Protocolo para el Estudio de la extinción del miedo condicionado en ratas hembras Naturalmente Ciclismo
Summary
Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.
Abstract
La extinción del miedo condicionado se ha estudiado extensamente en roedores machos. Recientemente, ha habido un creciente número de estudios que indican que los mecanismos neuronales para ciertas tareas de comportamiento y conductas de respuesta son diferentes en mujeres y hombres. Usando a las mujeres en los estudios de investigación puede representar un desafío debido a la variación de las hormonas gonadales durante su ciclo estral. Este protocolo describe procedimientos bien establecidos que son útiles en la investigación del papel de los estrógenos en el miedo consolidación de la memoria extinción en ratas hembras. Fase del ciclo estral y la administración exógena de estrógenos antes de la extinción de formación puede influir en recuerdo de la extinción 24 horas más tarde. La técnica de hisopado vaginal para la identificación de fase estral descrito aquí ayuda al examen y manipulación de ciclismo naturalmente las hormonas gonadales. El uso de este modelo básico de roedores pueden definir con mayor precisión los mecanismos por los que los estrógenos pueden modular la memoria de extinción miedo enhembras.
Introduction
Diferencias sexuales inherentes se observan a través de diversos comportamientos cognitivos y paradigmas de aprendizaje tanto en humanos y roedores. Por ejemplo, se ha informado de que las mujeres tienen en general las habilidades verbales y orientado a los detalles más fuertes, mientras que los hombres tienen mejores habilidades espaciales 1-3. Estas diferencias sexuales pueden deberse en parte a la influencia de las hormonas gonadales. Los niveles altos de estradiol mejorar el rendimiento en las tareas en las que las mujeres son mejores, pero empeoran el rendimiento en tareas que los hombres por lo general hacen bien 4-6. Aunque esta evidencia es convincente, la capacidad limitada para controlar completamente entornos experimentales en estudios humanos hace que sea difícil determinar si estos efectos en el comportamiento pueden ser atribuidos específicamente a las hormonas. Los estudios en animales, en cambio, permiten circunstancias totalmente controladas.
Aunque los mecanismos neurales básicos del miedo extinción han sido identificados y se ha estudiado bien en los machos, no está claro siestos sistemas son los mismos en las hembras o cómo cambian a través del ciclo estral. Condicionamiento del miedo y la extinción son ampliamente utilizados paradigmas conductuales en roedores y humanos para llevar a cabo estudios relacionados con los trastornos de ansiedad. Dado que las mujeres tienen un mayor riesgo de trastornos de ansiedad, así como una mayor duración de los síntomas y la gravedad 7-13, es fundamental para incluir mujeres en estos estudios. La escasa representación de las mujeres en esta investigación se puede atribuir a los desafíos de monitoreo fase estral y contabilización de los efectos en el comportamiento de las hormonas sexuales. Los laboratorios que hacen examinar las hembras en este sentido cuestiones encuentro que muchas veces no se denuncian ni se describen en los métodos para sus estudios.
Nuevas pruebas en roedores sugiere que las diferencias sexuales en el miedo extinción son moduladas por las hormonas gonadales 14-18. En el condicionamiento del miedo, los animales son entrenados para temer un estímulo particular. Después de una serie de presentaciones no reforzadas deel estímulo, los animales aprenden a no temer el momento justo, un proceso llamado extinción. ¿Qué tan bien el animal aprende y refuerza la memoria de aprendizaje de esta tarea se puede observar durante una prueba de recuerdo de la extinción dado algún tiempo después del entrenamiento de extinción. Menos expresión miedo durante la llamada de extinción demuestra una buena consolidación de la memoria extinción. Los resultados recientes de nuestro laboratorio sugieren que los estrógenos pueden modular la consolidación de la memoria de extinción miedo y mejorar recuerdo de la extinción. En concreto, las ratas hembras que se extinguen en proestro, la fase del ciclo estral durante el cual circula máximo los niveles de estrógeno, exhibir una mayor retención de la memoria de extinción. Por el contrario, las mujeres que se extinguen en la pantalla fase metaestro bajo estrógeno relativamente pobre recuerdo de la extinción, que se pueden mejorar con la administración de estradiol exógeno antes o inmediatamente después de la extinción de formación 15,16. Los mecanismos neurales de la consolidación de la memoria de extinción (including el papel de las hormonas gonadales) en las mujeres no están claras.
