Abstract
Ensemble Gibson (GA) clonage offre une alternative rapide, fiable et souple des procédés de clonage d'ADN classiques. Nous avons utilisé pour créer GA plasmides personnalisés pour l'expression de gènes exogènes dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). L'expression des gènes exogènes sous le contrôle de la SV40 ou les promoteurs de cytomégalovirus humain diminue rapidement après transfection dans mESCs. Un remède à cette expression diminuée est d'utiliser le promoteur humain facteur d'élongation 1-alpha (hEF1α) pour diriger l'expression du gène. vecteurs de plasmide contenant hEF1α ne sont pas aussi largement disponible que SV40 ou des plasmides contenant le CMV, en particulier ceux contenant également 3xFLAG-tags N-terminaux. Le protocole décrit ici est une méthode rapide pour créer des plasmides exprimant étiquetée FLAG CstF-64 et CstF-64 mutant en vertu du règlement expressional du promoteur hEF1α. GA utilise un mélange d'exonucléase d'ADN, l'ADN polymérase et d'ADN ligase de faire le clonage du chevauchement des extrémités des fragments d'ADN possibles.Basé sur les ADN de modèle dont nous disposions, nous avons conçu nos constructions pour être assemblés en une seule séquence. Notre conception utilisé quatre fragments d'ADN: pcDNA 3.1 squelette du vecteur, hEF1α promoteur partie 1, hEF1α promoteur partie 2 (qui contenait 3xFLAG-tag acheté comme un fragment d'ADN double brin synthétique), et soit CstF-64 ou spécifique CstF-64 mutant. Les séquences de ces fragments ont été chargés dans un outil de génération primaire pour concevoir des amorces de PCR appropriées pour générer les fragments d'ADN. Après la PCR, les fragments d'ADN ont été mélangés avec le vecteur contenant le marqueur de sélection et la réaction de clonage GA a été assemblé. Les plasmides provenant de colonies bactériennes transformées ont été isolées individuelles. Écran initial des plasmides a été réalisée par digestion de restriction, suivie d'un séquençage. En conclusion, GA a permis de créer des plasmides personnalisées pour l'expression des gènes dans les cinq jours, y compris la construction d'écrans et de la vérification.
Introduction
Les procédures de clonage d'ADN classiques reposent sur l'utilisation d'enzymes de restriction pour cliver l'ADN et l'ADN ligase pour joindre les fragments d'ADN ensemble. Génération de constructions d'expression personnalisées contenant différents fragments d'ADN est un procédé séquentiel qui comprend le clivage de l'ADN avec l'un et / ou plusieurs endonucléases de restriction et l'insertion ultérieure des fragments d'ADN par ligature. L'inconvénient majeur de cette procédure est que les enzymes de restriction appropriées pour l'un des fragments d'ADN peuvent être difficiles à identifier (ce est à dire, pourrait avoir plusieurs sites de clivage) rendu succès le clonage d'ADN de la protéine pleine longueur d'intérêt impossible. Par conséquent, la génération d'expression personnalisée construit sous la régulation transcriptionnelle des promoteurs spécifiques de type cellulaires efficace avec protéines-tags personnalisés nécessite une conception très prudent. Ce est aussi une technique de temps et intensité de travail. Récemment, plusieurs rapports ont décrit des méthodes pour assembler multipLe différents fragments d'ADN synthétique en une séquence continue à la fois dans les réactions soit à un ou à deux étapes sans l'utilisation d'enzymes de restriction 3.1. La réaction de clonage en une étape (à l'exclusion toutes les étapes de préparation), dépend de l'utilisation d'un mélange d'exonucléase de l'ADN, de l'ADN polymerase, l'ADN ligase de 2,3 et les extrémités de fragments d'ADN (Figure 1). Comme il n'y a pas d'utilisation d'enzymes de restriction, les fragments d'ADN de ne importe quelle taille et la composition de la séquence (à l'exclusion des séquences hautement répétitives) peuvent être fusionnés ensemble dans une construction sans couture. Récemment, un kit commercial (d'assemblage Gibson; GA) pour les réactions de clonage en une seule étape est devenu disponible. Ce kit permet un montage rapide et efficace et le coût de tous les fragments d'ADN dans un vecteur unique avec les promoteurs et les étiquettes personnalisées de protéines.
