط الثاني بوصفه 20 × 20 مجموعة من للحلقة مع 600 معرف ميكرون و 900 ميكرون OD مع 1200 ميكرون مركز إلى مركز تباعد.
- بالإضافة إلى ذلك، ضع 1 × 1 مم 2 العلامات المرجعية مربع في جميع الزوايا الأربع من كل تصميم مجموعة متباعدة 1200 ميكرون مركز إلى مركز من نمط الزاوية في زاوية 45 درجة.
- افتعال سادة السيليكون لاستخدامها في هذه التجربة مع 1: 1 الجانب نسب، رابطا إلى عمق ميزة 300 ميكرون باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية في أماكن أخرى القياسية بالتفصيل 15 أو بالتعاون مع مسبك ميكروفلويديك.
ملاحظة: ميزة أعماق أقل من 100 ميكرون يمكن أن يؤدي إلى تشوه غير طبيعي من الطوابع مسبقة في الاتصال مع السطوح الركيزة.
ملاحظة: هذا البروتوكول يبدأ مع وجود سادة السيليكون حصل بالفعل مع أنماط صفها من مقاومة للضوء، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة وغرف نظيفة لخلق. فمن الأفضل أن يتشاور مع منشأة كاذب أو الأساسية لإنشاء هذه سادة نمط.
- سادة السيليكون Silanize O / N قبل الحضانة مع (tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydroocty) trichlorosilane بخار.
ملاحظة: سيلاني بخار عالية السمية ويجب فقط أن تعالج في غطاء الدخان الكيميائي. - إنشاء نسخ متماثلة العكسية للسادة السيليكون من قبل علاج 10: 1 نسبة من PDMS قبل البوليمر وكيل PDMS علاج على رأس سادة السيليكون silanized في طبق بتري O / N عند 60 درجة مئوية.
- إزالة الطوابع PDMS من سادة السيليكون، والسندات والطوابع لالأكريلونيتريل ستايرين (ABS) المساند أو أي مادة صلبة أخرىليالي باستخدام الغراء.
ملاحظة: المادة المفضلة لا يلزم أن تكون شفافة أو حيويا. ومع ذلك، يجب أن توفر سطح مستو لواجهة مع الأدوات الروبوتية وصلابة أعلى من PDMS.
2. إعداد Coverslides
- coverslides المجهر شطف في التولوين، الميثانول ويصوتن في الأسيتون لمدة 1 دقيقة قبل الشطف مع الإيثانول والتجفيف تحت تيار النيتروجين لطيف (24 ملم × 50 ملم 1 #).
ملاحظة: التعامل مع التولوين، والأسيتون فقط في غطاء الدخان الكيميائي. - coverslides معطف مع ~ 3.5 نانومتر التيتانيوم (تي)، يليه 18.0 نانومتر الذهب (الاتحاد الافريقي) باستخدام تركيز شعاع الإلكترون المبخر.
ملاحظة: هذا الإجراء هو متوافق مع مجموعة متنوعة من ركائز المغلفة بالذهب بما السيليكون والبوليسترين. في حين أنه من الممكن أن تولد هذه في الموقع، وركائز المغلفة بالذهب متوفرة عن طريق الموردين التجاريين أيضا.
ملاحظة: يجب أن تكون طبقات تي 3 على الأقل نانومتر سميكة، في حين ينبغي أن تكون طبقات الاتحاد الافريقي على ركائز ور الأقل 5 نانومتر سميكة ويمكن أن تتراوح كل وسيلة ل1MM في سمك اعتمادا على الخصائص البصرية مثالية الركيزة النهائية 16،17. ليس مطلوبا من ركائز لتكون واضحة بصريا للتصنيع. ومع ذلك، فإنه يسهل التحليل المجهري للركائز ملفقة. - شطف coverslides المطلي بالذهب مع الإيثانول والجافة تحت النيتروجين لطيف مباشرة قبل الاستعمال.
3. R-μCP من بالطوق الخارجي
- قبل R-μCP مع ذراع الروبوت المفصلية (SCARA) متوافق مع نظام انتقائي، معايرة المستجيبات أداة الروبوتية وأنظمة كاميرا مزدوجة المرفقة باستخدام برنامج النظام.
ملاحظة: في الصورة هذه الأدوات في الشكل 1.
