Abstract
Verval van geconditioneerde vrees is uitgebreid bestudeerd in mannelijke knaagdieren. Onlangs is er een toenemend aantal studies aangeeft dat neurale mechanismen voor bepaalde gedragstaken en respons gedragingen verschillend bij vrouwen en mannen zijn. Met behulp van vrouwen in het onderzoek studies kan een uitdaging vormen vanwege de variatie van geslachtshormonen tijdens hun loopsheid. Dit protocol beschrijft gevestigde procedures die nuttig zijn bij het onderzoek naar de rol van oestrogeen in angst uitsterven geheugen consolidatie in vrouwelijke ratten zijn. Fase van de loopsheid en exogene oestrogenen administratie voorafgaand aan het uitsterven training kan uitsterven recall 24 uur later te beïnvloeden. De vaginale zwabberen techniek voor estrous fase identificatie hier beschreven helpt onderzoek en behandeling van natuurlijk fietsen geslachtshormonen. Het gebruik van deze fundamentele knaagdiermodel kan een nadere afbakening van de mechanismen waarmee oestrogeen angst uitsterven geheugen kan moduleren invrouwtjes.
Introduction
Inherente sekseverschillen zijn in verschillende cognitieve gedrag en leren paradigma's waargenomen in zowel mensen als knaagdieren. Bijvoorbeeld, het is gemeld dat vrouwen over het algemeen sterker verbale en detail-oriented capaciteiten, terwijl mannen beter ruimtelijk inzicht 1-3. Deze sekseverschillen kunnen zijn deels te wijten aan de invloed van geslachtshormonen. Hoge estradiol niveaus te verbeteren de prestaties op taken waarbij vrouwen beter zijn, maar verergeren prestaties op taken die mannen goed 4-6 doen meestal. Hoewel dit bewijs is dwingend, de beperkte mogelijkheid om volledige controle experimentele omgevingen humane studies maakt het moeilijk om te bepalen of deze effecten op het gedrag specifiek kan worden toegeschreven aan hormonen. Dierstudies daarentegen zorgen voor een volledig gecontroleerde omstandigheden.
Hoewel de fundamentele neurale mechanismen van angst uitsterven zijn geïdentificeerd en zijn goed bestudeerd bij mannen, is het onduidelijk ofdeze systemen is hetzelfde bij vrouwen of hoe ze veranderen in de loopsheid. Angst conditionering en uitsterven worden veel gebruikt gedragsproblemen paradigma bij knaagdieren en mensen te onderzoeken die verband houden met angststoornissen te voeren. Aangezien vrouwen een hoger risico voor angststoornissen en hogere symptoomduur en ernst 7-13, is het essentieel om vrouwen in deze studies omvatten. De ondervertegenwoordiging van vrouwen in dit onderzoek kan worden toegeschreven aan de uitdagingen van estrous fase monitoring en boekhouding voor de gedragseffecten van geslachtshormonen. Laboratoria die doen onderzoeken vrouwtjes in dit verband ontmoeting problemen die vaak niet gemeld of zijn niet in de methoden voor hun studie beschreven.
Opkomende bewijs bij knaagdieren suggereert dat sekseverschillen in angst uitsterven worden gemoduleerd door geslachtshormonen 14-18. In angst conditionering worden dieren getraind te vrezen van een bepaalde stimulus. Na een aantal ongewapende presentaties vande stimulus, de dieren leren niet te vrezen dat de cue, een proces genaamd uitsterven. Hoe goed het dier leert en consolideert de herinnering aan het leren van deze taak tijdens een uitsterven recall-test gegeven enige tijd na het uitsterven training kan worden waargenomen. Minder angst expressie tijdens uitsterven recall demonstreert goede uitsterven geheugen consolidatie. Recente bevindingen uit ons laboratorium suggereren dat oestrogeen de consolidatie van angst uitsterven geheugen kan moduleren en te verbeteren uitsterven recall. Specifiek, vrouwelijke ratten die worden gedoofd in proestrus, de fase van de loopsheid waarin circulerende oestrogenen niveaus piek, vertonen verhoogde retentie van uitsterven geheugen. In tegenstelling, vrouwen die worden gedoofd in de lage-oestrogeen metestrus fase scherm relatief slechte uitsterven recall, die kan worden verbeterd met exogene estradiol administratie voorafgaand aan of direct na het uitsterven training 15,16. De neurale mechanismen van uitsterven geheugen consolidatie (inclUding de rol van geslachtshormonen) bij vrouwen zijn niet duidelijk.