Les vecteurs d'expression plasmidiques disponibles largement utilisés pour exprimer des protéines exogènes dans les modèles de culture de cellules de mammifères sont souvent sous la reg transcriptionnelleulation viral du cytomegalovirus (CMV) ou le virus 40 SV40 (Simian promoteurs). Ces promoteurs viraux fournissent robuste expression transitoire des protéines exogènes dans la majorité des modèles fondés sur la culture de cellules de mammifères. Toutefois, la génération de lignées cellulaires exprimant de manière stable les protéines exogènes est souvent infructueux à cause de silençage transcriptionnel du CMV ou des promoteurs de SV40 de 4,5 au cours de la procédure d'établissement. En outre, les viral de SV40 et les promoteurs de CMV ne favorisent pas suffisamment l'expression de protéines exogènes dans des cellules de la lignée lymphoïde ou des cellules souches embryonnaires 6,7. La solution à la limitation inhérente de promoteurs viraux est d'utiliser des promoteurs forts non viraux constitutifs 8-10. Un fort bien caractérisé promoteur non viral d'origine humaine constitutif est le promoteur du facteur d'élongation 1α (hEF1α) (hEF1α est impliqué dans la catalyse de l'association de GTP-dépendante de l'aminoacyl-ARNt aux ribosomes 11). Cependant,des vecteurs d'expression contenant le promoteur hEF1α ne sont pas aussi largement que le promoteur viral contenant des plasmides, en particulier ceux contenant également 3 × FLAG à l'extrémité amino-terminale de la protéine d'intérêt.
La protéine de facteur de stimulation de clivage de 64 000 MW (PNC-64) est engagé dans l'extrémité 3 'de la plupart des ARNm traitement, y compris des histones 12,13 ARNm de réplication dépendant 14,15. CstF-64 est exprimée dans tous les tissus somatiques 12. Son motif de reconnaissance d'ARN se lie à GU riches en séquences d'ARN sur transcrits naissants en aval du site de clivage et une polyadénylation 16. Cette liaison de CstF-64 au pré-ARNm efficace favorise le clivage endonucléolytique de la transcription naissante.
Ici, un protocole est décrit qui utilise l'amplification par PCR de fragments d'ADN, un kit de clonage Gibson ensemble (qui comprend des cellules bactériennes chimiquement compétentes) pour produire des vecteurs de mesure m 3xFLAG marquésouse CstF-64 ou un mutant CstF-64 à leur extrémité amino-terminale sous l'expression d'une hEF1α promoteur.
Protocol
1. In Silico conception du plasmide et génération des amorces chevauchement
NOTE: L'objectif de cette étape est d'assembler séquence nucléotidique complète de la construction et de concevoir les amorces pour être utilisés pour générer des fragments avec des extrémités chevauchantes pour GA clonage.
- Concevoir une séquence nucléotidique continue de représenter le plasmide final.
- Obtenir ou lister les plasmides réels et des fragments d'ADN qui seront utilisés comme modèles dans PCR.
REMARQUE: fragments d'ADN qui ne sont pas facilement disponibles - comme combinaison différente de tags et promoteurs - peuvent être commandés en une seule ou plusieurs fragments d'ADN double brin synthétiques (SDNA). Ces fragments sont disponibles dans le commerce à un coût relativement faible et peut être jusqu'à 2 kb de longueur (voir le tableau des matériaux). - Diviser la séquence nucléotidique continue de la construction assemblés à l'étape 1.1 en fragments appropriés d'ADN pour la PCR. Confirm que les fragments correspondent plasmides disponibles et fragments SDNA. Évitez fragments d'ADN inférieure à 200 nt.
- Accéder à l'outil de production primaire (voir le tableau de l'équipement). Sélectionnez le menu "Définir les préférences". Choisir les réglages appropriés en cliquant sur l'onglet "PREFS de changement» dans la fenêtre pop-up "Modifier les paramètres de l'Assemblée Gibson".
REMARQUE: la conception d'amorce peut également être effectuée sans l'utilisation de l'outil de génération d'amorce. Cependant, l'utilisation de l'outil de génération amorce simplifie le processus. - Commencer à construire la construction en sélectionnant le menu "Build Construct". Insérer les fragments d'ADN fractionnés dans l'amorce de manière séquentielle de l'outil de génération de 5 'vers l'extrémité 3'.