الشكل 1. R- نظام μCP والأدوات الروبوتية الذراع. (A) عرض على نطاق واسع للنظام R-μCP مع جميع الأدوات والتركيبات، (أ) تشوك فراغ، (ب) حمام كاشف، (ج) لأسفل الكاميرا، (د) ختم التعشيش لاعبا اساسيا، (ه) الروبوتية الأداة. (ب) الأدوات الروبوتية الذراع تصور (و) ذات الرؤوس الماس أداة الحفر و (ز) أداة الشفط الهوائية عقد (ح) المدعومة ABS PDMS الطوابع.
- وضع ختم PDMS مع 600 معرف ميكرون و 900 ميكرون OD جاحظ للحلقة تواجه هبوطا في المباراة طابع التعشيش يدويا. وضع يدويا coverslide المغلفة بالذهب تنظيفها حديثا على رأس تشوك فراغ، المعروضة في الشكل 1A، وذلك باستخدام شل الفراغ مختبر المتصلة.
- باستخدام عناصر التحكم الروبوت، محاذاة الكاميرا لأسفل على نقطة وسط coverslide المغلفة بالذهب، كما في الشكل 2A.
ملاحظة: يمكن في البداية أن تحدد هذه النقطة عن طريق التفتيش البصري ولا تتطلب دقة كبيرة، كما هو الطابع PDMS الكثير من تأإيه من الشريحة المغلفة بالذهب. - تعليمات الذراع الروبوتية لحفر أربعة إشارة "X" علامات في القمم من مربع مع أبعاد 3.8 مم 3.8 مم تركزت على coverslide المغلفة الذهب باستخدام أداة الحفر ذات الرؤوس الماس تعلق على الذراع الروبوتية. (مبين في الشكل 2B، عملية مؤتمتة)
ملاحظة: هذا يضمن كافة العلامات المرجعية الأربعة هي ضمن الاطار البصري واحدة من الكاميرا أسفل. - باستخدام الروبوتات الهوائية شفط الأدوات، والبيك اب وعقد PDMS ختم 1 مم فوق اعبا اساسيا ختم التعشيش كما في الشكل 2C. (العمليات التكنولوجية)
- استخدام الكاميرا تواجه التصاعدي وLED حلقة إضاءة الصورة في الشكل 2D و E، تصور العلامات المرجعية مربع ختم والتعرف عليها مع برنامج الكاميرا 10 مرات من أجل تحديد متوسط X الطابع، وY، وتعويض الزاوي من وسط محور الروبوت الأدوات. (العمليات التكنولوجية)
- كما هو الحال في
- 3.8) ضع ختم في حمام من alkanethiol البادئ ATRP، bromoisobutyrate ω-mercaptoundecyl (2 ملم في الإيثانول) كما هو مبين في الشكل 2F. (العمليات التكنولوجية)
- إزالة ختم من حل alkanethiol ووضعه على تيار النيتروجين المضغوط إلى 0.48 شريط (5 رطل) حتى يتبخر الإيثانول كما في الشكل 2G. بعد 1 دقيقة زيادة الضغط على تيار النيتروجين هو 1.03 بار (15 رطل) لضمان جفاف موحد. (العمليات التكنولوجية)
ملاحظة: سوف التجفيف غير الكامل يؤدي إلى فقدان كلي أو جزئي للنمط الإخلاص. - بعد التجفيف، ونقل ختم على موقف وسط المحسوب من الشريحة المغلفة بالذهب وخفضه إلى 100 ميكرون الزيادات في حين رصد قوة المحرك المحور Z كما هو مبين في الشكل 2H.
ملاحظة: يتم إبلاغ هذا الأمر عزم الدوران التي يعاني منها المحرك المحور Z وعرضها في برنامج التوجيه الروبوت. (العمليات التكنولوجية) - وقف خفض ختم مرة واحدة وقد حقق ضغط محدد مسبقا من 79.2 كيلو باسكال، والبقاء على اتصال مع الشريحة المغلفة الذهب لمدة 15 ثانية. (العمليات التكنولوجية)
ملاحظة: قيم الضغط هنا هي الأمثل لتصميم طابع وميزة الارتفاع الحالي. إذا تم تغيير تصميم الطوابع، وتحديدا للجانب ارتفاع نسبة الطوابع ولحن هذه وفقا لذلك من خلال عملية التجربة والخطأ. - إزالة ببطء الطابع من الشريحة المغلفة بالذهب ووضع ختم العودة في المباراة طابع التعشيش. (العمليات التكنولوجية) 4. SI-ATRP من PEGMEMA على Micropatterned Coverslides
- الافراج عن الضغط فراغ عقد coverslide micropatterned، وتحويلها إلى 50 مل دورق شلنك. وختم ديغا في دورق شلنك باستخدام مضخة فراغ.
