Summary
Восстановление трансмембранного белка, KvAP, в гигантские однослойные везикулы (GUVs) демонстрируется в течение двух методов дегидратации-регидратации - electroformation, и гель-помощь набухания. В обоих методах, небольшие однослойные везикулы, содержащие белок слиты вместе, чтобы сформировать GUVs, которые затем могут быть изучены с помощью флуоресцентной микроскопии и патч-зажим электрофизиологии.
Abstract
Гигантский однослойные везикулы (GUVs) являются популярным биомиметический системой для изучения мембран связанные с ней явления. Тем не менее, обычно используются протоколы расти GUVs должны быть изменены, чтобы сформировать GUVs содержащие функциональные трансмембранных белков. Эта статья описывает два способа дегидратации-регидратации - electroformation и гель-помощь отеки - сформировать GUVs, содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP. В обоих способах раствор белка, содержащего небольшие однослойные пузырьки частично обезвоженной чтобы сформировать стопку мембран, который затем дают набухнуть в буфере повторной гидратации. Для метода electroformation, пленка наносится на платиновыми электродами, так что поле переменного тока могут быть применены во пленки регидратации. В отличие от этого, способ отек гель-помощь использует агарозном геле подложку пленки для повышения регидратации. Оба метода могут производить GUVs в низких (например, 5 мМ) и физиологических (например, 100 мм) концентрации соли, Полученные GUVs характеризуются с помощью флуоресцентной микроскопии, и функция восстановленных каналов измеряется с использованием конфигурации патч-зажим наизнанку. В то время как опухоль в присутствии электрического поля переменного (electroformation) дает высокий выход бездефектных GUVs, метод отек гель-помощь производит более равномерное распределение белка и не требует никакого специального оборудования.
Introduction
При изучении физических принципов, которые регулируют живые системы, снизу вверх подходы позволяют экспериментатор контролировать состав системы и другие параметры, которые не так легко манипулировать в клеточных систем 1. Для мембранных процессов на основе Giant однослойные везикулы (GUVs, диаметр ~ 1-100 мкм), оказались очень полезным Биомиметические Система 2 - 7, как они хорошо подходят для микроскопических исследований и микроманипуляций 8 - 10. В то время как есть много различных протоколов для производства GUVs, большинство делятся на две категории - эмульсия на основе подходов 11,12 и методы, основанные на станавливающим липидной пленки 13 - 16. В эмульсионных основе методов, внутренние и внешние листовки GUV мембран собраны последовательно от липидных монослоев на вода / масло интерфейсов. Этот подход является идеальным для инкапсуляции растворимые белки св GUVs, и для формирования GUVs с асимметричной композиции листовка липидов. Тем не менее, GUVs, образованные из эмульсий может сохранить следы растворителя, которые изменяют механические свойства мембраны 17, и подход не является особенно хорошо подходит для транс-мембранного восстановления белка.
Способы пленки регидратации рассчитывать на то, что сушка (обезвоживание) вызывает много смеси липидов с образованием нескольких слоистую стопку мембран. Если это стопка затем помещают в контакт с водным буфером, мембраны в стеке будет раздвигаться в качестве растворителя потоков между ними, а на поверхности штабеля, отдельные мембраны могут отделить, чтобы сформировать GUVs 13,18 (а настоящую зоопарка другие липидные объектов). Тем не менее, даже в оптимальных буферных и липидных композиций, этот метод классических "спонтанное набухание" имеет относительно низкий выход бездефектных GUVs. Один широко используемый метод для повышения урожайности бездефектных GUVs является "electroformation221 ;, в котором поле переменный ток (AC) применяется при фильма регидратации. В то время как механизм остается плохо изученным, "electroformation" может дать впечатляющие урожаи ПРАВ (> 90% при благоприятных условиях) для концентрации буферов с низким содержанием соли (<5 ммоль) 14,19, и может работать даже в физиологических буферов (~ 100 мм) с использованием Более высокая частота (500 Гц против 10 Гц) переменного поля и платиновые электроды 15. Альтернативный подход, чтобы повысить выход бездефектных GUVs является "гель-помощь отек", в котором липид раствор наносят на полимерную подложку гель, а не пассивным (например, стекло, PTFE) подложки используется в классической "спонтанной набухания ". Когда результате окисления липидов / гель фильм регидратации, GUVs может быстро сформировать даже по физиологическим буферов 16,20.
Все эти методы могут производить липидов только GUVs, которые могут быть использованы для изучения мембранных связаны такие явления, какВзаимодействие между растворимых белков и мембран. Тем не менее, чтобы включать транс-мембранного белка в GUVs, значительные изменения необходимы, чтобы гарантировать, что белок остается в функциональном состоянии в течение всей процедуры восстановления. В то время как растворы липидов в органических растворителях (например, хлороформ, циклогексан) идеально подходят для изготовления пленок липидов, транс-мембранные белки, как правило, только стабильны, когда их гидрофобным трансмембранным доменом встроен в липидный бислой или окружен моющего средства мицеллы ( например, во время очистки белков). Таким образом, исходный материал для восстановления, как правило, родной мембраны, очищенный белок в растворе моющего средства, или небольшие однослойные белка, содержащего везикулы (Proteo-внедорожников) и / или мульти-пластинчатые везикулы (Proteo-ГРЩ), образованные при удалении моющего средства в Наличие липидов. Большинство методов, чтобы включить эти мембранные белки в GUVs делятся на три категории.
Прямая Insertioн: Транс-мембранный белок приостановлено в производстве моющих средств смешивают с предварительно сформированным, липидов только, мягко моющих растворенных GUVs и моющим средством, затем удалить с помощью biobeads 21. В то время как концептуально простой, этот метод требует точного контроля концентрации моющего средства, а слишком высокая концентрация моющего средства может растворять GUVs то время как слишком низкой концентрации могут вызвать белок разворачиваться или агрегировать.
GUV / Proteo-внедорожник Fusion: Белок в протеобактерий-внедорожников в сочетании с заранее сформированным, липидов только GUVs и слияние способствует специальными фузогенные пептидов 22 или моющего средства 21. Обычно степень плавления в ограниченной приводит к GUVs с низкой плотностью белка.
Обезвоживание / Регидратация: белок, содержащий липидную пленку формируют путем частичного обезвоживания Proteo-SUV (или Proteo-MLV) раствора и GUVs которые затем выращивали в течение чистого липидной пленке. Очевидно, задача состоит в том, чтобы защитить белок во время частичного dehydratiна этапе 23, но метод был успешно использован для восстановления транс-мембранных белков, таких как Бактериородопсин, кальций-АТФазы, интегрина и VDAC в GUVs 7,23 - 25.
В этой статье описаны протоколы дегидратации / регидратации, чтобы GUVs содержащие калиевого канала потенциалзависимыми, KvAP, с гипер-термофильные археи, Aeropyrum pernix. KvAP имеет высокую степень гомологии в эукариотической напряжения зависимых калиевых каналов 26 и известную кристаллическую структуру 27 , что делает его хорошей моделью для изучения механизма напряжения стробирования. Производство протеобактерий-внедорожников был подробно описан ранее, и не является частью данного руководства 26,28,29. Важно отметить, что KvAP Proteo-внедорожников не должны быть подготовлены для каждого препарата ГУВ, как они могут быть сохранены в небольших (например, 10 мкл) аликвотах при -80 ° С в течение длительных периодов времени (> 1 год). Electroformationили гель-помощь опухоль может быть использован для выращивания GUVs от KvAP протеобактерий-внедорожников (или Proteo-ГРЩ).
