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Biology

प्लास्मिड वैक्टर की पीढ़ी गिब्सन विधानसभा का उपयोग मानव बढ़ाव फैक्टर-1α प्रमोटर के विनियमन के तहत झंडा टैग प्रोटीन व्यक्त

Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52235
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center

Abstract

गिब्सन विधानसभा (जीए) क्लोनिंग पारंपरिक डीएनए क्लोनिंग तरीकों के लिए एक तेजी से, विश्वसनीय, और लचीला विकल्प प्रदान करता है। हम माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बहिर्जात जीन (mESCs) की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित प्लास्मिड बनाने के लिए जीए इस्तेमाल किया। SV40 या मानव cytomegalovirus के प्रमोटरों के नियंत्रण के तहत बहिर्जात जीनों की अभिव्यक्ति mESCs में अभिकर्मक के बाद जल्दी से कम हो। इस कम अभिव्यक्ति के लिए एक उपाय जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए मानव बढ़ाव कारक-एक अल्फा (hEF1α) प्रमोटर उपयोग करने के लिए है। HEF1α युक्त प्लाज्मिड वैक्टर SV40- या सीएमवी युक्त प्लास्मिड, खासकर उन लोगों के भी युक्त एन टर्मिनल 3xFLAG-टैग के रूप में के रूप में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल hEF1α प्रमोटर के expressional विनियमन के तहत झंडा टैग CstF-64 और CstF-64 उत्परिवर्ती व्यक्त प्लास्मिड बनाने के लिए एक तेजी से विधि है। जीए संभव डीएनए टुकड़े के सिरों ओवरलैपिंग की क्लोनिंग बनाने के लिए डीएनए exonuclease, डीएनए पोलीमरेज़ और डीएनए ligase का एक मिश्रण का उपयोग करता है।हम उपलब्ध था टेम्पलेट DNAs के आधार पर, हम अपने निर्माणों एक भी दृश्य में इकट्ठा किया जा करने के लिए बनाया गया है। हमारे डिजाइन चार डीएनए टुकड़े का इस्तेमाल किया: pcDNA 3.1 वेक्टर रीढ़ की हड्डी, hEF1α प्रमोटर भाग 1 (एक डबल असहाय सिंथेटिक डीएनए टुकड़ा के रूप में खरीदा 3xFLAG टैग निहित है), और या तो CstF-64 या विशिष्ट CstF-64 उत्परिवर्ती hEF1α प्रमोटर भाग 2। इन टुकड़ों के दृश्यों डीएनए टुकड़े पैदा करने के लिए उपयुक्त पीसीआर प्राइमरों डिजाइन करने के लिए एक किताब पीढ़ी के उपकरण पर अपलोड किया गया। पीसीआर के बाद, डीएनए टुकड़े चयनात्मक मार्कर और जीए क्लोनिंग प्रतिक्रिया युक्त वेक्टर इकट्ठा किया गया था के साथ मिलाया गया। व्यक्तिगत तब्दील बैक्टीरियल कालोनियों से प्लास्मिड अलग थे। Plasmids के प्रारंभिक स्क्रीन अनुक्रमण द्वारा पीछा किया, प्रतिबंध पाचन द्वारा किया गया था। अंत में, जीए हमें स्क्रीन और सत्यापन का निर्माण सहित 5 दिनों में जीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित प्लास्मिड बनाने के लिए अनुमति दी।

Introduction

परम्परागत डीएनए क्लोनिंग प्रक्रियाओं को एक साथ डीएनए टुकड़े शामिल होने के लिए डीएनए और डीएनए ligase फोड़ना करने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग पर भरोसा करते हैं। अलग डीएनए टुकड़े युक्त कस्टम अभिव्यक्ति निर्माणों की पीढ़ी के एक और / या एकाधिक प्रतिबंध endonucleases और बंधाव के माध्यम से डीएनए टुकड़े के बाद प्रविष्टि के साथ डीएनए की दरार भी शामिल है कि एक अनुक्रमिक प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया की बड़ी खामी असंभव ब्याज की पूर्ण लंबाई प्रोटीन के सफल डीएनए क्लोनिंग प्रतिपादन (यानी, कई दरार साइटों हो सकता है) डीएनए टुकड़े में से एक के लिए उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइमों की पहचान करना मुश्किल हो सकता है। इसलिए, कस्टम अभिव्यक्ति की पीढ़ी अनुकूलित प्रोटीन-टैग के साथ कुशल सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों की ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के तहत constructs बहुत सावधान डिजाइन की आवश्यकता है। यह भी एक समय और श्रम लेने वाली तकनीक है। हाल ही में, कई रिपोर्टों multip को इकट्ठा करने के तरीके में वर्णितप्रतिबंध के उपयोग के बिना एक या दो कदम प्रतिक्रियाओं दोनों में एक ही समय में एक सतत अनुक्रम में Le अलग सिंथेटिक डीएनए टुकड़े 1-3 एंजाइमों। एक कदम क्लोनिंग प्रतिक्रिया (सभी तैयारी के चरण को छोड़कर), डीएनए exonuclease, डीएनए पोलीमरेज़, डीएनए ligase 2,3 और डीएनए टुकड़े के अतिव्यापी समाप्त होता है (चित्रा 1) का एक मिश्रण के उपयोग पर निर्भर करता है। प्रतिबंध एंजाइमों का कोई फायदा नहीं है, किसी भी आकार और (अत्यधिक दोहराए दृश्यों को छोड़कर) अनुक्रम रचना की डीएनए टुकड़े एक सहज निर्माण में आपस में जुड़े हुए किया जा सकता है। हाल ही में, एक वाणिज्यिक किट (गिब्सन विधानसभा; GA) के एक कदम क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के लिए उपलब्ध हो गया। इस किट अनुकूलित प्रमोटरों और प्रोटीन टैग के साथ एक एकल वेक्टर में किसी भी डीएनए टुकड़े के तेजी से और लागत प्रभावी विधानसभा की अनुमति देता है।

