Protocol
HINWEIS: Alle Protokolle mit lebenden Tieren müssen überprüft und durch ein Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen worden sein und offiziell anerkannte Methoden für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgen. Alle Sektionen sollte mit einer sterilen Technik auf eine saubere Sterilbank werden. Handschuhe und eine Maske, falls erwünscht, sollte bei diesem Verfahren getragen werden.
1. Präparation der embryonalen Maus-Ear-
- Einrichten für Corti-Organ Explantatkulturen:
- Sterilisieren der Laminarströmung Gewebekulturhaube durch Einschalten UV-Licht für ungefähr 30 min und desinfiziert die Oberfläche mit 70% igem Ethanol vor der Verwendung. Zusätzlich zu sterilisieren alle Dissektionsinstrumente einschließlich feiner Dissektion Werkzeuge und Sylgard-beschichtete Platten für Embryo Dissektion über Autoklaven oder durch Eintauchen in 70% Ethanol für mindestens 20 Minuten vor dem Gebrauch. Gießen Sie 70% Ethanol und lassen Sie die Speisen und Instrumente an der Luft trocknen in einem sauberen laminare Strömung clean Bank vor der Verwendung.
- Vorbereitung steriler Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure) (HEPES) Mischung durch Zugabe von 10% 10x HBSS und 0,5% HEPES und den pH-Wert auf etwa 7,2 und Filter sterilisieren endgültige Lösung und bei 4 ° C. Führen Sie alle Sektionen in gekühlt HBSS / HEPES-Lösung zu einer besseren Erhaltung der Gewebe während des gesamten Verfahrens.
- Beschichtung von Glasbodenschalen mit Basalmembranmatrix durch Zugabe von 5 ml kaltem (4 ° C) sterile Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) zu einem 300 & mgr; l Aliquot von Basalmembran-Matrix in einem sterilen 15 ml-Polypropylenröhrchen. Vortexen Inhalt und mit 150 ul der Basalmembranmatrix-DMEM Mischung auf die Mitte jeder Kulturschale, so dass es den in der Mitte der Schale gut vorliegenden gesamte Kultur umfasst. Decken Sie die Speisen und an einem 37 ° C Inkubator für mindestens 45 Minuten vor dem Gebrauch.
- Gießen Sie 4-5 ml gekühlt HBSS umgree sterile Polystyrol-Petrischalen und verlassen in der Haube geschlossen ist.
- Bereiten Kulturmedium in einem sterilen 15 ml-Polypropylenröhrchen durch Zugabe von 9 ml DMEM werden 100 ul N2 Ergänzungen, 10 g / ml Cipro und 1 ml FBS.
- Die Isolierung der Embryonen:
HINWEIS: In diesem Verfahren zum Kultivieren von Cochlea-Explantate aus embryonalen Mäuse, Ernte Innenohren aus embryonalen Tag (E) 13 Schläfenbeine mit dem Tag nach der Befruchtung als E1 9 berücksichtigt. Das Protokoll kann auch mit embryonalen Maus inneren Ohren beginnend von E12 bis E18 verwendet werden.- Euthanize eine zeitgesteuerte schwangeren Maus mit CO 2 und opfern Tier durch Genickbruch oder entsprechend zugelassenen Protokollen. Führen Sie die Euthanasie von Laminar-Flow-Gewebekultur Haube, um die Sterilität in der Gewebekulturraum zu erhalten.
- Zeigen eingeschläfert Maus auf Papiertuch mit Bauch nach oben und desinfizieren Bauch mit 70% Ethanol.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle durch Greifen der Hautmit einer gebogenen Pinzette mit einer Hand und schnitt Epidermis und Muskeln entlang der Mittellinie mit einer Schere mit einer anderen Hand. Machen Sie zwei senkrechte Schnitte auf beiden Seiten und ziehen Sie den Uterus sorgfältig durch Anheben bilateralen Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und entfernen Sie sie von unten Binde mit Gewebe Schere.