Ключевые шаги для протокола electroformation показаны на рисунке 1. Капли раствора внедорожников, содержащих белок осаждаются на платиновых проводов (как показано на рисунке 2). Частичное обезвоживание суспензии на SUV приводит к образованию липидов белка пленки путем слияния внедорожников. Во время регидратации переменного поля, приложенного к электродам, чтобы помочь липидные слои отслаиваются и образуют GUVs. Поле 10 Гц работает хорошо при использовании "с низким содержанием соли" (<5 ммоль) регидратация буфер 28 и GUVs занять несколько часов, чтобы расти. В отличие от этого, физиологические буферы (содержащий ~ 100 мм соль) хорошо работают с меньшим напряжением, 500 поле Гц переменного тока, но требуют длительного (~ 12 ч) отек период 15. Этот метод основан на более ранней протокола с использованием ИТО скользит 24, но использует пользовательский камеры продолжениеAining два платиновых провода, как показано на рисунке 2 (см дискуссию для проектирования деталей и предложения по проще, самодельные камеры).
Фиг.3 иллюстрирует способ отек гель-помощь. Протокол хорошо работает с буферами с физиологических концентрациях соли, протекает быстро, и производит GUVs с более однородным распределением белка. Тем не менее, выход из изолированных, по-видимому, без дефектов GUVs (т.е. GUV мембрана однородна по оптической длины масштабах и не заключать какие-либо предметы) ниже, хотя он обеспечивает достаточное количество для патч-зажим и микро-манипуляции экспериментов , Этот метод был основан на протоколе с использованием агарозном геле с получением липидов только GUVs 16 и требует специального оборудования меньше, чем метод electroformation.
Характеристика GUVs с флуоресцентной микроскопии описано, а также процедуры с использованием стандартного патч-зажим набора кизмерения KvAP деятельность в "наизнанку" вырезали мембраны патчи.
Рост содержащие белок GUVs может быть более сложным, чем липидных только GUVs. В частности, конечный выход ГУВ может зависеть от чувствительно точно, как SUV раствор осаждают и обезвоженной, чтобы сформировать стопку мембран. Для человека без каких-либо предыдущий опыт с GUVs, это может быть полезно, чтобы первые растут липидов только GUVs после обычного протокола 15,16, в котором мембрана пленка, путем осаждения липидов из органического растворителя. После того, как обычный протокол работает хорошо, осаждение внедорожник и частичное обезвоживание может быть освоено с помощью липидов только внедорожники, которые также очень полезны при настройке протокола для нового состава липидов. Когда GUVs расти надежно от липидных только внедорожников, это то только маленький шаг для получения белка, содержащего GUVs из протеобактерий-внедорожников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Решение Подготовка
- Подготовка 5 мл буфера "джипа", содержащего 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES (рН 7,4) или трис (рН 7,5) и 2 мМ трегалозы. Фильтр буфер с шприцевой фильтр 0,2 мкм и разделить на 1 мл аликвоты, которые могут храниться при температуре -20 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная информация для реагентов и приборов даны в списке материалов. - Подготовка 40 мл ПРАВ "роста буфера", который наполнит ПРАВ интерьер во пленки регидратации. Для '' с низким содержанием соли роста, объединить 5 мМ KCl, 1 мМ HEPES (рН 7,4) или 1 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 400 мМ сахарозы. Для '' физиологический солевой роста, объединить 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) или 5 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 200 мМ сахарозы.
- Подготовка 40 мл буфера 'наблюдения' для внешнего раствора в экспериментальной камере путем объединения 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES (рН 7,4) или 5 мМ Трис (рН 7,5), и ~ 200 мМ глюкозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти буферы только EXAmples. Смотрите обсуждение адаптировать буферы для других экспериментов. - Измерьте osmolarities роста и наблюдения буферы с осмометра. Добавить гранулы сахарозы или глюкозы, чтобы соответствовать им в пределах 1%, так что GUVs не растворит или свернуть, когда перевели из камеры роста на смотровую камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом диапазоне концентраций, добавив 1 мМ сахарозы (13,7 мг на 40 мл) или глюкозы (7,2 мг на 40 мл) повышает осмолярность от ~ 1 мОсм. - Фильтр роста и наблюдения буферы с 0,2 мкм фильтр и хранить их при 4 ° С для ингибирования роста бактерий.
- Растворите 50 мг бета-казеина в 10 мл 20 мМ Трис (рН 7,5) буфера с образованием 5 мг / мл бета-казеина раствор, необходимый для пассивации поверхности экспериментальных камер, так что GUVs не прилипают, распространение и разрыва. После того, как бета-казеин полностью не растворится (до нескольких часов при 4 ° С), фильтр (0,2 мкм) его в 0,5 мл аликвоты, которые могут быть заморожены и хранитьсяпри -20 ° С для последующего использования (размороженных аликвоты хранили при 4 ° С, как правило, могут быть использованы на срок до 1 недели).
2. SUV Подготовка
- Подготовка и заморозить аликвот протеобактерий-внедорожников, следующих за ранее опубликованные подробный протокол 28. Используйте KvAP флуоресцентно меченных с Alexa-488 малеимид, восстановленного в DPhPC внедорожников (10 мг / мл) в соотношении белка в липидной 1:10 (по массе).
ПРИМЕЧАНИЕ: дикого типа KvAP содержит один цистеин на мономер находится рядом с внутриклеточной С-конца (аминокислоты 247). - Флуоресцентные липидные только внедорожники:
ПРИМЕЧАНИЕ: Ручка хлороформ под вытяжкой носить нитриловые перчатки и защитные очки. Избегайте использования любого пластика, как хлороформ могут растворять их. Хлороформ растворы можно хранить в стеклянных флаконах янтарного с тефлоновыми крышками и переносят с помощью шприца стекла. Позаботьтесь, чтобы промыть все посуды по меньшей мере, от 5 до 10 раза хлороформом до и после пипетки липидов.- Подготовьте 100 мкл10 мг / мл DPhPC внедорожников, содержащие 0,5 моль% от красного флуоресцентного липида, Texas Red-DHPE, путем смешивания 100 мкл раствора DPhPC (10 мг / мл в хлороформе) с 8,2 мкл раствора техасский красный-DHPE (1 мг / мл в метаноле) в стекл нный сосудик на 1,5 мл янтарного.
- Сушат липиды вниз под потоком азота в химической капотом при вращении флакона. Когда появится фильм должна быть сухой, положите липидов под вакуумом в течение 3 ч, чтобы удалить остатки растворителя.
- Добавить 100 мкл буфера для SUV липидов и вихревые энергично, пока не липидов не застревает на стенках флакона, и раствор равномерно молочно.