स्तनधारी सेल संस्कृति मॉडल में बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल व्यापक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड अभिव्यक्ति वैक्टर ट्रांसक्रिप्शनल reg के तहत अक्सर होते हैंवायरल cytomegalovirus (सीएमवी) या बंदर का वायरस 40 (SV40) प्रमोटरों की आबादी। ये वायरल प्रमोटरों स्तनधारी सेल संस्कृति आधारित मॉडल के बहुमत में बहिर्जात प्रोटीन की मजबूत क्षणिक अभिव्यक्ति प्रदान करते हैं। हालांकि, stably बहिर्जात प्रोटीन व्यक्त सेल लाइनों की पीढ़ी क्योंकि स्थापना प्रक्रिया 4,5 दौरान सीएमवी या SV40 प्रमोटरों की ट्रांसक्रिप्शनल मुंह बंद करने के अक्सर असफल है। इसके अलावा, SV40 और सीएमवी वायरल प्रमोटरों पर्याप्त ल्य्म्फोइड वंश या भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 6,7 से कोशिकाओं में बहिर्जात प्रोटीन की अभिव्यक्ति का प्रचार नहीं करेंगे। वायरल प्रमोटरों के निहित सीमा का हल मजबूत विधान गैर वायरल प्रमोटरों 8-10 उपयोग करने के लिए है। मानव मूल के एक अच्छी तरह से विशेषता मजबूत विधान गैर वायरल प्रवर्तक (hEF1α राइबोसोम से 11 अमीनोएसिल-टीआरएनए की जीटीपी निर्भर एसोसिएशन के कटैलिसीस में शामिल है) बढ़ाव कारक 1α (hEF1α) प्रमोटर है। हालांकि,hEF1α प्रमोटर युक्त अभिव्यक्ति वैक्टर विशेष रूप से लोगों को भी ब्याज की प्रोटीन के अमीनो टर्मिनल अंत में 3 × झंडा युक्त, प्लास्मिड युक्त वायरल-प्रमोटर के रूप में के रूप में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं।

64,000 मेगावाट दरार उत्तेजना कारक प्रोटीन (CstF-64) प्रतिकृति निर्भर हिस्टोन mRNAs 14,15 सहित सबसे mRNAs 12,13, के 3 'अंत प्रसंस्करण में शामिल है। CstF-64 सब दैहिक ऊतकों 12 में व्यक्त किया है। अपने आरएनए मान्यता आकृति दरार और polyadenylation साइट 16 के बहाव के नवजात टेप पर गुजरात युक्त आरएनए दृश्यों को बांधता है। CstF-64 पूर्व mRNA के लिए के बंधन इस नवजात प्रतिलेख के कुशल endonucleolytic दरार को बढ़ावा देता है।

इधर, एक प्रोटोकॉल डीएनए टुकड़े की पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग करता है वर्णन किया गया है, (रासायनिक सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं शामिल है) एक गिब्सन विधानसभा क्लोनिंग किट 3xFLAG टैग मीटर की कस्टम वैक्टर का उत्पादन करने के लिएouse CstF-64 या उत्परिवर्ती CstF-64 hEF1α प्रमोटर एक की अभिव्यक्ति के तहत अपने अमीनो टर्मिनल अंत करने के लिए।

Protocol

ओवरलैपिंग प्राइमरों के सिलिको प्लाज्मिड के डिजाइन और पीढ़ी में 1.

नोट: इस कदम का उद्देश्य निर्माण की पूरी न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को इकट्ठा करने और प्राइमरों जीए क्लोनिंग के लिए समाप्त हो जाती है ओवरलैपिंग के साथ टुकड़े उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए डिजाइन करने के लिए है।

  1. अंतिम प्लाज्मिड प्रतिनिधित्व करने के लिए एक सतत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम डिजाइन।
  2. प्राप्त या पीसीआर में टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा कि वास्तविक प्लास्मिड और डीएनए टुकड़े की सूची।
    नोट: आसानी से उपलब्ध नहीं हैं कि डीएनए टुकड़े - जैसे टैग और प्रमोटरों के विभिन्न संयोजन के रूप में - एक एकल या एकाधिक सिंथेटिक डबल असहाय डीएनए टुकड़े (sDNA) के रूप में आदेश दिया जा सकता है। इन टुकड़ों को अपेक्षाकृत कम कीमत पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और लंबाई में 2 KB (सामग्री की तालिका देखें) तक हो सकता है।
  3. पीसीआर के लिए उपयुक्त डीएनए टुकड़े में 1.1 चरण में इकट्ठे निर्माण की सतत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम फूट डालो। CONFIRटुकड़े उपलब्ध प्लास्मिड और sDNA टुकड़े से मेल खाने वाले एम। डीएनए NT 200 से अधिक छोटे टुकड़ों से बचें।
  4. प्राइमर पीढ़ी के उपकरण का उपयोग (उपकरण की तालिका देखें)। "सेट वरीयता" मेनू का चयन करें। "बदलें गिब्सन विधानसभा सेटिंग्स" पॉप-अप विंडो में "परिवर्तन वरीयता" टैब पर क्लिक करके उपयुक्त सेटिंग्स का चयन करें।
    नोट: प्रथम डिजाइन भी प्राइमर पीढ़ी के उपकरण के उपयोग के बिना किया जा सकता है। हालांकि, प्राइमर पीढ़ी के उपकरण के उपयोग की प्रक्रिया सरल करता है।
  5. "का निर्माण बनाएँ" मेनू का चयन करके निर्माण निर्माण शुरू करो। अंत '3' करने के लिए 5 से प्राइमर पीढ़ी के उपकरण क्रमिक रूप में विभाजित डीएनए टुकड़े डालें।
    नोट: एक प्लाज्मिड रीढ़ के रूप में इस्तेमाल किया डीएनए टुकड़ा सुविधाजनक स्थान पर दो टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है। अंतिम पीसीआर उत्पाद में पिछले टुकड़ा के अंत 5 'यह पहला टुकड़ा और 3 के अंत' एक सतत डीएन में एक साथ जुड़े हुए हैंवेक्टर रीढ़ की हड्डी का प्रतिनिधित्व एक टुकड़ा।
  6. "वेक्टर या डालने टुकड़ा दर्ज" पॉप-अप विंडो में FASTA प्रारूप में वेक्टर डीएनए (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का एक पाठ आधारित प्रतिनिधित्व) के 5 'के अंत का प्रतिनिधित्व पहले डीएनए टुकड़ा चिपकाएं। डीएनए टुकड़ा नाम। या तो पीसीआर, रे डाइजेस्ट या संश्लेषण के रूप में, डीएनए टुकड़ा प्राप्त करने के लिए उपयुक्त तरीका चुनें। "जारी रखें" टैब पर क्लिक करें।
  7. "विधानसभा के लिए एक डालने टुकड़ा जोड़ें" विंडो में प्रदान की "अग्रेषित या रेव प्राइमर स्पेसर" रिक्त स्थान का उपयोग अंतिम निर्माण के जंक्शन पर अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड / प्रतिबंध साइटों को जोड़ने के लिए एक की जरूरत है। दोनों टुकड़े करने के लिए केवल एक ही डीएनए टुकड़े की और नहीं करने के लिए अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड / प्रतिबंध साइटों जोड़ें। "किया" टैब पर क्लिक करें।
  8. निर्माण पूरा हो गया है जब तक टुकड़े के सभी के लिए दोहराएँ। "देखें प्राइमर" मेनू का चयन करें और प्राइमर दृश्यों की समीक्षा करें।
  9. (वेक्टर ख सभी निर्माणों के लिए दोहराएँackbones और सम्मिलित करता है), या अलग हैं कि डीएनए टुकड़े के लिए।

