Abstract
的条件性恐惧灭绝已被广泛研究在雄性啮齿动物。最近，已经有越来越多的研究表明，对某些行为的任务和应对行为的神经机制是在女性和男性不同。在调查研究使用雌性可以表示由于性腺激素在其动情周期的变化的一个挑战。本协议描述既定程序，在调查中雌性大鼠恐惧消退记忆的巩固雌激素的作用是有用的。发情周期和外源性雌激素的管理之前灭绝培训阶段可以在24小时后影响灭绝召回。这里描述的发情相鉴别阴道擦拭技术辅助检查和处理的自然循环性腺激素。使用这个基本啮齿动物模型可进一步划定由雌激素能调节中灭绝的恐惧记忆的机制女性。
Introduction
固有的性别差异在人类和啮齿类动物在不同的认知行为和学习的范式观察。例如，据报道，妇女一般有较强的口头和注重细节的能力，而男性有更好的空间能力1-3。这些性别差异可能是部分原因是由于性腺激素的影响。高雌激素水平提高，妇女更好的工作性能，但恶化的任务，男人通常做的很好4-6性能。虽然这方面的证据是引人注目的，有限的能力，以在人类研究中完全控制实验环境使得它以确定是否对行为这些效果可以特异性归因于激素难。动物研究，与此相反，允许完全控制的情况。
虽然恐惧消退的基本神经机制已经确定，并很好的研究，男性，目前还不清楚是否这些系统是在女性或他们如何在整个发情周期变化一样。恐惧空调和灭绝被广泛应用于行为范式在啮齿动物和人类进行相关的焦虑症的研究。鉴于妇女对焦虑症的风险较高，以及较高的症状的持续时间和严重程度7-13，这是至关重要的，包括女性在这些研究中。女性在这项研究中代表性不足可能是由于发情期的监测和会计的性激素的行为影响的挑战。实验室是做检查的女性中，往往没有报告或方法的研究，没有说明这方面遇到的问题。
新出现的证据在啮齿类动物表明，在恐惧中灭绝的性别差异是由性腺激素14-18调制。在恐惧条件，动物训练害怕一个特定的刺激。一些无筋介绍后的刺激下，动物学会不害怕线索，一个叫灭绝的过程。如何做好动物学习和巩固学习这个任务可以给灭绝训练一段时间后的消光回忆测试过程中应遵循的记忆。期间灭绝召回少恐惧的表情显示出良好的消记忆的巩固。从我们实验室最近的研究结果表明，雌激素能调节恐惧消退记忆的巩固和提高灭绝召回。具体来说，雌性大鼠被扑灭在发情前期，发情周期的阶段期间，循环雌激素水平的高峰，显示出增强记忆灭绝保留。与此相反，雌被熄灭在低雌动情后期阶段显示相对差的消光召回，它可以与外源性雌二醇给药之前或消退训练15,16后，立即得到改善。灭绝记忆巩固的神经机制（包括UDING性腺激素在女性中的作用）不清晰。
在动物实验中，激素的作用，可通过微创手术切除的程序，如阉割去势，并进行调查。随后，从手术后恢复，性腺激素往往外生一种行为的任务19的性能在操纵。这种方法提供了关于性激素关键信息和，因为它允许对性腺激素的良好控制的操作（在定时和剂量计）20-23是有用的。这种方法，然而，没有评估在整个发情周期发生也不它们代表“正常”的动物，从而限制了平移潜在对人的研究的天然存在的波动的影响。它已被充分证明了雌性激素水平峰值和下降的发情周期的特定阶段，和在循环内的雌激素受体的表达的变化，和卵巢切除后24。因此，有必要进行研究，女性用完整性腺和缩小的实验设计，以可靠地研究了高和低雌激素状态可能对女性在其整个生命周期的影响。
该协议的重点是雌激素对参与恐惧消退的神经生物学系统的作用。它描述了如何：1）认真监测发情周期，2）准备有效剂量雌激素的全身用药，和3）遵循的行为模式，包括恐惧空调，灭绝，并记得在自然循环雌性大鼠。此协议可与其它药理学和操纵细胞和分子的工具进行修改，以帮助研究，以更好地理解，在条件性恐惧观察消光特性的性别差异。注意，以下描述的过程是那些我们实验室内使用，且存在许多的这些过程的变化i的n中的文献。
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Protocol
注：在本协议中的所有程序已经批准了小组委员会研究动物护理，作为该机构动物护理和使用委员会（IACUC）在马萨诸塞州总医院，并符合卫生准则的国家机构。