NOTE: Le fragment d'ADN utilisé comme squelette de plasmide peut être commodément divisée en deux morceaux. Dans le produit final de PCR extrémité de ce premier fragment et l'extrémité 3 'de la 5 fin du dernier fragment sont liés ensemble dans une DN continuUn fragment représentant le squelette du vecteur. - Collez le premier fragment d'ADN représentant l'extrémité 5 'de l'ADN de vecteur dans FASTA (une représentation textuelle de la séquence nucléotidique) dans la fenêtre "Entrée Vector ou Insérer Fragment" pop-up. Nommez le fragment d'ADN. Choisissez la façon appropriée d'obtenir le fragment d'ADN, soit que la PCR, RE Digest ou de synthèse. Cliquez sur l'onglet "CONTINUER".
- Se il est nécessaire d'ajouter des nucléotides supplémentaires / sites de restriction à la jonction de la construction finale utiliser les espaces "d'écartement FWD ou Rev amorce" prévues dans le "Ajouter un fragment d'insertion à l'Assemblée" fenêtre. Ajouter nucleotides appoint / sites de restriction à un seul des fragments d'ADN et des fragments de ne pas les deux. Cliquez sur l'onglet "DONE".
- Répéter pour tous les fragments jusqu'à ce que le produit d'assemblage est terminée. Sélectionnez le menu "View amorces» et examiner les séquences d'amorces.
- Répétez l'opération pour toutes les constructions (vecteur backbones et des inserts), ou de fragments d'ADN qui sont différents.
2. Amplification des fragments d'ADN par PCR en utilisant Hot Start Relecture ADN polymérase (2x Master Mix)
NOTE: L'objectif de cette étape est d'obtenir suffisamment d'ADN pour la réaction d'assemblage par PCR.
- Achetez les amorces PCR conçues à l'étape précédente en tant que produits dessalée et à la plus petite échelle possible. Diluer à leur 10 pM dans de l'eau ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, EDTA 1 mM).
- Achetez des fragments d'ADN qui ne sont pas facilement disponibles sous forme de fragments SDNA.
- Diluer tous les fragments d'ADN, y compris les fragments SDNA qui seront utilisés comme modèles pour les PCR à 1 ng / ul dans l'eau.
- Assembler les réactions de PCR à la température ambiante. En bref, utiliser 2,5 pi (de 10 uM solution mère) du chaque amorce respective de la paire d'amorces, une pi (de 1 ng ul solution / d'achat d'actions) du fragment d'ADN matrice, 25 μl d'eau chaude l'ADN polymérase début de relecture (ADN pol; 2x mélange maître; voir le tableau des matériaux) et 19 pi d'eau. Mélanger le tube en tapotant doucement et de recueillir les gouttelettes de liquide par une brève centrifugation.
- Amplifier simultanément dans des tubes séparés des fragments d'ADN de taille similaire selon les recommandations pour la pol de l'ADN. Effectuer 25 à 28 cycles de PCR ou de déterminer le nombre de cycles qui produisent le rendement en ADN suffisante.
- Run 10% du volume de réaction PCR (5 ul) sur une électrophorèse sur gel d'agarose coloré au niveau du bromure d'éthidium (0,2 ug / ml de concentration finale). Assurez-vous que d'une seule bande d'ADN représentant le produit de la PCR est visible. Déterminer la taille et la quantité relative des fragments d'ADN en utilisant des normes d'ADN de poids moléculaire. Si nécessaire, répéter la PCR pour obtenir une quantité suffisante de fragments d'ADN.
3. Dpnl digestion des produits de PCR
NOTE: L'objectif de cette étape est de Diger plasmide ADN résiduel modèle de RAP dans la section 2. Dpnl digère l'ADN de plasmide que si elle est méthylée, comme cela se produit à l'ADN plasmidique barrage + cultivées dans des souches bactériennes. Par conséquent, ne pas traiter avec Dpnl si l'ADN plasmidique sera utilisé comme un fragment d'ADN dans la réaction GA.
- Ajouter 2 ul d'enzyme de restriction Dpnl à 45 ul des produits de PCR obtenus dans la Section 2. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Procéder à l'article 4 ou gel à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
4. purification et la concentration des fragments d'ADN au cours de purification d'ADN Magnetic Beads
NOTE: L'objectif de cette étape est de purifier et de concentrer les produits de PCR obtenus dans les sections 2 et 3. D'autres procédés de purification de PCR peuvent être utilisées aussi bien.