गर्म प्रारंभ प्रूफरीडिंग डीएनए पोलीमरेज़ का प्रयोग पीसीआर द्वारा डीएनए टुकड़े 2. प्रवर्धन (2x मास्टर मिक्स)

नोट: इस कदम के लिए उद्देश्य पीसीआर का उपयोग विधानसभा प्रतिक्रिया के लिए पर्याप्त डीएनए प्राप्त करने के लिए है।

  1. Desalted उत्पादों के रूप में पिछले चरण में और छोटी संभव पैमाने पर तैयार पीसीआर प्राइमरों खरीदें। पानी या ते में 10 माइक्रोन (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.9, 1 मिमी EDTA) के लिए उन्हें पतला।
  2. SDNA टुकड़े के रूप में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं कि डीएनए टुकड़े खरीदें।
  3. पानी में 1 एनजी / μl को PCRs के लिए टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा कि sDNA टुकड़े सहित सभी डीएनए टुकड़े, पतला।
  4. कमरे के तापमान पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं इकट्ठे। संक्षेप में, प्राइमर जोड़ी के प्रत्येक संबंधित प्राइमर टेम्पलेट डीएनए टुकड़ा, 1 μl (1 एनजी से / μl शेयर समाधान), 25 μ के (10 माइक्रोन शेयर समाधान से) 2.5 μl का उपयोगगर्म शुरू प्रूफरीडिंग डीएनए पोलीमरेज़ के एल और 19 μl पानी (; 2x मास्टर मिश्रण डीएनए पीओएल सामग्री की तालिका देखें)। कोमल flicking द्वारा ट्यूब मिक्स और संक्षिप्त centrifugation द्वारा तरल बूंदों को इकट्ठा।
  5. डीएनए पीओएल के लिए सिफारिशों के अनुसार समान आकार के अलग ट्यूबों डीएनए टुकड़े में एक साथ बढ़ाना। 28 पीसीआर चक्र या पर्याप्त डीएनए उपज है कि उत्पादन चक्रों की संख्या का निर्धारण - 25 प्रदर्शन करते हैं।
  6. Ethidium ब्रोमाइड (0.2 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल अंतिम एकाग्रता) के साथ दाग एक मानक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा (5 μl) का 10% चलाएँ। पीसीआर उत्पाद का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक एकल डीएनए बैंड दिख रहा है कि सुनिश्चित करें। डीएनए आणविक भार मानकों का प्रयोग डीएनए टुकड़े का आकार और रिश्तेदार राशि का निर्धारण करते हैं। यदि आवश्यक हो, डीएनए टुकड़े के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए पीसीआर को दोहराएँ।

पीसीआर उत्पादों की 3. DpnI पाचन

नोट: इस कदम का उद्देश्य DIGE करने के लिए हैबांध + जीवाणु उपभेदों में उगाई डीएनए प्लाज्मिड के लिए होता है, क्योंकि यह ऐसी methylated तभी DpnI प्लास्मिड डीएनए पचाने जाएगा धारा 2 में PCRs से सेंट अवशिष्ट प्लाज्मिड टेम्पलेट डीएनए। प्लास्मिड डीएनए जीए प्रतिक्रिया में एक डीएनए टुकड़ा के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, तो इसलिए, DpnI के साथ इलाज नहीं है।

  1. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर धारा 2 सेते में उत्पादित पीसीआर उत्पादों के 45 μl के लिए DpnI प्रतिबंध एंजाइम के 2 μl जोड़ें। जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर धारा 4 या फ्रीज के साथ आगे बढ़ें।

डीएनए शुद्धि चुंबकीय मोती से अधिक 4. शोधन और डीएनए टुकड़े की एकाग्रता

नोट: इस कदम का उद्देश्य शुद्ध और धारा 2 और 3 अन्य पीसीआर शुद्धि विधियों में प्राप्त पीसीआर उत्पादों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ध्यान केंद्रित करने की है।