- Разрушать ультразвуком липидов раствора с образованием внедорожников. Отрегулируйте флакон позицию, пока УЗИ не вызывает наибольшее движение и поток внутри флакона, и заботиться, чтобы не нагревать решение без необходимости. Продолжить обработку ультразвуком до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, и, когда это возможно, прозрачным (2-5 мин в течение наконечника ультразвуком, ~ 20 мин для ванной ультразвуком).
- Aliquoт внедорожники (например, 10 мкл или 20 мкл) и заморозить (-20 ° C) для последующего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: липиды, особенно ненасыщенных липидов, может легко пробоя. Липидов Store Solutions при 20 ° C (или 80 ° C) в атмосфере аргона и использовать в течение 6 месяцев. Липидов продукты распада могут быть обнаружены при помощи тонкослойной хроматографии.
3. GUV рост за счет Electroformation
- Подготовка electroformation камеру.
- Если камера не была очищена, снимите окна, протрите все герметик и смазку, извлеките провода, и промойте и скраб камеру с ткани с использованием воды и этанола (≥70%) попеременно.
- Протрите провода и погрузите провода и камеру в ацетоне, и разрушать ультразвуком в течение 5 мин. Протрите все с ткани еще раз, используя ацетон. Поместите камеру в этаноле и разрушать ультразвуком в течение 5 мин.
- Соберите камеру, вставив провода через отверстия и поверните и протрите провода, чтобы убедиться, что они аре чистоте. Поместите камеру в дистиллированной воде, разрушать ультразвуком в течение 5 мин и сушат камеру с потоком азота или воздуха.
- Подготовка 30 мкл 3 мг / мл суспензии в SUV SUV буфера. Для формирования белка, содержащего GUVs, объединить 8 мкл протеобактерий-внедорожников (DPhPC 10 мг / мл KvAP 1:10), 2 мкл флуоресцентных внедорожников (10 мг / мл DPhPC, 0,5 моль% TexasRed-DHPE) и 20 мкл SUV Буфер в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для окончательного белка липидов (по массе) соотношении 1: до 12,5 и 0,1 моль% TexasRed-DHPE. Смешайте раствор энергично.
- С другой стороны, на практике протокол с липидами только внедорожников, просто объединить 10 мкл флуоресцентных внедорожников (10 мг / мл DPhPC и 0,5 моль% TexasRed-DHPE) с 20 мкл буфера SUV.
- Депозит внедорожник решение.
- Используйте 2 мкл пипетки или 5 мкл стеклянный шприц для нанесения небольших (<0,2 мкл) капелек внедорожник решения на проводах. Приблизительно 1 мкл раствора необходимо, чтобы образовать ряд капель вдоль1 см проволоки. Убедитесь, что капли достаточно малы и расположены достаточно далеко друг от друга, что они не касаются или предохранитель.
- Пусть хранение внедорожники высохнуть в течение ~ 30 мин на открытом воздухе. Когда все капли поселились, поверните провод так, липидные отложения легче наблюдать под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если внедорожники не высыхают достаточно, они могут просто смыть проводов при буфера рост будет добавлен, время сушки слишком много может повредить белок. Потому что влажность воздуха влияет на скорость сушки, время сушки и / или влажности воздуха можно регулировать для достижения оптимальных результатов 30. Липидную пленку на проводах должны быть видны под микроскопом.
- Соберите камеру.
- Уплотнение основания камеры: С помощью шприца для применения вакуумной смазки в нижней части камеры вокруг трех скважин и пресс 40 мм х 22 мм покровное осторожно против него, чтобы запечатать дно камеры так, чтобы она прилипает без зазора. Печать стороны камеры (где выход провода) сгерметик. Применение вакуумной смазки на верхней части камеры с изложением три скважины.
- Медленно добавьте буфер роста, пока каждый хорошо не заполнен до самого верха. Избегайте быстрого движения раствора в лунках, так как это может лишить липидной пленки с электродами.
- Закройте камеру, нажав на верхнюю крышку слайд мягко на смазку, стараясь не сместить нижнюю покровное. Использование ткани, чтобы удалить любые капли буфера на краях верхней покровным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошее время, чтобы изучить камеру под микроскопом, чтобы подтвердить, что липидная пленка осталась на проводах.
- Подключите генератор сигнала к проводам с помощью двух зажимов-крокодилов. Установите частоту (10 Гц / 500 Гц синусоидальной волны для низкой / высокой солевого буфера) и с помощью мультиметра для измерения и регулировки напряжения на проводах до 0,7 / 0,35 В среднеквадратическое (Vrms) для низкой / высокой солевого буфера. Крышка камеры с алюминиевой фольгой для защиты от света флуорофоров. Оставьте тон GUVs расти в течение 2 до 3 ч на низкой солевого буфера и 12 ч или O / N для высокой солевого буфера.
- Отключите камеру от генератора и осторожно поместите его на инвертированный микроскоп, чтобы оценить рост ПРАВ. Используйте медленный и стабильный движения или потока жидкости в скважинах может преждевременно снять GUVs от проводов.
ПРИМЕЧАНИЕ: GUVs на проводе краям обычно видны в фазового контраста (40X большое рабочее расстояние объективной), в то время как GUVs в любом месте на нижней половине проводов можно увидеть эпифлуоресцентной. Если не видны GUVs, можно попробовать повернуть провода, чтобы посмотреть на верхней поверхности. GUVs можно хранить при 4 ° С в ростовой камере в течение нескольких дней.
4. GUV рост за счет Гель-помощь Отек
- Подготовка 10 мл 1% -ного раствора агарозы путем смешивания 100 мг агарозы с 10 мл чистой воды. Нагрейте его до кипения, поместив его в микроволновой печи при 480 Вт в течение ~ 20 сек. Движение, чтобы убедиться, что агарозы полностью не растворится.
ПРИМЕЧАНИЕ: решениеможно хранить при 4 ° С и нагревают при необходимости. - Плазма-чистые (воздушно-плазменной) крышка-слайд в течение 1 мин, так что раствор агарозы будет распространяться приятно на него. Используйте кавер-слайды в течение следующего 15 мин, как эффект плазменной очистки стирается быстро.
- Применение 200 мкл теплой агарозном раствора в каждую 22 х 22 мм 2 слайда так что раствор смачивает всю поверхность. Наклоните слайд вертикально и касаться нижнего края к ткани, чтобы удалить лишнюю жидкость и оставить только тонкий гладкий слой агарозы на слайде.
- Поместите слайд на горячей плите или в духовке при температуре 60 ° С и оставить его сохнуть в течение по крайней мере 30 мин. Агарозном фильм едва заметны на глаз. После того, как скользит остыть до комнатной температуры, использовать их немедленно или хранить их в течение одной недели в закрытом контейнере при температуре 4 ° С.
- Поместите в агарозном покрытием покровное в стандартном 3,5 см чашку Петри.
- Подготовка внедорожника решение, как в разделе 3.2, и применить ~ 15 мкл внедорожник раствора (3 мг / мл липидов) в~ 30 очень мелкие капли мягко на агарозном поверхности. Будьте осторожны, не искажают агарозном слой слишком много.