- Setzen Sie den embryonalen Kette in einer Petrischale mit Kalt Dissektion Lösung (HBSS / HEPES-Gemisch) und Transfer zum Laminar-Flow-Sterilbank.
- Embryonen vorsichtig aus Plazenta und legen Sie sie in einem der sterile Petrischalen mit Dissektion Lösung. Wenn die Lösung färbt sich blutig, verschieben Sie sie in eine neue Petrischale.
HINWEIS: An dieser Stelle können Embryonen mit einem Theiler Inszenierung Führung statt. - Enthaupten Embryonen durch Kneifen im Halsbereich mit einem Paar von sauberen Pinzette oder Schere und legen die Köpfe in einer Petrischale mit frisch gekühlt Sezieren Lösung.
- Dissection der inneren Ohren:
- Ort one Embryokopf in einem sterilen Sylgard Schale mit kaltem Seziertisch
- Lösung. Arbeiten unter einem Binokular mit einer Vergrößerung von ~ 1,6X, immobilisieren den Embryo Kopf, indem Minutien Stifte oder um näher an Augenbereich (1A).
- Mit zwei Paar sterile Pinzette vorsichtig die Haut und die Öffnung des Schädels auf der Rückenseite entlang der Mittellinie (Abbildung 1B). Entfernen Gehirn von Schädelhöhle und Innenohren im Schläfenbeine befindet, kann in diesem Stadium (1C, D) identifiziert werden. Die Auskleidung des Blutgefäßes, die normalerweise um den Innenohren vorhanden ist, kann als Bezugspunkt für die Identifizierung des Innenohrs in dieser Phase (1D) verwendet werden.
- Präparieren Sie die Innenohr von der zeitlichen Knochen, indem die Zange unterhalb des Gewebes und Isolierung des Innenohrs von der Schädelbasis und in ein neues Gericht, das kalt Sezieren Lösung (1E, F).
2. Erzeugung von Corti-Organ Explantatkulturen
HINWEIS: In diesem Stadium der Entwicklung wird das Gewebe Knorpel und kann mit einer Pinzette leicht präpariert werden.
- Richten Sie das Innenohr, so dass Bauchseite nach oben zeigt (Abbildung 2A) und Stabilisierung des Innenohrs durch leichtes Einsetzen des scharfen Ende Minutien Stifte durch die vestibulären Teil des Innenohrs (2B).
- Mit ultrafeinen Zange aufgeschnitten das darüber liegende Knorpel durch einen Einschnitt mit einem Ende der Zange in der Nähe von dem ovalen Fenster und entfernen Sie vorsichtig den Knorpel aus der Hörschnecke (2C).
Hinweis: Es ist wichtig, sicherzustellen, dass Zange nicht zu tief in den Knorpel einge als darüberliegenden Knorpel wird manchmal mit dem Schneckengang in diesem Fall ist es hilfreich, geschlossener Zange verwenden, um Knorpel von dem darunterliegenden Schneckengang frei durch Abkratzen unter der kondensierte sberfl des Knorpels. In diesem Stadium der Entwicklung, ist die Spirale der Cochlea nur drei Viertel einer Umdrehung in der Länge. - Als nächstes setzen die Sinnesepithel indem die Zange in dem bevorzugten Bereich der Schneckengang entweder der Basis oder an der Spitze sehr, und sanft herausziehen das Dach der Cochlea (2D).
HINWEIS: Das Dach der Cochlea muss vollständig entfernt werden, da es die Sinnesepithel behindern die Analyse maskieren.
HINWEIS: Dieses Verfahren muss vorsichtig erfolgen, da es einfach ist, die Sinnesepithel reißen werden. - Als letzter Schritt, vorsichtig die zugrunde liegenden Bindegewebe von der freiliegenden Sinnesepithel so dass die Basis der Cochlea-Explantat gleichmäßig flach.
- Isolieren Sie die seziert Cochlea von der vestibulären Teil des Innenohrs mit einer Pinzette. Dies kann vor oder nach dem Schritt 2.4 (2E) durchgeführt werden.