- إضافة 5.5 مل من ATRP خليط التفاعل التي تحتوي على macromonomer PEGMEMA (208.75 ملمول) والمياه (34.4 مل)، والميثانول (43.8 مل)، والنحاس (II) بروميد (1 ملمول)، و 2، 2-bipyridine (3 ملمول) ل القارورة Schlenk.
- إضافة 0.5 مل من أسكوربات L-الصوديوم (454.3 ملم) في الماء لبدء التفاعل، والسماح لها أن تستمر لمدة 16 ساعة على RT تحت غاز خامل.
ملاحظة: بعد إضافة أسكوربات L-الصوديوم، واللون رد فعل التحول من الضوء الأخضر إلى البني الداكن كما هو مبين في الشكل 3A-B.
ملاحظة: إن رد فعل يمكن أن يستمر إلى ما بعد 16 ساعة، ولكن ذلك لن زيادة كبيرة في طول فرش PEG. - إزالة coverslide micropatterned من القارورة شينك وشطف مع الايثانول والماء والإيثانول والجافة تحت تيار النيتروجين لطيف.
ملاحظة: بعد SI-ATRP، وينبغي أن تكون التعديلات السطح المرئي للعين، ويمكن تصوير وتحليل تحت المجهر كما في الشكل 3C.
ملاحظة: هذا هو أبسط طريقة لاختبار دقة المحاكمة لأنه يغني عن الحاجة إلى immunostain ركائز. - وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
- إضافة 6 مل من N، N -dimethylformamide (DMF) تحتوي على 100 ملي أزيد الصوديوم في قارورة التفاعل. الحفاظ على هذا التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: التعامل مع DMF فقط في غطاء الدخان الكيميائي. توخي الحذر عندما يزن من أزيد الصوديوم. - عند الانتهاء، وإزالة coverslide micropatterned من القارورة رد فعل وشطف مع الماء والإيثانول ثم تجف تحت تيار النيتروجين.
- وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
- إضافة 6 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) تحتوي على 100 ملي و 300 ملي إيثانولامين ثلاثي الإيثيلامين إلى قارورة التفاعل. عقد هذا التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: التعامل مع DMSO، ايثانول، وثلاثي الإيثيلامين فقط في غطاء الدخان الكيميائي. - عند الانتهاء إزالة coversl micropatternedبيئة تطوير متكاملة من القارورة رد فعل، ثم شطف مع الماء والإيثانول الجافة تحت تيار النيتروجين.
- تنفيذ الخطوات R-μCP كما هو موضح سابقا في خطوات 3.2 و 3،6 حتي 3،12، استبدال طابع PDMS مع 300 ميكرون و 600 ميكرون ID OD جاحظ للحلقة، على ان يكون للحلقة مع ميزات أصغر يتم وضعها داخل للحلقة micropatterned سابقا.
ملاحظة: عتبة الضغط لهذا الطابع هي 132.0 كيلو باسكال. كما ذكر سابقا، يتم تحسين هذه الإعدادات الضغط للميزات الطوابع المستخدمة في هذه التجربة. - تنفيذ الخطوات SI-ATRP كما هو موضح سابقا في خطوات 4،1-4،4.
- وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
- إضافة 6 مل من DMSO تحتوي على 100 مليpropargylamine إلى قارورة التفاعل. الحفاظ على هذا التفاعل على RT لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: التعامل مع DMSO وpropargylamine فقط في غطاء الدخان الكيميائي. - عند الانتهاء إزالة coverslide micropatterned من القارورة رد فعل وشطف مع الماء والإيثانول ثم تجف تحت تيار النيتروجين.
- وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
- إضافة 6 مل من كبريتات النحاس (15 ملم) / تريس [(1-البنزيل 1-H--1،2،3 triazol-4-YL) الميثيل] أمين (TBTA، 30 ملي) (1: 1 V / V المياه / DMF) التي تحتوي على 562 ميكرومتر أزيد PEG-4 -Biotin المكورات إلى قارورة التفاعل. إضافة 1.2 مل من حمض L-الاسكوربيك (0.15 ملم) في الماء إلى الخليط لتهيئة التفاعل.
- النيتروجين فقاعة من خلال محلول التفاعل لمدة 10 ثانية، وختم القارورة مع بارافيلم، وتتفاعل لمدة 24 ساعة على RT.
- على completioن إزالة coverslide micropatterned من القارورة رد فعل، وشطف مع الماء ووضعه في طبق البوليسترين 12-جيدا.
- منع coverslide micropatterned في DPBS (3٪ المصل حمار) لمدة 1 ساعة على RT. وصمة عار للجماعات الأسيتيلين المعقدة البيروكسيديز مع Streptavidin-546 المترافقة (2 ميكروغرام / مل) في DBPS (3٪ المصل حمار في برنامج تلفزيوني) لمدة 2 ساعة على RT.
- شطف coverslide micropatterned 5 مرات مع DPBS لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف.
ملاحظة: الشكل 4B يصور صورة من الشريحة بعد اكتمال هذه الخطوة. - ترك coverslide micropatterned في 12-جيدا صطبق olystyrene DBPS التالية يشطف.
- إضافة 2 مل من DBPS (أو خلية الإعلام الثقافة) تحتوي على 20 ميكرومتر DBCO-PEG 4 -Biotin، والسماح لهذا التفاعل أن تستمر لمدة 24 ساعة على RT (أو على 37 درجة مئوية في حاضنة).
- عند الانتهاء، شطف coverslide micropatterned 5 مرات مع DPBS (أو ببساطة إجراء تغيير وسائل الإعلام).
- وصمة عار للجماعات أزيد المعقدة البيروكسيديز مع Streptavidin-488 المترافقة (2 ميكروغرام / مل) في 2 مل DPBS (3٪ المصل حمار) لمدة 2 ساعة على RT.
- شطف coverslide micropatterned 5 مرات في DPBS لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف.
- صورة micropatterned coverslide باستخدام المجهر متحد البؤر مضان. الشكل 4A-C يصور الصور من الشريحة بعد اكتمال هذه الخطوة.
ملاحظة: عند استخدام ركائز لفحوصات زراعة الأنسجة، انتقل المادتين 10 و 12 من هذا البروتوكول. بعد degre المطلوب(ه) من functionalization، تعقيم coverslide هندسيا من قبل الشطف كلا الجانبين مع الإيثانول بنسبة 100٪ والتجفيف تحت تيار النيتروجين. نقل الشريحة إلى خزانة السلامة البيولوجية العقيمة وشطف الشريحة مع برنامج تلفزيوني خمس مرات قبل الشروع في بذر الخلية والثقافة.
5. Functionalization أزيد من سلاسل Micropatterned PEGMEMA
6. التخميل من سلاسل البروم بين functionalized PEGMEMA
7. R-μCP من الحلقة الداخلية وSI-ATRP من PEGMEMA
8. الأسيتيلين Functionalization من سلاسل Micropatterned PEGMEMA
9. المحفز النحاس "انقر" Biotinylation من الأسيتيلين إنهاء سلاسل PEGMEMA
10. كشف مناعي من المجموعات المعقدة البيروكسيديز الأسيتيلين
مجانا النحاس و11. "انقر" Biotinylation أزيد من إنهاء سلاسل PEGMEMA
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، وهذا التعديل خطوة الركيزة يمكن أن يؤديها في الموقع خلال زراعة الخلايا.