- Поместите слайд в слабом токе азота в течение приблизительно 10-15 мин и последующей испарение буфера на глаз, как капли высыхают.
- Как только внедорожников высохли, добавить буфер роста, чтобы покрыть поверхность скольжения. Для небольшого 3,5 см чашку Петри использованием ~ 1 мл буфера.
- Разрешить опухоль протекать в течение ~ 30 мин, а затем изучить рост GUVs в камере с использованием инвертированного микроскопа с фазовым контрастом или дифференциального интерференционного контраста (DIC).
ПРИМЕЧАНИЕ: эпифлуоресцентной наблюдение затруднено из-за сильного фоне флуорофорами в геле и автофлуоресценции агарозы.
5. Заготовка и наблюдений GUVs
- Пассивировать наблюдения камеры (например, небольшой чашке Петри или покровного стекла), так что GUVs не придерживаться, распространение и взрыв на дно камеры. Обложка ЧамBER дно с бета-казеина раствором, инкубируют в течение 5 мин, промыть казеина раствор чистой водой, сушат в токе воздуха или азота, и, наконец, добавляют наблюдения буфер (например, ~ 5 мм глубина за небольшую чашку Петри).
- Урожай GUVs. Отрежьте конец 100 мкл наконечники пипеток так открытие больше (~ 2 мм в диаметре), и стремятся медленно, как стресс сдвига пипетки может легко разрушить GUVs.
- Для электро-образована GUVs, откройте камеру роста, аккуратно удалив верхний покровное. Поместите кончик пипетки прямо над каждой проволоки и аспирации ~ 50 мкл при перемещении пипетки вдоль провода, чтобы отделить GUVs.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может помочь повернуть провод, чтобы собрать GUVs на "другой стороне" провода. - Для "Гель-помощь отек" GUVs, сначала нажмите на сторону Петри несколько раз, чтобы помочь GUVs оторваться от поверхности покровного. Расположите кончик пипетки прямо над покровным и аспирации 50 мкл а рulling наконечник обратно на поверхность. Непосредственно передача собранных GUVs на смотровую камеру, или магазин в 1,5 мл трубки микроцентрифужных при 4 ° С в течение 1 недели.
- Для электро-образована GUVs, откройте камеру роста, аккуратно удалив верхний покровное. Поместите кончик пипетки прямо над каждой проволоки и аспирации ~ 50 мкл при перемещении пипетки вдоль провода, чтобы отделить GUVs.
- Поместите камеры для наблюдений на инвертированный микроскоп, добавьте GUVs на смотровую камеру и подождите несколько минут, для того GUVs, чтобы поселиться в дно камеры.
- Рассмотрите камеру с фазовым контрастом или DIC, чтобы быстро найти гладкие, сферические ('бездефектных') "GuV кандидатов". Исследуйте каждый "GuV кандидата" в эпифлуоресцентной, чтобы исключить любые, содержащие мелкие липосомы, вложенные в. И, наконец, проверить, что интенсивность флуоресценции липидов является однородным и совместимы с одной мембраной (например, однослойные).
Примечание: В некоторых bilamellar (или нескольких пластинчатых) пузырьков, мембраны слишком близко друг к другу должны быть решены, чтобы они появились однослойными в фазового контраста или DIC изображений. Тем не менее, эти объекты можно отличить от фактического unilameLlar GUVs по их липидного флуоресценции, что в два раза (или больше) ярче.
6. Патч зажима GUVs
- Сделайте патч пипетки с диаметром кончика 1-2 мкм от стандартного боросиликатного капиллярного стекла с использованием программы рекомендуется для пипетки съемника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Специальные методы лечения, такие как пожар полировки не нужны, и пипетки можно использовать в течение нескольких дней после того, как были вытащил, если они хранятся в закрытом ящике. - Пассивации камеру путем инкубации с раствором бета-казеина (5 мг / мл), чтобы гарантировать, что GUVs не прилипают, распространение и разрыв на поверхности камеры. Промойте казеин отключается после 5 мин.
- Вставьте заземляющий электрод, заполнить камеру со смотровой буфера, трансфер 10 мкл ГУВ суспензии, как описано в шаге 5.2 и 5.3, и подождите несколько минут, для того GUVs, чтобы поселиться в нижней части.
- Заполните свежий патч пипетки раствором (наблюдение буфера или другого изо-осмотического раствора) изакрепить его на патч-зажим усилителя headstage.
- Поиск через камеру, чтобы найти "бездефектной" GuV, как описано в разделе 5.4, и убедитесь, что она содержит флуоресцентный белок.
- Нанесите постоянную положительную давление (> 100 Па, или примерно 1 см H 2 O в манометром), чтобы сохранить патч пипетки салон чистый, и вставьте патч пипетки в камере. Принесите патч пипетки в поле зрения, применять тестовые импульсы для измерения / компенсации пипетки напряжение смещения и сопротивления, и изучить пипетку под флуоресцентным освещением, чтобы подтвердить, что наконечник чистый.
- Принесите патч пипетки к GUV, и, если необходимо, одновременно снизить избыточное давление, так внешнем потоке из патча пипетки не делает ПРАВ "убежать". Когда патч пипетки близко к GUV, применять отрицательное давление (до 5 см H 2 O), чтобы вытащить ПРАВ против патча пипетки. Монитор сопротивление как "; Язык "из ГУВ мембраны входит патч пипетки и gigaseal формы.
- Если gigaseal не образуют, удалить патч пипетки из камеры и вернуться к шагу 6.4. Если мембрана патч сформировали gigaseal, но GUV остается прикрепленной к пипетки, вырезать патч, потянув от GUV, заливаясь в GuV против дно камеры, или, коротко, перемещая пипетку из раствора.
- Когда наизнанку мембраны патч был вырезан из GUV и gigaseal является стабильным, выключите испытательных импульсов и применять протокол напряжения, таких как показано на рисунке 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 13 следует стандартной электрофизиологические конвенции о наизнанку патч, в котором ток, протекающий в патч-электрод "позитивный", и V = V ванна - V пипетки. Проведение патч под отрицательным потенциалом (например, V = -100 мВ) в течение ~ 30 сек мест KvAP в состоянии покоя, в то время как шаги (100 мс до 5 сек) до более положительных потенциалах (например, V = 100 мВ) может загонять его в проводящих (например, открытых) активных состояний. - После измерения на мембране патча закончена, разорвать патч с зап или импульса давления и убедитесь, что напряжение смещения патч электрода не дрейфовал. Удалить патч пипетки из камеры, и вернуться к шагу 6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рост GUVs может быть быстро оценена путем анализа ростовой камере под микроскопом. Для electroformation, что GUVs как правило, растут в пучки по платиновых проводов, как показано на рисунке 4. В гель-помощь отек, GUVs появляются в виде сферических структур, которые быстро растут и сливаются вместе (рис 5).