- Equilibrer les billes magnétiques de purification de l'ADN à la température ambiante. Remettre en suspension les billes par vortex brève.
- Transférez les PCR wi pré-digérée Dpnl à un des tubes de 1,5 ml et ajouter 81 ul de billes magnétiques de purification de l'ADN dans chaque tube. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 min.
- Placer les tubes sur le collecteur magnétique pendant environ 2 min. Jeter le liquide clair à l'aide d'une pipette. Laver deux fois avec 200 ul d'éthanol à 80% pendant 30 secondes.
- Laisser les boulettes de sécher. Gardez le couvercle des tubes ouverte, avec les tubes positionnés sur le collecteur magnétique.
- Remettre en suspension les billes séchées dans 10 pl de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger brièvement pour collecter le liquide au fond des tubes.
- Placer les tubes sur le collecteur magnétique pendant 2 min. Retirer de 8,5 à 10 pi de la solution claire et le placer dans un nouveau tube pré-étiquetés. Déterminer la concentration des fragments d'ADN par spectroscopie UV (voir le tableau de l'équipement).
5. Réaction Assemblée clonage et la transformation des produits en E. coli
<p class = "jove_content"> NOTE: L'objectif de cette étape est de calculer rapport 3: 1 de l'insert: vecteur et effectuer la réaction d'assemblage.- Utilisation d'au moins 100 ng de fragment d'ADN représentant le squelette du vecteur ou fragment d'ADN portant le marqueur sélectif. Calculer l'excès molaire de 3 fois pour les fragments d'ADN qui seront utilisés comme inserts.
- Convertir la molaire en excès en ng nécessaire de chaque insert particulier.
REMARQUE: Un moyen pratique pour faire les calculs est d'utiliser une application basée sur le Web (voir le tableau de l'équipement). - Mélanger des quantités calculées de fragments d'ADN dans un tube PCR, ajuster le volume à 10 pi. Ajouter 10 pi de mélange maître GA (2x, voir le tableau des matériaux). Incuber la réaction à 50 ° C pendant 1 heure pour l'assemblage de quatre à six fragments ou 15 min pour l'assemblage de deux à trois fragments dans un cycleur thermique de PCR.
- Procéder à la transformation du produit d'assemblage dans E. compétente coli ou geler les produits à -20° C, jusqu'à ce que nécessaire.
- Suivez la procédure de transformation qui accompagne l'électro cellules compétentes ou chimique. Habituellement, en utilisant 2 ul de la réaction d'assemblage par réaction de transformation.
- Après la transformation est complète, étaler les cellules transformées sur des plaques agar supplémenté avec l'antibiotique sélectif approprié.
6. plasmide isolement, digestion enzymatique et séquençage
NOTE: L'objectif de cette étape est d'isoler l'ADN plasmidique à partir de E. coli, puis de vérifier le produit d'assemblage par digestion de restriction et séquençage.
- Propager plusieurs colonies simples pour minipreps et l'isolement de plasmide. Culture liquide LB nuit utilisation de 2-5 complétée par antibiotique approprié. Isoler les plasmides correspondant en suivant la procédure qui est décrite dans le mini kit de préparation qui est utilisé.
- Déterminer la quantité et la concentration des plasmides obtenus en utilisant spectrophotomètre.
- Effectuer restriction digestion avec une ou plusieurs endonucléases de restriction à ~ 0,5 pg des plasmides purifiés. Utilisation d'enzymes de restriction qui fournissent motif distinct de digestion caractéristique pour les constructions d'ADN.
- Confirmer clonage d'ADN succès par séquençage d'ADN en utilisant des amorces spécifiques ou standard. Analyser les données de séquençage pour la précision.
