Protocol
NOTA: Todos os protocolos que utilizam animais vivos devem ser analisados e aprovados por um cuidado e uso de animais Comitê Institucional (IACUC) e deve seguir métodos para o cuidado e uso de animais de laboratório oficialmente aprovado. Todas as dissecações deve ser realizada utilizando uma técnica estéril em um banco de fluxo laminar limpo. Luvas e máscara, se desejado, deve ser usado durante este procedimento.
1. Dissecção da Orelha Embryonic Rato Inner
- Configuração para órgão de Corti culturas de explantes:
- Esteriliza-se o fluxo laminar capuz de cultura de tecidos, ligando a luz UV durante cerca de 30 min e desinfectar a superfície com etanol a 70% antes da utilização. Além disso, esterilizar todos os instrumentos de dissecação, incluindo ferramentas de dissecação finos e pratos Sylgard-revestidos para dissecção embrião via autoclave ou por imersão em etanol 70% por pelo menos 20 min antes do uso. Deitar fora 70% de etanol e permitir que os pratos e instrumentos para ar seco em um fluxo laminar clea limpon bancada antes de usar.
- Prepare a Solução Salina Equilibrada de Hank estéril (HBSS) / (4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico) (HEPES) mistura por adição de 10% de HBSS 10x e 0,5% de HEPES e ajustar o pH a aproximadamente 7,2 e esterilizar o filtro solução final e armazenar a 4 ° C. Realizar todas as dissecações em refrigerados solução HBSS / HEPES a melhor preservação do tecido durante todo o procedimento.
- Pratos de vidro de fundo casaco com matriz da membrana basal por adição de 5 mL de água fria (4 ° C) estéril de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) a uma alíquota de 300 ul de matriz de membrana basal num tubo de polipropileno de 15 ml estéril. Misturar em vortex o conteúdo e adicionar 150 uL da mistura da matriz da membrana basal DMEM-a do centro de cada placa de cultura de modo a que cubra a totalidade da cultura assim presente no centro do prato. Cubra os pratos e armazenar em um 37 ° C incubadora por pelo menos 45 min antes do uso.
- Despeje 5/4 ml refrigerados HBSS em three pratos de Petri de poliestireno e deixe fechado na capa.
- Prepare meio de cultura num tubo de polipropileno de 15 ml estéril por adição de 9 ml de DMEM, 100 ul de suplementos de N2, 10 g / ml e Cipro 1 ml de FBS.
- O isolamento de embriões:
NOTA: Neste procedimento para a cultura de explantes cocleares embrionárias de camundongos, ouvidos internos colheita do dia embrionário (E) 13 ossos temporais, com o dia após a fertilização sendo considerado como E1 9. O protocolo também pode ser utilizado com rato embrionário começando ouvidos internos de E12 a E18.- Euthanize um rato cronometrado-grávida de CO 2 e sacrificar animais por deslocamento cervical ou protocolos aprovados adequados. Realizar eutanásia longe de de fluxo laminar de cultura de tecidos capuz para manter a esterilidade na sala cultura do tecido.
- Coloque o mouse sacrificados em papel toalha com abdômen para cima e desinfectar abdômen com etanol 70%.
- Abra a cavidade abdominal, agarrando pelecom uma pinça curva com uma mão e epiderme de corte e muscular ao longo da linha média com tesoura usando uma outra mão. Faça dois cortes perpendiculares em ambos os lados e retirar o útero cuidadosamente levantando cornos uterinos bilaterais com uma pinça e retirá-la da parte de baixo do tecido conjuntivo com uma tesoura.
- Coloque a cadeia embrionárias em uma placa de Petri contendo solução refrigerada dissecção (mistura HBSS / HEPES) e transferir para o de fluxo laminar bancada limpa.
- Remover cuidadosamente a partir de embriões placenta e colocá-los em uma das placas de Petri estéreis contendo solução de dissecção. Se a solução se torna sangrenta, movê-los para uma nova placa de Petri.
NOTA: Neste ponto, os embriões podem ser encenado usando um guia de preparo Theiler. - Decapitar embriões por beliscar na região do pescoço com um par de fórceps limpas ou tesoura e coloque as cabeças em um prato fresco Petri contendo solução de dissecção gelada.
