Summary
La reconstitution de la protéine transmembranaire, KvAP, dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) est démontrée par deux méthodes de déshydratation-réhydratation, et - électroformation gonflement assisté gel. Dans les deux procédés, de petites vésicules unilamellaires contenant la protéine sont fusionnées ensemble pour former GUVs qui peuvent ensuite être étudiées par microscopie par fluorescence et de patch-clamp électrophysiologie.
Abstract
Géant vésicules unilamellaires (GUVs) sont un système biomimétique populaire pour l'étude des phénomènes associés à membrane. Cependant, les protocoles couramment utilisés pour cultiver GUVs doivent être modifiés afin de former GUVs contenant des protéines transmembranaires fonctionnelles. Cet article décrit deux méthodes de déshydratation-réhydratation - électroformation et gonflement assisté gel - pour former GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP. Dans les deux procédés, une solution de petites vésicules unilamellaires contenant des protéines est partiellement déshydraté pour former un empilement de membranes, qui est ensuite laissé à gonfler dans un tampon de réhydratation. Pour la méthode de électroformation, le film est déposé sur des électrodes de platine de telle sorte qu'un champ en courant alternatif peut être appliquée au cours de la réhydratation pellicule. En revanche, le procédé de gonflement assisté gel utilise un substrat en gel d'agarose afin d'améliorer le film réhydratation. Les deux méthodes peuvent produire GUVs dans (par exemple, 100 mM) des concentrations faibles en sel (par exemple, 5 mM) et physiologiques. Les GUVs résultantes sont caractérisées par microscopie à fluorescence, et de la fonction des canaux reconstituées mesurées en utilisant la configuration patch-clamp intérieur vers l'extérieur. Bien que le gonflement en présence d'un champ électrique alternatif (de électroformation) donne un rendement élevé de GUVs sans défaut, le procédé de gonflement assisté gel produit une distribution plus homogène de la protéine et ne nécessite aucun équipement spécial.
Introduction
Lorsque l'on étudie les principes physiques qui régissent les systèmes vivants, les approches bottom-up permettent un expérimentateur de contrôler la composition du système et d'autres paramètres qui ne sont pas faciles à manipuler dans les systèmes à base de cellules-1. Pour les procédés membranaires, Giant vésicules unilamellaires (GUVs, diamètre ~ 1-100 um) se sont révélés être un système biomimétique très utile 2-7 comme ils sont bien adaptés pour les études de microscopie et micromanipulation 8-10. Bien qu'il existe de nombreux protocoles différents pour produire GUVs, la plupart tombent dans deux catégories - émulsion à base approches 11,12 et techniques basées sur la réhydratation d'un film lipidique 13-16. Dans les procédés à base d'émulsion, les dépliants interne et externe des membranes GUV sont assemblés de manière séquentielle à partir de monocouches lipidiques aux interfaces eau / huile. Cette approche est idéale pour encapsuler des protéines solubles avecdans les GUVs, et pour former GUVs avec dépliant composition lipidique asymétrique. Cependant, GUVs formés à partir d'émulsions peuvent conserver des traces de solvant qui changent les propriétés mécaniques de la membrane 17, et l'approche ne est pas particulièrement bien adapté à la reconstitution trans-membranaire des protéines.
Modes de réhydratation du film reposent sur le fait que le séchage (déshydratation) provoque de nombreux mélanges de lipides pour former un empilement multi-lamellaire de membranes. Si cette pile est ensuite mise en contact avec un tampon aqueux, les membranes de la pile se déplacent en dehors des flux de solvant entre eux et à la surface de l'empilement, les membranes individuelles peuvent se détacher pour former GUVs 13,18 (ainsi un véritable zoo de d'autres objets lipidiques). Cependant, même pour les compositions de tampons et de lipides optimales, cette méthode classique "de gonflement spontanée" a un rendement relativement faible des GUVs sans défaut. Une méthode largement utilisée pour stimuler le rendement de GUVs sans défaut est "électroformation221 ;, dans laquelle un champ de courant alternatif (AC) est appliquée pendant le film réhydratation. Bien que le mécanisme reste mal comprise, "électroformation" peuvent donner des rendements de GUV spectaculaires (> 90% dans des circonstances favorables) pour faible teneur en sel des tampons de concentration (<5 mM) 14,19, et peut même travailler dans des tampons physiologiques (~ 100 mm) en utilisant une fréquence plus élevée (par rapport à 500 Hz 10 Hz) de champ en courant alternatif et des électrodes en platine 15. Une approche alternative pour augmenter le rendement de GUVs sans défaut est "assisté gel gonflant", dans lequel la solution lipidique est déposé sur un substrat de gel polymère plutôt que le passif (par exemple, le verre, PTFE) substrats utilisés dans "gonflement spontanée classique ». Lorsque le film lipidique / gel résultant est réhydraté, GUVs peuvent former rapidement même pour les tampons physiologiques 16,20.
Toutes ces méthodes peuvent produire GUVs lipidiques seule qui peuvent être utilisés pour étudier la membrane associée phénomènes tels que lainteraction entre les protéines solubles et les membranes. Cependant, à incorporer une protéine trans-membranaire dans GUVs, des modifications importantes sont nécessaires pour garantir que la protéine reste dans un état fonctionnel tout au long de la procédure de reconstitution. Bien que les solutions de lipides dans des solvants organiques (par exemple, le chloroforme, le cyclohexane) sont idéales pour produire des films lipidiques, les protéines transmembranaires sont généralement seulement stable lorsque leur domaine transmembranaire hydrophobe est incorporé dans une bicouche lipidique, ou entouré par une micelle de détergent ( par exemple, lors de la purification des protéines). Ainsi, le matériau de départ pour une reconstitution est typiquement membranes natives, la protéine purifiée dans une solution de détergent ou de petites vésicules contenant des protéines unilamellaires (Proteo-SUV) et / ou des vésicules multilamellaires (protéo-MLV) formés par élimination du détergent dans le présence de lipides. La plupart des méthodes d'intégrer ces protéines membranaires en GUVs se répartissent en trois catégories.
Insertio directn: protéine trans-membranaire en suspension dans le détergent est mélangé avec des lipides, seuls GUVs préformés, légèrement détergentes solubilisées, et le détergent ensuite éliminé en utilisant BioBeads 21. Bien que conceptuellement simple, cette méthode nécessite un contrôle précis de la concentration en détergent, comme une trop forte concentration de détergent puisse dissoudre les GUVs pendant trop faible peut entraîner une concentration de la protéine ou l'agrégat de se dérouler.
GUV / Proteo-SUV Fusion: protéines dans Proteo-VUS est combiné avec, lipides seulement GUVs préformés et la fusion est facilitée avec des peptides fusogènes spéciales 22 ou 21 détergent. Typiquement, la mesure de la fusion est Limited soit GUVs avec une densité faible en protéines.
La déshydratation / réhydratation: un film lipidique contenant des protéines est formée par la déshydratation partielle d'un protéo-SUV (ou protéo-MLV) et GUVs solution est ensuite cultivée comme pour un film lipidique pure. Le défi évident est de protéger la protéine pendant la dehydrati partielleà l'étape 23, mais la méthode a été utilisée avec succès pour reconstituer les protéines transmembranaires telles que bactériorhodopsine, calcium-ATPase, intégrine et VDAC en GUVs 7,23 - 25.