  1. कमरे के तापमान को डीएनए शुद्धि चुंबकीय मोतियों संतुलित करना। संक्षिप्त vortexing द्वारा मोती फिर से निलंबित।
  2. PCRs पूर्व पचा वाई स्थानांतरणएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को वें DpnI और प्रत्येक ट्यूब डीएनए शुद्धि चुंबकीय मोतियों की 81 μl जोड़ें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं।
  3. के बारे में 2 मिनट के लिए चुंबकीय कलेक्टर पर ट्यूबों रखें। एक पिपेट का उपयोग कर साफ तरल त्यागें। 30 सेकंड के लिए 80% इथेनॉल के 200 μl के साथ दो बार धोएं।
  4. छर्रों शुष्क करने की अनुमति दें। चुंबकीय कलेक्टर पर तैनात ट्यूबों के साथ, खुले ट्यूबों के ढक्कन रखें।
  5. पुनः निलंबित 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.0 के 10 μl में सूखे मोती। दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। ट्यूब के तल पर तरल इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में स्पिन।
  6. 2 मिनट के लिए चुंबकीय कलेक्टर पर ट्यूबों स्थिति। स्पष्ट समाधान के 10 μl और एक नया पूर्व लेबल ट्यूब में जगह - 8.5 निकालें। यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा डीएनए टुकड़े की एकाग्रता का निर्धारण (उपकरण की तालिका देखें)।

ई में उत्पादों की 5. विधानसभा क्लोनिंग रिएक्शन और परिवर्तन कोलाई

<पी वर्ग = "jove_content"> नोट: डालने की: 1 के अनुपात: वेक्टर और विधानसभा प्रतिक्रिया प्रदर्शन इस कदम के लिए उद्देश्य तीन की गणना करने के लिए है।

  1. चयनात्मक मार्कर ले जाने वेक्टर रीढ़ की हड्डी या डीएनए टुकड़ा का प्रतिनिधित्व डीएनए टुकड़ा के कम से कम 100 एनजी का प्रयोग करें। आवेषण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा कि डीएनए टुकड़े के लिए तीन गुना दाढ़ अतिरिक्त गणना।
  2. प्रत्येक विशेष डालने की जरूरत एनजी में दाढ़-अतिरिक्त कन्वर्ट।
    नोट: गणना करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका (उपकरण की तालिका देखें) एक वेब आधारित अनुप्रयोग का उपयोग करने के लिए है।
  3. एक पीसीआर ट्यूब में डीएनए टुकड़े की गणना की मात्रा में मिलाएं 10 μl के लिए मात्रा समायोजित करें। जीए मास्टर मिश्रण के 10 μl जोड़ें (2x, सामग्री की तालिका देखें)। 6 टुकड़े या एक पीसीआर थर्मल cycler में 2-3 टुकड़े की विधानसभा के लिए 15 मिनट - 4 की विधानसभा के लिए 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं।
  4. सक्षम ई में विधानसभा उत्पाद के परिवर्तन के साथ आगे बढ़ें कोलाई -20 पर उत्पादों फ्रीज याडिग्री सेल्सियस, जब तक की जरूरत।
  5. रासायनिक या विद्युत सक्षम कोशिकाओं के साथ जुडा हुआ है कि परिवर्तन की प्रक्रिया का पालन करें। आमतौर पर, परिवर्तन प्रतिक्रिया प्रति विधानसभा प्रतिक्रिया के 2 μl का उपयोग करें।
  6. परिवर्तन पूरा होने पर, उचित चयनात्मक एंटीबायोटिक के साथ पूरक अगर प्लेटों पर बदल कोशिकाओं में फैल गया।

6. प्लाज्मिड अलगाव, प्रतिबंध एंजाइम पाचन और अनुक्रमण

नोट: इस कदम का उद्देश्य ई से प्लास्मिड डीएनए को अलग-थलग करने के लिए है कोलाई, तो प्रतिबंध पाचन और अनुक्रमण द्वारा निर्माण सत्यापित करने के लिए।

  1. मिनी preps और प्लाज्मिड अलगाव के लिए कई एकल कालोनियों प्रचार। इस्तेमाल की 2-5 मिलीलीटर रातोंरात लेग तरल संस्कृति उचित एंटीबायोटिक के साथ पूरक। प्रयोग किया जाता है कि मिनी प्रस्तुत करने का किट में वर्णित है कि प्रक्रिया का पालन करके इसी प्लास्मिड पृथक।
  2. SPECTRO का उपयोग कर प्राप्त राशि और प्लास्मिड की एकाग्रता का निर्धारणदीप्तिमापी।
  3. एक या कई प्रतिबंध endonucleases शुद्ध plasmids के ~ 0.5 माइक्रोग्राम प्रति के साथ प्रतिबंध पाचन प्रदर्शन करते हैं। डीएनए निर्माणों के लिए पाचन विशेषता के विशिष्ट स्वरूप प्रदान करते हैं कि प्रतिबंध एंजाइमों का प्रयोग करें।
  4. विशिष्ट या मानक प्राइमरों का उपयोग डीएनए अनुक्रमण द्वारा डीएनए क्लोनिंग सफलता की पुष्टि करें। सटीकता के लिए अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण।