Бездефектной GUVs легче определить и оценить после передачи с камеры для наблюдений. Калибровочные измерения необходимы строго оценивать качество GuV и систематическое количественное была опубликована ранее 28. Однако, как эмпирический ориентир, "хорошие" GUVs должны быть изолированы (т.е. не в кластере), есть одиночные, гладкие, сферические наружную мембрану, не содержит объектов (то есть, трубки, вложенные пузырьки и т.д.) внутри, и есть "стандартный" уровень флуоресценции липидов (яркие объекты, как правило, двух- или много-пластинчатые). Рисунок 6 показывает ОПК и эпифлуоресцентной образы "бездефектной" GUV после перевода в раствор глюкозы изо-осмотического. Контраст в ДВС из-за разницы в оптической плотности между сахарозы заполнено GUV и глюкозы раствор, содержащий ванну. Показатель преломления контраст KvAP-содержащего GUVs часто уменьшается с течением времени, хотя сама KvAP не должны быть проницаемой для сахарозы или глюкозы. Равномерное флуоресценции белка в мембране ГУВ подтверждает, что KvAP включена в GUV (то есть, он не останется в липидной пленки) и не образуется микронных (или больше) агрегатов.
Фигуры 7, 8 и 9 показывают конфокальной изображения липидов и флуоресценции белка от GUVs производимых в соответствии с протоколом нижнего соли electroformation, физиологический солевой протокола electroformation, и гель-помощь набухания протокола. Флуоресцентный липидов (пурпурного) и белка(Зеленый) сигнал были пересчитаны в той же средней интенсивности, так что GUVs с низким / высоким числом белков на единицу площади (плотность белка) имеют малиновый / зеленый оттенок в наложении изображений (правая колонка), в то время как GUVs с Средняя плотность белка белые. Изолированные, бездефектных GUVs были выявлены и распределение по размерам GUV показано на рисунке 10. Обычно electroformation производит больше бездефектных GUVs, чем гель-помощь опухоль, но GUVs произведенные electroformation меньше. Рисунок 11 показывает распределение плотности белка выведенный от флуоресценции GUVs. Electroformation с высоким содержанием соли буфера производит GUVs, в котором плотность белка сильно отличается от GUV к ПРАВ. Плотность белка отдельных GUVs изменяется значительно меньше по electroformation с низким буфера соли, а плотность белка GUVs полученных путем гель-помощь отек удивительно однородным.
Методика патч-зажим является широко использованиеМетод d для изучения функции напряжения закрытого ионных каналов, таких как KvAP. В «изнутри-наружу" записей, чистое стекло "патч" пипетка используется, чтобы вырезать патч мембраны из GUV. Электрод внутри патч пипетки затем используется, чтобы подавать напряжение, и измеряют результирующий ток, протекающий через мембранный участок. Состав мембранной патч может значительно отличаться от остальной части ячейки / GUV 31, но конфигурация "изнутри-наружу" по-прежнему очень полезно для измерения одного проводимость канала, ионной селективности и потенциал-зависимого стробирования. Эти три свойства являются отличным способом, чтобы установить, что токи не из-за артефактов (например, gigaseal вопросы) или загрязняющих веществ (например, бактериальные поринов очистки), и функциональные каналы KvAP в GUVs.
Проводимость канала легче всего определить в виде пятен только с одним или двумя активными каналами. В EXAmple показано на рисунке 12, отверстий, каналов не наблюдается, когда мембрана выдерживают при -100 мВ, тогда как при 100 мВ, отдельные отверсти каналов могут быть четко решены. Ток Гистограмма показывает два пика, соответствующие закрытым и открытым состояниями, и их подгонки с двуспальной функции Гаусса дает единственный действующего канала 10,9 ± 0,85 Па, что соответствует проводимости 109,2 ± 8,5 пс (в 100 мМ KCl). Следует отметить, что проводимость одного канала зависит от раствора (особенно концентрации калия) и состава мембраны 32,33.
Как и многие другие К-каналов, индивидуальный KvAP каналов выставке "болтать" всплески быстрого открытия и закрытия. Как показано выше, селективность калия может быть проверена с помощью другое решение в патче пипетки (например, патч пипетки раствор 90 мМ NaCl, 10 мМ KCl) 28.
Напряжение зависит от стробирования часто ˘Studied пятнами с несколькими каналами, с тем чтобы более легко получить в среднем по ансамблю. Хотя нет никакого очевидного механизма, благоприятствующим физиологические (внутриклеточный домен на ГУВ внутренних дел) и обратный (внутриклеточное домена на ГУВ внешности) вставки из KvAP в GUVs, в "наизнанку" мембранных патчей большинство функциональных каналов есть " физиологический "вставка 28. Рисунок 13 показывает реакцию мембранного пластыря, содержащего множество (> 10) каналах серии 5-секундными деполяризующих шагов. Между каждым шагом, патч проводится при -100 мВ в течение 30 сек, чтобы каналы с «физиологической» вставки, чтобы вернуться в состояние покоя. Когда потенциал достаточно отрицательным (например, V <-60 мВ) большинство ток из-за утечки gigaseal, а иногда отверстия одного или двух каналов, которые, вероятно, чтобы иметь "обратной" вставки. Для шагов в более позитивном Потьеntials, все большее число каналов наблюдаются пока не так много, что отдельные открытия и закрытия не может быть больше не решен. Таким образом, вероятность открытия канала, очевидно, в зависимости от напряжения. Кинетика KvAP активации и инактивации значительно отличаются между черным липидные мембраны (БЛМ) 26 и GUVs, но это согласуется с предыдущими сообщениями, что Kv канала стробирования могут быть чувствительны к составу мембраны и государства 34.
Рисунок 1. GUV Electroformation Схема:. Капли, содержащие внедорожники наносят на электрод Частичное обезвоживание раствора приводит к тому, внедорожники предохранитель, чтобы сформировать стопку мембран. Затем добавляют буфер и электрическое поле переменного тока. Как фильм набухает, отдельные мембраны отделяться от стека, чтобы сформировать GUVs. (Эта цифра была мода маньяков из Aimon и др. 28)
Рисунок 2. GUV Electroformation палата. Камера измельчают из PTFE-блока с трех скважин (диаметром 10 мм, 5 мм в глубину). Два 0,5 мм Диаметр проволоки платины разделены на 3 мм (расстояние от края до края) и расположены близко к нижней части камеры, чтобы облегчить визуализацию проводов. Нижний и верхний скользит крышка удерживается на месте с вакуумной смазкой, и герметик предотвращает любые утечки от провода отверстия на стороне. Генератор переменного тока подключен с зажимами с проводами. Камера на основе одного разработанного Эрнесто Ambroggio и Луис Bagatolli. (Эта цифра была изменена с Aimon и др. 28)
"/>
Рисунок 3. Гель-помощь Спонтанный набухани Схема: Капли, содержащие SUV суспензии наносят на агарозном геле, как капли обезвоживает, что внедорожников предохранитель с образованием липидной пленки.. Когда буфер роста добавляют пленка увлажняет и GUVs образуют на поверхности. GUVs вырасти до размера ~ 10 мкм отеком и слияния с соседними GUVs.