Cet article décrit les protocoles de déshydratation / réhydratation pour faire GUVs contenant le canal potassique voltage-dépendants, KvAP, de la Archaea, Aeropyrum pernix hyper-thermophile. KvAP a un degré élevé d'homologie tension eucaryote dépendants canaux potassiques 26 et une structure cristalline connue 27 , ce qui en fait un bon modèle pour étudier le mécanisme de déclenchement de la tension. La production des Proteo-VUS a été décrite en détail précédemment, et ne fait pas partie de ce tutoriel 26,28,29. Fait important, KvAP Proteo-SUV ne ont pas à être produit pour chaque préparation d'GUV, car ils peuvent être stockés dans de petites aliquotes (par exemple, 10 pi) à -80 ° C pendant des périodes de temps prolongées (> 1 an). Électroformationou gonflement assisté gel peut alors être utilisé pour développer des GUVs KvAP Proteo-VUS (ou proteo-MLV).
Les principales étapes du protocole de électroformation sont illustrés sur la figure 1. Gouttelettes d'une solution de SUV contenant la protéine sont déposées sur des fils de platine (voir figure 2). La déshydratation partielle de la suspension de SUV conduit à la formation d'un film de protéine de lipide par la fusion des SUV. Au cours de la réhydratation, un champ en courant alternatif est appliqué aux électrodes afin d'aider les couches lipidiques pour délaminer et former GUVs. Un champ de 10 Hz fonctionne bien lorsque vous utilisez "pauvre en sel" (<5 mM) tampon de réhydratation 28 et GUVs prennent plusieurs heures à se développer. En revanche, les tampons physiologiques (contenant environ 100 mM de sel) bien travailler avec une tension inférieure, 500 Hz champ AC mais nécessitent un prolongée (~ 12 h) Période de 15 gonflement. Cette méthode est basée sur un protocole antérieur utilisant ITO glisse 24, mais utilise une suite de chambre personnaliséeaining deux fils de platine comme le montre la figure 2 (voir la discussion pour plus de détails de conception et des suggestions pour simple, chambres improvisé).
La figure 3 illustre le procédé de gonflement assisté gel. Le protocole fonctionne bien avec des tampons ayant des concentrations salines physiologiques, est rapide et produit GUVs avec une distribution plus homogène de protéines. Toutefois, le rendement des isolés GUVs, apparemment sans défaut (ce est à dire, la membrane GUV est uniforme à longueur échelles optiques et ne englobe pas tous les objets) est plus faible, mais il fournit un nombre suffisant de patch-clamp et les expériences de micro-manipulation . Cette méthode est basée sur un protocole utilisant un gel d'agarose pour produire GUVs lipidiques seule 16 et nécessite un équipement moins spécialisé que la méthode de électroformation.
La caractérisation de GUVs avec la microscopie de fluorescence est décrite, ainsi que des modes opératoires utilisant un patch-clamp configuration standardmesurer l'activité KvAP dans "inside-out" excisées patches membranaires.
Croissance GUVs contenant des protéines peuvent être plus difficile que GUVs lipidiques seule. En particulier, le rendement en GUV finale peut dépendre sensible sur exactement comment la solution de SUV est déposé et déshydraté pour former l'empilement de membrane. Pour une personne sans expérience antérieure avec GUVs, il peut être utile d'augmenter premier GUVs lipidiques uniquement suivant un protocole classique 15,16 dans lequel le film de la membrane est formée par dépôt de lipides dans un solvant organique. Une fois le protocole classique fonctionne bien, dépôt SUV et déshydratation partielle peuvent être maîtrisés à l'aide VUS lipidiques seule, qui sont également très utile lors du réglage du protocole pour une nouvelle composition lipidique. Lorsque GUVs poussent fiable de VUS de lipides seulement, il ne est alors qu'une petite étape pour produire GUVs contenant des protéines de Proteo-VUS.
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Protocol
1. Solution Préparation
- Préparer 5 ml de "tampon de SUV" contenant 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou TRIS (pH 7,5) et 2 mM de trehalose. Filtrer le tampon avec un filtre à seringue de 0,2 um et diviser en portions aliquotes de 1 ml qui peuvent être stockées à -20 ° C.
REMARQUE: Des détails supplémentaires pour les réactifs et les instruments sont donnés dans la liste des matériaux. - Préparer 40 ml de «tampon croissance» GUV qui permettra de combler l'intérieur GUV pendant le film réhydratation. Pour une croissance «faible teneur en sel», combiner 5 mM de KCl, 1 mM de HEPES (pH 7,4) ou 1 mM de TRIS (pH 7,5), et ~ 400 mM de saccharose. Pour une croissance 'de sel physiologique ", combiner KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de TRIS (pH 7,5) et 200 mM de saccharose ~.
- Préparer 40 ml de «tampon d'observation" pour la solution externe à la chambre expérimentale en combinant KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) ou 5 mM de TRIS (pH 7,5), et ~ 200 mM de glucose.
NOTE: Ces tampons ne sont examples. Voir la discussion d'adapter les tampons pour d'autres expériences. - Mesurer les osmolarités des tampons de croissance et d'observation avec un osmomètre. Ajouter granules de saccharose ou de glucose pour les faire correspondre à 1% afin que GUVs ne seront pas lyser ou se effondrer lors de son transfert de la chambre de croissance à la chambre d'observation.
NOTE: Dans cette gamme de concentration, en ajoutant 1 mM de saccharose (13,7 mg par 40 ml) ou de glucose (7,2 mg par 40 ml) augmente osmolarité par ~ 1 mOsm. - Filtrer les tampons de croissance et d'observation avec un filtre de 0,2 um et de les stocker à 4 ° C pour inhiber la croissance bactérienne.
- Dissoudre 50 mg de bêta-caséine dans 10 ml de TRIS (pH 7,5) de tampon 20 pour former une solution de bêta-caséine 5 mg / ml nécessaire pour passiver les surfaces des chambres expérimentales pour que GUVs ne collent pas, la propagation et rafale. Une fois que la bêta-caséine soit complètement dissous (jusqu'à plusieurs heures à 4 ° C), un filtre (0,2 pm) en aliquots de 0,5 ml qui peut être congelé et stocké éclairà -20 ° C pour une utilisation ultérieure (aliquotes décongelées stockées à 4 ° C peut généralement être utilisé jusqu'à une semaine 1).
2. Préparation SUV
- Préparer et congeler des aliquotes de Proteo-VUS suivants du protocole détaillé publié antérieurement 28. Utilisation KvAP marqué par fluorescence avec Alexa 488-maléimide, reconstitué dans DPhPC VUS (10 mg / ml) à une protéine à lipide de 1:10 (en masse).
Remarque: de type sauvage contient une cystéine KvAP par monomère situé près du C-terminal intracellulaire (acide aminé 247). - , VUS lipidiques seule fluorescentes:
REMARQUE: Manipulez chloroforme sous une hotte de porter des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Éviter l'utilisation de toute matière plastique que le chloroforme peut les dissoudre. solutions dans le chloroforme peuvent être stockés dans des flacons en verre ambre avec des bouchons en Téflon et transférées au moyen de seringues en verre. Prenez soin de rincer toute la verrerie au moins 5 à 10 fois avec du chloroforme avant et après pipetage lipides.- Préparer 100 ul de10 Véhicules mg / ml DPhPC contenant 0,5% en moles du lipide fluorescent rouge, le rouge Texas-DHPE, en mélangeant 100 ul de solution DPhPC (10 mg / ml dans le chloroforme) avec 8,2 ul de solution Texas Red-DHPE (1 mg / ml dans du methanol) dans un flacon en verre ambré de 1,5 ml.
- Sécher les lipides vers le bas sous un courant d'azote dans une hotte chimique tout en faisant tourner le flacon. Lorsque le film semble être sec, placez les lipides sous vide pendant 3 heures pour éliminer tout solvant résiduel.
- Ajouter 100 ul de tampon SUV aux lipides, et vortex vigoureusement jusqu'à ce qu'il ne reste collé lipidique sur les parois du flacon et la solution est laiteux uniforme.