- Dissecção da orelha interna:
- Coloque ocabeça embrião ne em um prato Sylgard estéril contendo dissecação frio
- solução. Trabalhando sob um microscópio de dissecação com uma ampliação de 1.6X ~, imobilizar a cabeça do embrião, colocando Minutien pinos em torno ou mais próxima da região dos olhos (Figura 1A).
- Usando duas pinças estéreis cuidadosamente retire a pele e abrir o crânio no lado dorsal ao longo da linha média (Figura 1B). Remover cérebro de cavidade craniana e ouvidos internos localizados em ossos temporais podem ser identificadas nesta fase (Figura 1C, D). O forro do vaso sanguíneo, que normalmente está presente em torno das orelhas internas, pode ser utilizado como um ponto de referência para a identificação do ouvido interno, nesta fase (Figura 1D).
- Dissecar o ouvido interno dos ossos temporais, colocando a pinça debaixo do tecido e isolamento do ouvido interno a partir da base do crânio e a transferência de um novo prato de dissecação contendo solução fria (Figura 1E, F).
2. Geração de Órgão de Corti culturas de explantes
NOTA: Nesta fase de desenvolvimento, o tecido cartilaginoso é e pode ser facilmente dissecados com a pinça.
- Oriente o ouvido interno para que o lado ventral está virada para cima (Figura 2A) e estabilizar o ouvido interno através da inserção suavemente a extremidade aguçada da Minutien pinos através da porção vestibular do ouvido interno (Figura 2B).
- Usando fórceps ultrafinas cortar abrir a cartilagem sobrejacente, fazendo uma incisão utilizando uma ponta de pinça perto da janela oval e cuidadosamente remover a cartilagem da cóclea (Figura 2C).
NOTA: É importante ter a certeza que os fórceps não são inseridos muito profundamente na cartilagem como cartilagem sobrejacente às vezes é fundido com o dueto coclear no caso em que é útil para utilizar uma pinça fechada para libertar cartilagem do ducto coclear subjacente por raspagem abaixo do surface da cartilagem. Nesta fase de desenvolvimento, a espiral da cóclea é de apenas três quartos de um turno de comprimento. - Em seguida, expor o epitélio sensorial, colocando a pinça na região preferida do ducto coclear, quer a base ou no vértice, e puxando para fora o telhado da cóclea (Figura 2D).
NOTA: O telhado da cóclea deve ser removido completamente, uma vez que pode mascarar o epitélio sensorial impedindo a análise.
NOTA: Este procedimento deve ser feito com cuidado, pois é fácil de rasgar o epitélio sensorial. - Como um último passo, cuidadosamente remover o tecido conjuntivo subjacente do epitélio sensorial exposta de modo que a base do explante coclear é uniformemente plana.
- Isolar a cóclea dissecada da porção vestibular do ouvido interno com a pinça. Isto pode ser realizado antes ou após a etapa 2.4 (Figura 2E).
- Transferir o epitélio sensorial da cóclea dissecado em uma membra porãopoço de cultura utilizando um cinzel estéril 1,5 milímetros (Figura 2F) ne-matriz revestida.
- Oriente o explante da cóclea com a superfície luminal do epitélio virado para cima, e aspirar a solução de matriz de membrana basal DMEM para achatar cuidadosamente o tecido e substituí-la com 150 ul de meio de cultura fresco adicionando suavemente para o prato. Deve ser tomado cuidado para assegurar que cada explante adere bem à lamela de vidro revestido e não está a flutuar no meio de cultura. Certifique-se de que a ponta do fórceps, é apontado para cima, enquanto a fixação do poço de vidro para evitar danificar o explante da cóclea.
- Suavemente transferir a placa de cultura estéril num prato de cultura de 150 milímetros e colocar numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C com 5% de CO 2 durante período de tempo desejado, normalmente 3-6 dias in vitro (DIV). Depois de 1 DIV, examinar as culturas sob um microscópio de dissecação para certificar-se que o explante da cóclea aderiu bem à placa de cultura.
- Depois de emcubation in vitro para comprimentos desejados de tempo, as culturas são processados para imuno-histoquímica.