Representative Results
Un flux de travail du protocole qui a été suivie est illustrée à la figure 2A. Nous voulions cloner CstF-64 et mutantes CstF-64 protéines fusionnées à 3xFLAG-tag en vertu du règlement expressional du promoteur hEF1α (figure 2B et la figure 3). Un hEF1α de plasmide contenant suivie par 3xFLAG-tag ne était pas disponible pour nous. Cependant, les plasmides suivants étaient disponibles: pcDNA 3.1 myc-His (A; un don généreux de Michaela Jansen), hEF1α contenant le plasmide (un don généreux de Mladen Yovchev) et de la souris CstF-64 plasmides 12 (Figure 3). La séquence entière pour la construction (s) a été assemblé en utilisant les applications nucléotides et l'édition de texte (Figure 3; voir le tableau de l'équipement). Par la suite, la séquence (s) a été divisée en quatre morceaux commodes (Figure 2B, les blocs rouges et la figure 3) correspondant aux ADN plasmidiques disponibles. Amplification primers ont été conçus en utilisant l'outil de génération amorce (voir le tableau de l'équipement) avec des contraintes de 4-6 fragments avec un chevauchement minimal de 25 nt, mis en place dans la fenêtre pop-up "Modifier les paramètres de l'Assemblée Gibson". Les sites de restriction Nhel et Notl ont été inclus dans la conception d'amorce dans le but d'identifier les plasmides correctement assemblés. Site Nhel est situé dans la séquence entre amorces pcDNA 3.1 et l'extrémité 5 'du promoteur hEF1α. Le site Notl est situé après le codon d'arrêt (UGA) de CstF-64 et pcDNA 3.1 squelette du vecteur. Lors de la digestion simultanée avec les deux enzymes fragment d'ADN consistant en hEF1α promoteur, 3xFLAG et CstF-64 ou mutant CstF-64 sera publié (voir ci-dessous et la figure 2B). Amorces ont été commandés en la plus petite échelle possible et dessalés. La deuxième partie du promoteur hEF1α fragment d'ADN contenant 3xFLAG-tag (490 pb, figure 2B, figure 3) a été acheté comme un fragment SDNA seule (see Table des matières). Les fragments d'ADN utilisés dans la réaction d'assemblage ont été amplifiés en utilisant l'ADN pol (voir le tableau des matériaux). fragments d'ADN de hEF1α promoteur partie 1, hEF1α promoteur partie 2, pleine longueur et mutant CstF-64 ont été amplifiés simultanément dans un des tubes séparés pendant 28 cycles (figure 4A), suivant les recommandations du fournisseur de la pol de l'ADN (voir le tableau des matériaux , pour chaque dénaturation du cycle était de 7 sec à 98 ° C, recuit 45 sec à 55 ° C, l'allongement de 90 sec à 72 ° C). Initialement, le squelette pcDNA 3.1 a été amplifié pendant 22 cycles (en utilisant les mêmes conditions que ci-dessus à l'exception du temps d'élongation, qui a été fixé à 3 min à 72 ° C). Cependant, le rendement d'ADN résultant était pas suffisant pour être utilisé dans une réaction d'assemblage (figure 4A). Par conséquent, une amplification supplémentaire a été effectuée pour obtenir suffisamment d'ADN.
Obtenir des produits de PCRed partir d'une matrice plasmidique doit être digéré avec l'enzyme de restriction Dpnl pour éliminer l'ADN plasmidique, qui autrement contaminer les produits de réaction résultant de l'assemblage et qui va produire des colonies bactériennes résistantes aux médicaments faux positifs. Par conséquent, les produits de PCR ont été digérés par enzyme de restriction Dpnl, qui clive l'ADN plasmidique méthylé et hémi-méthylé isolé de barrage + E. souches coli. Les produits de PCR obtenus en utilisant des fragments d'ADN synthétiques, en tant que modèles ne ont pas besoin d'être digéré avec Dpnl depuis ADN synthétisé par voie chimique ne contient pas de bases méthylées ou hémi-méthylé.