- Übertragen Sie die seziert Cochlea Sinnesepithel in einen Keller membrane Matrix-beschichteten Kultur auch mit einem 1,5 mm sterile scooper (2F).
- Richten Sie die Cochlea-Explantat mit der Lumenoberfläche des Epithels nach oben ein und saugen Sie den Basalmembranmatrix-DMEM-Lösung sorgfältig zu glätten das Gewebe und ersetzen Sie es mit 150 ml frisches Kulturmedium durch sanftes Zugabe in die Schale. Ist darauf zu achten, um sicherzustellen, dass jedes Explantat haftet gut auf der beschichteten Glasdeckglas und wird nicht in das Kulturmedium schwimm werden. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Zange wird darauf hingewiesen, während der Anbringung des Glases auch um eine Beschädigung der Cochlea Explantation.
- Die Kulturschale vorsichtig Führung in eine sterile 150 mm Kulturschale und in eine Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für eine gewünschte Zeitdauer, in der Regel 3-6 Tage in vitro (DIV). Nach 1 DIV, untersuchen Sie die Kulturen unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass die Cochlea-Explantat wurde auch in die Kulturschale eingehalten werden.
- Nach dem incubation in vitro für die gewünschten Zeitdauern werden die Kulturen für die Immunhistochemie verarbeitet.
HINWEIS: Die Explantatkulturen Regel werden 6 DIV das entspricht Entwicklungsstufe, P0 inkubiert. Nach Inkubation in vitro können Kulturen für Downstream-Anwendungen wie die Immunhistochemie (3B) verarbeitet werden, RT-PCR, in situ-Hybridisierung und / oder Western Blot.
3. Elektroporation vermittelte Gentransfer
- Die Einrichtung für die Elektroporation:
- Sterilisieren Sie einen 100 mm Sylgard-beschichtete Glasschüssel durch Autoklavieren oder Eintauchen in 70% Ethanol für etwa 20 Minuten und an der Luft trocknen in einer Sterilbank vor der Verwendung.
- Bereiten DNA aus einem Expressionsvektor der Wahl mit geeigneten Maxi- oder Midi-Prep-Kits. Die in diesem Protokoll verwendeten Expressionsvektoren sind pIRES2-Atoh1.EGFP und pCLIG-NeuroD1.EGFP. Die Endkonzentration der DNA sollte mindestens 1 ug / ul in sterilem DNA sein /RNase-freies Wasser.
- Elektroporation DNA in embryonale Cochlea Explantate:
- Fügen Sie 10 ul der Plasmid-DNA-Lösung auf eine frische 100 mm Sylgard beschichtete Schale und übertragen eine komplett zerlegt Cochlea Explantation (aus Schritt 2.5 erhalten) in die DNA-Lösung.
- Mit Lumenoberfläche des Epithels nach oben, kippen Sie das Cochlea leicht, so dass es senkrecht zur Ebene der Schale.
- Die Elektrode Schaufeln auf beiden Seiten der Cochlea mit negativen Paddel (Kathode) in Richtung des sensorischen Epithels und der positiven Paddel (Anode), die benachbart zu der Basis der Cochlea.
Hinweis: Da die DNA negativ geladen ist, von negativ nach positiv Elektrode und durch die Plazierung einer Kathode Ende der Sonde angrenzend an das Riechepithel wandert es; die DNA wird vor allem durch die Oberfläche des Sinnesepithel gehen. - Mit Elektroporator liefern 9-10 Pulse von 24 mV, 30 ms Pulsdauer mit dem Fußschalter auf T-er Elektroporator, und fügen Sie 100 ul von warmem Kulturmedium, um die elektroporierten Cochlea.
- Die Schritte 3.2.1-4 für alle Cochlea Explantate und DNA der Gene von Interesse und übertragen die elektroporierten Cochleae in die Basalmembran-Matrix-beschichtete Schale zum Plattieren (Schritt 2.7). Kultur ganze elektroporiert Cochleae in einem 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für gewünschte Zeitdauern, die dann für Immunzytochemie verarbeitet werden.
