Summary
La reconstitución de la proteína transmembrana, KvAP, en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se demostró por dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e inflamación gel asistida. En ambos métodos, pequeñas vesículas unilamelares que contienen la proteína se fusionan para formar GUVs que luego pueden ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia y la electrofisiología patch-clamp.
Abstract
Gigante vesículas unilamelares (GUVs) son un sistema biomimético popular para el estudio de la membrana fenómenos asociados. Sin embargo, comúnmente utilizados protocolos para crecer GUVs deben modificarse con el fin de formar GUVs que contienen proteínas transmembrana funcionales. En este artículo se describen dos métodos de deshidratación-rehidratación - electroformation e hinchazón gel asistida - para formar GUVs contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP. En ambos métodos, una solución de pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas es parcialmente deshidratado para formar una pila de membranas, que después se deja a hincharse en un tampón de rehidratación. Para el método de electroformation, la película se deposita sobre electrodos de platino de manera que un campo de corriente alterna puede ser aplicada durante la rehidratación de la película. En contraste, el método de la hinchazón gel asistida utiliza un sustrato en gel de agarosa para mejorar la rehidratación de la película. Ambos métodos pueden producir en GUVs (por ejemplo, 100 mM) concentraciones bajas (por ejemplo, 5 mM) y fisiológicas de sal. Los GUVs resultantes se caracterizan por medio de microscopía de fluorescencia, y la función de los canales reconstituidas midieron utilizando la configuración de patch-clamp de dentro a fuera. Mientras que la hinchazón en la presencia de un campo eléctrico alterno (electroformation) da un alto rendimiento de GUVs libres de defectos, el método hinchazón gel asistida produce una distribución más homogénea de proteínas y no requiere equipo especial.
Introduction
Al estudiar los principios físicos que rigen los sistemas vivos, los enfoques ascendentes permiten un experimentalista para controlar la composición del sistema y otros parámetros que no son fácilmente manipulables en sistemas basados en células 1. Para los procesos basados en membranas, vesículas unilamelares gigantes (GUVs, diámetro ~ 1-100 micras) han demostrado ser un sistema muy útil biomimético 2 - 7 ya que son muy adecuado para estudios de microscopía y micromanipulación 8 - 10. Si bien hay muchos protocolos diferentes para producir GUVs, la mayoría caen en dos categorías - emulsión a base aproxima 11,12 y técnicas basadas en la rehidratación de una película lipídica 13-16. En los métodos basados en emulsión, las láminas interior y exterior de las membranas GUV se ensamblan secuencialmente a partir de monocapas de lípidos en las interfases agua / aceite. Este método es ideal para la encapsulación de proteínas solubles conen los GUVs, y para la formación de GUVs con composición lipídica valva asimétrica. Sin embargo, GUVs formados a partir de emulsiones pueden retener trazas de disolvente que cambian las propiedades mecánicas de la membrana 17, y el enfoque no es especialmente adecuado para la reconstitución de proteínas trans-membrana.
Métodos de rehidratación de película se basan en el hecho de que el secado (deshidratación) causa muchas mezclas de lípidos para formar una pila multi-lamelar de las membranas. Si esta pila se coloca entonces en contacto con un tampón acuoso, las membranas de la pila se moverán flujos separados como disolvente entre ellos y en la superficie de la pila, las membranas individuales pueden separar para formar GUVs 13,18 (así un verdadero zoológico de otros objetos lipídicos). Sin embargo, incluso para las composiciones de amortiguación y de lípidos óptimos, este método clásico "inflamación espontánea" tiene un rendimiento relativamente bajo de GUVs libres de defectos. Un método muy utilizado para aumentar el rendimiento de GUVs sin defectos es "electroformation221 ;, en el que se aplica un campo de corriente alterna (AC) durante la rehidratación de la película. Mientras que el mecanismo sigue siendo poco conocida, "electroformation" puede dar rendimientos GUV espectaculares (> 90% en circunstancias favorables) para los búferes de baja concentración de sal (<5 mM) 14,19, e incluso se puede trabajar en tampones fisiológicos (~ 100 mM) usando una mayor frecuencia (500 Hz frente a 10 Hz) de campo de CA y electrodos de platino 15. Un enfoque alternativo para aumentar el rendimiento de GUVs libres de defectos es "gel asistida inflamación", en el que se deposita la solución de lípidos sobre un sustrato de gel polimérico en lugar de la pasiva sustratos (por ejemplo, vidrio, PTFE) utilizado en "inflamación espontánea clásica ". Cuando se rehidrata la película de lípido / gel resultante, GUVs pueden formar rápidamente incluso para tampones fisiológicos 16,20.