Les fragments d'ADN ont été purifiés et concentrés sur des billes magnétiques de purification de l'ADN (voir le tableau des matériaux) comme décrit dans l'étape de protocole 4. Les PCR pour le pcDNA 3.1 squelette du vecteur ont été combinés ensemble et la quantité de billes magnétiques de purification d'ADN utilisée a été ajustée en conséquence. Le rendement en ADN a été déterminéeà l'aide d'un spectrophotomètre (tableau 1 et le tableau de l'équipement). réactions de montage pour CstF-64 et mutantes CstF-64 constructions ont été assemblés sur la glace (Tableau 1). Un excès molaire de 3 fois des fragments d'ADN considérées comme "inserts" a été utilisé (tableau 1, figure 3). Le volume final des mélanges de fragments d'ADN a été ajusté à 10 ul avec de l'eau et 10 ul de mélange maître d'assemblage (2x) a été ajouté. Les réactions ont été mélangés et incubés à 50 ° C pendant 1 heure. Réaction du contrôle positif a également été assemblé selon la recommandation du manuel de kit GA et incubé simultanément avec les CstF-64 et mutantes CstF-64 réactions. Tel que recommandé dans le protocole, 2 pl de la chacune des réactions d'assemblage ont été transformées dans le E. chimiquement compétente coli fourni avec le kit de clonage Assemblée (voir le tableau des matériaux). La transformation a été effectuée comme décrit dans le kitmanuel. Les clones positifs ont été sélectionnés sur des plaques de gélose à l'ampicilline / LB. 6 colonies par chaque réaction d'assemblage ont été choisis au hasard pour se propager. Les ADN plasmidiques ont été isolés en utilisant un mini kit d'isolement de plasmide (voir le tableau des matériaux). Dans silico digestion des produits d'assemblage avec les enzymes de restriction Nhel et Notl ont donné lieu à deux fragments avec des tailles de 4590 pb, 3032 pb pour CstF-64 et 4590 pb, 2711 bp pour CstF-64 mutant (figure 2B et la figure 4B). La digestion avec les enzymes de restriction HindIII et Notl ont donné lieu à trois fragments ayant les tailles suivantes: 5872 pb, 1005 pb et 745 pb (PNC-64) et 5872 pb, 1005 pb et 424 pb (mutant CstF-64, Figure 2B et Figure 4C). En effet, la digestion des plasmides isolés affiche les motifs caractéristiques attendues (figure 4B, C). On notera que le fragment d'ADN de 424 pb produit par digestion avec HindIII et Notl du CstF-64 mutantplasmides sur la figure 4C est faiblement colorés en raison de sa petite taille. 2 sur les 6 plasmides isolés ont été envoyés pour le séquençage. Nous avons séquencé le promoteur hEF1α et CstF-64 ou mutant CstF-64 parties des constructions afin de vérifier qu'il n'y a pas des suppressions, des insertions ou des substitutions. Nous recommandons vivement le séquençage des constructions d'ADN résultant de cette ou tout protocole basé sur la PCR. Le séquençage a montré que une séquence de chaque plasmide contenait la séquence attendue dans la zone de hEF1α, 3xFLAG-tag et CstF-64 ou un mutant CstF-64. Chacun des autres plasmides avaient un point de mutation introduite lors de l'amplification du fragment d'ADN correspondant. Expression du plasmide contenant CstF-64 dans les cellules souches embryonnaires de souris, a produit quantité abondante de protéine exogène comparable à l'expression de type sauvage 17.
Figure 1. Représentation schématique du mécanisme Assemblée Gibson. Les fragments d'ADN avec des extrémités chevauchantes ont été assemblées de manière isotherme dans une seule séquence continue. Le chevauchement premières extrémités sont mâchés retour par 5 'exonucléase, qui est la chaleur progressivement inactivé. Par conséquent, différents fragments d'ADN avec des extrémités qui se chevauchent se hybrider de manière isotherme. ADN polymérase sera de combler les lacunes et d'ADN ligase thermostable ligats les entailles. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. (A) Diagramme de flux du protocole décrit pour le clonage assemblage. (B) Représentation du plasmide, pGA-CstF-64 généré en utilisant un kit GA rouges - fragments d'ADN utilisés dans la réaction d'assemblage:. PcDNA3,1; hEF1α promoteur partie 1 (hEF1a - 1); hEF1α promoteur partie 2 (hEF1a - 2) ordonné comme un ADN synthétique; souris CstF-64 (mCstF-64). Bleu - cadres de lecture ouverts. Violet - promoteurs viraux et non viraux. Vertes -. Régions de clivage et de polyadénylation Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Conception de l'assemblage Gibson CstF-64 plasmide. Boîtes noires représentent les fragments d'ADN qui étaient disponibles pour concevoir un seul ensemble Gibson CstF-64 dans la séquence de silico. Par la suite, la séquence est divisée en quatre morceaux d'ADN qui ont été amplifiés par PCR. Notez qu'en raison de la petite taille de la 3xFLAG-tag la séquence a été conçu comme un SDNA avec le pr hEF1α omoter partie 2. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. PCR des fragments d'ADN utilisés dans les réactions de clonage et représentant la digestion d'enzyme de restriction des plasmides obtenus (A) PCR représentatifs utilisant démarrage à chaud haute fidélité 2x master mix pour les fragments d'ADN utilisés dans les réactions d'assemblage:. (B) représentant plasmides de hEF1α, pleine longueur CstF-64, pcDNA 3.1 construction (PGA-CstF-64) et hEF1α, mutant CstF-64, pcDNA 3.1 construction (PGA-mutCstF-64) digéré avec Nhel et Notl. (C) les mêmes plasmides comme dans B digérés par les enzymes HindIII et Notl."_blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nom de fragments d'ADN | La taille attendue (pb) | CONCN. (Ng / ul) | Dilué à (ng / ul) | ul utilisé dans CstF GA-64 à partir dilué | ul utilisé dans mutCstF GA-64, à partir dilué | Rapport molaire (ins: VEC) |
| pcDNA 3.1 (vecteur) | 4618 | 158 | non dilué | 1 | 1 | |
| hEF1_ promoteur partie 1 | 825 | 213 | 75 | 1 | 1 | 3: 1 |
| hEF1_ promoteur partie 2 pour CstF-64 | 516 | 229 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| CstF-64 | 1796 | 161 | non dilué | 1 | 3: 1 | |
| hEF1_ promoteur partie 2 pour mutant CstF-64 | 516 | 199 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| mutant CstF-64 | 1448 | 201 | 171 | 1 | 3: 1 |
Tableau 1. Rendement de fragments d'ADN après concentration sur des billes magnétiques, la dilution et mettre en place des réactions d'assemblage.
Discussion
L'utilisation réussie de clonage GA doit toujours être précédée d'une conception soignée de la construction complète (figures 2 et 3).
Vérification minutieuse des séquences d'amorces conçus par l'outil de génération amorce est également fortement recommandé. Amorces pour GA peuvent être produits sans l'utilisation de l'outil de génération d'amorce. Cependant, l'utilisation de l'outil est fortement recommandé, car il simplifie le processus. Généralement, l'amorce pour le clonage GA doit avoir deux séquences fonctionnellement différents. La première séquence est un fragment d'ADN spécifique, et permet l'amplification du fragment par PCR. La seconde séquence chevauche le fragment adjacent, ce qui est nécessaire pour l'assemblage GA. Une séquence-spécifique fragment d'ADN typique serait de 18 à 22 nt de longueur. Des séquences spécifiques d'ADN utilisées pour amplifier un fragment du même ADN doivent avoir des températures de fusion similaires et le contenu GC. Séquence de chevauchement doit être au moins de 15nt de long avec une température de fusion d'au moins 48 ° C. Le rassemblement de plus de quatre fragments d'ADN nécessitera la séquence de chevauchement d'au moins 20 nt. Chevauche plus permettront spécificité accrue du recuit résultant en des fragments d'ADN plus correctement montés. Il est recommandé d'éviter des séquences qui sont biaisées dans leur GC ou AT contenu dans le développement de séquences qui se chevauchent, parce séquences asymétriques pourraient compromettre l'assemblage d'ADN appropriée.
Nous suggérons également d'utiliser comme contrôle négatif, qui ne devrait pas produire des colonies bactériennes résistantes aux médicaments, juste le fragment d'ADN correspondant au squelette du vecteur dans une réaction GA. En variante, l'un des fragments d'ADN comprenant les "inserts" peuvent être omis de la réaction GA, ce qui devrait également se traduire par pas de colonies bactériennes résistantes aux médicaments. La raison pour laquelle aucune colonie ne se développent sera l'absence de chevauchement des extrémités des fragments d'ADN adjacents, ce qui rend l'assemblage d'un complplasmide ete.
Dans le protocole décrit des séquences chevauchantes de 25 nt pour générer les ensembles d'amorces ont été utilisées, en raison du nombre de fragments d'ADN utilisées (figure 3). La recommandation du site de l'outil de production primaire (voir le tableau de l'équipement) est d'utiliser au moins 20 séquences chevauchantes nt à assembler 4-6 fragments d'ADN. En outre, plus le chevauchement séquence assure que la complémentation appropriée des brins d'ADN (voir la figure 1) augmenter le nombre de produits assemblés avec précision.