- Soniquer la solution de lipide pour former VUS. Ajustez la position flacon jusqu'à ce que l'échographie cause le plus de mouvement et de circuler à l'intérieur du flacon, et de prendre soin de ne pas chauffer la solution inutilement. Continuer sonication jusqu'à la solution devient translucide, ou lorsque possible, transparent (2-5 min pour embout sonication, ~ 20 min pour les bains à ultrasons).
- Aliquot VUS (par exemple, 10 pi ou 20 pi) et gel (-20 ° C) pour une utilisation ultérieure.
NOTE: Les lipides, en particulier les lipides insaturés, peut facilement ventilation. solutions lipidiques de magasin à 20 ° C (ou 80 ° C) sous argon et utiliser dans les 6 mois. Produits de dégradation des lipides peuvent être détectés avec chromatographie sur couche mince.
3. GUV croissance par électroformation
- Préparer la chambre de électroformation.
- Si la chambre n'a pas été nettoyé, retirez les fenêtres, essuyer le scellant et de graisse, extraire les fils, et rincer et frotter la chambre avec un tissu en utilisant l'eau et de l'éthanol (≥70%) en alternance.
- Frottez les fils ainsi, plonger les fils et la chambre dans l'acétone et soniquer pendant 5 min. Tout essuyer avec un tissu à nouveau avec de l'acétone. Mettre la chambre dans l'éthanol et de traitement par ultrasons pendant 5 min.
- Assemblez la chambre en insérant les fils à travers les trous, et faire pivoter et essuyez les fils pour vous assurer qu'ils are propre. Mettre la chambre dans l'eau distillée, sonication pendant 5 min et sécher la chambre avec un courant d'azote ou d'air.
- Préparer 30 ul de 3 mg / ml de suspension de SUV dans un tampon SUV. Pour former GUVs contenant des protéines, mélanger 8 pi de Proteo-VUS (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01h10), 2 pi de VUS fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) et 20 pi de SUV tampon dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml pour une protéine finale de lipide (masse) d'un rapport de 1: 12,5 et 0,1% en moles TexasRed-DHPE. Mélanger vigoureusement la solution.
- Sinon, pour pratiquer le protocole avec lipides seulement VUS, simplement combiner 10 pi de VUS fluorescentes (10 mg / ml et 0,5 mol DPhPC% TexasRed-DHPE) avec le tampon de SUV de 20 pi.
- Déposer la solution SUV.
- Utiliser une pipette de 2 5 ul ul ou seringue en verre pour déposer de petites (<0,2 ul) des gouttelettes de la solution de SUV sur les fils. Environ 1 ul de solution sont nécessaires pour former une série de gouttes le long de1 cm de fil. Assurez-vous que les gouttes sont assez petit et suffisamment espacées qu'ils ne touchent pas ou le fusible.
- Laissez les VUS déposés sécher pendant ~ 30 min à l'air libre. Lorsque toutes les gouttes se sont installés, tourner le fil de sorte que les dépôts lipidiques sont plus faciles à observer avec le microscope.
NOTE: Si les VUS ne se dessèchent pas suffisamment, ils peuvent tout simplement laver les fils lorsque la mémoire tampon de croissance est ajouté, pendant le séchage trop peut endommager les protéines. Étant donné que l'humidité de l'air influe sur la vitesse de séchage, le temps de séchage et / ou l'humidité de l'air peut être ajustée 30 pour des résultats optimaux. Le film lipidique sur les fils doit être visible sous un microscope.
- Assemblez la chambre.
- Sceller le fond de la chambre: Utiliser une seringue pour appliquer la graisse à vide au fond de la chambre autour des trois puits et appuyez doucement à 40 mm x 22 mm lamelle contre elle pour sceller le fond de la chambre, de sorte qu'il adhère sans lacune. Sceller les côtés de la chambre (où la sortie des fils) avecpâte d'étanchéité. Appliquer de la graisse à vide au-dessus de la chambre décrivant les trois puits.
- Ajouter lentement tampon de la croissance jusqu'à ce que chaque puits est rempli jusqu'en haut. Éviter tout mouvement rapide de la solution dans les puits comme cela peut décaper le film lipidique hors tension les électrodes.
- Fermez la chambre en appuyant sur la lame du capot supérieur doucement sur la graisse, en prenant soin de ne pas déloger la lamelle inférieure. Utilisez un tissu pour enlever les gouttes de tampon sur les bords du capot supérieur glissement.
NOTE: Ce est un bon temps pour examiner la chambre sous le microscope pour confirmer que le film lipidique est resté sur les fils.
- Branchez le générateur de signal pour les câbles à l'aide de deux pinces crocodiles. Régler la fréquence (10 Hz / 500 Hz sinusoïdal pour le tampon de sel basse / haute) et utiliser un multimètre pour mesurer et ajuster la tension entre les fils à 0,7 / 0,35 V racine carrée (Vrms) pour le tampon de sel bas / haut signifie. Couvrir la chambre avec du papier aluminium pour protéger les fluorophores de la lumière. Laissez tes GUVs croître pendant 2 à 3 h pour le tampon de faible teneur en sel, et 12 h ou H / N pour le tampon à haute teneur en sel.
- Déconnecter la chambre de générateur et soigneusement le placer sur un microscope inversé à évaluer l'évolution de la GUV. Utilisez des mouvements lents et réguliers ou l'écoulement de fluide dans les puits peut se détacher prématurément GUVs des fils.
REMARQUE: GUVs sur les bords de fils sont généralement visibles en contraste de phase (40X travail de longue objectif à distance), alors que GUVs ne importe où sur la partie inférieure des fils sont visibles à épifluorescence. Si aucune GUVs sont visibles, essayez de tourner les fils à regarder la surface supérieure. GUVs peuvent être conservés à 4 ° C dans une chambre de croissance pendant plusieurs jours.
4. GUV croissance par Gonflement Gel assistée
- Préparer 10 ml d'une solution d'agarose à 1% en mélangeant 100 mg d'agarose avec 10 ml d'eau pure. Chauffer jusqu'à ébullition en le plaçant dans un micro-ondes à 480 W pour ~ 20 sec. Remuer pour se assurer que l'agarose est complètement dissous.
REMARQUE: La solutionpeuvent être stockées à 4 ° C et réchauffé si nécessaire. - (air plasma) de plasma nettoyer une couverture-toboggan pour 1 min afin que la solution d'agarose se étendra bien sur il. Utilisez les couvre-diapositives dans les 15 prochaines minutes que l'effet de nettoyage au plasma se dissipe rapidement.
- Appliquer 200 ul d'une solution chaude d'agarose à chaque 22 x 22 mm 2 de sorte que le coulisseau solution mouille toute la surface. Inclinez la lame verticalement et toucher le bord inférieur à un tissu pour enlever l'excès de liquide et il suffit de laisser une couche mince et lisse d'agarose sur la diapositive.
- Placer la lame sur une plaque chauffante ou un four à 60 ° C et laisser sécher pendant au moins 30 min. Le film est à peine visible agarose à l'oeil. Après les diapositives refroidir à température ambiante, les utiliser immédiatement, ou de les stocker pendant une semaine dans un récipient fermé à 4 ° C.
- Placez la lamelle d'agarose revêtues dans un plat de 3,5 cm de Pétri.
- Préparer la solution de SUV comme dans la section 3.2 et appliquer ~ 15 pi de la solution de SUV (3 mg / lipide ml) dans~ 30 très petites gouttes doucement sur la surface agarose. Prenez soin de ne pas fausser la couche d'agarose trop.
- Placez la lame sous un léger courant d'azote pendant environ 10 à 15 min et suivez l'évaporation de la mémoire tampon à l'oeil que les gouttelettes sèchent.