Todos estos métodos pueden producir GUVs lípidos sólo que se pueden utilizar para estudiar los fenómenos asociadas a la membrana tales como lala interacción entre las proteínas y las membranas solubles. Sin embargo, para incorporar una proteína trans-membrana en GUVs, se necesitan modificaciones importantes para asegurar que la proteína permanece en un estado funcional durante todo el procedimiento de reconstitución. Mientras que las soluciones de lípidos en disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo, ciclohexano) son ideales para la producción de películas de lípidos, las proteínas trans-membrana son típicamente sólo es estable cuando su dominio trans-membrana hidrófoba se incorpora en una bicapa lipídica, o rodeado por una micela detergente ( por ejemplo, durante la purificación de proteínas). Por lo tanto, el material de partida para una reconstitución es típicamente membranas nativas, proteína purificada en una solución de detergente, o pequeñas vesículas unilamelares que contienen proteínas (Proteo-SUVs) y / o vesículas multilamelares (proteo-MLV) formado por la eliminación del detergente en el presencia de lípidos. La mayoría de los métodos para incorporar estas proteínas de membrana en GUVs se dividen en tres categorías.
Insertio directon: Trans-proteína de membrana suspendida en el detergente se mezcla con, de sólo lípidos, GUVs solubilizadas ligeramente detergentes preformadas, y el detergente elimina a continuación usando Biobeads 21. Si bien conceptualmente simple, este método requiere un control preciso de la concentración de detergente, como una concentración demasiado alta de detergente puede disolver los GUVs mientras que una concentración demasiado baja puede causar la proteína se despliegue o agregado.
GUV / Proteo-SUV Fusión: La proteína en Proteo-SUV se combina con preformadas, lípidos sólo para GUVs y fusión se facilita con péptidos de fusión especiales 22 o detergente 21. Normalmente la extensión de la fusión es limitada llevando a GUVs con baja densidad de proteínas.
La deshidratación / rehidratación: Una película de lípidos que contiene proteína está formada por deshidratación parcial de un proteo-SUV (o proteo-MLV) solución y GUVs se cultivan como para una película lipídica pura. El reto es obvio para proteger a la proteína durante la dehydrati parcialen el paso 23, pero el método se ha utilizado con éxito para reconstituir proteínas trans-membrana tales como bacteriorodopsina, calcio-ATPasa, integrina y VDAC en GUVs 7,23 - 25.
Este artículo describe protocolos de deshidratación / rehidratación para hacer GUVs que contienen el canal de potasio dependiente de voltaje, KvAP, desde el Archaea, Aeropyrum pernix hiper-termófilo. KvAP tiene un alto grado de homología con los canales de potasio dependientes de voltaje eucariota 26 y una estructura cristalina conocida 27 , por lo que es un buen modelo para estudiar el mecanismo de compuerta de voltaje. La producción de los proteo-SUV ha sido descrito en detalle anteriormente y no es parte de este tutorial 26,28,29. Es importante destacar que, KvAP Proteo-SUVs no tienen que ser producidos para cada preparación GUV, ya que pueden ser almacenados en pequeñas alícuotas (por ejemplo, 10 l) a -80 ° C durante largos períodos de tiempo (> 1 año). Electroformationo hinchazón gel asistida se puede usar entonces para crecer GUVs de los proteo-SUVs KvAP (o proteo-MLV).
Los pasos clave para el protocolo electroformation se ilustran en la Figura 1. Gotitas de una solución de SUVs que contienen la proteína se depositan sobre alambres de platino (que se muestran en la Figura 2). Deshidratación parcial de la suspensión de SUV conduce a la formación de una película de lípidos y proteínas a través de la fusión de SUVs. Durante la rehidratación, un campo de corriente alterna se aplica a los electrodos para ayudar a las capas de lípidos a la delaminación y formar GUVs. Un campo de 10 Hz funciona bien cuando se utiliza "bajo en sal" (<5 mM) rehidratación de amortiguación 28 y GUVs tardan varias horas para crecer. En contraste, los tampones fisiológicos (que contiene ~ 100 mM de sal) trabajar bien con un voltaje más bajo, campo 500 Hz AC pero requieren un prolongado (~ 12 h) hinchazón período 15. Este método se basa en un protocolo anterior usando ITO se desliza 24, pero utiliza un cont cámara de encargoaining dos alambres de platino, como se muestra en la Figura 2 (ver la discusión de los detalles de diseño y sugerencias para la más simple, cámaras improvisado).