1.动物住房和处理程序
- 抵达后，房屋成年SD雌性大鼠约8-10周龄（体重200-225克），在3-4英寸的塑料箱用木片床上用品组。维持它们在饮食中随意获得食物和水，并在12小时的光/暗周期。离开老鼠适应的住房条件和动物设施至少1周。
注：本稿件所有过程都是在光周期中进行。 - 在此之后的适应期，处理所有动物的每个2-3天5分钟。正确地拿起大鼠一次一个（由躯干，而不是由尾支持），追究他们的安全，并在此期间抚摸。处理出现更多的强调，神经质，或焦虑的时间较长的动物。这样做是为了尽量减少处理压力，这可能会影响本协议的下列步骤。
注：天数和时间处理的动物可以在不同的实验室之间变化量;然而，这些都应该是相同的实验室内的实验之间保持一致。
2.监测发情周期：阴道拭子拖尾和染色过程
- 使0.9％盐溶液（溶解在蒸馏水氯化钠）。滋润在此溶液中的棉签。印迹使用纸巾，以避免过饱和，这可能导致样品收集或细胞的损失不足的小费。抱着尾巴向上远离阴道口，轻轻插入棉花尖端插入阴道运河和打滚的墙壁捕捉宽松阴道细胞。
- 如果动物小便的婴儿床吨尖，更换一个新的，因为尿液污染将难以相鉴别。要格外小心，因为在此过程中不造成困扰的动物，因为接触应力破坏发情周期。当抽汲，旨在实现一个快速的插拔，是不是太深，以减少额外的刺激子宫颈，可引起假孕。
注：假孕可确定为无环发情周期通常持续约12天， 即发情间期25个连续天。 - 小心地取出敷贴尖端和滚动它到一个预先标记的显微镜载玻片。避免按下太难为幻灯片上过多的液体可以相鉴别困难，一旦干燥。
注：一张幻灯片可以包含多个天的每只动物，尽管这可以根据个人的喜好来完成。 - 确保样品转移到幻灯片。采集样品SEVER在一个人的滑动连续两天，以便能够更好地跟踪和识别每日发情期的变化。
注：如果可能的话，它也是理想的，如果人们采集样品保持相同的所有动物。 - 一旦幻灯片是干的，开始染色协议相鉴别。使用染色试剂盒（见表材料），浸泡载玻片10倍，在固定液（浅蓝色），在染色溶液的10倍（粉红色）和5倍于染液溶液（紫色）。冲洗轻轻滑动，在流水下。让幻灯片完全风干显微镜下观察之前。
注：一般4-5天的长发情周期包括（按顺序）：发情期（E），发情后期（M），动情（D），和发情前期（P）26。发情的特点是蓝色，角化细胞，动情后期由白细胞和角化和有核细胞的组合，间情期是相似于细胞类型的存在，以动情后期除了它们是非常稀疏，动情前期由紫染色的聚集体的有核细胞（ 图1）。有各种染色方法，除了上述的那些，这是同样有效的用于阴道涂片细胞学检查。 - 为了监测准确前实验阶段收集的样品在至少两个完整的周期（〜8-10天）。是同一天的样品所用的时间是一致的。每日贯穿并直到实验结束收集阴道涂片样品。
3.预曝光
- 在实验前的启动，将动物预暴露于调节腔室允许动物适应环境之前的任何行为测试的上下文中（调理室）。
- 预暴露的女性的调理室（位于声音衰减框）与房子灯每天20-30分钟3天之前的任何实验。它们是预先暴露于作为其腔室为研究分配的框。彻底清洁T字会话和动物之间他盒（墙壁和托盘），以去除异味，因为他们可以影响人的行为和发情周期。
4.第1天：习惯化/恐惧条件
- 一旦动物已被证明是在其发情周期的发情期，开始为期3天的实验的习惯化/调理相。
- 取预音在实验中的每一天冷冻前到第一音调条件刺激（CS）的演示的基线测量。通过收购冻结百分之几十的CS发病前第一CS-单独开庭审理时的刺激，缺席的时间间隔内（由试验的持续时间，再乘以100花不动秒来计算的）做到这一点。
注意：可以用这些措施来评估，并与习惯，空调，灭绝和召回过程中比较基准冻结水平。 - 要在发情后期阶段进行消退训练，调理老鼠发情期的最后一天。拭子并确定动情期（步骤2）的每一天开始的实验方案（调节/消光/调用）之前。由于发情期可能会持续更长的时间超过一天，使用周期的历史来预测阶段的长度来确定当动物准备开始训练。
- 取预音在实验中的每一天冷冻前到第一音调条件刺激（CS）的演示的基线测量。通过收购冻结百分之几十的CS发病前第一CS-单独开庭审理时的刺激，缺席的时间间隔内（由试验的持续时间，再乘以100花不动秒来计算的）做到这一点。