- Dès que les VUS ont séché, ajouter tampon de croissance pour couvrir la surface de glissement. Pour un petit 3,5 cm boîte de Pétri utilisation ~ 1 ml de tampon.
- Laisser le gonflement se dérouler pendant ~ 30 min, puis examiner la croissance de GUVs dans la chambre à l'aide d'un microscope inversé avec contraste de phase ou contraste d'interférence différentiel (DIC).
NOTE: observation épifluorescence est difficile en raison de la solide expérience de fluorophores dans le gel et l'auto-fluorescence de l'agarose.
5. La récolte et observation GUVs
- Passiver la chambre d'observation (par exemple, une petite boîte de Pétri ou lamelle de verre) de sorte que GUVs ne collent pas, la propagation et éclater sur le fond de chambre. Couvrir le chambre de fond avec une solution de bêta-caséine, incuber pendant 5 min, rincer la solution de caséine avec de l'eau pure, sèche avec un courant d'air ou de l'azote, et enfin ajouter tampon d'observation (par exemple, ~ 5 mm de profondeur pour une petite boîte de Pétri).
- Récolter les GUVs. Couper le bout de 100 embouts de pipette ul donc l'ouverture est plus grande (~ 2 mm de diamètre), et aspirer lentement que la contrainte de cisaillement de pipetage peut facilement détruire GUVs.
- Pour GUVs électro-formée, ouvrir la chambre de croissance en retirant doucement la lamelle supérieure. Placez la pointe de la pipette directement au-dessus de chaque fil et aspirer ~ 50 pi tout en déplaçant la pointe de la pipette le long du fil de détacher les GUVs.
NOTE: Il peut être utile pour faire tourner le fil de recueillir GUVs de "l'autre côté" du fil. - Pour GUVs "assisté gel-gonflement", appuyez d'abord sur le côté de la boîte de Pétri à quelques reprises pour aider les GUVs détachent de la surface de lamelle. Placez la pointe de la pipette juste au-dessus de la lamelle et aspirer 50 pi tout en pulling la pointe de retour sur la surface. Transférer directement GUVs récoltés à une chambre d'observation, ou un magasin dans un tube de 1,5 ml à 4 ° C pendant 1 semaine.
- Pour GUVs électro-formée, ouvrir la chambre de croissance en retirant doucement la lamelle supérieure. Placez la pointe de la pipette directement au-dessus de chaque fil et aspirer ~ 50 pi tout en déplaçant la pointe de la pipette le long du fil de détacher les GUVs.
- Placez la chambre d'observation sur un microscope inversé, ajouter les GUVs à la chambre d'observation, et attendre quelques minutes pour que les GUVs à se déposent au fond de la chambre.
- Enquête sur la chambre avec un contraste de phase ou DIC pour localiser rapidement lisses, sphériques ('sans défaut') "candidats GUV". Examinez chaque «candidat GUV» dans épifluorescence afin d'exclure tout petits liposomes contenant imbriquées à l'intérieur. Enfin, vérifiez que l'intensité de fluorescence des lipides est uniforme et compatible avec une seule membrane (ce est à dire, unilamellaire).
NOTE: Dans certains bilamellaire (ou multi-lamellaires) vésicules, les membranes sont trop proches pour être résolus afin qu'ils apparaissent unilamellaire en contraste de phase ou images DIC. Cependant, ces objets peuvent être distingués des unilame réelGUVs Llar par leur fluorescence lipidique, qui est deux fois (ou plus) lumineux.
6. GUVs Patch-serrage
- Assurez-pipettes de patch avec un diamètre de pointe de 1-2 um à partir de verre borosilicate capillaire standard en utilisant le programme recommandé pour l'extracteur de pipette.
NOTE: Les traitements spéciaux tels que polissage au feu ne sont pas nécessaires, et pipettes peuvent être utilisés pendant plusieurs jours après qu'ils ont été tirés se ils sont conservés dans une boîte fermée. - Passiver la chambre par incubation avec une solution de bêta-caséine (5 mg / ml) pour se assurer que GUVs ne adhèrent pas, et répartis sur les surfaces de rupture de la chambre. Rincer la caséine éteint après 5 min.
- Insérez l'électrode de masse, remplir la chambre avec un tampon d'observation, transférer 10 pi de la suspension de GUV comme décrit dans l'étape 5.2 et 5.3, et attendre quelques minutes pour que les GUVs à se déposent au fond.
- Remplir une pipette de patch avec une solution fraîche (tampon d'observation ou d'une autre solution iso-osmotique) etmonter sur le patch-clamp amplificateur headstage.
- Recherche à travers la chambre pour trouver une GUV "sans défaut" comme décrit dans la section 5.4, et vérifiez qu'il contient une protéine fluorescente.
- Appliquer une pression positive constante (> 100 Pa, soit environ 1 cm H 2 O dans un manomètre) pour maintenir la pipette de patch intérieur propre, et insérez la pipette de patch dans la chambre. Apportez la pipette de patch dans le champ de vision, appliquer des impulsions de test pour mesurer / compenser le décalage et la résistance tension de pipette, et examiner la pipette sous éclairage fluorescent pour confirmer que la pointe est propre.
- Apportez la pipette de patch vers la GUV, et, si nécessaire, de réduire simultanément la pression positive pour l'écoulement vers l'extérieur de la pipette de patch ne rend pas la GUV "se enfuir". Lorsque la pipette de patch est proche de la GUV, appliquer une pression négative (jusqu'à 5 cm H 2 O) pour tirer la GUV contre la pipette de patch. Surveiller la résistance comme le "; Langue "de la membrane GUV entre dans la pipette de patch et les formulaires de gigaseal.
- Si un gigaseal ne forment pas, retirer la pipette de patch de la chambre et retourner à l'étape 6.4. Si la pièce de membrane formé un gigaseal, mais le GUV reste attaché à la pipette, exciser le patch en tirant loin de la GUV, éclatement de la GUV contre le fond de la chambre, ou brièvement déplacer la pipette de la solution.
- Lorsque la pièce de membrane inside-out a été excisé du GUV et la gigaseal est stable, éteindre les impulsions de test et appliquer un protocole de tension tel que celui représenté sur la figure 13.
REMARQUE: Figure 13 suit la convention électrophysiologique standard pour un correctif inside-out dans lequel le courant circulant dans le patch-électrode est «positif», et V = V salle de bain - V pipette. Tenir le patch à un potentiel négatif (par exemple, V = -100 mV) pour ~ 30 sec endroits KvAP dans l'état de repos, tandis que les étapes (100 ms à 5 sec) à des potentiels plus positifs (par exemple, V = 100 mV) peut alors conduire dans conductrices (c.-à-ouverts) états actifs. - Après les mesures sur une pièce de membrane sont finis, briser le patch avec une impulsion zap ou de la pression et vérifier que le décalage de l'électrode de patch tension n'a pas dérivé. Retirer la pipette de patch de la chambre, et retourner à l'étape 6.4.
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Representative Results
La croissance de GUVs peut être évaluée en examinant rapidement la chambre de croissance sous le microscope. Pour électroformation, les GUVs ont tendance à croître en grappes le long des fils de platine, comme le montre la Figure 4. Au cours de gonflement assisté gel, GUVs apparaissent comme des structures sphériques qui se développent rapidement et fusionnent ensemble (figure 5).