Actuellement, plusieurs systèmes pour le clonage sont disponibles sans soudure. Toutefois, certains de ces systèmes utilisent encore des enzymes de restriction (c.-à Golden Gate clonage 18). D'autres utilisent des mélanges exclusifs d'enzymes à base de virus de la vaccine et l'ADN polymerase de la protéine de liaison d'ADN simple brin à partir de la même source 19 biologique. Les deux systèmes sont limités par rapport à l'AG par le shorlongueur ter des séquences chevauchantes. Parce que des séquences plus courtes qui se chevauchent peuvent ne pas fournir une spécificité suffisante pour l'étape de recuit de fragments d'ADN adjacents, ce qui rend le montage correct de plus de 23 fragments d'ADN problématiques. Ces lacunes ne sont pas présents dans le système GA.
La taille des fragments d'ADN à amplifier doit être également considérée afin de ne pas dépasser la taille de manière fiable amplifiable par PCR (ce est à dire, à moins de 8 kpb de longueur). Même avec les améliorations de la fonction de polymérases d'ADN dans des 10 dernières années, de grands fragments d'ADN seront amplifiés avec moins d'efficacité et de précision. Si nécessaire, des fragments d'ADN plus grands peuvent être obtenus à partir d'autres sources de PCR, par exemple, par l'isolement du plasmide et digestion d'ADN appropriée avec des enzymes de restriction. Plus précisément, pour le protocole décrit dans le manuscrit actuel, notre rationnel d'utiliser la PCR était basée sur la taille des fragments d'ADN disponibles, qui étaient toutes inférieures à5 kpb. Se il existe plus d'un produit de PCR identifiée par électrophorèse sur gel d'agarose, la purification sur gel du fragment de taille souhaitable est recommandé d'utiliser l'une des techniques de biologie moléculaire ou des kits disponibles appropriées. Dans le protocole actuel d'une ADN polymérase thermostable est utilisé (voir le tableau des matériaux). Toutefois, tout ADN polymérase fournir de haute fidélité et le rendement sera adapté pour être utilisé avec ce protocole. Si haute fidélité ADN polymérases différent de celui décrit dans le protocole sont disponibles, utiliser les conditions fixées comme décrit dans les manuels respectifs. Dans le protocole actuel, E. chimiquement compétente cellules de E. coli sont utilisés qui sont fournis avec le kit GA. E. Sinon, chimiquement ou électro compétente les souches E. coli DH5a ou tels que DH10B peuvent être utilisés.
L'assemblée clonage master mix 2x est facile à utiliser avec un minimum de mains sur le temps. Cependant, pipetage précis est nécessaire en raison des faibles volumes neEDED à être mélangés ensemble. Une bonne technique de biologie moléculaire doit être exercé en tout temps ainsi.
Le clonage GA offre des possibilités illimitées pour une construction de fragments d'ADN, des plasmides et des vecteurs, qui sont plus longues que 3 kpb de taille. En outre, il a un impact plus large dans le domaine de la biologie synthétique, car il permet la synthèse et l'assemblage de, par exemple, un ensemble bactérienne (Mycoplasma mycoides) génome ou une levure (Saccharomyces cerevisiae) chromosome 20,21. La technique est également applicable aux clonage conventionnel doit générer des constructions sans soudure.
En conclusion, le clonage GA offre de remplacement rapide, fiable et flexible pour la procédure de clonage d'ADN classique.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Michaela Jansen au Health Sciences Center Texas Tech University, Lubbock, TX et Mladen Yovchev à l'Université de Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA pour le pcDNA fournissant généreusement 3.1 myc-His (A) et hEF1α promoteur contenant des plasmides . Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Eunice Kennedy Shriver Institut national de la santé infantile et le développement humain des Instituts nationaux de la santé sous le numéro d'attribution R01HD037109 (à CCM). Un soutien supplémentaire est de l'Institut Laura W. Bush pour la santé des femmes (à CCM et PNG). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP - PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
References
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
- Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
- Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
- Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
- Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
- Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
- Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
- Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
- Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
- MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
- Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
- Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
- Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
- Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
- Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
- Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
- Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).