- 在调理室中，对足部电击格栅地板连接到电刺激发生器。使用0.5-0.6 mA的刺激电平作为条件刺激（US）。使用4 kHz的80 dB音调作为条件刺激（CS）。
注意：这些参数可能跨越实验室变化，并且可以被修改为最佳调节。- 如果冷冻分析程序需要视觉线索（相对于时间），共激活的LED光与色调。定位在光上的操作性室的外部，所述视频帧内的。在每次试验的开始，启动LED灯，并保持照明，直到日结束Ë审判。
注意：此光不被动物可见和仅作为一个标记为起始和所记录的视频文件内的试验结束（将用于测量冷冻行为）。
- 如果冷冻分析程序需要视觉线索（相对于时间），共激活的LED光与色调。定位在光上的操作性室的外部，所述视频帧内的。在每次试验的开始，启动LED灯，并保持照明，直到日结束Ë审判。
- 把动物进入空调室的习惯5 CS单机试验。紧随其后的习惯，应执行恐惧条件的7成对CS-美国选拔赛。确保CS音调持续30秒和coterminates与0.5秒美国休克。运行试验中的所有会话（习惯，调节，消光，并召回）具有可变intertrial间隔平均3分钟。
- 在调理会议结束，返回动物到其家笼中，并给动物设施，直到第二天。
5.第2天：准备雌二醇
- 拭子并确定发情阶段所有接受该协议的第1天动物。制备雌二醇（也称为E2，17β-雌二醇，或β-雌二醇）用于15微克/千克的剂量皮下注射使用芝麻油或0.9％盐水作为溶媒。
- 为了计算雌二醇的量为注射准备，使用所有的动物，这是测量和记录，当他们被空调有关此协议的第1天的体重。
- 进行计算，以规范每鼠雌二醇（ 即 0.2ml）中的管理音量。因为雌二醇难以溶解，由于其不溶于水，并且需要大量的溶剂为小剂量时，通过混合雌二醇在芝麻油过热直至溶解制成原液。该溶液然后可以通过0.22微米过滤器以除去杂质。例如，为了实现15微克/千克的剂量在每只动物0.2注射体积添加的3000微克雌二醇/1毫升芝麻油原液芝麻油总所需体积计算的容积。
注：另外，用其他形式的雌激素的塔吨是水溶性的和更容易溶解。
6.第2天：雌二醇管理/消退训练
- 管理雌二醇皮下。抬起肩胛骨之间的皮肤松弛的脖子形成平缓的捏和将注射器针头插入一个由皮肤折叠形成的三角形。
- 下面雌二醇皮下注射30分钟后，再次将动物的调理室，并开始消退训练。在这种灭绝会议，进行20 CS单机试验，每个试验包括一个30秒，4千赫，80分贝色调，以可变intertrial间隔平均为3分钟介绍。
注：雌二醇对召回的影响时，雌二醇之前灭绝培训或灭绝后立即给予发生。效果没有观察4小时后的消光，因此建议注入在时间上接近的训练会话15的开头或结尾。
- 灭绝训练后24小时，棉签上的天完成1和2本协议的动物。
- 将动物进入分配给他们的空调室（同日1和2）。通过提供3 CS单机试验（灭绝召回三次试验），其中只包含3.80分贝与intertrial间隔类似给药灭绝培训20次试验CS单机试验按步骤6.2中所述开始灭绝召回会话。
- 在召回会话完成后，返回的动物，以他们家的笼子。
8.数据分析
- 通过视频采集行为数据，并使用计算机软件对其进行分析。
注：冻结的分数也可以通过实验者是盲目的药物治疗的CS表示每次试验过程中定时冻结发作手工计算，表现为时间的百分比花的基调期间冻结。结冰由完全缺乏运动与在30秒CS-美国选拔赛异常呼吸定义。由花30秒（试验持续时间）乘以100冻结（动）秒除以计算百分比冻结。
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Representative Results
