Protocol
BEMÆRK: Alle protokoller der anvendes levende dyr skal gennemgås og godkendes af et Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og skal følge officielt godkendte metoder til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle dissektioner bør udføres under anvendelse af steril teknik på en ren laminar flow bænk. Handsker og en maske, hvis det ønskes, skal bæres under denne procedure.
1. Dissektion af den embryoniske mus Inner Ear
- Opsætning for orgel af Corti eksplantatkulturer:
- Steriliser laminar strømning vævskultur hætte ved at dreje på UV-lys i ca. 30 minutter og desinficere overfladen med 70% ethanol før brug. Desuden sterilisere alle dissektion instrumenter, herunder fine dissektion værktøjer og Sylgard-belagte retter til embryo dissektion via autoklave eller ved iblødsætning i 70% ethanol i mindst 20 minutter før brug. Hæld 70% ethanol og lade retter og instrumenter lufttørre i en ren laminar strømning clean bænk før brug.
- Forbered steril Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre) (HEPES) blanding ved tilsætning af 10% af 10x HBSS og 0,5% HEPES og justere pH til ca. 7,2 og filter sterilisere endelige opløsning og opbevares ved 4 ° C. Foretag alle dissektioner i afkølet HBSS / HEPES løsning bedre bevare vævet under hele proceduren.
- Coat glasbund retter med basalmembranmatrix ved tilsætning af 5 ml kold (4 ° C) sterilt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) til en 300 pi portion af basalmembran-matrix i et sterilt 15 ml polypropylenrør. Vortexes indholdet og tilføje 150 pi af basalmembranen matrix-DMEM blandingen til midten af hver dyrkningsskål, så det dækker hele kulturen godt til stede i midten af skålen. Dæk retter og gemmer i en 37 ° C inkubator i mindst 45 minutter før brug.
- Hæld 4-5 ml kølet HBSS i three sterile polystyren petriskåle og forlade lukket i hætten.
- Forbered dyrkningsmedium i et sterilt rør 15 ml polypropylen ved tilsætning 9 ml DMEM, 100 pi N2 kosttilskud, 10 g / ml Cipro og 1 ml FBS.
- Isolering af embryoner:
BEMÆRK: I denne procedure til dyrkning cochlear eksplantater fra embryonale mus, høst indre ører fra embryonale dag (E) 13 tindingeben med dagen efter befrugtningen betragtes som E1 9. Protokollen kan også anvendes med embryonale mus indre ører begynder fra E12 til E18.- Aflive en tidsindstillet-gravid mus med CO 2 og ofre dyr ved cervikal dislokation eller egnede godkendte protokoller. Foretag euthanization væk fra laminar flow vævskultur hætte for at opretholde sterilitet i vævskultur værelse.
- Placer aflivet musen på køkkenrulle med maven opad og desinficere maven med 70% ethanol.
- Åbn bughulen ved at snuppe hudmed buede pincet med en hånd og afskårne epidermis og muskler langs midterlinjen med en saks ved hjælp en anden hånd. Lav to vinkelrette snit på begge sider og træk livmoderen forsigtigt ved at løfte op bilaterale uterine horn med pincet og frigøre det fra undersiden bindevæv med en saks.
- Placer embryonale kæde i en petriskål indeholdende afkølet dissektion opløsning (HBSS / HEPES blanding) og transfer til laminar flow ren bænk.
- Fjern embryoner grundigt placenta og placere dem i en af de sterile petriskåle indeholdende dissektion løsning. Hvis opløsningen fik blodig, flytte dem til en ny petriskål.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan embryoner blive afholdt ved hjælp af en Theiler iscenesættelse vejledning. - Halshugge embryoner ved at knibe på halsregionen med et par rene tang eller saks og placere hovedet i en frisk petriskål indeholdende afkølet dissektion løsning.
- Dissektion af de indre ører:
- Placer one embryo hovedet i en steril Sylgard skål indeholdende kold dissekere
- opløsning. Arbejde under et dissektionsmikroskop ved en forstørrelse på ~ 1,6X, immobilisere embryo hovedet ved at placere Minutien stifter omkring eller tættere på øjet region (figur 1A).