Bij proefdieren, kan de rol van hormonen worden onderzocht met behulp van invasieve chirurgische verwijdering procedures, zoals castratie en ovarectomie. Na het herstel van een operatie, geslachtshormonen worden vaak exogeen gemanipuleerd tijdens de uitvoering van een gedrags-taak 19. Deze aanpak heeft cruciale informatie verstrekt over de geslachtshormonen en is nuttig omdat het zorgt voor een goed gecontroleerde manipulaties van geslachtshormonen (in termen van timing en dosering) 20-23. Deze benadering is echter niet de invloed van de natuurlijk voorkomende schommelingen die zich voordoen in de loopsheid noch vormen zij "normale" dieren, zodat de translationele potentieel menselijke studies beperken beoordelen. Het is goed gedocumenteerd dat vrouwelijke geslachtshormoon niveaus piek en daling bij bepaalde fasen van de loopsheid, en oestrogeen receptor expressie veranderingen binnen de cyclus,en na ovariectomie 24. Er is dus behoefte aan studies over vrouwen met intacte geslachtsklieren en verfijnen experimentele ontwerpen om op betrouwbare wijze de studie van de effecten die hoge en lage oestrogeen staten kunnen hebben op vrouwen gedurende hun levensduur.
Dit protocol is gericht op het effect van oestrogeen op de neurobiologische ook die angst uitsterven. Het beschrijft hoe u: 1) zorgvuldig toezien op de loopsheid, 2) bereidt effectieve doses van estradiol voor systemische toediening, en 3) volgen een gedrags-paradigma dat angst conditionering, uitsterven omvat, en op te roepen in natuurlijk fietsen vrouwelijke ratten. Dit protocol kan worden aangepast met andere farmacologische manipulaties en cellulaire en moleculaire tools waarmee studies helpen om beter te begrijpen sekseverschillen die worden waargenomen in geconditioneerde angst uitsterven gedrag. Merk op dat de hieronder beschreven procedures die gebruikt worden in ons laboratorium, en er bestaan een aantal variaties van deze procedures in de literatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures in dit protocol zijn goedgekeurd door de Subcommissie Research Animal Care, die dient als de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) voor het Massachusetts General Hospital, en zijn in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen.
1. Dierlijke Huisvesting en Hanteringprocedure
- Bij aankomst, huis volwassen Sprague Dawley vrouwelijke ratten ongeveer 8-10 weken oud (met een gewicht van 200-225 g) in groepjes van 3-4 inch plastic bakken met houtsnippers beddengoed. Behouden ze op een dieet van ad libitum toegang tot chow en water en een 12 uur licht / donker-cyclus. Laat ratten acclimatiseren huisvesting en dierenverblijf voor minimaal 1 week.
OPMERKING: Alle procedures in dit manuscript worden uitgevoerd gedurende het licht cyclus. - Na deze acclimatisatie periode, omgaan met alle dieren gedurende 5 minuten elk voor 2-3 dagen. Behoorlijk pak de ratten een voor een (gesteund door de romp en niet bij de staart),houd ze stevig, en huisdier hen in deze tijd. Behandel dieren die meer lijken gestrest, springerig, of angstig voor een langere periode van tijd. Doe dit tot een minimum te beperken omgaan met stress, die van invloed kunnen de volgende stappen in dit protocol.
Opmerking: Het aantal dagen tijd behandeling van de dieren kunnen variëren tussen de verschillende laboratoria; Echter, deze moet in overeenstemming zijn tussen de experimenten in hetzelfde lab.