Рисунок 4. Представитель образ DPhPC GUVs, содержащих KvAP растет на платиновой проволоки в буфере с высоким содержанием соли. В GUVs напоминают гроздья винограда вдоль проволоки. Фазового контраста изображения, используя цели 40X УОЖ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. DPhPC GUVs, содержащие KvAP опухоль на агарозном геле. В GUVs видны как слабые сферах диаметром ~ 10 мкм. Темные / Светлые пятна липидов / агарозы агрегаты, из которых пузырьки набухают. Фазового контраста изображения с 40X каротажа в процессе бурения цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Изображения бездефектной GUV. (Яйцо-PC: яйцо-PA 9: 1 по массе), содержащие KvAP помеченный Alexa-488 Слева направо: DIC, справа: Alexa-488 эпифлуоресцентной. Питание: 470/50 нм, эмиссия: 545/75 нм. Обратите внимание на равномерное свечение от KvAP без видимых агрегатов. 81fig6large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7. Конфокальные изображения липидов (Magenta) и белка (зеленый) флуоресценции гальванопластического GUVs, выращенных в буфере с низким соли (Egg-PC: яйцо-PA 9: 1 по массе) () белые стрелки знак (вероятно). GUVs, в то время как красная стрелка отмечает потенциально би-пластинчатые пузырек с более высокой флуоресценции липидов. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции ярче в центре этого изображения из-за крайне большого поля зрения. (B) Zoom показывает небольшую группу GUVs. Left (пурпурный): возбуждение TexasRed-DHPE: 543 нм лазерный луч, эмиссия: 605/70 нм. Центр (зеленый): KvAP помечены возбуждения Alexa-488: 488 нм лазерный луч, эмиссия: 515/30 нм. Справа: Overlay.OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8. конфокальных изображений липидов (пурпурного) и белка (зеленый) флуоресценции от гальванопластического GUVs, выращенных в физиологической концентрации соли (яйцо-PC: яйцо-PA 9: 1 по массе). (A) GUVs (белые стрелки показывают скорее однослойными примеры) более редкими по сравнению с протоколом низкого соли и может иметь совершенно различные концентрации белка (красная стрелка). (B) Zoom показывает небольшую группу GUVs. Left (пурпурный): возбуждение TexasRed-DHPE: 543 нм лазерный луч, эмиссия: 605/70 нм средний (зеленый): KvAP помечены Alexa-488 возбуждения: 488 нм лазерный луч, эмиссия: 515/30 нм. Справа:. Наложение Пожалуйста, слизать здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 9. конфокальной образ липидов (Magenta) и белка (зеленый) флуоресценции GUVs (DPhPC), образованных гель помощь отек с физиологическим буфером концентрации соли. GUVs показывают более однородной плотности белка, чем гальванопластического GUVs, приготовленных с физиологическом буфере. Слева (пурпурный): BPTR-Cer 0,1% возбуждения: 543 нм лазерный луч, эмиссия: 605/70 нм. Средний (зеленый): KvAP помечены возбуждения Alexa-488: 488 нм лазерный луч, эмиссия: 515/30 нм. Справа:. Слияние двух каналов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 11. GUV плотности белка гистограммы: плотность белка (количество белков на единицу площади) GUVs гальванопластики с низким содержанием соли буфера (5 мМ KCl, DPhPC) изменяется меньше, чем при концентрации физиологического солевого (100 мм KCl, яиц-PC: яйцо -PA 9: 1. по массе) плотность белка GUVs (DPhPC), выращенных методом гель-помощь отек в физиологическом солевом буфере демонстрирует наименьшее изменение. Плотность белка пропорциональна интенсивности флуоресценции KvAP-A488 для этих концентрациях 28, а в каждой гистограммы интенсивности флуоресценции нормированы на среднее распределения. (Средняя панель была измененаот Aimon др. 28)
Рисунок 12. Одноканальный деятельность ГУВ мембраны патчи ("наизнанку" конференц-DPhPC напряжения). GUV выращивали в 100 мМ KCl, 5 мМ HEPES рН 7,4 платиновых проводов. Отдельные каналы открытые после применения 100 мВ потенциал на патч. Справа от вставке представлена гистограмма используется для вычисления одного проводимость канала. Красная линия подходит к двойной функцией Гаусса с максимумами при 4,70 ± 0,27 мкА и 15,62 ± 0,58 Па, что соответствует проводимости 109,2 ± 8,5 пс. След фильтруют при 10 кГц с 4-полюсный фильтр Бесселя и записал на 50 кГц.
Рисунок 13. Напряжение-dependen т стробирования каналов в мембране патч из GUV, сформированной на агарозы в буфере с высоким содержанием соли (DPhPC, "изнутри-наружу" конференц-напряжение). () Ответ патч мембраны тока в переходном этапе напряжения. Пипетки и Растворы в ванне оба содержали 100 мМ KCl, и мембрана была проведена в течение 30 сек при -100 мВ между последовательными шагами напряжения. На близком осмотре видно, что след содержит 1 или 2 каналов, которые, кажется, чтобы открыть с отрицательными напряжениями. Вставка) показывает масштаб задержанного открытия и вставка б) задержкой закрытия канала. Токи фильтровали через 4-контактный фильтр Бесселя при 10 кГц и записал на 51,3 кГц. Offline след был с пониженной частотой дискретизации до 513 Гц. Отрицательный емкость переходный обрезается на -150 мкА. (B) Средний ток (0,25 сек <T <5 сек) по сравнению с напряжением ступени. Токи при положительных напряжениях больше, потому что канал открыт вероятность напряжения зависит.Иль / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Биомиметические модели системы являются важным инструментом для изучения свойств и взаимодействия белков и мембран. По сравнению с другими восстановленных систем, таких как БЛМ или поддерживаемых липидных мембран, GUV основе системы представляют несколько возможностей, включая значительный контроль состава мембраны, напряженности и геометрии, а также быть по-настоящему масла. Тем не менее, включение трансмембранных белков, таких как KvAP, в GUVs требует значительных адаптации традиционных протоколов для липидных только GUVs. Протокол electroformation, представленные здесь ранее охарактеризованы и использованы для изучения биофизических принципов распределения мембранного белка и динамики в искривленных мембран 2,4,35. Эта работа демонстрирует новый протокол отек гель-помощь, добавляя к множеству методов белковой восстановления в GUVs. Оба протокола могут производить бездефектных GUVs, содержащие высокую плотность KvAP и измерения внутри-патчи подтвердить, чтоSE GUVs содержат функциональные, зависящие от напряжения калиевые каналы, избирательно.
Эти два подхода имеют свои сильные и слабые стороны. Когда условия с низким содержанием соли могут быть использованы, electroformation обеспечивает хороший компромисс между выходом ГУВ и равномерной плотности белка. Electroformation все еще дает разумные выходы с физиологическими концентрациями солей, но плотность белка могут сильно различаться между GUVs (см рисунки 8 и 11). Вариации плотности-видимому, связана с длительностью electroformation, как рост буфера с низким содержанием соли также могут иметь существенные вариации плотности, если рост продолжается гораздо дольше, чем 2 часа. В отличие от этого, GUVs производимые гель-помощь набухания имеют чрезвычайно равномерную плотность белка, даже физиологических буферах. Тем не менее, часть мульти-пластинчатых пузырьков больше и агарозы автоматического флуоресценции усложняет количественное определение низкой плотности белка 16. Использование поливинилового спирта в плаCE агарозы, как сообщалось, улучшить гель-помощь выход ГУВ, когда липиды осаждали из смеси хлороформ 20, но мы не смогли произвести GUVs использованием поливинилового спирта с растворами внедорожников. Если низкий выход бездефектных GUVs является приемлемым, гель-помощь опухоль имеет явное преимущество для экспериментов, требующих равномерного распределения белка.