12. كشف مناعي من المجموعات المعقدة البيروكسيديز أزيد
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام تقنيات المحاذاة μCP اليدوية لمهندس ركائز الثقافة مع صفائف فرش PEG-المطعمة بين functionalized متعامد مع "فوق" وقد ثبت كيمياء في العمل السابق 6. ومع ذلك، وهذا يوفر الحد الأدنى من السيطرة على توجيه نمط وغالبا ما يؤدي إلى تداخل بين functionalized المناطق. هنا، يتم استخدام الرواية نظام R-μCP للتغلب على هذا القيد، وقدرته على نمط بدقة مجموعة من PEG للحلقة فرشاة مع 300 ميكرون و 600 ميكرون ID OD يقدمون مجموعة آلكاين الطرفية ضمن مجموعة منفصلة من PEG للحلقة فرشاة مع 600 ميكرون ويتجلى ID و 900 ميكرون OD عرض مجموعات أزيد 14 محطة. بعد رد فعل آلكاين تقديم PEG فرش مع أزيد PEG-3 -Biotin ورد فعل أزيد تقديم PEG فرش مع DBCO-PEG 4 -Biotin، تم immunostained الركيزة مع تحقيقات الفلورسنت وتصويرها باستخدام مجهر متحد البؤر (Figure 4). تحليل هذه الصور باستخدام برنامج MATLAB مخصصة تحسب أن اثنين PEG صفائف الفرشاة هي التي تنسجم مع دقة 10 فرعية ميكرومتر، أي X ~ 6.4 ميكرون، Y ~ 1.7 ميكرون، وθ ~ 0.02 درجة، وهي في الشركة المصنعة استشهد الحد من نموذجنا SCARA (أي ~ 10 ميكرون) ويدل على أداء نظام R-14 μCP مسبق. وبالتالي، فإننا نعتقد بأن استخدام SCARAs أعلى حد في هذا النظام سيوفر أقل من ذلك، القرار ميكرون الفرعي. هذه النتائج تبرهن على القدرات الهندسية الركيزة تنوعا مكنت من الاستخدام المشترك لنظام R-μCP وردود الفعل استبدال شغوف بالنواة متتابعة. في الحد الأدنى عبر التفاعل يتضح من العلامات الفلورية للكيمياء السطحية المتعامدة يعمل على توضيح إمكانيات هذا النظام لتجميد الدقيق للمنبهات الكيميائية الحيوية لتوليد ركائز ثقافة معقدة لتطبيقات هندسة الأنسجة. </ P>
الشكل 2. تخطيطي لعملية R- μCP. (A) لأسفل الكاميرا تصور يجمد الشرائح المغلفة بالذهب وعلامات (ب) إشارة النقش على الذهب المطلي coverslide، (C) إزالة الطابع PDMS من الطوابع اعبا اساسيا التعشيش، (D - E) تصور العلامات المرجعية ختم PDMS مع الكاميرا التي تواجه صعودا (F) وضع ختم PDMS في alkanethiol حمام البادئ، (G) التجفيف alkanethiol البادئ المذيبات خلال تيارات النيتروجين، و (H) ختم alkanethiol المغلفة ختم PDMS على المغلفة بالذهب coverslide.
الرقم 4. Immunostained صور MicroPatterned الشرائح. (A) أزيد و (ب) مجموعات آلكاين، المعقدة البيروكسيديز باستخدام خالية من النحاس والنحاس بوساطة بنقرة والكيمياء، والكشف مع Streptavidin-488 و -546 على التوالي. (C) تراكب كل القنوات الفلورسنت. جميع نطاق ويمنع 500 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سوف ركائز مثالية لهندسة الأنسجة وبالتالي يتم bioinspired ألخص التوزيع المكاني للبروابط النشطة بيولوجيا الحيوية الموجودة داخل أنسجة الأم. فإنها تمتلك أيضا خصائص الديناميكية التي تمكن التعديلات الزمنية للبروابط والأنماط المكانية التي يتم تقديمها للسماح توجه التشكل الأنسجة والمقيدة مكانيا تحريض مصير الخلية. تلفيق مثل هذه ركائز يتطلب تجميد للمنبهات الكيميائية الحيوية المعقدة متعددة في التوجهات وأمر كبير على ركائز. في حين تحاكي جميع العوامل الذاتية من مكانة خلية في المختبر من غير المعقول، ونظام R-μCP الموصوفة هنا يسمح للتجميد في مناطق متعددة من كيمياء الحيوية النشطة المتعامدة مع التحكم الميكروسكيل من التوجه المكاني.