NOTA: As culturas de explantes geralmente são incubadas durante 6 DIV, que é equivalente a fase de desenvolvimento, P0. Após a incubação in vitro, as culturas podem ser processados em aplicações a jusante, como imuno-histoquímica (Figura 3B), RT-PCR, a hibridização in situ, e / ou Western blot.
3. A electroporação mediada por Transferência de Genes
- Configuração para eletroporação:
- Esterilizar um Sylgard 100 milímetros prato de vidro revestido por autoclavagem ou imersão em etanol a 70% durante cerca de 20 min e deixar secar ao ar numa bancada limpa antes da utilização.
- Prepare o DNA de um vector de expressão de escolha utilizando Maximiliano ou midi-prep kits adequados. Os vectores de expressão utilizados neste protocolo são pIRES2-Atoh1.EGFP e pCLIG-NeuroD1.EGFP. A concentração final de ADN deve ser de pelo menos 1 ug / uL de ADN estéril /Livre de RNAse água.
- Electroporating ADN em explantes da cóclea embrionárias:
- Adicionar 10 ul de solução de ADN de plasmídeo para um novo Sylgard 100 milímetros revestida prato e transferir um explante da cóclea totalmente dissecados (obtido a partir do passo 2.5) para a solução de ADN.
- Com a superfície luminal do epitélio virado para cima, a cóclea inclinar ligeiramente de modo que é perpendicular ao plano do prato.
- Coloque as pás de eléctrodos em ambos os lados da cóclea com pá negativo (cátodo) para o epitélio sensorial e a pá positivo (ânodo) localizada adjacente à base da cóclea.
Observação: Uma vez que o ADN tem carga negativa, que migra de negativo para positivo e do eléctrodo, colocando a extremidade do cátodo da sonda adjacente ao epitélio sensorial; o DNA principalmente ir através da superfície do epitélio sensorial. - Usando electroporator, entregar 9-10 pulsos de 24 mV, 30 ms duração do pulso com o interruptor do pedal em tele electroporator, e em seguida, adicione 100 ml de meio de cultura quente para a cóclea electroporado.
- Repita os passos 3.2.1-4 para todos os explantes da cóclea e para o DNA de todos os genes de interesse e transferir as cócleas electroporadas na membrana basal revestida de matriz prato para o plaqueamento (passo 2.7). Cultura todas as cócleas electroporados em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora humidificada para comprimentos de tempo desejados, que serão depois processadas para imunocitoquímica.
NOTA: A cóclea de uma ninhada inteira de CD1 rato (aproximadamente 8-12 filhotes) pode ser isolado, microdissecados, electroporado e banhado em <4 horas.
4. Análise das Culturas Coclear explantes
NOTA: As culturas são geralmente incubados durante 6 DIV, que é equivalente a fase de desenvolvimento, P0. Após a incubação in vitro, as culturas são fixadas e processadas para imunocitoquímica.
- Depois de comprimento desejado de incubation, remover o meio de cultura e lavar rapidamente o explante da cóclea em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incuba-se em paraformaldeído a 4% (em PBS) durante 15 min à temperatura ambiente.
- Lavar o fixador por adição de PBS e lavar três vezes em PBS durante 15 min.
- Permeabilizar utilizando PBS-T (PBS + Tween a 0,5%) durante 30 min antes de bloqueio com PBS-T contendo 10% de soro de cabra.
- Incubar em solução de anticorpo primário contendo o anticorpo primário em PBS-T com 1% de soro de cabra durante a noite a 4 ° C.
- Lava-se a cóclea três vezes à temperatura ambiente utilizando PBS-T 15 min antes da adição de cada anticorpos secundários conjugados com Alexa adequadas.
- Uma vez que o explante é cultivado sobre coclear lamela de vidro que pode ser tratado individualmente pelo isolamento da lamela do prato de montagem e sobre a lâmina. Isto pode ser conseguido por imersão da placa de cultura em OS30 solvente para pelo menos 1 hora à temperatura ambiente. Usando a lâmina estéril, retire a lamela do dish e montar em um slide e visualizar em um microscópio fluorescente.