2. Monitoring van de loopsheid: vaginale uitstrijkje Versmering en kleuringsprocedure
- Voeg 0,9% zoutoplossing (natriumchloride opgelost in gedestilleerd water). Bevochtig een wattenstaafje in deze oplossing. Dep de tip met een papieren handdoek om oververzadiging, wat kan leiden tot onvoldoende monstername of verlies van cellen te voorkomen. Houden van de staart naar boven weg van de vaginale opening, breng dan het wattenstaafje in het vaginale kanaal en rollen over de muren om losse vaginale cellen vast te leggen.
- Als het dier plast op het kinderbedton tip, te vervangen door een nieuw exemplaar, zoals urine besmetting het moeilijk voor fase identificatie zal maken. Wees uiterst voorzichtig als naar nood om het dier niet te veroorzaken tijdens deze procedure, omdat de blootstelling aan stress de loopsheid verstoren. Wanneer zwabberen, streven naar een snelle inbrengen en verwijderen die niet te diep als extra stimulatie van de baarmoederhals, die pseudozwangerschap kunnen induceren minimaliseren bereiken.
OPMERKING: pseudozwangerschap kan worden geïdentificeerd als een acyclische loopsheid die doorgaans duurt ongeveer 12 dagen, dwz opeenvolgende dagen van diestrus 25. - Verwijder voorzichtig de applicator tip en rol het uit op een pre-gelabeld microscoop dia. Duw niet te hard als te veel vocht op de dia kunt fase identificatie moeilijk eens droog te maken.
OPMERKING: Een dia kan meerdere dagen bevatten voor elk dier, hoewel dit kan worden gedaan op basis van individuele voorkeuren. - Zorg ervoor dat het monster transfers op de dia. Verzamelen monsters voor several dagen achter elkaar op één dia te kunnen beter bij te houden en te identificeren dagelijkse estrous fasen veranderingen.
OPMERKING: Als het mogelijk is, het is ook ideaal als de mensen monsters hetzelfde blijven voor alle dieren. - Zodra de dia droog is, beginnen de kleuringsprotocol voor fase identificatie. Met behulp van de kleuring kit (zie tabel van Materialen), dompel dia 10 keer in het fixeermiddel (lichtblauw), 10 keer in de beits oplossing (roze), en 5 keer in tegenstreng oplossing (paars). Rinse schuift voorzichtig onder stromend water. Laat dia's volledig aan de lucht drogen voordat u deze bekijkt onder de microscoop.
OPMERKING: De typisch 4-5 dag lang loopsheid bestaat uit (in deze volgorde): oestrus (E), metestrus (M), diestrus (D), en de pro-oestrus (P) 26. Oestrus wordt gekenmerkt door blauw, verhoornde cellen, metestrus door leukocyten en een combinatie van verhoornde en kernhoudende cellen diestrus vergelijkbaar met metestrus in aanwezigheid van celtypen tenzij ze zeer schaars en proestrus door paars gekleurde aggregatenkernhoudende cellen (Figuur 1). Er zijn verschillende kleuringen, naast die hierboven beschreven, dat even effectief voor vaginale uitstrijkje cytologie. - Verzamel monsters gedurende ten minste twee volledige cycli (~ 8-10 dagen) om de fasen nauwkeurig voor experimenten volgen. Wees consistent met de tijd van de dag de monsters worden genomen. Verzamel vaginale uitstrijkjes dagelijks gedurende en tot het einde van het experiment.
3. Pre-exposure
- Voorafgaand aan de start van het experiment, de dieren vooraf bloot te stellen aan de conditionering kamers om de dieren te laten wennen aan de context (conditionering kamers) voordat een gedrags test.
- De vrouwtjes de conditionering kamers (in geluidremmende boxen) met het huis lichten Pre-bloot gedurende 20-30 minuten per dag gedurende 3 dagen vóór het experiment. Wijs de box die vooraf blootgesteld als kamer voor de studie. Grondig schoon thij dozen (muren en trays) tussen de sessies en dieren om geuren te verwijderen omdat ze kunnen invloed op het gedrag en de loopsheid.
4. Dag 1: Gewenning / Fear Conditioning
- Nadat de dieren zijn geverifieerd in de estrus fase van hun oestrische cycli beginnen de gewenning / conditioneringsfase van de 3-daagse experiment.