Representative Results

पीछा किया गया था कि प्रोटोकॉल के एक कार्यप्रवाह 2A चित्रा में दिखाया गया है। हम CstF-64 और hEF1α प्रमोटर (चित्रा 2B और चित्रा 3) के expressional विनियमन के तहत 3xFLAG-टैग के लिए जुड़े हुए उत्परिवर्ती CstF-64 प्रोटीन क्लोन करने के लिए करना चाहता था। 3xFLAG-टैग के बाद प्लाज्मिड युक्त hEF1α हमें करने के लिए उपलब्ध नहीं था। हालांकि, निम्नलिखित प्लास्मिड उपलब्ध थे: pcDNA 3.1 MYC-उनका (ए; माइकेला Jansen से एक उदार उपहार), hEF1α युक्त प्लाज्मिड (Mladen Yovchev से एक उदार उपहार) और माउस CstF-64 प्लास्मिड 12 (चित्रा 3)। निर्माण (ओं) के लिए पूरा दृश्य न्यूक्लियोटाइड और पाठ संपादन आवेदन (; उपकरण की तालिका देखें चित्रा 3) का उपयोग कर इकट्ठा किया गया था। इसके बाद, अनुक्रम (ओं) उपलब्ध प्लाज्मिड DNAs करने के लिए इसी चार सुविधाजनक टुकड़े (चित्रा 2B, लाल ब्लॉक और चित्रा 3) में विभाजित किया गया था। प्रवर्धन पी, NT 25 की न्यूनतम ओवरलैप के साथ 6 टुकड़े "बदलें गिब्सन विधानसभा सेटिंग्स" पॉप-अप विंडो में स्थापित - rimers 4 की कमी के साथ प्राइमर पीढ़ी के उपकरण (उपकरण की तालिका देखें) का उपयोग कर बनाया गया था। NheI और चना प्रतिबंध साइटों को ठीक से इकट्ठे प्लास्मिड की पहचान करने के प्रयोजन के लिए प्राइमर डिजाइन में शामिल थे। NheI साइट pcDNA 3.1 और hEF1α प्रमोटर के 5 'अंत के बीच प्राइमर अनुक्रम में स्थित है। चना साइट स्टॉप कोडोन CstF-64 और pcDNA 3.1 वेक्टर रीढ़ की (UGA) के बाद स्थित है। HEF1α प्रमोटर, 3xFLAG और CstF-64 या उत्परिवर्ती से मिलकर दोनों एंजाइमों डीएनए टुकड़ा के साथ एक साथ पाचन पर CstF-64 (नीचे देखें और चित्रा 2B) जारी किया जाएगा। प्राइमर छोटी संभव पैमाने में आदेश दिया और desalted थे। 3xFLAG टैग डीएनए टुकड़ा युक्त hEF1α प्रमोटर का दूसरा हिस्सा (490 बीपी, चित्रा 2B, चित्रा 3) एक एकल sDNA टुकड़ा (ओं के रूप में खरीदा गया थासामग्री के ईई तालिका)। विधानसभा प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया डीएनए टुकड़े डीएनए पीओएल (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग परिलक्षित किया गया। HEF1α प्रमोटर भाग 1, hEF1α प्रमोटर भाग 2, पूरी लंबाई और उत्परिवर्ती CstF-64 के डीएनए टुकड़े डीएनए पीओएल के आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के बाद, 28 चक्र (चित्रा -4 ए) के लिए एक अलग नलियों में एक साथ प्रवर्धित गया (सामग्री की तालिका देखें , प्रत्येक चक्र विकृतीकरण के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, annealing के 55 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड, बढ़ाव 72 डिग्री सेल्सियस पर 90 सेकंड) पर 7 सेकंड था। प्रारंभ में, pcDNA 3.1 रीढ़ की हड्डी (72 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए निर्धारित किया गया है, जो बढ़ाव समय, के अपवाद के साथ ऊपर के रूप में एक ही शर्तों का उपयोग) 22 चक्र के लिए परिलक्षित किया गया था। हालांकि, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए उपज एक विधानसभा प्रतिक्रिया (चित्रा -4 ए) में इस्तेमाल किया जा करने के लिए पर्याप्त नहीं था। इसलिए, एक अतिरिक्त प्रवर्धन पर्याप्त डीएनए प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया था।

पीसीआर उत्पादों को प्राप्तएक प्लाज्मिड टेम्पलेट से एड अन्यथा जिसके परिणामस्वरूप विधानसभा प्रतिक्रिया उत्पादों को दूषित होगा और झूठी सकारात्मक दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया कालोनियों का उत्पादन होगा जो प्लास्मिड डीएनए, दूर करने के लिए DpnI प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा जाना चाहिए। इसलिए, पीसीआर उत्पादों cleaves methylated और हेमी-methylated प्लास्मिड डीएनए बांध + ई से अलग जो DpnI प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा गया कोलाई उपभेदों। टेम्पलेट्स methylated या अर्ध-methylated अड्डों को शामिल नहीं करता रासायनिक संश्लेषित डीएनए के बाद से DpnI साथ पच होने की जरूरत नहीं है के रूप में पीसीआर उत्पादों, सिंथेटिक डीएनए टुकड़े का उपयोग कर प्राप्त की।