La Figura 3 ilustra el método hinchazón gel asistida. El protocolo funciona bien con tampones con concentraciones fisiológicas de sal, es rápida, y produce GUVs con una distribución más homogénea de proteínas. Sin embargo, el rendimiento de GUVs, aparentemente sin defectos aislados (es decir, la membrana GUV es uniforme en la longitud de las escalas ópticas y no encierra ningún objeto) es menor, a pesar de que ofrece un número suficiente de patch-clamp y experimentos de micro-manipulación . Este método se basa en un protocolo usando gel de agarosa para producir GUVs lípidos sólo 16 y requiere un equipo menos especializado que el método electroformation.
La caracterización de GUVs con microscopía de fluorescencia se describe, así como los procedimientos que utilizan un estándar de patch-clamp set-up amedir la actividad KvAP en "dentro-fuera" extirpados parches de membrana.
Cultivo GUVs que contienen proteínas pueden ser más difícil que GUVs lípidos solamente. En particular, el rendimiento GUV final puede depender sensiblemente de exactamente cómo la solución SUV se deposita y se deshidrata para formar la pila de membranas. Para alguien sin ninguna experiencia previa con GUVs, puede ser útil para crecer primero GUVs lípidos sólo siguiendo un protocolo convencional de 15,16 en el que la película de membrana se forma mediante el depósito de lípidos en un disolvente orgánico. Una vez que el protocolo convencional funciona bien, SUV deposición y deshidratación parcial luego se pueden dominar el uso de los SUV de lípidos sólo, que también son muy útiles cuando se ajusta el protocolo para una nueva composición de los lípidos. Cuando GUVs crecen de forma fiable de los SUV de lípidos sólo, entonces es sólo un pequeño paso para producir GUVs que contienen proteínas de Proteo-SUV.
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Protocol
1. Preparación de la solución
- Preparar 5 ml de búfer SUV 'que contiene 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o TRIS (pH 7,5), y la trehalosa 2 mM. Filtrar el tampón con un filtro de jeringa de 0,2 micras y se dividen en alícuotas de 1 ml que se pueden almacenar a -20 ° C.
NOTA: Los detalles adicionales de los reactivos e instrumentos se dan en la lista de materiales. - Preparar 40 ml de 'Crecimiento Buffer' GUV que llenará el GUV interior durante la rehidratación película. Para un crecimiento 'baja en sal ", se combinan 5 mM KCl, 1 mM HEPES (pH 7,4) o 1 mM TRIS (pH 7,5), y sacarosa ~ 400 mM. Para un crecimiento 'salina fisiológica', combinar mM KCl 100, 5 mM HEPES (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), y ~ 200 mM de sacarosa.
- Preparar 40 ml de 'Observación Buffer' para la solución externa en la cámara experimental mediante la combinación de KCl 100 mM, HEPES 5 mM (pH 7,4) o 5 mM TRIS (pH 7,5), y ~ 200 mM de glucosa.
NOTA: Estos amortiguadores son sólo examples. Véase la discusión para adaptar los tampones para otros experimentos. - Mida las osmolaridades de los buffers de crecimiento y de observación con un osmómetro. Añadir gránulos de sacarosa o glucosa para que coincida con ellos dentro del 1% de manera que GUVs no lisar o contraer cuando se transfieren desde la cámara de crecimiento a la cámara de observación.
NOTA: En este rango de concentración, la adición de 1 mM de sacarosa (13,7 mg por cada 40 ml) o glucosa (7,2 mg por 40 ml) aumenta la osmolaridad por ~ 1 mOsm. - Filtrar los buffers de crecimiento y observación con un filtro de 0,2 micras y almacenar a 4 ° C para inhibir el crecimiento bacteriano.
- Disolver 50 mg de beta-caseína en 10 ml de TRIS 20 mM (pH 7,5) tampón para formar una solución de beta-caseína 5 mg / ml necesaria para pasivar las superficies de cámaras experimentales de modo que GUVs no se adhieren, se propagan y se rompen. Una vez que la beta-caseína se disuelve por completo (hasta varias horas a 4 ° C), el filtro (0.2 m) en alícuotas de 0,5 ml que se puede flash congelado y almacenadoa -20 ° C para su uso posterior (alícuotas descongeladas almacenados a 4 ° C por lo general se puede utilizar durante un máximo de un 1 semana).