在这种恐惧灭绝召回的协议，冻结百分比是衡量恐惧的指标。动物熄灭很好，保留了灭绝培训的内存表现出较低的恐惧在行为测试期间灭绝召回的最后一天。雄性和雌性大鼠不显著在条件性恐惧表达的调节，消光期间不同，并且召回相（ 图2）。然而，性别差异变得明显，当动物如高和低雌激素发情期组分别进行了分析。 ，在发情周期的低雌激素发情后期阶段进行消退训练雌鼠不记得第3天，以及那些训练有素的发情前期（ 图3）的灭绝内存。这些雌性发情后期也表现出在灭绝召回（可怜的灭绝内存）相比，男性显著更大的恐惧恢复。然而，当雌性发情后期是皮下injec泰德与现有灭绝学习雌二醇的15微克/千克的剂量，合并的恐惧灭绝存储器的出现被增强时消光召回（ 图4）就证明了低凝固。因此，这些数据表明，性腺激素可以调节恐惧灭绝的召回，也调解条件性恐惧灭绝行为的性别差异。
图1：细胞类型的跨发情周期阶段代表性的图像（放大倍数20倍）发情前期的特点是群众的圆形，紫红色，核染色上皮细胞。发情可以通过蓝染色，鳞状角化细胞的聚集体来识别。发情后期和间情期表达的细胞类型（白细胞，有核和角化细胞）的结合，但显示较少的细胞。雌激素水平在整个发情期波动，发情前期出现峰值。 （MET =发情后期;。迪斯特=动情; Proest =发情前期）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在三个阶段实验的男性和女性之间的比较中有习惯（HAB）没有观察到显著的性别差异，调理（条件），消光，或调出实验15的阶段。
图3：发情前期之间的行为差异（高雌激素）和发情后期（低雌激素）的女性在女性的高雌激素发情前期阶段O操作。˚F恐惧高于低雌激素发情后期的发情周期展品少。这些数据表明，在自然循环女性体内雌激素水平会影响灭绝的恐惧记忆的巩固，后来15调节召回24小时。
图4：在女性发情后期雌激素治疗。相比于车辆16前灭绝培训（箭头）雌二醇30分钟总局方便灭绝召回。
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Discussion
恐惧灭绝已被广泛研究在雄性大鼠调处下各种操作识别和评估条件性恐惧灭绝的神经机制。相对而言，很少有研究探讨雌性大鼠或性腺激素的恐惧消退的作用。具体研究雌激素对恐惧消退的影响，自然循环雌性大鼠受到了为期三天的行为范式。这个过程包括习惯/调理，灭绝，灭绝和召回阶段。使用此协议，它已经证明，雌性大鼠低雌激素发情后期阶段表现出较高的冻结（或受损灭绝召回）相比，女性被熄灭在高雌激素发情前期15时训练的灭绝。在发情后期阶段之前灭绝培训雌二醇的管理调控灭绝存储器16的巩固。这表现在freezin下降期间灭绝召回克。总之，这些结果突出显示进行阴研究，注意卵巢激素和行为的发情周期的影响的重要性。虽然对照实验没有被这里描述的，这将是必要的，以包括适当的控制， 即没有消光基团，以进一步评估雌激素对参与消光记忆巩固过程的影响。
此协议的目的有两个方面：1）研究雌激素对条件性恐惧灭绝在发情周期的完整动物的特定阶段的影响，2）检查在女性雌激素如何急性更换是正常的低雌激素状态可调节自己的行为。通过这里所描述的阴道拭子过程中，四个阶段的发情周期的可以被识别：发情，动情后期，发情间期和发情前期。这使我们能够卵巢激素时，苏评估行为CH雌激素是自然在低和高的浓度。例如，雌激素水平低的发情（20-40微克/毫升），动情后期（15-20微克/毫升）中，并动情（25-40微克/毫升）相，但在动情前期期间高（〜75皮克/ ml）的发情周期27,28的阶段。这些阶段，不仅在不同的激素环境，而且在持续时间。虽然可变，动情前期已经典型地观察到持续12至14小时;发情的25〜27小时;动情后期为6至8个小时;和动情的55至57小时。每个阶段的持续时间可长可短于一天（取决于动物），导致5天的周期，包括2天要么发情间期或发情。如上所述，发情前期和发情后期较短相（12-14和6-8小时，分别）并且可以被错过。在这个协议中，它使用动物的自然循环激素检查召回消退训练的能力相间的差异时，仔细监测发情周期，因此关键从前一天。动情周期雌性大鼠，很像人类的月经周期，也是许多外部因素，如年龄，压力，一天中的时间，住房条件，温度等敏感，并且规划实验时，应考虑。动物可能变得无环（扩展发情/发情间期），或前或在研究期间显示的不规则周期（短于4天或超过5天）。在这种情况下，这些动物将被排除在实验分析中，在发情周期的特定阶段被严格测试。重要的是要注意的是过渡阶段期间，将样品混有粘液，使它稍微难以清楚地识别各相所特有的特定细胞类型。这也可能是由于将拭子采取的一天中的时间。如果有粘液样分泌物涂片收集每日擦拭的结果时过量，使数天的处理通过不抽汲可以解决这个问题。