GUVs sans défauts sont plus facilement identifiés et évalués après avoir transféré dans une chambre d'observation. Des mesures d'étalonnage sont nécessaires pour évaluer rigoureusement la qualité de GUV, et une quantification systématique a été publié précédemment 28. Cependant, comme un guide empirique, les «bons» GUVs doivent être isolés (ce est à dire, pas dans un cluster), avoir une seule membrane externe lisse, sphérique, ne contiennent pas d'objets (ie, des tubes, des vésicules imbriqués, etc.) à l'intérieur, et avoir le niveau de fluorescence de lipides "standard" (objets lumineux sont généralement bi- ou multi-lamellaire). La figure 6 montre des images DIC et épifluorescence d'un GUV 'sans défaut' après transfert dans une solution iso-osmotique du glucose. Le contraste DIC est due à la différence de densité optique entre le saccharose et rempli GUV la solution de bain contenant du glucose. L'indice de réfraction de contraste contenant KvAP GUVs diminue souvent au fil du temps, même si elle-même ne doit pas KvAP être perméable au glucose ou saccharose. La fluorescence de la protéine dans la membrane uniforme GUV confirme que KvAP est incorporé dans la GUV (elle ne reste pas dans le film lipidique) et ne est pas formée l'échelle du micron (ou plus) des agrégats.
Les figures 7, 8 et 9 montrent des images confocales de lipides et de protéines de fluorescence GUVs produits par le protocole inférieure sel électroformation, physiologique protocole électroformation de sel, et le protocole de gonflement assisté gel. Le lipide fluorescent (magenta) et de la protéineSignaux (vert) ont été réduits à la même intensité moyenne, de sorte que GUVs avec un faible nombre / élevé de protéines par unité de surface (densité de protéine) ont un magenta / teinte verte dans les images de superposition (colonne de droite), tandis que GUVs avec un la densité moyenne en protéines sont blancs. , GUVs sans défaut isolés ont été identifiés et la distribution de taille de GUV est montré à la figure 10. Typiquement électroformation produit plus GUVs sans défaut que gonflement assisté gel, mais les GUVs produites par électroformation sont plus petits. La figure 11 montre la distribution de densité de protéines présumées à partir de la fluorescence des GUVs. Électroformation avec du tampon riche en sel produit GUVs dans lequel la densité de la protéine varie considérablement d'GUV à Guv. La densité de la protéine de GUVs individuels varie beaucoup moins pour électroformation avec un tampon de faible teneur en sel, tandis que la densité des protéines produites par des GUVs gonflement assisté gel est remarquablement uniforme.
La technique de patch-clamp est une utilisation largementProcédé de d pour étudier la fonction des canaux ioniques voltage-dépendants, tels que KvAP. Dans les enregistrements "inside-out", un verre "patch" pipette propre est utilisée pour exciser un patch de la membrane d'une GUV. Une électrode à l'intérieur de la pipette de patch est ensuite utilisée pour appliquer une tension, et mesurer le courant résultant qui circule dans la pièce de membrane. La composition de la pièce de membrane peut différer grandement du reste de la cellule / GUV 31, mais la configuration "inside-out" est encore très utile pour mesurer la conductance de canal unique, sélectivité ionique et déclenchement dépendant de la tension. Ces trois propriétés sont un excellent moyen d'établir que les courants ne sont pas dues à des artefacts (par exemple, les questions gigaseal) ou de contaminants (par exemple, porines bactériennes de la purification), et il ya des canaux de KvAP fonctionnels dans les GUVs.
conductance de canal est plus facile à mesurer dans les patchs avec seulement un ou deux canaux actifs. Dans le example représenté sur la figure 12, aucune ouverture de canal sont observés lorsque la membrane est maintenu à -100 mV, alors qu'à 100 mV, ouvertures de canaux individuels peuvent être clairement résolues. L'histogramme actuelle montre deux pics correspondant à la fermeture et les états ouvert et leur adaptation avec une double fonction gaussienne donne un courant de canal unique de 10,9 ± 0,85 pA, correspondant à une conductance de 109,2 ± 8,5 pS (dans 100 mM de KCl). Notez que la conductance de canal unique dépend de la solution (en particulier de la concentration de potassium) et de la composition des membranes 32,33.
Comme beaucoup d'autres K-canaux, individuelle canaux de KvAP exposition «bavardage» des éclats de ouvertures et fermetures rapides. Comme démontré précédemment, la sélectivité de potassium peut être testée en utilisant une solution différente dans la pipette de patch (par exemple, NaCl solution patch pipette 90, 10 mM de KCl) 28.
déclenchement dépendant de la tension est S souventtudied en plaques avec des canaux multiples, de manière à obtenir plus facilement une moyenne d'ensemble. Bien qu'il n'y ait pas de mécanisme évident favorisant l'physiologique (domaine intracellulaire sur GUV intérieur) et inverse (domaine intra-cellulaire sur la GUV extérieur) insertion de KvAP dans GUVs, dans "inside-out" patches membranaires la majorité des canaux fonctionnels ont la " physiologique "insertion 28. La figure 13 montre la réponse d'une pièce de membrane contenant multiple (> 10) des canaux à une série de 5 secondes étapes dépolarisants. Entre chaque étape, le patch est maintenu à -100 mV pendant 30 secondes pour permettre canaux avec l'insertion «physiologique» de revenir à leur état de repos. Lorsque le potentiel est suffisamment négatif (par exemple, V <-60 mV) la majorité du courant est due à la fuite de gigaseal, et les ouvertures occasionnelles de un ou deux canaux qui sont susceptibles d'avoir le "inverse" insertion. Pour les étapes à pote plus positiventials, un nombre croissant de canaux sont observés jusqu'à ce qu'il y en a tellement que les ouvertures et fermetures individuelles ne peuvent plus être résolus. Ainsi, la probabilité d'ouverture du canal est clairement dépendant de la tension. La cinétique d'activation et d'inactivation KvAP diffèrent considérablement entre le noir (membranes lipidiques BLMS) 26 et GUVs, mais ce est cohérent avec les rapports précédents ce canal déclenchement Kv peut être sensible à la composition de la membrane et de l'État 34.
Figure 1. Représentation schématique GUV électroformation. Gouttelettes contenant VUS sont déposées sur une électrode déshydratation partielle de la solution provoque SUV à fusionnent pour former un empilement de membranes. Le tampon est ensuite ajoutée et un champ électrique alternatif appliqué. Étant donné que les houles de films, membranes individuelles se détachent de la pile pour former GUVs. (Ce chiffre a été mod ified de Aimon et al. 28)
Figure 2. GUV électroformation chambre. La chambre est broyée à partir d'un bloc de PTFE avec trois puits (diamètre 10 mm, profondeur de 5 mm). Deux 0,5 mm diamètre des fils de platine sont séparés par 3 mm (distance bord à bord) et sont positionnées à proximité du fond de la chambre pour faciliter l'imagerie des fils. Lamelles inférieure et supérieure sont maintenus en place avec de la graisse à vide, et la pâte d'étanchéité empêche toute fuite des trous de fil sur le côté. Le générateur de courant alternatif est connecté avec pinces crocodiles aux fils. La chambre est basé sur celui développé par Ernesto Ambroggio et Luis Bagatolli. (Ce chiffre a été modifié depuis Aimon et al. 28)
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Figure 3. Gel-assistée gonflement spontané Schéma: gouttelettes contenant une suspension de SUV sont déposés sur un gel d'agarose que la gouttelette se déshydrate, les véhicules utilitaires sport fusionnent pour former un film lipidique.. Lorsque la mémoire tampon de croissance est ajouté, le film se réhydrate et GUVs former à la surface. GUVs atteignent une taille d'environ 10 um par le gonflement et la fusion avec GUVs voisins.
