Protocol
MERK: Alle protokoller ved hjelp av levende dyr må gjennomgås og godkjennes av en Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og må følge offisielt godkjente metoder for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle dissections bør utføres ved bruk av steril teknikk på en rent laminær strømning benk. Hansker og en maske, om ønsket, bør brukes i løpet av denne prosedyren.
1. Disseksjon av Embryonic Mouse Inner Ear
- Sette opp for orgel av Corti eksplantering kulturer:
- Steril laminær vevskultur hette ved å slå på UV-lys i ca. 30 minutter og desinfisere overflaten med 70% etanol før bruk. I tillegg sterilisere alle disseksjon instrumenter inkludert fine disseksjon verktøy og Sylgard-belagt retter for embryo disseksjon via autoklav eller ved bløtlegging i 70% etanol i minst 20 minutter før bruk. Hell av 70% etanol og la oppvasken og instrumenter lufttørke i en ren laminær Clean benk før bruk.
- Forbered steril Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre) (HEPES) blanding ved å tilsette 10% av 10 x HBSS, og 0,5% HEPES og justere pH til omtrent 7,2 og filtersteriliser endelig løsning og oppbevares ved 4 ° C. Utføre alle disseksjoner i kjølt HBSS / HEPES løsning for å bedre bevare vevet gjennom hele prosedyren.
- Belegge glassbunn retter med basalmembran matriks ved tilsetning av 5 ml kald (4 ° C) steril Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) i en 300 ul alikvot av basalmembranmassen i et sterilt 15 ml polypropylenrør. Bland ved å virvle innholdet og tilsett 150 ul av basalmembranen matriks-DMEM blandingen til midten av hver kulturskål, slik at det dekker hele kulturen godt til stede i midten av skålen. Dekk retter og lagrer i en 37 ° C inkubator i minst 45 min før bruk.
- Hell 4-5 ml kjølt HBSS til thRee sterile polystyren petriskåler og la stengt i panseret.
- Forbered kulturmedium i et sterilt 15 ml polypropylenrør ved tilsetning av 9 ml DMEM, 100 ul av N2 kosttilskudd, 10 g / ml Cipro og 1 ml FBS.
- Isolering av embryoer:
MERK: I denne prosedyren for dyrking cochlea eksplantater fra embryonale mus, slakte indre ører fra embryonale dag (E) 13 timelige bein med dagen etter befruktning blir vurdert som E1 9. Protokollen kan også brukes med embryonale muse indre ører som begynner fra E12 til E18.- Avlive en tidsbestemt-gravid mus med CO 2 og ofre dyr ved halshugging eller aktuelle godkjente protokoller. Gjennomføre euthanization bort fra laminær-flow vev kultur hette for å opprettholde sterilitet i vevet kultur rommet.
- Plasser avlives mus på tørkepapir med magen vendt opp og desinfisere magen med 70% etanol.
- Åpne bukhulen ved å gripe hudmed buede tang med én hånd og kuttet epidermis og muskel langs midtlinjen med saks ved hjelp av en annen hånd. Lag to vinkelrette kutt på begge sider og trekke ut livmoren nøye ved å løfte opp bilaterale livmor horn med pinsett og løsne den fra undersiden bindevev med saks.
- Plasser embryonale kjeden i en petriskål med kjølt disseksjon løsning (HBSS / HEPES blanding) og overføring til laminær-flow ren benk.
- Fjern embryoer nøye fra morkaken og plassere dem i en av de sterile petriskåler som inneholder disseksjon løsning. Hvis løsningen blir blodig, flytte dem til en ny petriskål.
MERK: På dette punktet, kan embryoer bli avholdt ved hjelp av en Theiler iscenesettelse guide. - Halshogge embryoer ved å knipe på halsregionen med et par rene tang eller saks og legg hodene i en fersk petriskål som inneholder kjølt disseksjon løsning.