- Neem pre-tone baselinemetingen bevriezen voorafgaand aan de eerste toon geconditioneerde stimulus (CS) presentaties op elke dag van het experiment. Doe dit door procent invriezen scores (berekend door de seconden immobiel doorgebracht met de duur van de proef, vermenigvuldigd met 100) tijdens de stimulus-afwezige tijdsinterval aan het begin van de eerste CS-alone proces voor de CS begin verwerven.
LET OP: Deze maatregelen kunnen worden gebruikt om te beoordelen en basislijn bevriezing niveau te vergelijken met die in de loop van gewenning, conditionering, uitsterven, en recall. - Om uitsterven training te geven tijdens de metestrus fase,conditioneren van de ratten in hun laatste dag van de bronsttijd. Doekje en identificeren estrous fase (stap 2) elke dag voor het begin van de experimentele protocol (conditionering / uitsterven / recall). Zoals de oestrus fase langer kan duren dan een dag, gebruik cyclus geschiedenis op lengte van de fasen te voorspellen om te bepalen wanneer de dieren zijn klaar om te beginnen met de training.
- Neem pre-tone baselinemetingen bevriezen voorafgaand aan de eerste toon geconditioneerde stimulus (CS) presentaties op elke dag van het experiment. Doe dit door procent invriezen scores (berekend door de seconden immobiel doorgebracht met de duur van de proef, vermenigvuldigd met 100) tijdens de stimulus-afwezige tijdsinterval aan het begin van de eerste CS-alone proces voor de CS begin verwerven.
- In de conditionering kamers, sluit de voet-shock roostervloer om een elektrische stimulatie generator. Gebruik een stimulatie niveau van 0,5-0,6 mA als de ongeconditioneerde stimulus (US). Gebruik een 4 kHz, 80 dB toon als de geconditioneerde stimulus (CS).
OPMERKING: Deze parameters kunnen variëren tussen laboratoria en kan worden aangepast voor optimale conditionering.- Als de bevriezing analyse programma vereist visuele aanwijzingen (in tegenstelling tot tijdelijke), co-activeren van een LED-lamp met de toon. Plaats het licht op de buitenzijde van de operante kamer binnen het videoframe. Aan het begin van elke proef, het activeren van de LED-licht en houdt het branden tot het eind van The trial.
LET OP: Dit licht is niet zichtbaar door het dier en dient alleen als een marker voor de initiatie en het einde van de proef binnen de opgenomen video bestanden (te gebruiken om bevriezing gedrag te meten).
- Als de bevriezing analyse programma vereist visuele aanwijzingen (in tegenstelling tot tijdelijke), co-activeren van een LED-lamp met de toon. Plaats het licht op de buitenzijde van de operante kamer binnen het videoframe. Aan het begin van elke proef, het activeren van de LED-licht en houdt het branden tot het eind van The trial.
- Plaats de dieren in de conditionering kamers voor 5 CS-alone proeven van gewenning. Onmiddellijk na de gewenningssessie, voeren 7 gekoppelde CS-Amerikaanse trials van angst conditionering. Zorg ervoor dat de CS toon duurt 30 seconden en coterminates met de 0,5 sec Amerikaanse shock. Run proeven in alle sessies (gewenning, conditionering, uitsterven, en recall) met een variabele interval tussen gemiddeld 3 minuten.
- Aan het einde van de conditionering sessie terug de dieren naar hun kooien en de dierenverblijf tot de volgende dag.
5. Dag 2: Estradiol Voorbereiding
- Wattenstaafje en identificeren van de estrous fase voor alle dieren die Dag 1 onderging van dit protocol. Bereid estradiol (ook bekend als E2, 17beta-estradiol ofbeta-estradiol) voor een 15 ug / kg subcutane injectie met sesamolie of 0,9% zoutoplossing als drager.
- Om de hoeveelheid oestradiol te berekenen voor te bereiden voor injecties, gebruikt het lichaam gewichten van alle dieren, die werden gemeten en geregistreerd toen ze werden geconditioneerd op dag 1 van dit protocol.