Figure 4. Représentant l'image de GUVs DPhPC contenant KvAP croissante sur le fil de platine dans un tampon de sel trop élevée. Les GUVs ressemblent grappes le long du fil. l'image de contraste de phase en utilisant un objectif 40X LWD. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. GUVs DPhPC contenant KvAP gonflement sur gel d'agarose. Les GUVs sont visibles sous forme de sphères faibles avec un diamètre d'environ 10 um. Les taches sombres / claires sont des agrégats agarose / lipides à partir de laquelle les vésicules gonflent. image de contraste de phase avec objectif 40X LWD. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Images d'une GUV sans défaut. (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 en masse) contenant KvAP marqué avec Alexa-488 gauche: DIC, à droite: Alexa-488 épifluorescence. Excitation: 470/50 nm, émission: 545/75 nm. Notez la fluorescence uniforme de KvAP sans agrégats visibles. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. images confocale de lipides (magenta) et en protéines (vert) la fluorescence de GUVs électroformées cultivées dans un tampon de faible teneur en sel (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 en masse) (A) La marque flèches blanches (probable). GUVs, tandis que la flèche rouge indique potentiellement une vésicule bi-lamellaire avec une fluorescence lipidique. A noter que l'intensité de fluorescence est plus lumineux au centre de cette image en raison de la très large champ de vision. (B) Zoom montrant un petit groupe de GUVs. Gauche (magenta): TexasRed-DHPE excitation: ligne laser de 543 nm, émission: 605/70 nm. Center (vert): KvAP marqué avec Alexa-488 excitation: ligne laser de 488 nm, émission: 515/30 nm. Droite: superposition.ADO / 52281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. images confocale de lipides (magenta) et en protéines (vert) la fluorescence de GUVs électroformées cultivés dans la concentration de sel physiologique (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 en masse). (A) Les GUVs (flèches blanches montrent susceptibles unilamellaire Des exemples) sont plus rares par rapport au protocole de sel faible et peuvent avoir des concentrations en protéines extrêmement différentes (flèche rouge). (B) Zoom montrant un petit groupe de GUVs. Gauche (magenta): TexasRed-DHPE excitation: ligne laser de 543 nm, émission: 605/70 nm milieu (vert): KvAP marqué avec Alexa-488 excitation: ligne laser de 488 nm, émission: 515/30 nm. Droite:. Overlay Se il vous plaît clécher ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9. de l'image confocale de lipide (magenta) et de protéines (vert) fluorescence de GUVs (DPhPC) formées par assistée gel gonflant avec un tampon de concentration saline physiologique. GUVs montrent une densité de protéine plus homogène que GUVs électroformés préparés avec un tampon physiologique. Gauche (magenta): BPTR-Cer 0,1% excitation: 543 ligne laser nm, émission: 605/70 nm. Moyen (vert): KvAP marqué avec Alexa-488 excitation: ligne laser de 488 nm, émission: 515/30 nm. Droite:. Fusion des deux canaux Se il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 11. GUV des histogrammes de densité de la protéine: La densité de la protéine (nombre de protéines par unité de surface) de GUVs électroformé avec du tampon faible teneur en sel (KCl 5 mM, DPhPC) varie de moins de la concentration de sel physiologique (100 mM de KCl, Egg PC: Egg 9-PA:. 1 en masse) La densité de la protéine de GUVs (DPhPC) issues assistée par gel gonflant dans un tampon de sel physiologique montre la moindre variation. densité en protéines est proportionnelle à KvAP-A488 intensité de fluorescence pour ces concentrations 28 et, dans chaque histogramme des intensités de fluorescence sont normalisées par la moyenne de la distribution. (Le panneau du milieu a été modifiéde Aimon et al. 28)
Figure 12. L'activité de canal unique de GUV membrane correctifs («inside-out" convention de tension DPhPC). Le GUV a été cultivé dans 100 mM de KCl, 5 mM HEPES pH 7,4 sur fils de platine. Canaux unique ouvert après l'application de 100 mV potentiel sur le patch. A droite de l'encart est un histogramme utilisé pour calculer la conductance de canal unique. La ligne rouge est un ajustement à une double fonction gaussienne avec des maxima à 4,70 ± 0,27 et 15,62 ± pA 0,58 pA, correspondant à une conductance de 109,2 ± 8,5 pS. La trace a été filtré à 10 kHz avec un filtre de Bessel 4 pôles et enregistré à 50 kHz.
Figure 13. Voltage-dependen canaux t de déclenchement dans la pièce de membrane d'une GUV formée sur agarose dans un tampon élevée en sel (DPhPC, "inside-out" convention de tension). (A) Réponse du courant membranaire patch à une étape transitoire dans la tension. Pipettes et de bain deux solutions contenaient KCl 100 mM, et la membrane a eu lieu pendant 30 secondes à -100 mV entre les étapes successives de tension. Sur une inspection minutieuse, on peut voir que la trace contient 1 ou 2 canaux qui semblent ouvrir avec des tensions négatives. Encart a) montre un zoom de l'ouverture retardée et encadré b) la fermeture retardée du canal. Les courants ont été filtrés avec un filtre de Bessel 4 pôles à 10 kHz et comptabilisés à 51,3 kHz. Déconnecté la trace a été sous-échantillonné à 513 Hz. La capacité transitoire négative est coupée à -150 pA. (B) de courant moyenne (0,25 sec <t <5 sec) par rapport à la tension de l'étape. Courants à des tensions positives sont plus grandes parce que le canal probabilité d'ouverture est dépendant de la tension.iles / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Systèmes modèles biomimétiques sont un outil important pour étudier les propriétés et les interactions des protéines et les membranes. Comparé à d'autres systèmes reconstitués comme BLM ou membranes lipidiques supportées, GUV systèmes basés offrent plusieurs possibilités, y compris un contrôle considérable de la composition de la membrane, la tension et la géométrie, ainsi que d'être vraiment libre d'huile. Cependant, l'incorporation des protéines transmembranaires, comme KvAP, dans GUVs nécessite des adaptations importantes de protocoles classiques pour GUVs lipidiques seule. Le protocole de électroformation présenté ici a été précédemment caractérisée et utilisée pour étudier les principes biophysiques de la distribution et de la dynamique de la protéine membranaire dans les membranes courbes 2,4,35. Ce travail démontre un nouveau protocole de gonflement assisté gel, ajoutant à l'ensemble des méthodes pour la protéine reconstitution dans GUVs. Les deux protocoles peuvent produire GUVs sans défaut contenant de fortes densités de KvAP, et des mesures sur les correctifs Inside-Out confirment que leGUVs soi contiennent, les canaux potassiques sélectifs fonctionnels voltage-dépendants.
Les deux approches ont différentes forces et faiblesses. Lorsque les conditions de faible teneur en sel peuvent être utilisés, électroformation offre un bon compromis entre le rendement de GUV et la densité de protéines uniforme. Électroformation donne encore des rendements raisonnables avec des concentrations salines physiologiques, mais la densité de protéines peut varier considérablement entre les GUVs (voir les figures 8 et 11). Les variations de densité semble être liée à la durée de électroformation, comme la croissance de tampon pauvre en sel peut également avoir des variations importantes de densité si la croissance continue beaucoup plus longue que 2 h. En revanche, GUVs produites par gonflement assisté gel ont une densité de protéines remarquablement uniforme, même pour les tampons physiologiques. Cependant, la fraction de vésicules multilamellaires est plus grande, et l'auto-fluorescence d'agarose complique la quantification des densités de 16 faible teneur en protéines. En utilisant de l'alcool polyvinylique en plaCE du agarose a été rapporté pour améliorer le rendement de GUV assisté gel lorsque lipides ont été déposés dans le chloroforme 20, mais nous avons été incapables de produire GUVs consomment de l'alcool de polyvinyle avec des solutions SUV. Si un rendement inférieur de GUVs sans défaut est acceptable, gonflement assisté gel a un net avantage pour les expériences qui nécessitent une distribution de protéines uniforme.