Electroformation и гель-помощь отек и имеют совершенно разные требования к оборудованию. Протокол отек гель-помощь использует мало специализированное оборудование для пылесоса плазмы, которая не является существенным, поскольку есть много альтернативных методов получения чистых гидрофильный стекло исключением. В отличие от этого, electroformation требуется пользовательская камера с проволочными электродами. Платиновый провод дорого, но для этого протокола GUVs вырос более легко с платиной, чем титановые проволоки, и GUVs не растут на ITO скользит при использовании физиологические концентрации солей. Диаметр электродов (0,5 мм) помощью компрессораomise между поверхностью электрода и цене. Камера показано на рисунке 2, на основе конструкции Луис Bagatolli 15 и Эрнесто Ambroggio, и был изготовлен из политетрафторэтилена (ПТФЭ), чтобы позволить очистки с большинством растворителей. Тем не менее, полиацеталь или поливинилхлорид (ПВХ) также должны хорошо работать. Возможность удаления платиновые провода для агрессивной чистки важно, и когда начинаете изучать протокол, это очень полезно, чтобы иметь возможность наблюдать рост GuV на месте через нижнюю крышку слайд. Меньше, закрытые колодцы предотвратить решение от болтающихся взад и вперед, а также позволит несколько тестов липидов композиций параллельно. Тем не менее, специальные пользовательские камера не является существенным, когда начинали. Например, простые камеры с одним также могут быть самодельные по лавируя два провода на дно небольшой чашки Петри, или с помощью уплотнительного воск сэндвич их между двумя предметными стеклами, или просто тыкая их через крышку небольшого флакона.
И electroformation и гель-помощь отек протоколы должны производить достаточное количество бездефектных GUVs для микро-манипуляции и патч-зажим экспериментов. Однако выход GUV существенно зависит от формирования стека двухслойной когда SUV раствор частично обезвоженной. При возникновении трудностей в выращивании GUVs (то есть, нет или мало GUVs видны в камере роста), это может быть очень полезно выращивать липидов только GUVs с использованием раствора липидов / хлороформ в месте внедорожников 15,16 (и низкой буферного раствора). Если GUVs не растут хорошо от липидов / хлороформ фильма то что-то фундаментальным является неправильным (например, некорректные решения липидов или буферы, жир или грязь на электродах, неправильное напряжение или частота и т.д.). Однако, если GUVs растут из липидов / хлороформ фильмов, но не фильмы внедорожников, то вопрос может быть с частичной дегидратации.
Шаг частичное обезвоживаниеНаиболее легко оптимизированы с помощью липидов, только внедорожники, потому что нет никакого риска "денатурирующих" липидов чрезмерной дегидратации. Для electroformation, это может быть полезно изучить провода после капельки SUV были высохнуть, чтобы проверить есть яркий липидов флуоресценции в каждой точке, где помещалась капля. Если флуоресценции липидов исчезает после того, как камера заполнена раствором роста, то либо раствор рост должен быть добавлен более тщательно, или внедорожников должны обезвоживают дольше, так что пленка придает более прочно к проводу. Во время роста, убедитесь, что ни проводов, ни решение двигаться в камере (например, при вводе в камеру на микроскопе), чтобы избежать зачистки GUVs от проводов. Когда GUVs хорошо растут, они, как правило, легко увидеть, в контрастных изображений фазы. Тем не менее, небольшие GUVs часто яснее использованием липидов флуоресценции, которое также полезно для просмотра, как стек мембраны изменилось в процессе роста. Проверьте все поверхностипровода (внутри, снаружи, сверху и снизу) во всех скважинах, а также камера пол, прежде чем выбросить рост, потому что дает может значительно варьироваться от одного места к другому.
Обработка и хранение GUVs проста по сравнению с клетками, но GUVs весьма чувствительны к осмотический стресс, поперечных сил и адгезии. Гладкие, мягкие движения важны при уборке или передачи GUVs, и очень важно, чтобы пассивировать поверхностей, чтобы исключить GUVs от присоединения и взрыва. Тем не менее, для локальной фиксации экспериментов камера должна быть тщательно промыты после пассивации так, что пассивация решение не может покрыть патч пипетки и предотвратить gigaseal образование. Для пассивации, бета-казеин лечение является простым и эффективным, и по сравнению с бычьим сывороточным альбумином, который имеет липидный транспортную функцию, бета-казеин имеет более ограниченные взаимодействия с липидных бислоев и следует отдать предпочтение при работе с GUVs 36. Изменяя время инкубации, томожно получить GUVs придерживаться, не взорвавшись. Тем не менее, GUVs не будет прилипать к крышке слайд твердо, как клетки, и поэтому следует позаботиться еще должны быть приняты в течение любого процедуры, которые могут вызвать поток в камере (например, буфера перфузии, перемещая камеру).
Запись Patch-зажим классический метод для изучения напряжения-ионные каналы, такие как KvAP и этот протокол является производным от стандартных методов для получения "наизнанку" заплатки из прикрепленных клеток. Стандартный патч-зажим набор параметров, с которым патч пипетки опускается под углом (например, 30-60 градусов к горизонтали) в небольшой чашке Петри должны хорошо работать. Тем не менее, более четкие изображения патча пипетки и gigaseal области можно получить, используя камеру, в которой кавер-слипы сформировать камеры сверху и снизу (~ разделения 1 мм), так что патч пипетки можно ввести в горизонтальном со стороны. Поскольку большое давление патч пипетки не нужен, то давление может быть легко Controlled с помощью шприца и контролироваться с любой простой манометр (например, импровизационная вода манометра). Это может быть полезно в первую очередь практика патч зажим экспериментов с липидами только GUVs, выращенных с использованием окисления липидов / раствор хлороформа и низким содержанием соли буфер. Потому что выход бездефектных GUVs очень высока, там будет много совершенных GUVs работать с, даже если многие из них разрушены во время сбора урожая и трансфер в экспериментальной камере.
С небольшой практикой, вырезанные мембранные участки со стабильной gigaseals можно легко получить из DPhPC GUVs и KvAP-DPhPC GUVs. Для достижения высокой скорости успеха, он помогает тщательно выбирать круглые, но немного колеблющийся, бездефектных GUVs и убедитесь, что патч пипетки чистой (поиск липидов в флуоресценции) перед тем, как сформировать gigaseal. Когда мембрана "язык" входит в патч пипетки gigaseal обычно образуется быстро (<1 сек) без необходимости сильного всасывания или УдельныйС холдинг напряжение. В то время как плохо уплотнение может улучшить как мембрана ползет дальше в патч пипетки, часто уплотнение остается бедным, потому что пипетка интерьер был загрязнен и надо начинать все сначала с новым патч пипетки и GUV. DPhPC формы очень стабильные мембраны патчи (десятки минут) с превосходным сопротивлением уплотнения даже при больших напряжениях (например, ± 150 мВ). SOPC: холестерин (3: 1 по мол) могут также образовывать очень стабильные участки, но могут требовать более высокую всасывание для герметизации, тогда как яйцо-PC участки видимому, более легко сломать.