2. Preparación SUV
- Prepare y congele alícuotas de Proteo-SUV siguiendo el protocolo detallado publicado previamente 28. Use KvAP marcada con fluorescencia con Alexa-488 maleimida, reconstituida en DPhPC SUVs (10 mg / ml) a una proteína a la relación de lípido de 1:10 (en masa).
NOTA: De tipo salvaje KvAP contiene una cisteína por monómero situado cerca del extremo C-terminal intracelular (aminoácido 247). - Fluorescentes, en lípidos sólo SUV:
NOTA: Maneje cloroformo bajo una campana de humos con guantes de nitrilo y gafas de seguridad. Evite el uso de cualquier plástico como cloroformo puede disolverlos. Soluciones de cloroformo se pueden almacenar en viales de vidrio ámbar con tapas de teflón y se transfieren utilizando jeringas de vidrio. Tener cuidado para enjuagar todo el material de vidrio al menos 5 a 10 veces con cloroformo antes y después de pipetear los lípidos.- Preparar 100 l de10 SUVs mg / ml DPhPC que contienen 0,5% en moles del lípido fluorescente de color rojo, rojo de Texas-DHPE, mediante la mezcla de 100 l de solución de DPhPC (10 mg / ml en cloroformo) con 8,2 l de solución de Rojo Texas-DHPE (1 mg / ml en metanol) en un vial de vidrio de 1,5 ml de color ámbar.
- Secar los lípidos hacia abajo bajo una corriente de nitrógeno en una campana química mientras gira el vial. Cuando la película parece estar seca, coloque los lípidos en condiciones de vacío durante 3 horas para eliminar cualquier disolvente residual.
- Añadir 100 l de tampón SUV a los lípidos, y agitar vigorosamente hasta que no lipídico queda pegado a las paredes del vial y la solución es uniformemente lechoso.
- Sonicar la solución de lípidos para formar SUVs. Ajuste la posición del vial hasta que el ultrasonido hace que la mayor parte del movimiento y el flujo en el interior del vial, y tener cuidado de no calentar la solución innecesariamente. Continuar sonicación hasta que la solución se vuelve traslúcido, o cuando sea posible, transparente (2-5 minutos de sonicación punta, ~ 20 min de tratamiento con ultrasonidos de baño).
- Aliquot SUV (por ejemplo, 10 l ó 20 l) y de congelación (-20 ° C) para su uso posterior.
NOTA: Los lípidos, especialmente los lípidos insaturados, puede fácilmente avería. Soluciones de lípidos tienda a 20 ° C (o 80 ° C) en atmósfera de argón y utilizan dentro de los 6 meses. Productos de degradación de lípidos pueden ser detectados con cromatografía de capa fina.
3. GUV Crecimiento por Electroformation
- Prepare la cámara electroformation.
- Si la cámara no se ha limpiado, retire las ventanas, elimine todo el sellador y la grasa, extraiga los cables, y enjuague y frote la cámara con un paño con agua y etanol (≥70%) alternativamente.
- Frotar los cables así, se sumergen los alambres y la cámara en acetona, y sonicar durante 5 min. Limpie todo con un tejido nuevo utilizando acetona. Ponga la cámara en etanol y se somete a ultrasonidos durante 5 min.
- Montar la cámara mediante la inserción de los cables a través de los agujeros, y girar y limpie los cables para asegurarse de que are limpio. Ponga la cámara en agua destilada, sonicar durante 5 min y secar la cámara con una corriente de nitrógeno o aire.
- Preparar 30 l de 3 mg / suspensión SUV ml en tampón SUV. Para formar GUVs que contienen proteínas, combine 8 l de Proteo-SUV (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), 2 l de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC, 0,5% en moles TexasRed-DHPE) y 20 l de SUV tampón en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para una proteína final de lípidos (masa) relación de 1 a: 12,5 y 0,1% en moles TexasRed-DHPE. Mezclar enérgicamente la solución.
- Alternativamente, para practicar el protocolo de sólo con lípido SUVs, simplemente combinar 10 l de SUVs fluorescentes (10 mg / ml DPhPC y 0,5% en moles TexasRed-DHPE) con tampón de SUV 20 l.
- Deposite la Solución SUV.
- Usar una pipeta de 2 l o 5 l jeringa de vidrio para depositar pequeños (<0,2 mu l) gotitas de la solución SUV en los cables. Aproximadamente se necesita 1 l de solución para formar una serie de gotas a lo largo1 cm de alambre. Asegúrese de que las gotas son lo suficientemente pequeños y espaciados lo suficientemente aparte que no se toquen o fusible.