- Berekeningen aan de toegediende hoeveelheid estradiol (dwz 0,2 ml) per rat standaardiseren. Aangezien estradiol is moeilijk oplosbaar vanwege zijn onoplosbaarheid in water en vereist een grote hoeveelheid oplosmiddel voor de kleine dosis Bereid een voorraadoplossing door het mengen estradiol in sesamolie oververhitting tot opgelost. De oplossing kan vervolgens worden geleid door een 0,22 urn filter om verontreinigingen te verwijderen. Voeg bijvoorbeeld een berekende volume van 3000 ug estradiol / 1 ml sesamolie voorraadoplossing de totale benodigde hoeveelheid sesamolie om 15 ug / kg in een 0,2 ml injectie volume per dier bereiken.
OPMERKING: U kunt ook gebruik maken van andere vormen van oestrogeen tha t is water oplosbaar en gemakkelijker te lossen.
6. Dag 2: Estradiol Administratie / Uitsterven Training
- Dien de estradiol subcutaan. Til de losse huid tussen de schouderbladen van de nek in een zachte snuifje en steek de naald in de driehoek die wordt gevormd door de huidplooien.
- 30 minuten na subcutane injecties van estradiol, plaatst u de dieren in de conditionering kamers weer en beginnen uitsterven training. In dit uitsterven sessie, presteren 20 CS-alone proeven, met elke proef bestaande uit een 30 sec, 4 kHz, 80 dB toon, gepresenteerd op een variabele interval tussen gemiddeld 3 min.
OPMERKING: Het effect van estradiol op recall komt voor wanneer estradiol wordt toegediend voorafgaand aan het uitsterven training of onmiddellijk na het uitsterven. Het effect is niet waargenomen 4 uur na het uitsterven, dus het is aangeraden om te injecteren dicht in de tijd naar het begin of het einde van de training 15.
- 24 uur na het uitsterven training, zwabberen de dieren die Dag 1 en 2 van dit protocol afgerond.
- Plaats de dieren in hun toegewezen conditioning kamers (zelfde als dag 1 en 2). Begin het uitsterven recall sessie door de presentatie van 3 CS-alone trials (de drie proeven van uitsterven recall), die bestaat uit slechts 3,80 dB CS-alone studies met intertrial intervallen vergelijkbaar met de 20 trials toegediend voor uitsterven opleiding zoals beschreven in stap 6.2.
- Na voltooiing van de recall-sessie, de terugkeer van de dieren naar hun kooien.
8. Data Analyse
- Verwerven gedrags data door middel van video en analyseren ze met behulp van computersoftware.
LET OP: Het bevriezen scores kunnen ook handmatig worden geteld door een experimentator die blind is voor de behandeling met geneesmiddelen door de timing van het bevriezen van aanvallen tijdens de CS presentatie van elk proces, uitgedrukt als percentage van de bestede tijd bevriezen tijdens de toon. Bevriezing isgedefinieerd door volledige gebrek aan beweging, met uitzondering van de ademhaling tijdens de 30 sec CS-Amerikaanse studies. Bereken procent bevriezing door het verdelen van de seconden besteed bevriezing (immobiel) met 30 seconden (duur van de proef), vermenigvuldigd met 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze angst uitsterven recall-protocol, werd procent vriespunt gemeten als een indicator van angst. Dieren die goed gedoofd en behield de herinnering aan het uitsterven training tentoongesteld lage angst op de laatste dag van de gedrags-testen tijdens uitsterven recall. Mannelijke en vrouwelijke ratten niet significant verschillen in geconditioneerde angst expressie tijdens de conditionering, uitsterven, en herinneren fasen (figuur 2). Echter, een sex verschil wordt duidelijk wanneer de dieren afzonderlijk worden geanalyseerd als hoog- en laag-oestrogeen estrous fase groepen. Vrouwelijke ratten die uitsterven training ondergaan tijdens het laag-oestrogeen metestrus fase van de loopsheid niet de extinctie geheugen op dag 3 als die opgeleid proestrus (figuur 3) oproepen. Deze metestrus vrouwtjes vertonen ook beduidend grotere angst herstel tijdens uitsterven recall (slechte uitsterven geheugen) in vergelijking met mannen. Echter, wanneer metestrus vrouwtjes zijn subcutaan injected met 15 ug / kg dosis estradiol vóór uitsterven leren, wordt de consolidatie van de angst uitsterven geheugen worden versterkt zoals aangetoond door laag vriespunt tijdens extinctie geven (figuur 4). Daarom zijn deze gegevens aan dat geslachtshormonen angst uitsterven recall kan moduleren en bemiddelen ook sekseverschillen in geconditioneerde angst uitsterven gedrag.