فائدة هذه الزيادات ركائز أبعد من ذلك عندما تفكر في أنه في حين PEG صفائف فرشاة ملزمة مع يغاندس ثبتوايمكن أن تثير التفاعلات biospecific، تبقى فرش PEG غير منضم مقاومة لامتصاص البروتين وبالتالي يمكن أن تساعد على السيطرة على التصاق الخلايا والهجرة. على الرغم من السلبي، والامتزاز micropatterned من المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات أو تقارن البوليمر PEG هو أبسط طريقة للسيطرة على التصاق الخلايا والهجرة، وهذه التقنية توفر سوى السيطرة عابرة منذ الامتزاز هو عملية عكسها 11. أيضا، الجزيئات كثف على الأسطح في توجهات غير متوقعة وبتركيزات عشوائية مما يحد من الإخلاص والسيطرة على التفاعلات biospecific. وعلاوة على ذلك، عادة المركبات المستخدمة في إنشاء المناطق غير قاذورات، مثل ألبومين المصل البقري أو Pluronic F127، لا تمتلك مواقع على رد الفعل المعينة لمزيد من functionalization الحد مرحلة ما بعد الامتصاص في التعديلات الموقع. يمكن أن تتولد من صواريخ سام alkanethiols مع هذه المجموعات التفاعلية لتعديل سطح إضافي، ولكن لديهم أيضا متانة محدودة في نسيج الثقافة كونديتأيونات نظرا لعدم وجود الأكسدة التي يوفرها التدريع المطعمة PEG فرش 10،11. على العكس، دمج دينا منصات R-μCP مع تطعيم PEG-فرشاة وردود الفعل استبدال شغوف بالنواة متتابعة يوفر القدرة على هندسة ركائز مع دائمة، مناطق cytophobic الميكروسكيل التي يمكن تعديلها مسبقا أو في الموقع مع الوظائف الحيوية متعامد. هذا وسوف تسمح بقدر أكبر من السيطرة على التفاعلات biospecific التي يمكن أن تنظم في التشكل الأنسجة في المختبر والنمو.
إحدى نقاط القوة الرئيسية لR-μCP مقارنة مع النظم الأخرى لمواءمة المطبوعات microcontact متتابعة هي القدرة على إزالة الطبقة من النظام بين تركيب الجمله المتكررة مع الحفاظ على محاذاة عالية الدقة 12،13. وهذا يتيح تنوع أكبر في أنواع كيمياء السطحية التي يمكن تطبيقها، ويمكن أن تختلف المدة من التفاعلات تعديل السطح لضبط كثافة في وقت لاحق ايمبروابط حشدت 6. وبالتالي، يمكن استخدام R-μCP لإنشاء التدرجات تركيز التنسيق في العظة التي تتوسط التفاعلات الكيميائية الحيوية biospecific 14. مع القدرة على التحكم بدقة كل من موقعه ودرجة التفاعل biospecific، ونظام R-μCP يوفر طريقة فريدة للتحقيق أدوار بروابط النشطة بيولوجيا في التشكل الأنسجة ويؤسس نظاما قويا لتوليد ركائز ثقافة محاكاة عرض الاشارات البيولوجية في في الجسم الحي المتخصصة.
وثمة جانب بالغ الأهمية من محاريب الخلوية، وتحديدا في إطار التنمية، هو تعديل الزماني المكاني من الإشارات عوامل 18. على الرغم من الإشارات البيوكيميائية للذوبان يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام الثقافة بطريقة محددة زمنيا، هناك يقتصر السيطرة المكانية عبر الخلايا التي تواجه هذه العظة. مع نظام R-μCP الموصوفة هنا، فمن الممكن لبناء ركائز الثقافة micropatterned مع عضال functionalizإد PEG فرش تقديم مجموعات وظيفية أزيد أن يكون له تأثير على مصير الخلايا في الثقافة. بينما مجموعات أزيد قادرة على خضوعه لردود الفعل المحفز النحاس "فوق" مع جزيئات تقديم آلكاين، وهذا لا يمكن أن يؤديها في وجود خلايا في ثقافة معينة سمية النحاس. ومع ذلك، جزيئات عالية الضغط مثل dibenzocyclooctyne (DBCO) تخضع لانتقائية للغاية وحيويا خالية من النحاس وأزيد آلكاين cycloaddition رد فعل 19،20. من خلال الاقتران من linkers التي تحتوي على DBCO، ركائز الثقافة micropatterned يمكن تعديلها في الموقع بروابط مع البيولوجية الجديدة 21. مع القدرة على جعل المناطق cytophobic أليف الخلايا أو إضافة الاشارات البيوكيميائية المختلفة لاستخدامها في إجراءات إشارات متعددة الخطوات، ركائز الثقافة ولدت مع هذه الطريقة لديها قدرات تكيفية جديدة وبالتالي توفير نظام أكثر قوة للتعليمات التشكل الأنسجة في المختبر.