PcDNA 3.1 वेक्टर रीढ़ की हड्डी के लिए PCRs एक साथ संयुक्त थे प्रोटोकॉल चरण 4 में वर्णित है और इस्तेमाल किया डीएनए शुद्धि चुंबकीय मोतियों की राशि के हिसाब से समायोजित किया गया था के रूप में डीएनए टुकड़े (सामग्री की तालिका देखें) शुद्ध और डीएनए शुद्धि चुंबकीय मोतियों से अधिक ध्यान केंद्रित किया गया। डीएनए उपज निर्धारित किया गया थाएक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (उपकरण की तालिका 1 और तालिका) का उपयोग करते हुए। CstF-64 और उत्परिवर्ती CstF-64 निर्माणों के लिए विधानसभा प्रतिक्रियाओं बर्फ (1 टेबल) पर इकट्ठे हुए थे। "सम्मिलित करता है" के रूप में माना डीएनए टुकड़े के एक 3 गुना दाढ़ अतिरिक्त (1 टेबल, चित्रा 3) का इस्तेमाल किया गया था। मिश्रित डीएनए टुकड़े की अंतिम मात्रा पानी के साथ 10 μl और विधानसभा मास्टर मिश्रण (2x) जोड़ा गया है के 10 μl के लिए निकाला गया था। प्रतिक्रियाओं मिलाया जाता है और 1 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे। सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया भी जीए किट मैनुअल की सिफारिश अनुसार इकट्ठा किया और CstF-64 और उत्परिवर्ती CstF-64 प्रतिक्रियाओं के साथ एक साथ incubated किया गया था। प्रोटोकॉल में सिफारिश के रूप में, विधानसभा प्रतिक्रियाओं में से प्रत्येक के दो μl रासायनिक सक्षम ई में तब्दील हो गया कोलाई विधानसभा क्लोनिंग किट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ की आपूर्ति की। किट में वर्णित के रूप में परिवर्तन किया गया थामैनुअल। सकारात्मक क्लोन एम्पीसिलीन अगर / लेग प्लेटों पर चयन किया गया था। प्रत्येक विधानसभा प्रतिक्रिया प्रति छह कालोनियों बेतरतीब ढंग से प्रचारित किया जा करने के लिए चयन किया गया था। प्लाज्मिड DNAs (सामग्री की तालिका देखें) एक प्लाज्मिड अलगाव मिनी किट का उपयोग कर अलग किया गया था। प्रतिबंध के साथ निर्माणों की सिलिको पाचन NheI और चना 4590 बीपी, CstF-64 और 4590 बीपी के लिए 3032 बीपी के आकार के साथ दो टुकड़ों में हुई एंजाइमों में, उत्परिवर्ती CstF-64 (चित्रा 2B और 4B चित्रा) के लिए 2711 बीपी। प्रतिबंध के साथ पाचन HindIII और चना निम्न आकारों के साथ तीन टुकड़ों में हुई एंजाइमों: (5872 बीपी, 1005 बीपी, और 745 बी पी (CstF-64) और 5872 बीपी, 1005 बीपी, और 424 बी पी उत्परिवर्ती CstF-64, चित्रा 2B और चित्रा 4C)। दरअसल, पृथक plasmids के पाचन की उम्मीद विशेषता पैटर्न (चित्रा 4 बी, सी) का प्रदर्शन किया। ध्यान दें कि CstF-64 उत्परिवर्ती की HindIII और चना साथ पाचन द्वारा उत्पादित 424 बीपी डीएनए टुकड़ाचित्रा 4C पर प्लास्मिड दुर्बलता से अपने छोटे आकार की वजह से सना हुआ है। 6 अलग plasmids के बाहर दो अनुक्रमण के लिए भेजा गया था। हम hEF1α प्रमोटर अनुक्रम, और CstF-64 या उत्परिवर्ती CstF-64 निर्माणों के कुछ हिस्सों कोई विलोपन, सम्मिलन या प्रतिस्थापन है कि वहाँ सत्यापित करने के लिए। हम अत्यधिक इस से उत्पन्न डीएनए निर्माणों या किसी भी पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल का अनुक्रमण सलाह देते हैं। अनुक्रमण प्रत्येक अनुक्रम प्लाज्मिड की एक hEF1α, 3xFLAG-टैग और CstF-64 या उत्परिवर्ती CstF-64 के क्षेत्र में होने की उम्मीद है अनुक्रम कि निहित दिखाया। अन्य plasmids के प्रत्येक इसी डीएनए टुकड़ा के प्रवर्धन के दौरान पेश एक बिंदु उत्परिवर्तन था। माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में CstF -64 युक्त प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति, जंगली प्रकार अभिव्यक्ति 17 के लिए तुलनीय बहिर्जात प्रोटीन की प्रचुर मात्रा में उत्पादन किया।

चित्र 1
गिब्सन विधानसभा तंत्र के 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा। डीएनए टुकड़े सिरों isothermally एक भी निरंतर अनुक्रम में इकट्ठे हुए थे ओवरलैपिंग के साथ। अतिव्यापी पहले धीरे-धीरे निष्क्रिय गर्मी है, जो 5 'exonuclease ने वापस चबाया जाता है समाप्त होता है। नतीजतन, ओवरलैपिंग सिरों के साथ अलग अलग डीएनए टुकड़े isothermally पानी रखना होगा। डीएनए पोलीमरेज़ अंतराल और nicks ligates थर्मास्टाइबल डीएनए ligase में भरना होगा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
प्रोटोकॉल के चित्रा 2 (ए) फ़्लोचार्ट विधानसभा क्लोनिंग के लिए वर्णित है। प्लाज्मिड (बी) के प्रतिनिधित्व, पीजीए-CstF-64 जीए किट का उपयोग कर उत्पन्न लाल - विधानसभा प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया डीएनए टुकड़े:। PcDNA3.1; hEF1α प्रमोटर भाग 1 (hEF1a - 1); hEF1α प्रमोटर भाग 2 (hEF1a - 2) एक कृत्रिम डीएनए के रूप में आदेश दिया; माउस CstF-64 (mCstF-64)। ब्लू - खुला पढ़ने फ्रेम। वायलेट - वायरल और गैर-वायरल प्रमोटरों। ग्रीन -। दरार और polyadenylation क्षेत्रों में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा गिब्सन विधानसभा CstF-64 प्लाज्मिड 3. डिजाइन। ब्लैक बॉक्स सिलिको अनुक्रम में एक भी गिब्सन विधानसभा CstF -64 डिजाइन करने के लिए उपलब्ध थे कि डीएनए टुकड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके बाद, अनुक्रम पीसीआर से परिलक्षित किया गया है जो चार डीएनए टुकड़े, में विभाजित किया गया था। कारण अनुक्रम hEF1α जनसंपर्क के साथ एक साथ एक sDNA के रूप में डिजाइन किया गया था 3xFLAG-टैग के छोटे आकार के लिए ध्यान दें कि omoter भाग दो। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं और प्राप्त plasmids के प्रतिनिधि प्रतिबंध एंजाइम पाचन में इस्तेमाल डीएनए टुकड़े की चित्रा 4. पीसीआर (ए) प्रतिनिधि PCRs गर्म विधानसभा प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया डीएनए टुकड़े के लिए उच्च निष्ठा 2x मास्टर मिश्रण शुरू का उपयोग:। (बी) के प्रतिनिधि hEF1α, पूरी लंबाई CstF-64, pcDNA 3.1 निर्माण (पीजीए-CstF-64) और hEF1α, उत्परिवर्ती CstF-64, pcDNA 3.1 निर्माण (पीजीए-mutCstF-64) NheI और चना के साथ पचा की प्लास्मिड। (सी) बी के रूप में ही प्लास्मिड HindIII और चना एंजाइमों के साथ पच।"_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डीएनए टुकड़े का नाम उम्मीद आकार (बीपी) Concn। (एनजी / μl) पतला (एनजी / μl) μl पतला से जीए CstF-64 में इस्तेमाल किया μl पतला से, जीए mutCstF-64 में इस्तेमाल किया दाढ़ अनुपात (आईएनएस: ग्राम शिक्षा समिति)
pcDNA 3.1 (वेक्टर) 4618 158 undiluted 1 1
hEF1_ प्रमोटर भाग 1 825 213 75 1 1 3: 1
CstF-64 के लिए hEF1_ प्रमोटर भाग 2 516 229 50 1 3: 1
Cstf-64 1796 161 undiluted 1 3: 1
उत्परिवर्ती CstF-64 के लिए hEF1_ प्रमोटर भाग 2 516 199 50 1 3: 1
उत्परिवर्ती CstF-64 1448 201 171 1 3: 1