En animales de laboratorio, el papel de las hormonas puede ser investigada usando procedimientos de eliminación quirúrgicos invasivos tales como la castración y la ovariectomía. Después de la recuperación de la cirugía, las hormonas gonadales a menudo son manipulados de forma exógena durante la realización de una tarea de comportamiento 19. Este enfoque ha proporcionado información crítica acerca de las hormonas sexuales y es útil porque permite manipulaciones bien controlados de hormonas gonadales (en términos de tiempo y de la dosis) 20-23. Este enfoque, sin embargo, no evaluar la influencia de las fluctuaciones de origen natural que se producen en todo el ciclo estral ni representan animales "normales", limitando así el potencial de traslación a los estudios humanos. Ha sido bien documentado que los niveles de hormona sexual femenina pico y el declive en fases específicas del ciclo estral, y cambios en la expresión del receptor de estrógeno dentro del ciclo,y 24 después de la ovariectomía. Por lo tanto, existe la necesidad de llevar a cabo estudios sobre las hembras con gónadas intactas y perfeccionar los diseños experimentales para estudiar de forma fiable los efectos de que los estados de alta y baja de estrógeno pueden tener sobre las mujeres a lo largo de su vida útil.
Este protocolo se centra en el efecto de los estrógenos sobre los sistemas neurobiológicos implicados en el miedo extinción. En él se describe cómo: 1) controlar cuidadosamente el ciclo estral, 2) preparar las dosis efectivas de estradiol para la administración sistémica, y 3) siguen un paradigma de comportamiento que incluye el condicionamiento del miedo, la extinción, y recordar en el ciclismo de forma natural las ratas hembras. Este protocolo se puede modificar con otras manipulaciones farmacológicas y herramientas celulares y moleculares para ayudar a estudios para comprender mejor las diferencias de sexo que se observan en el comportamiento condicionado temer la extinción. Tenga en cuenta que los procedimientos descritos a continuación son los utilizados dentro de nuestro laboratorio, y existen un número de variaciones de estos procedimientos in la literatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extinción miedo ha sido ampliamente estudiado en ratas macho con los mecanismos neurales que median condicionado extinción miedo identificado y evaluado bajo diversas manipulaciones. Relativamente pocos estudios han examinado las ratas hembras o el papel de las hormonas gonadales en el miedo extinción. Para estudiar específicamente los efectos del estrógeno en el miedo extinción, que completan un ciclo natural ratas hembras son sometidos a un paradigma de comportamiento de tres días. Este procedimiento consiste e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
References
- Baron-Cohen, S., Knickmeyer, R. C., Belmonte, M. K. Sex differences in the brain: implications for explaining autism. Science. 310 (5749), 819-823 (2005).
- Voyer, D., Voyer, S., Bryden, M. P. Magnitude of sex differences in spatial abilities: a meta-analysis and consideration of critical variables. Psychological Bulletin. 117 (2), 250-270 (1995).
- Pinker, S., Spelke, E. A Conversation with Steven Pinker and Elizabeth Spelke. The Science of Gender and Science. , (2005).
- Hampson, E. Estrogen-related variations in human spatial and articulatory-motor skills. Psychoneuroendocrinology. 15, 97-111 (1990).
- Hampson, E., Kimura, D. Reciprocal effects of hormonal fluctuations on human motor and perceptual-spatial skills. Behavioral Neuroscience. 102, 456-459 (1988).
- Hampson, E. Variations in sex-related cognitive abilities across the menstrual cycle. Brain and Cognition. 14 (1), 26-43 (1990).
- Kilpatrick, D. G., Resnick, H. S., Milanak, M. E., Miller, M. W., Keyes, K. M., Friedman, M. J. National estimates of exposure to traumatic events and PTSD prevalence using DSM-IV and DSM-5 criteria. Journal of Traumatic Stress. 26 (5), 537-547 (2013).
- Breslau, N. Gender differences in trauma and posttraumatic stress disorder. Journal of Gender-Specific Medicine. 5 (1), 34-40 (2002).
- Frans, O., Rimmo, P. A., Aberg, L., Fredrikson, M. Trauma exposure and post-traumatic stress disorder in the general population. Acta Psychiatrica Scandinavica. 111 (4), 291-299 (2005).