Figuur 1: Vertegenwoordiger beelden van celtypes in heel loopsheid fasen (vergroting 20X) Proestrus wordt gekenmerkt door massa's van de ronde, paars-gekleurde kernen epitheelcellen.. Estrus kunnen worden geïdentificeerd door aggregaten van blauw-gekleurd, squameuze verhoornde cellen. Metestrus en diestrus drukken een combinatie van soorten cellen (leukocyten, een kern en verhoornde cellen), maar vertonen minder cellen. Oestrogeengehalte fluctueert gedurende de estrous fasen, Met een piek tijdens proestrus. (Met = metestrus;.. Diest = diestrus;. Proest = proestrus). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Vergelijking tussen mannen en vrouwen over de drie fasen van het experiment Er zijn geen significante sekseverschillen waargenomen in de gewenning (. Hab), airconditioning (. Cond), uitsterven, of herinneren fasen van het experiment 15.
Figuur 3: Behavioral verschillen tussen proestrus (hoog oestrogeen) en metestrus (laag oestrogeen) vrouwtjes Vrouwtjes in de high-oestrogeen proestrus fase o.f de loopsheid vertonen minder angst dan die in lage-oestrogeen metestrus. Deze gegevens suggereren dat de oestrogeenspiegel in natuurlijk fietsen vrouwtjes de consolidatie van angst uitsterven geheugen kan beïnvloeden, modulerende recall 24 uur later 15.
Figuur 4: oestrogeen behandeling metestrus vrouwtjes. Toediening van estradiol 30 min voordat uitsterven training (pijl) faciliteert uitsterven recall in vergelijking met het voertuig 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angst uitsterven is uitgebreid bestudeerd bij mannelijke ratten met de neurale mechanismen bemiddelen geconditioneerde angst uitsterven geïdentificeerd en beoordeeld op basis van diverse manipulaties. Relatief weinig studies hebben vrouwelijke ratten of de rol van geslachtshormonen in angst uitsterven onderzocht. Om specifiek bestuderen de effecten van oestrogeen op angst uitsterven, zijn natuurlijk fietsen vrouwelijke ratten onderworpen aan een driedaagse behavioral paradigma. Deze procedure bestaat uit gewenning / conditionering, uitsterven, en uitsterven recall fasen. Met behulp van dit protocol, is aangetoond dat vrouwelijke ratten getraind met uitsterven tijdens het laag-oestrogeen metestrus fase vertonen hogere bevriezen (of slechtzienden uitsterven recall) dan bij vrouwen die worden gedoofd in high-oestrogeen proestrus 15. Toediening van estradiol voorafgaand aan het uitsterven training tijdens de metestrus fase moduleert de consolidatie van uitsterven geheugen 16. Dit blijkt uit een afname freezing tijdens uitsterven recall. Samen vormen deze resultaten benadrukken het belang van het uitvoeren van vrouwelijke studies met aandacht voor de invloed van de ovariële hormonen en de loopsheid op het gedrag. Hoewel controle experimenten niet hier beschreven, is het noodzakelijk om de juiste controles omvatten, dat wil zeggen geen extinctie groepen, de invloed van oestrogeen op processen van extinctie geheugenconsolidatie verder te evalueren.