- Disseksjon av de indre ører:
- Sted one embryo hodet i en steril Sylgard fatet inneholder kald dissekere
- oppløsning. Arbeider under en disseksjonsmikroskop på en forstørrelse på ~ 1.6x, immobilisere embryoet hodet ved å plassere Minutien pins rundt eller nærmere øyet regionen (figur 1A).
- Ved hjelp av to par av steril pinsett forsiktig fjerne hud og åpne opp skallen på ryggsiden langs midtlinjen (figur 1B). Fjerne hjernen fra kraniet og indre ører som ligger innenfor tidsmessige bein kan identifiseres på dette stadiet (figur 1C, D). Foringen av blodkaret, som vanligvis er til stede rundt de indre ører, kan brukes som et fjell for å identifisere det indre øret på dette stadium (figur 1D).
- Dissekere det indre øret fra tidsmessige bein ved å plassere tang under vev og isolere det indre øret fra bunnen av hodeskallen og overføring til en ny rett som inneholder kald dissekere løsning (figur 1E, F).
2. Generering av Organ of Corti eksplantat kulturer
MERK: I denne fasen av utviklingen, er vevet brusk og kan lett dissekert med tang.
- Orienter indre øret slik at ventral side vender opp (Figur 2A) og stabilisere det indre øret ved forsiktig å sette inn den skarpe enden av Minutien pins gjennom vestibular del av det indre øret (figur 2B).
- Bruker ultrafine tang kutte åpne liggende brusk ved å lage et snitt ved hjelp av den ene enden av tang nær det ovale vinduet og forsiktig fjerne brusk fra sneglehuset (figur 2C).
MERK: Det er viktig å sørge for at pinsett ikke er satt inn for dypt inn i brusk som overliggende brusk er noen ganger smeltet sammen med cochlea duct og da er det nyttig å bruke lukkede tang for å løsne brusk fra den underliggende cochlea kanal ved å skrape under surface av brusk. På dette stadiet av utviklingen, er det spiral cochlea bare tre fjerdedeler av en sving i lengde. - Deretter utsettes den sensoriske epitel ved å plassere tang ved den foretrukne område av cochlea kanalen, enten basen eller i det apex, og forsiktig trekke ut taket av sneglehuset (figur 2D).
MERK: Taket av sneglehuset må fjernes helt som det kan maskere den sensoriske epitel hindre analyse.
MERK: Denne prosedyren må gjøres forsiktig som det er lett å rive den sensoriske epitel. - Som et siste skritt, fjern forsiktig den underliggende bindevev fra konkurranseutsatt sensorisk epitel, slik at bunnen av cochlea eksplantering er jevnt flat.
- Isoler dissekert cochlea fra vestibular del av det indre øret ved hjelp av pinsett. Dette kan utføres før eller etter trinn 2.4 (figur 2E).
- Overfør dissekert cochlea sensorisk epitel i en kjeller membranne matrise-belagt kultur godt ved hjelp av en 1,5 mm steril scooper (figur 2F).
- Orienter cochlea eksplantering med lumenal overflaten av epitel vendt opp og aspirer basalmembran matrix-DMEM løsning å nøye flate vev og erstatte den med 150 mL av fersk kulturmedium ved å forsiktig legge til parabolen. Forsiktighet bør tas for å sikre at hver eksplantat hefter godt til den belagte glass dekkglass og er ikke flytende i kulturmediet. Pass på at tuppen av tang peker opp mens festing i glasset godt for å unngå å skade cochlea eksplantering.
- Forsiktig overføre kulturskål i en steril 150 mm kulturskål, og plasser i en vevskulturinkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i ønsket tidsrom, vanligvis 3-6 dager in vitro (DIV). Etter en DIV, undersøke kulturer under a disseksjonsmikroskop å sørge for at cochlea eksplantering har levd godt til kultur fatet.
- Etter icubation in vitro for ønskede lengder av gangen, er kulturer behandlet for immunhistokjemi.
MERK: eksplantatet kulturer vanligvis inkuberes i 6 DIV som tilsvarer utviklingsstadiet, P0. Etter inkubering in vitro, kan kulturene bli behandlet for videre nedstrøms applikasjoner som immunhistokjemi (figur 3B), RT-PCR, in situ hybridisering, og / eller Western blot.