- Brug to par steril pincet forsigtigt fjerne huden og åbne kraniet på den dorsale side langs midterlinjen (figur 1B). Fjern hjernen fra kraniehulen og indre ører beliggende inden tindingeben kan identificeres på nuværende tidspunkt (figur 1C, D). Foring af blodkar, der normalt er til stede rundt om de indre ører, kan anvendes som en milepæl for at identificere det indre øre på dette stadium (figur 1D).
- Skær det indre øre fra tindingeben ved at anbringe tangen under vævet og isolere det indre øre fra basen af kraniet og overføres til en ny skål indeholdende kold dissekere opløsning (figur 1E, F).
2. generation af organ Corti eksplantatkulturer
BEMÆRK: På dette stadium i udviklingen, vævet er brusk og kan let dissekeres med en pincet.
- Orient det indre øre, så ventrale side vender opad (figur 2A) og stabilisere det indre øre ved forsigtigt at indsætte den skarpe ende af Minutien stifter gennem vestibulære del af det indre øre (figur 2B).
- Brug af ultrafine pincet skar overliggende brusk ved at gøre et snit ved hjælp af den ene ende af tang nær det ovale vindue, og fjern forsigtigt brusk fra øresneglen (figur 2C).
BEMÆRK: Det er vigtigt at sikre, at tang ikke er sat for dybt ind i brusk som overliggende brusk undertiden fusioneres med cochlear kanal i hvilket tilfælde det er nyttigt at bruge lukkede pincet til at frigive brusk fra den underliggende cochlear kanalen ved at skrabe under sverflade af brusk. På dette stadium i udviklingen, den cochlear spiral er kun tre fjerdedele af en tur i længden. - Dernæst udsættes sensoriske epithel ved at anbringe tangen på den foretrukne område af cochlear kanalen, enten base eller ved meget spids, og forsigtigt trække taget af cochlea (figur 2D).
BEMÆRK: tag cochlea skal fjernes fuldstændigt, da det kan maskere sensoriske epithel hindre analysen.
BEMÆRK: Denne procedure skal ske forsigtigt, da det er let at rive det sensoriske epithel. - Som et sidste skridt, forsigtigt fjerne det underliggende bindevæv fra den udsatte sensoriske epithel, så bunden af cochlear eksplantat er ensartet flad.
- Isoler det dissekerede cochlea fra det vestibulære del af det indre øre ved hjælp af pincet. Dette kan udføres før eller efter trin 2.4 (figur 2E).
- Overfør det dissekerede cochlear sensoriske epithel ind i en kælder Membrane matrix-coatede kultur brønd med en 1,5 mm steril scooper (figur 2F).
- Vend cochlear eksplantatet med lumenale overflade epitel opad og aspirere basalmembranen matrix-DMEM løsning omhyggeligt flade vævet og erstatte det med 150 pi frisk dyrkningsmedium ved forsigtigt at tilføje til skålen. Der bør udvises omhu for at sikre, at hver enkelt eksplantat klæber godt til det overtrukne dækglas og ikke flydende i dyrkningsmediet. Sørg for, at spidsen af tangen peger op, mens påføre glasset godt for at undgå at beskadige cochlear eksplantation.
- Overføre forsigtigt dyrkningsskålen i en steril 150 mm dyrkningsskål og sted i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 for ønsket tidsrum, sædvanligvis 3-6 dage in vitro (DIV). Efter 1 DIV, undersøge kulturerne under et dissektionsmikroskop for at sikre, at den cochlear eksplantat har levet godt til dyrkningsskålen.
- Efter icubation in vitro for ønskede længder af tid, kulturer forarbejdet til immunohistokemi.
BEMÆRK: eksplantatkulturer normalt inkuberes i 6 DIV som svarer til udviklingsstadiet, P0. Efter inkubation in vitro, kan kulturer behandles for yderligere downstream-applikationer som immunhistokemi (figur 3B), RT-PCR, in situ-hybridisering og / eller Western blot.