除了这里描述的发情相鉴别方法，其他的方法工具可以被用来获取循环血清卵巢激素浓度的措施。例如，雌激素浓度可以量化使用酶联免疫吸附测定（ELISA）的血液样品中。在此过程中，雌激素的血清/血浆样品绑定到特定的抗雌激素抗体，其被链接到一种酶内。酶的底物产生的反应，结果在一个可见的信号，例如，可以使用分光光度计进行测定的颜色变化。这个工具计算吸光度，并提供在样品中的雌激素水平的定量。这种方法可以在实验期间评估自然横跨发情周期波动的雌二醇水平，以及更重要的是，在特定的时间是有用的。它也可以被用来确定雌激素如何外源性给药可改变模人的生理浓度。从血液中的雌激素浓度的测量可在过渡阶段防止与相鉴别困难时，或者当涂片难以阅读，由于样品中的粘液。不幸的是，这种方法可能会变得非常昂贵，并提供延迟的结果相比，阴道涂片集合。
程序，以获得足够的血液样本， 例如 ，经由尾静脉，眶窦，剪尾，并隐静脉29，可能会造成不必要的压力给动物。这可能会影响激素水平在关键时间，在实验中，导致不准确的或倾斜的测量。使用主干的血液来衡量雌二醇水平是终端，因此提供了有关阶段内荷尔蒙波动非常有限的信息。评估阴道细胞学细胞似乎提供了一个更好的选择。虽然这种方法仅可在整个发情阶段提供的卵巢激素曲线的粗略估计，它可以尽量减少应激和随后较少破坏性的行为实验。
有不同形式的雌激素类固醇的被自然循环在人类和非人类的动物，如雌三醇，雌二醇，雌酮和。在这个协议中，雌二醇是敏锐地通过皮下注射给药。雌二醇（同义词E2，17β-雌二醇或β-雌二醇）用于在这个协议中，因为它是天然存在的雌激素在非怀孕女性30的最有效的形式。而相比之下，雌二醇注射急，其他实验室雇用长期雌激素的管理方法。例如，缓释丸或硅橡胶胶囊皮下植入允许平稳，连续输送的雌激素或载体溶液19。此过程通常用于结合ovariectomies，这消除了动物的自然繁殖的状态。
该manipu这里讨论的办法第十四专注于天然荷尔蒙的状态，方便的实验室检查结果临床应用。个人与创伤后应激障碍（PTSD）通常受损的熄灭的恐惧与他们的惨痛经历一个刺激，并记住这个灭绝的能力。这种情况往往持续很久之后，事件已经过去了。长时间暴露疗法是创伤后应激障碍，依赖于研究在啮齿动物模型中，如这里描述的消光系的处理的通用的治疗选择。有趣的是，女性大约两倍，可能是男性发展的压力和焦虑有关的精神障碍31。在流行这种性别差异可能与恐惧灭绝过程的性别差异和underlies这些化验结果的潜在临床意义。尽管PTSD在女性的发病率较高，相对较少担心在啮齿类动物灭绝的研究，女性已经进行。女性研究重点检查行为的性别差异时，荷兰国际集团对性腺激素的作用不容忽视。表征整个发情周期自然波动的激素水平的行为的影响提供了有价值的洞察男性和女性之间的行为的根本区别。这个协议提供了一个基本的模型，以促进卵巢激素的未来的研究和对影响，但不限于，认知和行为过程，如恐灭绝。这个协议集中在一个特定的性腺激素，雌激素，然而，其它激素如孕酮和睾酮的影响也可以被评估。使用行为范式与其它药理学，细胞和分子生物学技术这里提出结合（ 即 ，局部药物输注，免疫组化，Western印迹），未来的研究可能会认为可能增强行为治疗大脑内确定的雌激素作用的特定网站/目标。
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Disclosures
这个手稿的作者有没有竞争经济利益或其他利益冲突的披露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
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