Électroformation et le gonflement assisté gel ont également des exigences d'équipement tout à fait différentes. Le protocole de gonflement assisté gel utilise peu de matériel spécialisé, sauf pour le nettoyeur à plasma, qui ne est pas indispensable car il existe de nombreuses méthodes alternatives pour produire propre, verre hydrophile. En revanche, électroformation nécessite une chambre de mesure avec des électrodes métalliques. fil de platine est cher, mais pour ce protocole GUVs a augmenté plus rapidement que les fils de platine de titane, et GUVs ne ai pas grandi sur ITO glisse lors de l'utilisation des concentrations salines physiologiques. Le diamètre des électrodes (0,5 mm) est une compromise entre la surface d'électrode et le prix. La chambre montre la figure 2 est basé sur une conception par Luis Bagatolli 15 et Ernesto Ambroggio, et a été usiné à partir de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour permettre le nettoyage avec la plupart des solvants. Cependant, le chlorure polyacétal ou vinyle (PVC) devrait aussi bien fonctionner. La possibilité de supprimer les fils de platine pour le nettoyage agressif est important, et lors de la première apprendre le protocole, il est très utile de pouvoir observer la croissance des GUV in situ par la lamelle de fond. Le plus petit, fermé puits empêchent solution de ballottement d'avant en arrière et permettent également des tests de plusieurs compositions lipidiques en parallèle. Cependant, une chambre de mesure spéciale ne est pas essentiel au départ. Par exemple, des chambres simples, un seul puits peut être improvisés en virant deux fils vers le bas d'une petite boîte de Pétri, ou en utilisant la cire à cacheter pour prendre en sandwich entre eux entre deux lames de verre, ou tout simplement les piquer à travers le capuchon d'un petit flacon.
Tant le électroformation et protocoles gonflement assisté gel devraient produire un nombre suffisant de GUVs sans défaut pour micro-manipulation et les expériences de patch-clamp. Cependant, le rendement dépend de GUV sensible sur la formation de l'empilement bicouche lorsque la solution de SUV est partiellement déshydraté. Si des difficultés sont rencontrées dans GUVs croissance (c.-à-pas ou peu GUVs sont visibles dans la chambre de croissance), il peut être très utile à croître GUVs lipidiques uniquement en utilisant une solution de lipide / chloroforme en place des VUS 15,16 (et une faible tampon sel). Si GUVs ne poussent pas bien d'un film lipidique / chloroforme puis quelque chose de fondamental est mauvais (par exemple, des solutions lipidiques incorrectes ou des tampons, de graisse ou de la saleté sur les électrodes, la tension incorrecte ou de fréquence, etc.). Toutefois, si GUVs poussent à partir de films de lipides / chloroforme mais pas les films SUV, alors la question est susceptible d'être avec la déshydratation partielle.
L'étape de déshydratation partielle estle plus facilement optimisé en utilisant lipidiques seuls VUS parce qu'il n'y a pas de risque de "dénaturation" lipides par déshydratation excessive. Pour électroformation, il peut être utile d'examiner les fils après que les gouttelettes de VUS ont été autorisés à sécher pour vérifier il est lumineux fluorescence lipidique à chaque endroit où une gouttelette a été déposé. Si la fluorescence des lipides disparaît après que la chambre est remplie avec une solution de croissance, alors soit la solution de croissance doit être ajouté plus de soin, ou les SUV besoin pour déshydrater plus longtemps si le film se fixe plus solidement sur le fil. Pendant la croissance, assurez-vous que ni le fils ni solution mouvement dans la chambre (par exemple, lors de la mise de la chambre sur le microscope) pour éviter le décapage GUVs hors les fils. Lorsque GUVs poussent bien, ils sont généralement faciles à voir dans les images à contraste de phase. Toutefois, les petites GUVs sont souvent plus claire à l'aide lipide fluorescence, qui est également utile pour voir comment la pile de membranes a changé au cours de la croissance. Examiner toutes les surfaces deles fils (intérieur, extérieur, haut et bas) dans tous les puits ainsi que le plancher de la chambre avant de jeter la croissance, parce que les rendements peuvent varier considérablement d'un endroit à un autre.
La manipulation et le stockage des GUVs est simple par rapport aux cellules, mais GUVs sont très sensibles au stress osmotique, des forces de cisaillement et l'adhérence. Lisses, mouvements doux sont importants lors de la récolte ou le transfert GUVs, et il est important pour passiver surfaces pour prévenir GUVs d'adhérer et de l'explosion. Cependant, pour des expériences de patch-clamp la chambre doit être rincé soigneusement après passivation sorte que la solution de passivation ne peut enrober les pipettes de patch et empêchent la formation gigaseal. Pour passivation, le traitement de la bêta-caséine est simple et efficace, et par rapport à l'albumine de sérum bovin, qui a une fonction de transport des lipides, la bêta-caséine a des interactions plus limitées avec les bicouches lipidiques et doit être préféré lorsque l'on travaille avec GUVs 36. En faisant varier le temps d'incubation, il estpossibles pour obtenir GUVs à adhérer sans exploser. Cependant, les GUVs ne adhèrent pas à la diapositive de couverture aussi fermement que les cellules, et les soins afin doit encore être prise au cours d'une procédure qui peut induire un écoulement dans la chambre (par exemple, la perfusion tampon, déplaçant la chambre).
Enregistrement patch-clamp est une méthode classique pour l'étude des canaux ioniques voltage-dépendants comme KvAP et ce protocole est dérivé de techniques standard pour l'obtention d'patches "inside-out" de cellules adhérentes. Un patch-clamp set-up standard dans lequel la pipette de patch descend obliquement (par exemple, 30 à 60 degrés de l'horizontale) dans une petite boîte de Petri devrait bien fonctionner. Cependant, des images plus claires de la pipette de patch et la région gigaseal peuvent être obtenues en utilisant une chambre dans laquelle lamelles forment le haut et le bas de la chambre (~ 1 mm séparation) de sorte que la pipette de patch peut entrer horizontalement du côté. Parce grande tache pressions de pipettes ne sont pas nécessaires, la pression peut être commodément controlled avec une seringue et contrôlé avec un compteur de pression simple (par exemple, manomètre à eau improvisée). Il peut être utile de premières expériences pratiques de patch-clamp avec GUVs lipidiques uniquement cultivées en utilisant une solution de lipides / chloroforme et le tampon pauvre en sel. Parce que le rendement de GUVs sans défaut est très élevé, il y aura beaucoup de GUVs parfaits pour travailler avec, même si beaucoup sont détruites pendant la récolte et le transfert à la chambre expérimentale.
Avec un peu de pratique, excisées patches membranaires avec gigaseals stables peuvent être facilement obtenus à partir DPhPC GUVs et KvAP-DPhPC GUVs. Pour atteindre un taux de réussite élevé, il aide à choisir soigneusement ronde, mais légèrement fluctuant, GUVs sans défaut et vérifiez que la pipette de patch est propre (la recherche de lipides dans fluorescence) avant de tenter de former le gigaseal. Lorsqu'une membrane «langue» entre dans la pipette de patch, le gigaseal forme typiquement rapidement (<1 sec) sans nécessité d'une forte aspiration ou spécific tension de maintien. Alors une mauvaise étanchéité peut améliorer à mesure que la membrane se traîne plus loin dans la pipette de patch, souvent le sceau reste faible parce que l'intérieur de la pipette a été contaminé et il est nécessaire de recommencer avec une pipette de patch fraîche et GUV. DPhPC formes très stables patches membranaires (dizaines de minutes) avec une excellente résistance d'étanchéité, même à des tensions élevées (par exemple, ± 150 mV). SOPC: cholestérol (3: 1 par mole) peuvent également former des plaques très stables mais peuvent nécessiter aspiration plus élevé pour sceller, tandis que Egg-PC patchs semblent briser plus facilement.