3. Elektroporation genoverføring
- Opsætning til elektroporation:
- Steriliser en 100 mm Sylgard-belagte glasskål ved autoklavering eller iblødsætning i 70% ethanol i ca. 20 min og lad lufttørre i en ren bænk før brug.
- Forbered DNA fra en ekspressionsvektor af valg ved hjælp af passende mak- eller midi-prep kits. Ekspressionsvektorerne anvendt i denne protokol er pIRES2-Atoh1.EGFP og pCLIG-NeuroD1.EGFP. Slutkoncentrationen af DNA bør være mindst 1 pg / pl i sterilt DNA /RNAse-frit vand.
- Elektroporering af DNA i embryonale cochleære eksplantater:
- Tilsæt 10 pi plasmid-DNA-opløsning til en frisk 100 mm Sylgard belagt skål og overføre et fuldt dissekeret cochlear eksplantat (opnået fra trin 2.5) i DNA-opløsning.
- Med luminale overflade af epithelet vendende opad, vippe cochlea lidt, så det er vinkelret på planet af skålen.
- Placer elektrode skovlene på hver side af sneglen med negativt paddle (katode) mod sensoriske epithel og den positive paddle (anode) placeret ved siden af bunden af cochlea.
BEMÆRK: Da DNA er negativt ladet, det migrerer fra negativ til positiv elektrode og ved at placere katoden ende af sonden støder op til sensoriske epithel; DNA'et vil mest gå gennem overfladen af sensoriske epithel. - Ved hjælp elektroporator, levere 9 til 10 pulser af 24. mV, 30 ms pulsvarighed med fodpedalen kontakten på than elektroporator, og derefter tilføje 100 pi varm dyrkningsmedium til den elektroporerede cochlea.
- Gentag trin 3.2.1-4 for alle de cochlear eksplantater og for DNA af alle gener og overføre den elektroporerede cochleae i basalmembranen matrix-belagt skål for plating (trin 2.7). Kultur al elektroporeres cochleae i et 37 ° C, 5% CO2 befugtet inkubator for ønskede længder af tid, som så vil blive behandlet for immuncytokemi.
BEMÆRK: cochlea fra en hel kuld CD1 mus (ca. 8-12 hvalpe) kan isoleres, mikrodissekeret, elektroporeres og forgyldt i <4 timer.
4. Analyse af Cochlear eksplantatkulturer
BEMÆRK: Kulturerne sædvanligvis inkuberet i 6 DIV som svarer til udviklingsstadiet, P0. Efter inkubation in vitro kulturerne fikseret og forarbejdet til immuncytokemi.
- Efter den ønskede længde incubation fjernes dyrkningsmediet og hurtigt skylles cochlear eksplantatet i phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberes i 4% paraformaldehyd (fremstillet i PBS) i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vask fiksativ ved tilsætning PBS og skylles i PBS tre gange i 15 min.
- Permeabilisere anvendelse af PBS-T (PBS + 0,5% Tween) i 30 minutter før blokering med PBS-T indeholdende 10% gedeserum.
- Inkuber i primært antistof opløsning indeholdende primære antistof i PBS-T med 1% gedeserum natten over ved 4 ° C.
- Vask cochlea tre gange ved stuetemperatur under anvendelse af PBS-T 15 min hver før tilsætning passende Alexa-konjugerede sekundære antistoffer.