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Discussion
Todas as células dentro do labirinto membranoso do ouvido interno de rato, incluindo sensorial, não-sensorial e os neurónios do gânglio da espiral são todos derivados de placodally derivado otocyst localizado adjacente à parte posterior do cérebro da ectoderme, cerca de 10-14 E8. Em E11, a região ventral do otocyst estende-se para formar o ducto coclear e como desenvolvimento continua, um grupo de células epiteliais no interior da cóclea, bem como em outras regiões do otocyst, tornar-se como emplastros prosensory especificado que, subsequentemente, dão origem a diferentes tipos de células ciliadas mecanosensorial e células de suporte não-sensorial. Na cóclea em desenvolvimento, uma linha de células ciliadas internas e três fileiras de células ciliadas externas podem ser identificados em torno de E15.5 e por E17, padronização é essencialmente completa com uma única linha de células ciliadas internas, células pilares e três fileiras de células ciliadas externas . Em um período de tempo que se estende desde E11 quando o dueto coclear primeiro começa a crescer para fora através E17 toda a diferendife- decisões destino celular e padronização ocorrer dentro do epitélio em desenvolvimento para gerar um padrão celular impressionante com um complemento normal de células ciliadas e células de suporte. A perda de células ciliadas e / ou células de apoio é a principal causa de deficiência auditiva. Uma vez que estes tipos de células são gerados apenas durante um período de tempo bastante compacto durante o desenvolvimento embrionário, é crucial para compreender as vias moleculares e genéticos que especificam cada um desses tipos de células que deverá conduzir a uma visão significativa nas estratégias regenerativas.
Técnicas de cultura e electroporação cocleares têm sido desenvolvidos para manipular a expressão génica no rato em desenvolvimento. Neste vídeo, demonstramos técnicas de cultura para a geração de explantes primários e uma técnica de electroporação para a entrega de genes em cultura de órgãos embrionários de murídeo de Corti. Os explantes primários preparados desta forma pode ser mantida durante 7-10 dias in vitro. Explantes cocleares can ser usada para manipular a expressão do gene por abordagens farmacológicas que nos permitam compreender os mecanismos que regulam os processos de desenvolvimento, tais como especificação de destino, o compromisso, diferenciação e padronização. Além disso, este método facilita a análise de fenótipos de desenvolvimento embrionário de murganhos mutantes que não sobrevivem passado E12.
O procedimento de transferência do gene de onda quadrada electroporação mediada fornece um mecanismo para manipular a expressão de genes em células sensoriais capilares, células de suporte e células dentro das regiões de RGE e LER, a fim de visualizar o seu destino ex vivo. Usando este procedimento, podemos regular negativamente ou ectopically expressar genes específicos em células prosensory, células ciliadas e / ou células de suporte em um fundo de outra forma de tipo selvagem e analisar seus efeitos específicos na especificação e diferenciação destino. Isto irá permitir-nos compreender a função do gene específico dentro da cóclea em desenvolvimento. Por exemplo, como mostrado na
Embora a cultura cochear pode ser criado logo em E12, eletroporação de explantes cocleares menores de E12.5 / E13 irá resultar em danos ao tecido tornando-se complicado para análise. Além disso, o promotor do vector de expressão utilizado determina quais os tipos de células são transfectadas na cóclea duct. Por exemplo, o promotor de citomegalovírus humano contendo vectores de expressão produz transfecção robusto no órgão Kollikers ', enquanto que a utilização de CMV precoce resultados potenciador / promotor da actina de galinha beta em maior eficiência de transfecção em células dentro do epitélio sensorial. Os problemas comuns encontradas durante a electroporação de explantes da cóclea embrionárias são morte celular excessiva e / ou dano do tecido e pobre a eficiência da transfecção. O espaçamento adequado de eléctrodos e a concentração do ADN desempenha um papel crucial na obtenção de dano mínimo e uma maior eficiência de transfecção. Em resumo, estas técnicas aumenta nossa capacidade de manipular a expressão do gene através de ganho ou perda de estratégias de função e manipulações farmacológicas e de grande ajuda em dissecar os sinais que influenciam as decisões de padronização e destino da célula.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
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