Pour les longues séances de patch-clamp, il peut être nécessaire d'ajuster l'osmolarité de la solution de la chambre. Si l'osmolarité est trop beaucoup plus faible que la mémoire tampon de la croissance de la GUV, GUVs enflent, tendue et sphérique et il peut ne pas être possible d'aspirer la membrane GUV assez loin dans la pipette de patch pour former un gigaseal. Cela peut souvent être fixé par simplement attendre 10 ou 20 minutes que l'évaporation de la chambre augmente la postesolution ernal osmolarité jusqu'à ce que les GUVs dégonflent et commencent à fluctuer. Inversement, si la chambre est laissée ouverte pendant trop longtemps l'osmolarité de la solution externe peut augmenter jusqu'à GUVs dégonflent, tubulé et le bourgeon. Ceci peut être évité en bloquant l'évaporation à partir de la chambre (par exemple, avec de l'huile minérale) ou périodiquement ajoutant de l'eau distillée pour remplacer l'eau qui se est évaporée.
Parce que les protéines peuvent être exclus de patchs excisés de la membrane 31, le nombre de canaux actifs dans un timbre excisé ne est pas simplement liée à la densité de la protéine dans la membrane GUV. Les mesures de fluorescence indiquent la concentration de KvAP dans la membrane patch est beaucoup plus faible que la GUV 28 et il peut être très facile d'obtenir des taches contenant seulement un petit nombre de canaux. Cependant, si les patchs contiennent trop de canaux pour l'enregistrement à un seul canal, les mesures les plus évidentes de l'aide de pipettes de patch avec de plus petites pointes et / ou l'abaissement de la d-protéine-lipide àensité dans le mélange de SUV sont efficaces. En revanche, pour effectuer des mesures d'ensemble sur les taches contenant de nombreux canaux, il peut être utile de commencer avec une densité relativement élevée de protéines (par exemple, 01 heures 10, la protéine de lipide en poids), utiliser la fluorescence de la protéine à sélectionner GUVs avec une densité élevée en protéines , utiliser de plus grandes pipettes correctifs (par exemple, 2 à 3 microns de diamètre à la pointe) et aspirer rapidement pour essayer de former rapidement le joint. De toute évidence, la configuration "cellule entière" de type (ce est à dire, «tout-GUV») serait idéal pour caractériser tous les canaux dans un GUV, mais malheureusement, le «tout-GUV" configuration pose plusieurs questions techniques 37.
Les solutions, les lipides et les concentrations de protéines dans ce tutoriel sont simplement fournis à titre de point de départ, et peuvent être modifiés pour répondre aux besoins d'une expérience particulière suivantes quelques considérations.
Toutes les solutions doivent inclure un tampon de pH tels que HEPESou TRIS pour assurer protéines ne sont pas exposés à des extrêmes de pH. Le tampon de SUV devrait avoir aussi bas une concentration de solutés que la protéine tolère (par exemple, un sel ou inférieure à 5 mM), car les concentrations de soluté augmente pendant l'étape de déshydratation partielle et de fortes concentrations de sel peuvent dénaturer la protéine ou provoquer le film lipidique à rapidement délaminer lors de l'étape de réhydratation. De faibles quantités de sucres tels que le trehalose (par exemple, 1 mm à 5 mm) sont considérés pour protéger la protéine au cours de la déshydratation 23. Alors que le tréhalose a été impliqué dans anhydrobiose et est censé protéger les protéines membranaires et contre la dessiccation 38, le saccharose ou le glucose peuvent fonctionner aussi bien.
Pour le tampon de croissance, la concentration en sel est particulièrement important car cela va influencer les paramètres pour la croissance des GUV optimale (par exemple, la tension de électroformation, fréquence et durée). En revanche, la contrainte primaire pour le tampon d'observation est tchapeau elle devrait avoir la même osmolarité que le tampon de croissance. L'inclusion de saccharose et / ou glucose dans le "tampon de croissance" et "tampon d'observation" peut se avérer utile pour se assurer GUVs sédiments au fond de la chambre d'observation, tandis qu'une différence d'indice de réfraction entre GUV intérieur et l'extérieur aide à contraste de phase ou microscopie DIC. Electrophysiologists comprennent souvent des ions calcium ou de magnésium à la solution de bain et / ou à améliorer la pipette en patch formation gigaseal avec les membranes cellulaires, mais ceux-ci ne semble pas être essentielle pour GUVs. En effet, des ions divalents tels que le magnésium et le calcium peuvent induire une séparation de phase lipidique et facilitent l'adhérence, de sorte que ces problèmes se posent, il peut être utile d'ajouter EDTA 1 mM.
De toute évidence, une attraction clé des systèmes reconstitués par rapport à des cellules est la capacité de contrôler la composition en lipides. DPhPC GUVs poussent bien et forme stable patches membranaires excisées, et ces protocoles ont également travaillé efcace pour des mélanges de lipides contenant de la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphatidique (PA), phosphatidylsérine (PS) et de cholestérol. Cependant, la croissance GUV est sensible à la fois à la composition lipidique et tampons 15, et ainsi de paramètres de protocole (par exemple, la quantité de lipide déposé, la tension de électroformation / fréquence) peut être nécessaire d'ajuster de mélanges de lipides contenant de fortes concentrations de PE, des lipides chargés (PG, PA, PS), ou de cholestérol. Lors du démarrage, Egg-PC, DOPC ou DPhPC sont un bon premier choix, et il est également très utile d'inclure un lipide fluorescente pour observer la croissance de GUV et de distinguer GUVs de vésicules multilamellaires avec deux ou plusieurs bicouches. des mélanges lipidiques peuvent être préparées en combinant des suspensions de SUV de solutions mères, comme les lipides se mélangent au cours de l'étape de déshydratation partielle (à condition que la température est supérieure à ne importe quelle température de transition de phase individuelle). Utilisation de la concentration de SUV supérieur (par exemple,10 mg / ml) des solutions mères permet une grande souplesse, et ceux-ci peuvent ensuite être dilué à 3 mg / ml avant la déshydratation de la suspension.
Si tenter de se adapter à ces protocoles autres protéines trans-membrane, il est très important de pouvoir observer à la fois directement l'incorporation de la protéine dans la fonction GUVs et protéine d'essai. Bien que pas un problème avec KvAP, il est toujours possible que lors de la réhydratation étape la protéine trans-membranaire restera dans la pile de membranes conduisant à la formation de GUVs lipidiques seule. Le marquage fluorescent de la protéine est très pratique car il fournit un moyen rapide et sans équivoque à respecter protéines incorporation dans GUVs et aussi vérifier pour l'agrégation au sein GUVs. Il est également très important de tester la fonction des protéines dans les GUVs pour confirmer que la protéine n'a pas été endommagée pendant le processus de reconstitution. Pour les canaux ioniques tels que KvAP, les mesures de patch-clamp peut établir la présence de canaux fonctionnels dans leGUVs. Cependant, un ligand de haute affinité marquée par fluorescence (par exemple, la toxine, substrat ou anti-corps) serait également très utile pour tester l'état de protéines dans GUVs.
En résumé, cet article montre comment produire Proteo-GUVs contenant le canal potassique de tension fermée KvAP et caractériser les utilisant la microscopie par fluorescence et en électrophysiologie. Espérons que ces méthodes peuvent être adaptés à de nouvelles classes de protéines membranaires et fournissent une base pour les systèmes in vitro plus complexes pour l'étude et la constitution de la matière vivante de ses composantes fondamentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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