- Da cochlear eksplantat er dyrket på dækglas det kan håndteres individuelt ved at isolere dækglasset fra fadet og montering på et dias. Dette kan opnås ved at gennemvæde dyrkningsskålen i OS30 opløsningsmiddel i mindst 1 time ved stuetemperatur. Brug af sterile barberblad, afmontere dækglas fra dish og montere på et dias og visualisere under en fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle celler i membranøs labyrint af muse indre øre, herunder sensorisk, nonsensory og spiral ganglieneuroner er alle afledt af placodally afledt otocyst placeret ved siden af baghjerne af ektoderm, omkring E8 10-14. På E11, den ventrale region af otocyst strækker sig til dannelse af den cochleære kanal og som udvikling fortsætter, en gruppe af epitelceller i cochlea, såvel som i andre regioner af otocyst bliver angivet som prosensory patches, som efterfølgende vil give anledning til forskellige typer af mechanosensory hårceller og nonsensory støtter celler. I udviklingen af cochlea, kan en række af indre hårceller og tre rækker af ydre hårceller kan identificeres omkring E15.5 og E17, mønsterdannelse er i det væsentlige fuldstændig med en enkelt række af indre hårceller, søjle celler og tre rækker af ydre hårceller . I et tidsrum, der spænder fra E11 når cochlear kanalen først begynder at vokse ud gennem E17 alle difskellige celle skæbne beslutninger og mønsterdannelse sted inden for udvikling af epithel at generere en slående cellulær mønster med en normale antal hårceller og støtte celler. Tab af hårceller og / eller støtter celler er den hyppigste årsag til hørenedsættelse. Da disse celletyper genereres kun i en forholdsvis kompakt tidsperiode under fosterudviklingen, er det afgørende at forstå de molekylære og genetiske veje, der angiver hver af disse celletyper, der bør føre til en betydelig indsigt i regenerative strategier.
Cochlear dyrkning og elektroporering teknikker er blevet udviklet til at manipulere genekspression i udviklingslandene mus. I denne video har vi vist dyrkningsteknikker til generering primære eksplantater og en elektroporation teknik til genlevering i dyrkede embryonale murine organ Corti. De primære eksplantater fremstillet på denne måde kan opretholdes i 7-10 dage in vitro. Cochlear eksplantater can bruges til at manipulere genekspression ved farmakologiske metoder, som vil sætte os i stand til at forstå de mekanismer, der regulerer udviklingsprocesser såsom skæbne specifikation, engagement, differentiering og mønster. Desuden giver denne metode letter analysen af udviklingsmæssige fænotyper af mutant embryonale mus, der ikke overlever forbi E12.
Den firkantede bølge elektroporation-medieret procedure genoverførsel tilvejebringer en mekanisme til at manipulere genekspression i sansehårceller, support celler og celler i GER og ler regioner for at visualisere deres skæbne ex vivo. Ved hjælp af denne procedure, kan vi nedregulere eller ektopisk udtrykker specifikke gener i prosensory celler, hårceller og / eller støtter celler i en ellers vildtype-baggrund og analysere deres specifikke virkninger på skæbne specifikation og differentiering. Det vil gøre os i stand til at forstå specifikt gen funktion inden for udvikling cochlea. For eksempel, som vist i
Selv kan etableres cochear kulturer så tidligt som E12, elektroporering af cochleære eksplantater yngre end E12.5 / E13 vil resultere i skade på vævet, hvilket gør det besværligt for analyse. Desuden promotoren af ekspressionsvektoren anvendt Angiver, hvilke celletyper transficeret inden cochlear duct. For eksempel den humane cytomegalovirus-promotor indeholdende ekspressionsvektorer giver robust transfektion i Kollikers "organ, mens anvendelse af CMV tidlig enhancer / kylling beta actin promoter resulterer i højere effektivitet af transfektion i celler i sensoriske epithel. De fælles problemer under elektroporation af embryonale cochlear eksplantater er overdrevne celledød og / eller skade af vævet og dårlig transfektionseffektivitet. Den passende afstand mellem elektroderne og DNA-koncentrationen spiller en afgørende rolle i at opnå minimal skade og højere transfektionseffektivitet. Sammenfattende disse teknikker forbedrer vores evne til at manipulere genekspression via gevinst eller tab af funktion strategier og farmakologiske manipulationer og i høj grad støtte i dissekere signaler, der påvirker mønsterdannende og celle skæbne beslutninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
- Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
- Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
- Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
- Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
- Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
- Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
- Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
- Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
- Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).