HINWEIS: Die Schnecke aus einem ganzen Wurf von CD1 Maus (ungefähr 8-12 Welpen) isoliert werden, mikrodissezierten, elektroporiert und in <4 Stunden überzogen.
4. Analyse der Cochlear Explantatkulturen
HINWEIS: Die Kulturen werden in der Regel für 6 DIV, die äquivalent zu der Entwicklungsstufe, P0 ist, inkubiert. Nach Inkubation in vitro werden die Kulturen fixiert und für Immunzytochemie verarbeitet.
- Nach gewünschte Länge incubation Entfernen Kulturmedium schnell und gründlich die Cochlea Explantat in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Inkubation in 4% Paraformaldehyd (in PBS) für 15 min bei Raumtemperatur.
- 15 min Waschen Sie die Fixiermittel durch Zugabe von PBS und spülen in PBS dreimal.
- Permeabilisieren Verwendung von PBS-T (PBS + 0,5% Tween) für 30 min vor dem Blockieren mit PBS-T, enthaltend 10% Ziegenserum.
- Inkubiere in primären Antikörperlösung, die Primärantikörpers in PBS-T mit 1% Ziegenserum über Nacht bei 4 ° C.
- Dreimal Waschen Sie die Cochlea bei Raumtemperatur mit PBS-T jede 15 Minuten, bevor Sie entsprechende Alexa-konjugierten Sekundärantikörper.
- Da der Cochlea Explantat auf Glasdeckgläschen kultiviert sie können einzeln durch Isolierung des Deckglases von der Schale und die Montage auf einer Folie verarbeitet werden. Dies kann durch Eintauchen der Kulturschale in OS30 Lösungsmittel für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur erreicht werden. Mit dem sterilen Rasierklinge, nehmen Sie den Deckglas aus der dish und montieren auf einer Folie und sichtbar unter einem Fluoreszenzmikroskop.
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Discussion
Alle Zellen innerhalb des membranösen Labyrinth des Maus Innenohres einschließlich sensorischer, nonsensory und die Spiralganglienneuronen sind alle aus placodally abgeleiteten otocyst benachbart zu dem Hinterhirn des Ektoderms rund E8 10-14 abgeleitet ist. Bei E11 ventralen Bereich des otocyst erstreckt, um den Schneckengang zu bilden, und die Entwicklung geht weiter, eine Gruppe von Epithelzellen in der Cochlea als auch in anderen Bereichen des otocyst, werden als prosensory Patches, anschließend Hieraus wird angegeben verschiedene Arten von mechanosensorischen Haarzellen und Stützzellen nonsensory. In der Entwicklung von Cochlea, können eine Reihe von inneren Haarzellen und drei Reihen von äußeren Haarzellen um E15.5 und E17 identifiziert werden kann, ist im Wesentlichen abgeschlossen Strukturierung mit einzelnen Reihe von inneren Haarzellen, Säule Zellen und drei Reihen von äußeren Haarzellen . In einer Zeitperiode, die von E11 überspannt, wenn der Schneckengang beginnt zuerst durch E17 wachsen alle difschiedlichen Zellschicksal Entscheidungen und Musterung kommen in der Entwicklung von Epithel, eine markante zelluläre Muster mit einem üblichen Ergänzung der Haarzellen und Stützzellen zu erzeugen. Verlust der Haarzellen und / oder Stützzellen ist die häufigste Ursache der Schwerhörigkeit. Da diese Zelltypen werden nur während einer relativ kompakten Zeitraum während der embryonalen Entwicklung erzeugt wird, ist es entscheidend, die molekularen und genetischen Signalwege, die jede dieser Zelltypen, die wichtige Einblicke in regenerative Strategien führen sollen angeben verstehen.