3. Electroporation-mediert genoverføring
- Sette opp for elektroporering:
- Sterilisere en 100 mm Sylgard belagt glassfat ved autoklavering eller bløtlegging i 70% etanol i ca 20 min og la det lufttørke i en ren benk før bruk.
- Forberede DNA fra et uttrykk vektor av valg ved hjelp av egnede maksi- eller midi-prep kits. Ekspresjonsvektorene brukes i denne protokollen er pIRES2-Atoh1.EGFP og pCLIG-NeuroD1.EGFP. Den endelige konsentrasjonen av DNA bør være minst 1 ug / mL i sterilt DNA /RNase-fritt vann.
- Electroporating DNA i embryonale cochlea eksplanter:
- Tilsett 10 pl av plasmid-DNA-oppløsning til en frisk 100 mm Sylgard belagt fatet og overføre et fullstendig dissekert cochlea eksplantasjon (oppnådd i trinn 2.5) i DNA løsningen.
- Med lumenal overflaten av Epitel vendt opp, vipp cochlea litt slik at det er vinkelrett på planet av fatet.
- Plassere elektrode elektrodene på hver side av sneglehuset med negativ åre (katode) mot den sensoriske epitelet og den positive åre (anode) som er plassert ved siden av bunnen av sneglehuset.
MERK: Siden DNA er negativt ladet, migrerer det fra negativ til positiv elektrode, og ved å plassere katoden enden av sonden ved siden av sensorisk epitel; DNA vil for det meste går gjennom overflaten av den sensoriske epitel. - Ved hjelp electroporator, levere 9 til 10 pulser av 24 mV, 30 msek puls varighet med fotpedal bryteren på than electroporator, og deretter legge til 100 mL av varm kultur medium til elektroporerte cochlea.
- Gjenta trinn 3.2.1-4 for alle cochlea eksplantater og for DNA av alle gener av interesse og overføre electroporated cochleae inn i kjelleren membran matrise-belagt parabolen for plating (trinn 2.7). Kultur alle elektroporert cochleae i en 37 ° C, 5% CO2 fuktet inkubator i ønskede lengder av tid som vil bli behandlet for immunocytokjemi.
MERK: cochlea fra en hel kull på CD1 mus (ca. 8-12 unger) kan isoleres, microdissected, elektroporert og belagt i <4 timer.
4. Analyse av Cochlear eksplantat kulturer
MERK: Kulturene vanligvis inkuberes for 6 DIV som tilsvarer utviklingsstadiet, P0. Etter inkubering in vitro, blir kulturene fiksert og prosessert for immunocytokjemi.
- Etter ønsket lengde incubation, fjernes dyrkningsmediet og raskt skylle cochlea eksplantatet i fosfat-bufret saltvann (PBS) og inkuberes i 4% paraformaldehyd (fremstilt i PBS) i 15 min ved romtemperatur.
- Vask fiksativ ved tilsetning av PBS, og skyller i PBS tre ganger i 15 min.
- Permeabilize bruke PBS-T (PBS + 0,5% Tween) i 30 min før blokkering med PBS-T inneholdende 10% geiteserum.
- Inkubasjon i primært antistoff-løsning inneholdende primært antistoff i PBS-T med 1% geiteserum over natten ved 4 ° C.
- Vask cochlea tre ganger ved romtemperatur ved bruk av PBS-T 15 min før hver tilsetning av passende Alexa-konjugerte sekundære antistoffer.