Het doel van dit protocol is tweeledig: 1) om de effecten van oestrogeen op de geconditioneerde angst uitsterven tijdens bepaalde fasen van de loopsheid bij intacte dieren te onderzoeken, en 2) te onderzoeken hoe acute estradiol vervangen gedurende het vrouwtje is doorgaans laag oestrogeen staat kan moduleren zijn gedrag. Door de hier beschreven vaginale zwabberen procedure kan de vier fasen van de loopsheid worden geïdentificeerd: oestrus, metestrus, diestrus en proestrus. Dit stelt ons in staat om gedrag te beoordelen wanneer ovariële hormonen such oestrogeen nature bij lage en hoge concentraties. Bijvoorbeeld, oestrogeenniveaus laag tijdens de estrus (20-40 pg / ml), metestrus (15-20 pg / ml), en diestrus (25-40 pg / ml) fasen, maar hoog tijdens de pro-oestrus (~ 75 pg / ml) fase van de loopsheid 27,28. Deze fasen niet alleen verschillen hormonale milieu, maar ook duur. Hoewel variabele, is proestrus is meestal waargenomen voor het laatst voor 12 tot 14 uur; oestrus voor 25 tot 27 uur; metestrus 6 tot 8 uur; en Diestrus voor 55-57 uur. De duur van elke fase kan langer of korter zijn dan een dag (afhankelijk van het dier), waardoor 5-daagse cycli die 2 dagen hetzij diestrus of estrus omvatten. Zoals gezegd, de pro-oestrus en metestrus zijn korter fasen (12-14 en 6-8 uur, respectievelijk) en kan worden gemist. In dit protocol is het daarom van groot belang om zorgvuldig toezicht houden op de loopsheid bij gebruik van natuurlijk fietsen hormonen van het dier om inter-fase verschillen in het vermogen om uitsterven training herinneren onderzoekenvan de dag ervoor. De loopsheid in vrouwelijke ratten, net als de menselijke menstruele cyclus, is ook gevoelig voor verschillende externe factoren, zoals leeftijd, spanning, tijd, behuizing, temperatuur, enz., En moet worden beschouwd bij het plannen experimenten. Een dier kan acyclisch (verlengde oestrus / diestrus) wordt of vertonen een onregelmatige cyclus (korter dan 4 dagen of langer dan 5 dagen) vóór of tijdens de studie. In dit geval zouden deze dieren uit het experimentele analyse uitgesloten, waarbij streng testen tijdens bepaalde fasen van de loopsheid. Belangrijk om op te merken zijn overgang stadia waarin de monsters worden gemengd met slijm, waardoor het een beetje moeilijk is om duidelijk het specifieke celtypen die elke fase karakteriseren. Dit kan ook het gevolg zijn van het tijdstip van de dag het uitstrijkje genomen. Als er een overmatige hoeveelheid slijm-achtige ontlading tijdens uitstrijkje collectie als gevolg van dagelijkse zwabberen, waardoor er verschillende handling dagen te passeren zonder zwabberenkan dit probleem oplossen.
Naast de oestrus fase identificatiemethode hier beschreven, kunnen andere methodieken en instrumenten worden gebruikt om maatregelen van circulerende serum eierstokhormoon verdunningen bereid. Zo kan oestrogeenconcentratie worden gekwantificeerd in bloedmonsters met een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). In deze procedure oestrogenen in de serum / plasma samples binden aan een specifiek anti-oestrogeen-antilichaam, gekoppeld met een enzym. Het enzym substraat produceert een reactie die leidt tot een zichtbare signaal zoals een kleurverandering die kan worden gemeten met een spectrofotometer. Deze tool berekent absorptie en levert een kwantificering van oestrogeenniveaus in het monster. Deze werkwijze is nuttig om natuurlijk fluctuerende estradiol niveaus in de loopsheid, en belangrijker, op bepaalde momenten tijdens het experiment zijn. Het kan ook worden gebruikt om te bepalen hoe de exogene toediening van oestrogeen kan norm veranderenal fysiologische concentraties. Meting van oestrogeen concentraties van bloed kan problemen met fase identificatie te voorkomen dat tijdens de overgang stadia, of wanneer uitstrijkjes zijn moeilijk te lezen vanwege slijm in de monsters. Helaas kan deze methode heel duur geworden en aanbiedingen vertraagde resultaten in vergelijking met vaginale uitstrijkje collectie.
