雌激素等性腺激素在多种实验范式中调节记忆形成，包括恐惧消退记忆。本方案描述了一组用于研究性腺激素在自然动情周期雌性动物消退过程中特异性作用的方法，包括动情周期监测和外源性雌激素给药。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
条件性恐惧的消退在雄性啮齿类动物中已得到广泛研究。近年来，越来越多的研究表明，某些行为任务和反应行为的神经机制在雌性和雄性之间存在差异。在研究中使用雌性动物可能带来挑战，原因是其动情周期中性腺激素水平存在波动。本实验方案描述了经过验证的成熟方法，可用于研究雌二醇在雌性大鼠恐惧消退记忆巩固中的作用。动情周期的阶段以及在消退训练前给予外源性雌激素，均可能影响24小时后的消退记忆回忆。本文所述的阴道涂片技术用于识别动情周期阶段，有助于检测和调控自然周期中的性腺激素水平。利用这一基础啮齿类动物模型，可进一步阐明雌激素在雌性中调节恐惧消退记忆的潜在机制。
引言
在人类和啮齿类动物中，多种认知行为和学习范式均观察到固有的性别差异。例如，已有报道表明，女性通常具有更强的语言能力和细节关注能力，而男性则具有更好的空间能力1-3。这些性别差异可能部分归因于性腺激素的影响。高水平的雌二醇可提高女性擅长任务中的表现，但会降低男性通常表现较好的任务中的成绩4-6。尽管这些证据具有说服力，但人类研究中难以完全控制实验环境，使得难以确定这些行为效应是否可明确归因于激素作用。相比之下，动物研究能够实现完全受控的实验条件。
尽管恐惧消退的基本神经机制已在雄性个体中被识别并得到深入研究，但这些机制在雌性个体中是否相同，以及其在动情周期中如何变化，目前尚不清楚。恐惧条件化与消退是啮齿类动物和人类中广泛使用的行为范式，用于开展与焦虑障碍相关的研究。鉴于女性不仅焦虑障碍风险更高，且症状持续时间更长、严重程度更高7-13，在这些研究中纳入雌性个体至关重要。雌性在该研究领域中的代表性不足，可能源于动情周期监测的困难，以及难以控制性激素对行为的影响。在此方面开展雌性研究的实验室常面临一些问题，但这些问题往往未被报告，或未在研究方法部分中加以描述。
在啮齿类动物中的新近证据表明，恐惧消退的性别差异受到性腺激素的调节14-18。在恐惧条件反射实验中，动物被训练对特定刺激产生恐惧。经过多次无强化的刺激呈现后，动物学会不再对这一线索产....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本方案中的所有操作均已获得麻省总医院研究动物护理委员会（该委员会作为机构动物护理与使用委员会，即 IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。
1. 动物饲养与操作程序
- 到达后，将约8-10周龄（体重200-225 g）的成年Sprague Dawley雌性大鼠每3-4只一组饲养在塑料箱中，垫以木屑。自由摄取饲料和水，并维持12小时光照/12小时黑暗的循环。让大鼠在饲养环境和动物设施中至少适应1周时间。
注意：本方案中的所有操作均在光照周期内进行。 - 经过上述适应期后，连续2-3天每天对所有动物进行5分钟的抓取操作。每次正确抓取一只大鼠（用手托住躯干，不要抓尾巴），牢固握住并在此期间轻抚。对于表现出更高应激反应、易惊跳或焦虑的大鼠，应延长抓取时间。此举旨在尽量减少抓取应激，以免影响本方案后续步骤。
注意：不同实验室在抓取动物的天数和时长上可能有所不同；但在同一实验室的不同实验之间应保持一致。
2. 动情周期监测：阴道拭子涂片与染色步骤
- 制备0.9%生理盐水溶液（将氯化钠溶解于蒸馏水中）。将棉签浸入该溶液中，然后用纸巾轻压棉签尖端以吸去多余液体，避免过度饱和，否则可能导致样本采集不足或细胞丢失。将小鼠尾巴向上抬起并远离阴道口，轻轻将棉签插入阴道腔内，并沿阴道壁旋转，以收集脱落的阴道细胞。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在此恐惧消退记忆提取实验方案中，以僵直百分比作为恐惧程度的指标。成功消退且保留消退训练记忆的动物，在消退记忆提取阶段行为测试的最后一天表现出较低的恐惧反应。雄性和雌性大鼠在条件化、消退及记忆提取阶段的条件性恐惧表达水平无显著差异（图2）。然而，当根据动情周期中雌激素水平高低将雌性动物分为高雌激素期和低雌激素期组进行单独分析时，性别差异变得明显。在动情周期低雌激素期（即动情间期）接受消退训练的雌性大鼠，其第3天消退记忆的提取效果明显差于在动情前期接受训练的雌性大鼠（图3）。这些处于动情间期的雌性大鼠在消退记忆提取过程中也表现出显著更高的恐惧恢复（即消退记忆较差），与雄性相比尤为明显。然而，若在动情间期雌性大鼠进行消退学习前，皮下注射15 μg/kg剂量的雌二醇，则恐惧消退记忆的巩固能力得到增强，表现为消退记忆提取期间僵直时间显著降低（图4）。因此，这些数据表明性腺激素可调节恐惧消退记忆的提取，并介导条件性恐惧消退行为中的性别差异。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
恐惧消退在雄性大鼠中已被广泛研究，介导条件性恐惧消退的神经机制已在多种干预条件下被识别和评估。相比之下，针对雌性大鼠或性腺激素在恐惧消退中作用的研究相对较少。为了专门研究雌激素对恐惧消退的影响，采用自然动情周期的雌性大鼠进行为期三天的行为实验范式。该程序包括适应/条件化、消退和消退记忆三个阶段。利用此方案已证明，在低雌激素水平的动情间期接受消退训练的雌性大鼠，其冻结行为更高（即消退记忆受损），相较于在高雌激素水平的动情前期接受消退训练的雌性大鼠。15在间情期阶段的消退训练前给予雌二醇可调节消退记忆的巩固16这通过消退记忆期间冻结行为的减少得以证明。综上所述，这些结果强调了在雌性动物研究中关注卵巢激素及动情周期对行为影响的重要性。尽管本文未描述对照实验，但有必要纳入适当的对照组。 即 无消退组，以进一步评估雌激素对消退记忆巩固过程中相关机制的影响。
本实验方案的目的有两个：1）研究在完整动物动情周期的特定阶段，雌激素对条件性恐惧消退的影响；2）考察在雌性动物通常处于低雌激素状态时，急性补充雌二醇如何调节其行为。通过本文所述.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
本稿件的作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
Mohammed R. Milad 获得美国国家精神卫生研究院（NIMH）R01 MH097880 基金以及麻省总医院（MGH）精神病学系机构资金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 恐惧条件反射实验箱 | Coulbourn Instruments | ||
| 图形化状态控制器 | Coulbourn Instruments | ||
| 隔音箱 | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| 雌二醇 | Sigma-Aldrich | E1024 | 溶于芝麻油用于皮下注射 |
| 芝麻油 | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| 快速染色剂 | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6英寸，无菌 |
| 0.9%生理盐水 | LabChem, Inc. | LC23460-2 | 氯化钠质量体积比溶液 |
| Selectfrost 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | 用水按1:256稀释 |
| 鲁尔锁式1ml注射器 | Becton Dickinson | 309628 | |
| 一次性皮下注射针头 | Exelint International, Co. | 26402 | 26号规格 |
参考文献
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abiliti....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