Для более сеансов патч-зажим может быть необходимо регулировать осмолярность раствора камеры. Если осмолярность слишком много ниже, чем буфер роста GUV, GUVs отекают, напряженной и сферическая, и это не может быть возможно аспирации ПРАВ мембрану достаточно далеко в патч пипетки, чтобы сформировать gigaseal. Это часто может быть решена просто ждут 10 или 20 мин, как испарения из камеры увеличивает добernal решение осмолярность, пока GUVs не выкачать и начинают колебаться. И наоборот, если камера остается открытой слишком долго осмолярность внешнего раствора можно увеличить до GUVs не выкачать, tubulate и бутон. Этого можно избежать путем блокирования испарение из камеры (например, минерального масла) или периодически добавлением дистиллированной воды, чтобы заменить воду, которая испаряется.
Поскольку белки могут быть исключены из вырезанных мембранных участками 31, количество активных каналов в вырезанной патч не просто связан с плотностью белка в мембране ГУВ. Измерения флуоресценции предложить концентрация KvAP в патч мембраны значительно ниже, чем в GUV 28, и она может быть довольно легко получить пластыри, содержащие только небольшое количество каналов. Однако, если патчи содержат слишком много каналов для записи одного канала, очевидные шаги, используя патч пипетки с меньшими советы и / или снижение D белково-на-жировойensity в SUV смеси являются эффективными. В отличие от этого, для выполнения измерений на ансамбль пластырями, содержащими много каналов, это может быть полезно начать с плотностью относительно высоким содержанием белка (например, 1:10, чтобы белок, липид по весу), используют флуоресценции белка, чтобы выбрать GUVs с высокой плотностью белка , использовать больший патч пипетки (например, от 2 до 3 мкм диаметр кончика) и аспирация быстро, чтобы попытаться как можно быстрее сформировать печать. Очевидно, что конфигурация -типа "цельноклеточная" (то есть, "целое-GUV ') идеально было бы охарактеризовать все каналы в GUV, но, к сожалению," вся-GUV "конфигурация создает ряд технических вопросов, 37.
Решения, липиды и концентрации белка в этом учебнике, просто предоставляется в качестве отправной точки, и могут быть изменены в соответствии с потребностями конкретного эксперимента следующие несколько соображений.
Все растворы должны содержать буфер рН, такие как HEPESили трис обеспечить белки не подвергаются воздействию экстремальных значениях рН. Буфер SUV должен иметь низкую концентрацию растворенных веществ, как протеин будет переносить (например, 5 мМ соли или ниже), а концентрация растворенного вещества увеличивают в ходе стадии частичной дегидратации и высокие концентрации солей может денатурации белка или вызывать липидной пленки быстро расслаиваться во время стадии регидратации. Небольшие количества сахаров, таких как трегалоза (например, от 1 мм до 5 мм), как полагают, чтобы защитить белок при обезвоживании 23. В то время как трегалоза была вовлечена в ангидробиоза и, как полагают, чтобы защитить мембрану и белки против просушка 38, сахароза или глюкоза могут работать одинаково хорошо.
Для буфера роста, концентрация соли особенно важно, так как это будет влиять на параметры для оптимального роста ГУВ (например, electroformation напряжения, частоты и длительности). В отличие от этого, основным сдерживающим фактором для буфера наблюдения является тшлем должен иметь такую же осмолярность, как буфер роста. Включение сахарозы и / или глюкозы в «буфер роста" и "наблюдения буфера" может быть полезным для обеспечения GUVs осадок на дно камеры для наблюдений, в то время как разница в коэффициенте преломления между ГУВ интерьера и экстерьера помогает фазового контраста или DIC микроскопии. Электрофизиологов часто включают в себя ионы кальция или магния в ванну и / или патч пипетки решений для повышения gigaseal образование с клеточных мембран, но они не являются необходимыми для GUVs. В самом деле, двухвалентные ионы, такие как магний и кальций может вызвать разделение липидной фазе и облегчить адгезию, так что, если эти проблемы возникают, может быть полезно добавить 1 мМ ЭДТА.
Очевидно, что одним из ключевых привлечение восстановленных систем по сравнению с клетками, является способность контролировать липидный состав. DPhPC GUVs хорошо растут и образуют стабильные вырезали мембраны патчи, и эти протоколы также работал EFтивно для липидных смесей, содержащих фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (ПЭ), фосфатидилглицерина (PG), фосфатидной кислоты (PA), фосфатидилсерин (PS) и холестерина. Однако рост GUV чувствительна как к липидной композиции и буферы 15, и так параметры протокола (например, количество липидов на хранение, electroformation напряжение / частота) возможно, должны быть скорректированы для липидных смесей, содержащих высокие концентрации ПЭ, загружают липидов (PG, PA, PS) или холестерина. Когда начинали, яйцо-PC, DOPC или DPhPC являются хорошим первым выбором, и это тоже очень полезно включать флуоресцентный липида наблюдается рост GuV и отличить GUVs из многослойных везикул с двумя или более двойных слоев. Липидные смеси могут быть получены путем объединения SUV суспензии исходных растворов, а липидов смешивания во время стадии частичной дегидратации (при условии, температура выше, чем любой отдельный температуры фазового перехода). Использование более высокую концентрацию внедорожник (например,10 мг / мл) растворы позволяет значительную гибкость, и они могут быть разбавлен до 3 мг / мл до дегидратации суспензии.
При попытке адаптировать эти протоколы других транс-мембранных белков, очень важно, чтобы иметь возможность непосредственно наблюдать как включение белка в функции GUVs и тест белка. Хотя это и не является проблемой при KvAP, всегда есть возможность того, что во время регидратации шаг транс-мембранного белка будет оставаться в стеке мембраны, приводящей к образованию липидных только GUVs. Флуоресцентных меток белка очень удобно, так как она обеспечивает быстрый и однозначный способ наблюдать белка включение в GUVs, а также проверить для агрегации в GUVs. Это также очень важно проверить функцию белка в GUVs, чтобы подтвердить, что белок не был поврежден во время процесса восстановления. Для ионных каналов, таких как KvAP измерения патч-зажим может установить наличие функциональных каналов вGUVs. Тем не менее, флуоресцентно меченных, с высоким сродством лигандом (например, токсин, субстрат или анти-тела) также будет очень полезно для проверки состояния белков в GUVs.
Таким образом, эта статья демонстрирует, как произвести Proteo-GUVs, содержащие напряжения закрытого калиевые каналы KvAP и охарактеризовать их с помощью флуоресцентной микроскопии и электрофизиологии. Надеемся, что эти методы могут быть адаптированы к новым классам мембранных белков и предоставляют основу для более сложных в пробирке систем для изучения и создания живой материи из ее основных компонентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al.
- Domanov, Y. A., et al.
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T.
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E.
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al.
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