على الرغم من وعاء ضخمential وفائدة منصة R-μCP، فإنه لا يكون لها بعض السلبيات. استخدام العديد من الخطوات SI-ATRP لتوليد ركائز PEG-المطعمة يزيد كثيرا من الوقت تلفيق مقارنة أساليب تنطوي على الطباعة النافثة للحبر أو ترسب microdroplet من البروتينات ECM. بينما دقة تقنيات الطباعة النافثة للحبر تضاهي نظام R-μCP الحالي، وامتصاص البروتينات ECM هو عكسها وبالتالي توفير أقل السيطرة على التفاعلات الخلية البروتين. أيضا، ركائز المولدة عبر تقنيات الطباعة النافثة للحبر لا يمكن إزالتها أثناء التصنيع، وبالتالي تعوق استخدام المتنوعة كيمياء تعديل الركيزة التي تسمح، على سبيل المثال، تقتصر مكانيا في التعديلات الركيزة الموقع 22. بسبب هذه القيود تقنيات النافثة للحبر هي أكثر ملاءمة لتوليد السريع من ركائز الثقافة المعنية في المقام الأول مع مدة قصيرة، وترتيبات ثابتة من الجزيئات الحيوية وأنواع الخلايا 23 في حين أن نظام R-μCP إلى حد باتص مناسبة نحو توليد ركائز متعددة الأوجه تهدف إلى إظهار المدى الطويل، والتحكم الديناميكي على كل التفاعلات الخلوية المكانية والزمانية في 2D مع بروابط البيولوجية المتنوعة.
microcontact الطباعة تمكن ترسب السريع للنانو لالميكروسكيل "الحبر" ميزات أكثر المناطق السطحية الكبيرة، ولكن كان هناك دائما تباين كبير في تركيز المواد 'الحبر' المودعة. وهذا هو أيضا وجود قيود الحالي للمنصة R-μCP كما يمكن ملاحظتها في الشكل (4). ونحن نفترض أن عدم التجانس في تعديل الفلورسنت من PEG فرش ويرجع ذلك إلى تطبيق الروبوت قوة طبيعية متفاوتة على ختم PDMS بأكمله، والتي كما من المحتمل أن لا شقة تماما. وهذا يؤدي إلى ضغط اتصال غير موحدة بين جميع مناطق الطوابع والركيزة مما يسبب ترسب متفاوتة من البادئ alkanethiol وسمك اللاحق للفرشاة PEG المطعمة. فيأجل تصنيع ركائز PEG المطعمة مع حتى ترسب alkanethiols وظائف سطح بذلك، وسوف تحتاج إلى تصميم أداة ختم ليكون الأمثل لتطبيق قوة طبيعية وموحدة وزعت على ختم PDMS بأكمله. وسوف يسهل هذا الاتصال الموحد مع الشرائح المغلفة بالذهب عبر واجهة مستقلة كاملة من عيوب الطوابع. أيضا، في الشكل 4B، يمكن للمرء أن يلاحظ طفيف انتقال التلوث من مجموعات الأسيتيلين على أزيد إنهاء PEG الفرشاة. في حين أن كثافة سطح بروابط يجمد بسبب التلوث المتبادل هو الحد الأدنى بالمقارنة مع ذلك على المقصود PEG-فرشاة، وهذا يمكن أن تخفض إلى الصفر تقريبا عن طريق زيادة مدة رد الفعل إيثانولامين التحييد (انظر القسم 6) كما هو موضح سابقا 6.