Procedures om voldoende bloedmonsters te verkrijgen, bijv. Via de staart ader, orbitale sinus, staart snip en vena saphena 29, kan onnodige stress veroorzaken bij het dier. Dit kan hormoonspiegels invloed op kritieke momenten in het experiment, wat leidt tot onnauwkeurige of schuin metingen. Met behulp van trunk bloed naar estradiol niveaus te meten is terminal en biedt daarom zeer beperkte informatie over hormonale schommelingen binnen de fasen. Beoordeling vaginale cel cytologie blijkt een beter alternatief bieden. Hoewel deze methode kan alleen een ruwe schatting van de ovariële hormonen profielen tegenover estrous fasen, het kanminimaliseren van stress en is vervolgens minder verstorend voor de gedrags-experiment.
Er zijn verschillende vormen van oestrogene steroïden die van nature circuleren in mensen en niet-menselijke dieren, zoals estriol, oestradiol en oestron. In dit protocol wordt oestradiol acuut toegediend via subcutane injectie. Estradiol (synoniem E2, 17beta-estradiol of beta-estradiol) wordt gebruikt in dit protocol, omdat het de meest krachtige vorm van natuurlijk voorkomende oestrogeen bij niet-zwangere vrouwtjes 30. In tegenstelling tot acute injectie van estradiol, hebben andere laboratoria die methoden chronische oestrogeen toediening. Bijvoorbeeld, onderhuidse implantaten van slow-release pellets of silastische capsules zorgen voor een gelijkmatige, continue levering van oestrogeen of voertuig oplossing 19. Deze procedure wordt gewoonlijk gebruikt in combinatie met ovariectomies die natuurlijke dekking toestand van het dier te elimineren.
De manipuschriften hier besproken richten op natuurlijke hormonale staten om de klinische toepassing van de laboratoriumresultaten te vergemakkelijken. Personen met post-traumatische stress-stoornis (PTSS) worden vaak belemmerd in hun vermogen om angst voor een stimulans in verband met hun traumatische ervaringen te doven en om dit uitsterven te onthouden. Deze toestand aanhoudt vaak lang na het evenement voorbij is. Langdurige blootstelling therapie is een gemeenschappelijke behandeling voor PTSS die berust op extinctie processen bestudeerd in diermodellen zoals hier beschreven. Interessant, vrouwen zijn ongeveer twee keer zoveel kans als mannen om stress en angst-gerelateerde psychiatrische stoornissen 31 te ontwikkelen. Deze sex verschil in prevalentie kan worden gekoppeld aan sekseverschillen in angst uitsterven processen en ligt ten grondslag aan de potentiële klinische betekenis van deze laboratoriumresultaten. Ondanks de hogere prevalentie van PTSS bij vrouwen, relatief weinig te vrezen uitsterven studies bij knaagdieren zijn uitgevoerd bij vrouwen. Vrouwelijke studies richten ziching over de rol van geslachtshormonen moet niet worden vergeten bij het onderzoek van sekseverschillen in gedrag. Karakteriseren van de gedragseffecten van nature fluctuerende hormoonspiegels over de loopsheid geeft waardevol inzicht in de fundamentele verschillen in gedrag tussen mannen en vrouwen. Dit protocol geeft een basismodel toekomstige studies van geslachtshormonen en hun invloed op, maar niet beperkt tot, cognitie en gedrag processen zoals angst extinctie vergemakkelijken. Dit protocol is gericht op een specifieke gonadale hormoon, oestrogeen, maar de effecten van andere hormonen zoals progesteron en testosteron kan ook geëvalueerd worden. Met behulp van de gedrags-paradigma hier samen gepresenteerd met andere farmacologische, cellulaire en moleculaire technieken (dat wil zeggen, gelokaliseerde drug infusies, immunohistochemie, western blot), toekomstig onderzoek kunnen specifieke sites / doelen van oestrogeen actie binnen de hersenen dat gedragstherapie kan vergroten identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs van dit manuscript hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten bekend te maken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , Harvard University: Mind/Brain/Behavior Initiative. (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