Cochlear Kultivierung und Elektroporation Techniken entwickelt worden, um die Genexpression im sich entwickelnden Maus manipulieren. In diesem Video haben wir gezeigt, Kultivierung Techniken zur Erzeugung von primären Explantaten und eine Elektroporation Technik für den Gentransfer in kultivierte embryonale Maus-Corti-Organ. Die primäre Explantate auf diese Weise hergestellt wurden, können für 7-10 Tage in vitro aufrechterhalten werden. Cochlear Explantate can verwendet werden, um die Genexpression durch pharmakologische Ansätze, die es uns ermöglichen, die Mechanismen, die Entwicklungsprozesse wie Schicksal Spezifikation, Engagement, Differenzierung und Strukturierung regeln verstehen zu manipulieren. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Analyse von Entwicklungs Phänotypen der Mutanten embryonalen Mäuse, die nicht in der Vergangenheit E12 überleben.
Die Rechteck Elektroporation vermittelte Gentransfer Verfahren stellt einen Mechanismus zur Manipulation der Genexpression in sensorischen Haarzellen, Stützzellen und Zellen innerhalb GER und LER Regionen, um ihr Schicksal ex vivo zu visualisieren. Mit diesem Verfahren können wir herunterregulieren oder ektopisch exprimieren spezifische Gene in prosensory Zellen, Haarzellen und / oder Stützzellen in einem ansonsten Wildtyp-Hintergrund und ihre spezifischen Auswirkungen auf das Schicksal Spezifizierung und Differenzierung analysieren. Dies wird es uns ermöglichen, spezifische Gen-Funktion in der Entwicklung von Cochlea zu verstehen. Zum Beispiel, wie in gezeigt,
Obwohl cochear Kulturen kann so früh wie E12, die Elektroporation von Cochlea Explantate jünger als E12.5 hergestellt werden / E13 wird einer Beschädigung des Gewebes zur Folge, was es mühsam für die Analyse. Darüber hinaus wurde der Promotor des Expressionsvektors bestimmt, welche Zelltypen innerhalb der Cochlea du transfiziertct. Beispielsweise kann die menschliche Cytomegalovirus-Promotor enthaltenden Expressionsvektoren ergibt robust Transfektion in Kollikers 'Organ, während die Verwendung des frühen CMV-Enhancer / chicken beta-Aktin-Promotor führt zu einer höheren Effizienz der Transfektion in Zellen innerhalb des sensorischen Epithels. Die häufigsten Probleme bei der Elektroporation von embryonalen Cochlea Explantate begegnet sind übermäßige Zelltod und / oder Beschädigung des Gewebes und schlechte Transfektionseffizienz. Der geeignete Abstand der Elektroden und die DNA-Konzentration eine entscheidende Rolle beim Erhalten minimaler Schädigung und höhere Transfektionseffizienz. Insgesamt verbessert diese Techniken unsere Fähigkeit, die Genexpression über Gewinn oder Verlust der Funktion Strategien und pharmakologische Manipulationen zu manipulieren und eine große Hilfe in Sezieren Signale, die Musterbildung und Zellschicksal Entscheidungen zu beeinflussen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Gibco | 14065-056 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Dulbecco’s Modified Medium | Gibco | 12430-054 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Ciprofloxacin hydrochloride | Cellgro | 61-277-RF | |
| Glass Dish 60 mm | Kimble Chase | 23062-6015/23064-6015 | |
| Glass Dish 100 mm | Kimble Chase | 23064-10015/23062-10015 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Pulse generator | Protech International Inc | CUY21Vivo-SQ | |
| Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356237 | |
| Culture dish, 60 x 15 mm | Becton Dickinson | 353037 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010-023 | |
| OS-30 | Dow Corning | 4021768 | |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Conical tubes, 15 ml | Greiner Bio-one | 188261 | |
| Myosin 6 | Proteus Biosciences Inc | 25-6791 | |
| Myosin 7a | Proteus Biosciences Inc | 25-6790 | |
| TuJ1 | Sigma | T2200 |
References
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