التطبيق الرئيسي للنظام R-μCP الموصوفة هنا هو لتصنيع معقدة ركائز زراعة الأنسجة التي يمكن استخدامها لممارسة المكاني والزماني المراقبة سو مصير الخلية. ومع ذلك، فإن دقة عالية ودقة منصة R-μCP يجعلها وسيلة جذابة لتطبيقات أخرى أيضا. القدرة على نمط المناطق أليف الخلايا مع كيمياء يجند التفاضلية تليها تعديل الموقع من خاملة سابقا، في المناطق cytophobic تسمح للثقافة مشتركة من خطوط الخلايا متعددة مع رقابة مشددة على التوجه المكاني. هذا إلى جانب الطبيعة الإنتاجية العالية المتأصلة في micropatterning تقديم بديل للطرق الحالية للالإنتاجية العالية فحص كل من خلايا مفردة ومجموعات متعددة الخلايا 24. في حين أن نظام R-μCP لديها امكانات كبيرة في مجال علم الأحياء، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على مجال نظم الميكروية (MEMS). في MEMS تلفيق، فمن المستحسن لنقل مكونات ممس مع دقة عالية ودقة لانتاج كميات كبيرة. مع تقنيات ختم الحركية الجديدة، ونظام R-μCP الموصوفة هنا يمكن تكييفها لطباعة compone فعالاليلة من السيليكون أو الغاليوم نيتريد على رقائق السيليكون لاستخدامه في توليد MEMS 25. وبالتالي، فإن منصة R-μCP يمكن أن تستخدم لمجموعة واسعة من التطبيقات المحتملة.
في الختام، استخدام نظام R-μCP لتوليد PEG-المطعمة ركائز الثقافة بين functionalized متعامد باستخدام تفاعلات استبدال شغوف بالنواة متتابعة لا يقدم منصة مثالية ليحتمل السيطرة على التشكل والنمو الأنسجة في المختبر، ولكن نظام ممتاز للتحقيق أدوار متعددة بروابط النشطة بيولوجيا على مصير الخلية. القدرة على نمط الاشارات البيوكيميائية متعددة في أنماط متميزة وأمر غاية ترسي الأساس لبناء ركائز الثقافة قادرة على تعليمات تشكيل هياكل الأنسجة مع أنواع الخلايا المتعددة التي تنظم على نطاق ميكرون. هذا، إلى جانب القدرة على تعديل ركائز micropatterned في الموقع، يمكن أن تسمح للسيطرة لا مثيل لها من التشكل الأنسجة وسللتر في مصير الثقافة. تقنيات الزخرفة الموصوفة هنا توفير نظام متعدد الاستعمالات لتصنيع ركائز الثقافة التي يمكن أن يوما واحدا تسهيل إنتاج الرشيد واستنساخه من الهياكل الأنسجة في المختبر عضوي النمط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SCARA | Epson | LS3-401ST | Higher end models with increased precision are available if desired. |
| (Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | Gelest | SIT8174.0 | CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesive Co | NC9020938 | Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable. |
| 24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides | Fisher Scientific | 48393106 | These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need. |
| CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator | Telemark | SEC-600-RAP | Requries specialized training. |
| EPSON LS3 SCARA | EPSON | LS3-401ST | |
| ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate | Prochimia | FT 015-m11-0.2 | Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. |
| Schlenk Tube Flask 50 ml | Synthware | 60003-078 | Requires rubber stoppers with diaphram. |
| Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate | Sigma Aldrich | 447943 | Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors. |
| Methanol (Certified ACS) | Fisher Scientific | A412-4 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Copper(II) Bromide | Sigma Aldrich | 437867 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| 2,2'-Bipyridine | Sigma Aldrich | D216305 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
| 20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials | Fisher Scientific | 03-340-4E | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| N,N-dimethyformamide | Sigma Aldrich | 227056 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | 398136 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Propargylamine | Sigma Aldrich | P50900 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| 200 Proof Ethanol | University of Wisconsin Material Distribution Services | 2292 | CAUTION, only handle in chemical fume hood. |
| Azide-PEG3-Biotin | ClickChemistryTools | AZ104-100 | Solubilized in DMF |
| Copper(II) Sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | CAUTION, limit exposure with surgical mask. |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A7506 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190144 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | D9663 | Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose. |
| 12-Well Polystyrene Plate | Thermo Scientifit - NUNC | 07-200-81 | Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions. |
| DBCO-PEG4-Biotin | Clickchemistytools | A105P4-10 | Solubilized in DMF |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | S-11223 | Solubilized in PBS |
| Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | S-11225 | Solubilized in PBS |
| Nikon A1-R Confocal Microscope | Nikon | Nikon Eclipse Ti, A1R | An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates. |
References
- Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
- Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
- Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
- Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
- Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
- Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
- Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
- Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
- Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
- Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
- Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
- Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).
- McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
- Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
- Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
- Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).
- DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
- Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
- Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).