- Breslau, N., Kessler, R. C., Chilcoat, H. D., Schultz, L. R., Davis, G. C., Andreski, P. Trauma and posttraumatic stress disorder in the community: the 1996 Detroit Area Survey of Trauma. Archives of General Psychiatry. 55 (7), 626-632 (1996).
- Seedat, S., Stein, D. J., Carey, P. D. Post-traumatic stress disorder in women: epidemiological and treatment issues. CNS Drugs. 19 (5), 411-427 (2005).
- Holbrook, T. L., Hoyt, D. B., Stein, M. B., Sieber, W. J. Gender differences in long-term posttraumatic stress disorder outcomes after major trauma: women are at higher risk of adverse outcomes than men. Journal of Trauma. 53 (5), 882-888 (2002).
- Labad, J., Menchon, J. M., Alonso, P., Segalas, C., Jimenez, S., Jaurrieta, N., et al. Gender differences in obsessive-compulsive symptom dimensions. Depression and Anxiety. 25 (10), 832-838 (2008).
- Gupta, R. R., Sen, S., Diepenhorst, L. L., Rudick, C. N., Maren, S. Estrogen modulates sexually dimorphic contextual fear conditioning and hippocampal long-term potentiation (LTP) in rats. Brain Research. 888, 356-365 (2001).
- Milad, M. R., Igoe, S. A., Lebron-Milad, K., Novales, J. E. Estrous cycle phase and gonadal hormones influence conditioned fear extinction. Neuroscience. 164 (3), 887-895 (2009).
- Zeidan, M., et al. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats. Biological Psychiatry. 70 (10), 920-927 (2011).
- Lebron-Milad, K., Milad, M. R. Sex differences, gonadal hormones and the fear extinction network: implications for anxiety disorders. Biology of Mood & Anxiety Disorders. 2 (3), (2012).
- Rey, C. D., Lipps, J., Shansky, R. M. Dopamine d1 receptor activation rescues extinction impairments in low-estrogen female rats and induces cortical layer-specific activation changes in prefrontal-amygdala circuits. Neuropsychopharmacology. 39 (5), 1282-1289 (2013).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. , e4013 (2012).
- Markham, J. A., Pych, J. C., Juraska, J. M. Ovarian hormone replacement to aged ovariectomized female rats benefits acquisition of the morris water maze. Hormones & Behavior. 42 (3), 284-293 (2002).
- Markowska, A. L., Savonenko, A. V. Effectiveness of estrogen replacement in restoration of cognitive function after long-term estrogen withdrawal in aging rats. Journal of Neuroscience. 22 (24), 10985-10995 (2002).
- Bredemann, T. M., McMahon, L. L. 17β Estradiol Increases Resilience and Improves Hippocampal Synaptic Function in Helpless Ovariectomized Rats. Psychoneuroendocrinology. 42, 77-88 (2014).
- Grueso, R., et al. Early, but not late onset estrogen replacement therapy prevents oxidative stress and metabolic alterations caused by ovariectomy. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 236-246 (2014).
- Shughrue, P. J., Bushnell, C. D., Dorsa, D. M. Estrogen receptor messenger ribonucleic acid in female rat brain during the estrous cycle: a comparison with ovariectomized females and intact males. Endocrinology. 131 (1), 381-388 (1992).
- Frye, C. A., Erskine, M. S. Influence of time of mating and paced copulation on induction of pseudopregnancy in cyclic female rats. Journal of Reproduction and Fertility. 90 (2), 375-385 (1990).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146, 1650-1673 (2005).
- Westwood, F. R. The female rat reproductive cycle: a practical histological guide to staging. Toxicologic Pathology. 36 (3), 375-384 (2008).
- Hurn, P. D., Macrae, I. M. Estrogen as a Neuroprotectant in Stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 20, 631-652 (2000).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Gillies, G. E., McArthur, S. Estrogen actions in the brain and the basis for differential action in men and women: a case for sex-specific medicines. Pharmacological Reviews. 62 (2), 155-198 (2010).
- Tolin, D. F., Foa, E. B. Sex differences in trauma and posttraumatic stress disorder: a quantitative review of 25 years of research. Psychological Bulletin. 132, 959-992 (2006).