तालिका 1. चुंबकीय मोती, कमजोर पड़ने पर एकाग्रता के बाद डीएनए टुकड़े की यील्ड और विधानसभा प्रतिक्रियाओं की स्थापना की।

Discussion

जीए क्लोनिंग के सफल प्रयोग हमेशा पूरा निर्माण (चित्रा 2 और चित्रा 3) के एक सावधान डिजाइन से पहले किया जाना चाहिए।

प्राइमर पीढ़ी के उपकरण द्वारा डिजाइन प्राइमर दृश्यों की सावधानी से सत्यापन भी अत्यधिक की सिफारिश की है। जीए के लिए प्राइमर प्राइमर पीढ़ी के उपकरण के उपयोग के बिना उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, उपकरण के उपयोग यह प्रक्रिया सरल है क्योंकि अत्यधिक की सिफारिश है। आम तौर पर, जीए क्लोनिंग के लिए प्राइमर दो कार्यात्मक विभिन्न दृश्यों के लिए होना चाहिए। पहले अनुक्रम डीएनए टुकड़ा-विशिष्ट है, और पीसीआर का उपयोग टुकड़ा का प्रवर्धन की अनुमति देता है। दूसरी अनुक्रम जीए विधानसभा के लिए आवश्यक है जो आसन्न टुकड़ा, साथ ओवरलैप। एक ठेठ डीएनए टुकड़ा-विशिष्ट अनुक्रम लंबाई में 18-22 NT होगा। एक ही डीएनए बढ़ाना इस्तेमाल डीएनए टुकड़ा विशिष्ट दृश्यों इसी तरह पिघलने तापमान और जीसी सामग्री होनी चाहिए। ओवरलैपिंग अनुक्रम होना चाहिए 15 के कम से कमNT कम से कम 48 डिग्री सेल्सियस के तापमान के पिघलने के साथ लंबाई में। अधिक से अधिक 4 डीएनए टुकड़े की विधानसभा में कम से कम 20 NT होने के लिए अतिव्यापी अनुक्रम की आवश्यकता होगी। लंबे समय तक overlaps के अधिक ठीक से इकट्ठे डीएनए टुकड़े में जिसके परिणामस्वरूप annealing की वृद्धि की विशिष्टता की अनुमति देगा। यह विषम दृश्यों उचित डीएनए विधानसभा समझौता हो सकता है, क्योंकि उनके जीसी में या अतिव्यापी दृश्यों को विकसित करने में सामग्री पर टेढ़ी कर रहे हैं कि दृश्यों से बचने के लिए सिफारिश की है।

हम भी किसी भी दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया कालोनियों, एक जीए प्रतिक्रिया में वेक्टर रीढ़ की हड्डी के लिए इसी सिर्फ डीएनए टुकड़ा का उत्पादन नहीं किया जाना चाहिए जो एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने का सुझाव। वैकल्पिक रूप से, "आवेषण" जिसमें डीएनए टुकड़े में से एक भी कोई दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया कालोनियों में परिणाम चाहिए जो जीए प्रतिक्रिया से हटाया जा सकता है। एक compl की विधानसभा में प्रस्तुत करना होगा जो कोई कालोनियों आसन्न डीएनए टुकड़े की ओवरलैपिंग सिरों की कमी हो जाएगा विकसित होगा कारण,ETE प्लाज्मिड।

प्रोटोकॉल में वर्णित में, क्योंकि इस्तेमाल किया डीएनए टुकड़े की संख्या (चित्रा 3) की, NT प्राइमर सेट का इस्तेमाल किया गया उत्पन्न करने के लिए 25 के दृश्यों अतिव्यापी। 6 डीएनए टुकड़े - प्राइमर पीढ़ी के उपकरण वेबसाइट की सिफारिश 4 इकट्ठा करने के लिए कम से कम 20 NT अतिव्यापी दृश्यों का उपयोग करने के लिए है (उपकरण की तालिका देखें)। इसके अलावा, अब डीएनए किस्में के उचित complementation सुनिश्चित करेंगे अनुक्रम ओवरलैपिंग सही रूप में इकट्ठे उत्पादों की संख्या बढ़ रही है (चित्रा 1 देखें)।