- Siden cochlea eksplantering er dyrket på glass dekk det kan håndteres individuelt ved å isolere dekkglass fra fatet og montering på et lysbilde. Dette kan oppnås ved å dyppe dyrkningsskålen i OS30 oppløsningsmiddel i minst en time ved romtemperatur. Bruke sterile barberblad, ta av dekkglass fra dish og montere på et lysbilde og visualisere i fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle cellene i membranøs labyrint av musen indre øret inkludert sensoriske, nonsensory og spiral ganglion neuroner er alle avledet fra placodally-avledet otocyst plassert ved siden av hindbrain av ektoderm, rundt E8 10-14. På E11, ventral region av otocyst strekker seg for å danne et cochlea-kanalen og som utviklingen fortsetter, en gruppe av epitelceller i sneglehuset, samt i andre regioner av otocyst, blir spesifisert som prosensory patcher som senere vil gi opphav til ulike typer mechanosensory hårcellene og nonsensory støtte celler. I utviklings cochlea, kan en rad av indre hårceller og tre rader med ytre hårcellene bli identifisert rundt E15.5 og ved E17, er mønster i hovedsak komplett med enkel rekke indre hårceller, søyle celler og tre rader med ytre hårcellene . I en periode som strekker seg fra E11 når cochlea-kanalen først begynner å vokse ut gjennom E17 alle diflige celle skjebne beslutninger og mønster skje innen utviklings epitel å generere en slående cellular mønster med en normal bemanning av hårceller og støtteceller. Tap av hårceller og / eller støtteceller er den ledende årsaken til hørselsskader. Siden disse celletypene genereres bare under et ganske kompakt tidsperiode under embryonal utvikling, er det avgjørende å forstå de molekylære og genetiske trasé som angir hver av disse celletypene som bør føre til betydelig innsikt i regenerative strategier.
Cochlea dyrknings og electroporation teknikker har blitt utviklet for å manipulere genekspresjon i utviklings mus. I denne videoen har vi demonstrert dyrking teknikker for å generere primære eksplanter og en elektroporering teknikk for genet levering til kultivert embryonale murine organ Corti. Den primære eksplantater forberedt på denne måten kan opprettholdes i 7-10 dager in vitro. Cochlea eksplantater can brukes til å manipulere genekspresjon av farmakologiske tilnærminger som vil gjøre oss i stand til å forstå mekanismene som regulerer utviklingsprosesser som skjebnen spesifikasjonen, engasjement, differensiering, og mønster. Dessuten letter denne metoden analyse av utviklingsmessige fenotyper av mutant embryoniske mus som ikke overlever forbi E12.
Firkantbølge elektroporering-mediert genoverføring prosedyren gir en mekanisme for å manipulere genekspresjon i sensoriske hårceller, støtteceller og celler innenfor GER og ler regioner for å visualisere deres skjebne ex vivo. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, kan vi nedregulere eller ectopically uttrykke spesifikke gener i prosensory celler, hårceller og / eller støtte celler i en ellers vill-type bakgrunn og analysere deres spesifikke virkninger på skjebnen spesifikasjonen og differensiering. Dette vil gjøre oss i stand til å forstå bestemt gen-funksjon innenfor utviklings cochlea. For eksempel, som vist i
Selv cochear kulturer kan etableres så tidlig som i E12, elektroporering av cochlea eksplantater yngre enn E12.5 / E13 vil føre til skade på vevet som gjør det tungvint for analyse. I tillegg har arrangøren av uttrykket vektor brukes bestemmer hvilken celletyper er transfektert i cochlea duct. Eksempelvis gir den humane cytomegalovirus promoteren inneholdende ekspresjonsvektorer robust transfeksjon i Kollikers 'organ, mens bruk av CMV-tidlig forsterker / kylling beta-actin promoter-resulterer i høyere effektivitet av transfeksjon i celler i sensorisk epitel. De vanligste problemene under elektroporering av embryonale cochlea explants er overdreven celledød og / eller skade på vev og dårlig transfeksjonseffektivitet. Den passende avstand mellom elektrodene og DNA-konsentrasjon spiller en avgjørende rolle i å oppnå minimal skade og høyere transfeksjonseffektivitet. Oppsummert disse teknikkene forbedrer vår evne til å manipulere genekspresjon via gevinst eller tap av funksjons strategier og farmakologiske manipulasjoner og stor hjelp i dissekere signaler som påvirker mønstrings og celle skjebne beslutninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
- Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
- Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
- Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
- Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
- Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
- Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
- Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
- Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
- Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).