वर्तमान में, निर्बाध क्लोनिंग के लिए कई सिस्टम उपलब्ध हैं। हालांकि, इन पद्धतियों में से कुछ अभी भी (यानी, गोल्डन गेट 18 क्लोनिंग) प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करें। दूसरों को एक ही जैविक स्रोत 19 से चेचक वायरस डीएनए पोलीमरेज़ और एकल कतरा डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के आधार पर एंजाइमों के मालिकाना मिश्रणों का उपयोग करें। दोनों प्रणालियों शोर से जीए की तुलना में सीमित कर रहे हैंदृश्यों ओवरलैपिंग के आतंकवाद की लंबाई। छोटे अतिव्यापी दृश्यों समस्याग्रस्त 23 से अधिक डीएनए टुकड़े के समुचित विधानसभा प्रतिपादन आसन्न डीएनए टुकड़े की annealing कदम है, के लिए पर्याप्त विशिष्टता प्रदान नहीं हो सकता है। इन कमियों को जीए प्रणाली में मौजूद नहीं हैं।

(लंबाई में यानी, कम से कम 8 KBP) पीसीआर द्वारा मज़बूती amplifiable आकार से अधिक नहीं इतनी के रूप में परिलक्षित हो डीएनए टुकड़े का आकार भी विचार किया जाना चाहिए। यहां तक ​​कि पिछले 10 साल में डीएनए पीसीआर के समारोह में सुधार के साथ, बड़े डीएनए टुकड़े कम क्षमता और सटीकता के साथ परिलक्षित होगा। यदि आवश्यक हो, बड़ा डीएनए टुकड़े प्लाज्मिड अलगाव और प्रतिबंध एंजाइमों के साथ उचित डीएनए पाचन द्वारा, जैसे पीसीआर के लिए वैकल्पिक अन्य स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है। विशेष रूप से, वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, हमारे पीसीआर उपयोग करने के लिए तर्कसंगत से सभी कम थे जो उपलब्ध डीएनए टुकड़े के आकार के आधार पर किया गया था5 KBP। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा की पहचान की एक से अधिक पीसीआर उत्पाद है, तो वांछनीय टुकड़ा आकार की जेल शुद्धि उपलब्ध आणविक जीव विज्ञान तकनीक या उचित किट के किसी भी उपयोग की सिफारिश की है। वर्तमान प्रोटोकॉल में एक थर्मास्टाइबल डीएनए पोलीमरेज़ (सामग्री की तालिका देखें) किया जाता है। हालांकि उच्च निष्ठा और उपज प्रदान करने के लिए किसी भी डीएनए पोलीमरेज़ इस प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग किया जा करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा। प्रोटोकॉल में वर्णित की तुलना में अलग उच्च निष्ठा डीएनए पीसीआर उपलब्ध हैं, तो संबंधित पुस्तिकाओं में वर्णित के रूप में, की स्थापना की शर्तों का उपयोग करें। वर्तमान प्रोटोकॉल में, रासायनिक सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं जीए किट के साथ आपूर्ति की जाती है कि इस्तेमाल किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, रासायनिक या विद्युत सक्षम ई ऐसे DH5α या DH10B के रूप में कोलाई उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

2x मास्टर मिश्रण क्लोनिंग विधानसभा न्यूनतम हाथों पर समय के साथ प्रयोग करने में आसान है। हालांकि, सटीक pipetting के पूर्वोत्तर क्योंकि छोटे संस्करणों के लिए जरूरी हैeded एक साथ मिलाया जा सके। गुड आणविक जीव विज्ञान तकनीक के रूप में अच्छी तरह से हर समय पर प्रयोग करने की आवश्यकता है।

जीए क्लोनिंग अब आकार में तीन KBP से कर रहे हैं, जो डीएनए टुकड़े, प्लास्मिड और वैक्टर, के निर्माण के लिए असीमित संभावनाएं प्रदान करता है। यह उदाहरण के लिए, संश्लेषण और विधानसभा की अनुमति देता है, क्योंकि इसके अलावा यह एक पूरे जीवाणु (माइकोप्लाज्मा mycoides) जीनोम या एक खमीर (Saccharomyces cerevisiae) गुणसूत्र 20,21, सिंथेटिक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक व्यापक प्रभाव पड़ता है। पारंपरिक क्लोनिंग सहज निर्माणों को उत्पन्न करने की जरूरत के लिए तकनीक भी लागू है।

अंत में, जीए क्लोनिंग पारंपरिक डीएनए क्लोनिंग की प्रक्रिया को तेजी से, विश्वसनीय और लचीला विकल्प प्रदान करता है।

Acknowledgments

हम उदारता से उपलब्ध कराने pcDNA 3.1 MYC-उनका (ए) और hEF1α प्रमोटर युक्त plasmids के लिए, टेक्सास टेक विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र, Lubbock, टेक्सास और Mladen Yovchev पिट्सबर्ग मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में, पिट्सबर्ग में पीए माइकेला Jansen शुक्रिया अदा करना चाहूँगा । इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या (सीसीएम) के R01HD037109 के तहत बाल स्वास्थ्य और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के मानव विकास की Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। अतिरिक्त सहायता महिलाओं के स्वास्थ्य के लिए (सीसीएम और PNG के लिए) लौरा बुश संस्थान से था। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) Integrated DNA Technologies We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.
DNA purification magnetic beads Beckman Coulter A63880 Agencourt AMPure XP - PCR Purification system
Plasmid Isolation Mini Kit Omega Bio-Tek Inc D6942-01 E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I
Gibson Assembly Cloning Kit New England BioLabs E5510S
DNA polymerase New England BioLabs M0494S Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix
DpnI New England BioLabs R0176S
NheI New England BioLabs R3131S
NotI New England BioLabs R3189S
HindIII New England BioLabs R3104S
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop device
EditSeq DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
SeqBuilder DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
Word Microsoft Part of Microsoft Office
NEBuilder New England BioLabs primer generation tool: http://nebuilder.neb.com
NEBioCalculator New England BioLabs ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation

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References

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Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1α Promoter Using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235, doi:10.3791/52235 (2015).

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