- Deje que los SUVs depositados sequen durante ~ 30 minutos en el aire libre. Cuando todas las gotas se han asentado, gire el cable por lo que los depósitos de lípidos son más fáciles de observar con el microscopio.
NOTA: Si los SUVs no se sequen lo suficiente, que sólo puede lavar los cables cuando se añade el tampón de crecimiento, mientras que el secado en exceso puede dañar la proteína. Debido a la humedad del aire influye en la velocidad de secado, el tiempo de secado y / o la humedad del aire se puede ajustar para obtener resultados óptimos 30. La película de lípidos en los cables debe ser visible en el microscopio.
- Montar la cámara.
- Sellar el fondo de la cámara: Utilice una jeringa para aplicar grasa de vacío a la parte inferior de la cámara alrededor de los tres pozos y presione un 40 mm x 22 mm cubreobjetos suavemente contra él para sellar el fondo de la cámara para que se adhiera sin un hueco. Selle los lados de la cámara (en la salida cables) consellado pasta. Aplicar grasa de vacío en la parte superior de la cámara de esbozar los tres pozos.
- Agregue lentamente tampón crecimiento hasta cada pozo se llena hasta el tope. Evite cualquier movimiento rápido de la solución en los pozos, ya que esto puede pelar la película de lípido de los electrodos.
- Cerrar la cámara pulsando el portaobjetos cubierta superior con cuidado sobre la grasa, teniendo cuidado de no desplazar el portaobjetos inferior. Utilice un tejido para eliminar las gotas de tampón a los bordes de la hoja de la cubierta superior.
NOTA: Este es un buen momento para examinar la cámara bajo el microscopio para confirmar que la película de lípido se ha mantenido en los cables.
- Conecte el generador de señales a los cables utilizando dos pinzas de cocodrilo. Ajuste la frecuencia (10 Hz / 500 Hz onda sinusoidal de tampón salino de baja / alta) y usar un multímetro para medir y ajustar el voltaje a través de los cables de 0,7 / 0,35 V raíz cuadrada (Vrms) para el búfer de sal baja / alta significar. Cubra la cámara con papel de aluminio para proteger los fluoróforos de la luz. Deja tél GUVs crecer durante 2 a 3 h para el tampón bajo en sal, y 12 hr o O / N para el tampón de alta sal.
- Desconecte la cámara del generador y que lo coloque en un microscopio invertido para evaluar el crecimiento GUV. Utilice, movimientos lentos y firmes o flujo de líquido en los pozos pueden desprenderse prematuramente GUVs de los cables.
NOTA: GUVs en los bordes de alambre son generalmente visibles en contraste de fase (40X mucho trabajo objetivo distancia), mientras GUVs en cualquier lugar en la mitad inferior de los cables se pueden ver con epifluorescencia. Si no hay GUVs son visibles, intente girar los cables a mirar a la cara superior. GUVs se pueden almacenar a 4 ° C en una cámara de crecimiento durante varios días.
4. GUV Crecimiento por Hinchazón asistida-Gel
- Preparar 10 ml de una solución de agarosa al 1% mediante la mezcla de 100 mg de agarosa con 10 ml de agua pura. Calentar hasta que hierva colocándolo en un microondas a 480 W durante ~ 20 seg. Revuelva para asegurarse de que la agarosa se disuelva por completo.
NOTA: La soluciónse puede almacenar a 4 ° C y recalentado cuando sea necesario. - -Plasma limpia (plasma de aire) a-corredera de cobertura de 1 min de manera que la solución de agarosa se extenderá muy bien en él. Utilice los toboganes de cobertura dentro de los próximos 15 minutos como el efecto de limpieza por plasma desaparece rápidamente.
- Aplicar 200 l de solución de agarosa caliente a cada 22 x 22 mm 2 diapositiva para la solución moja toda la superficie. Inclinar la placa verticalmente y tocar el borde inferior de un pañuelo de papel para eliminar el exceso de líquido y dejar sólo una capa lisa fina de agarosa en la diapositiva.
- Colocar el portaobjetos en una placa caliente o un horno a 60 ° C y se deja secar durante al menos 30 minutos. La película de agarosa es apenas visible a simple vista. Después de las diapositivas se enfríen a temperatura ambiente, utilizar inmediatamente o almacenar durante un máximo de una semana en un recipiente cerrado a 4 ° C.
- Coloque el cubreobjetos de agarosa recubiertas de 3,5 cm en un plato de Petri estándar.
- Preparar la solución SUV como en la Sección 3.2 y aplicar ~ 15 l de la solución SUV (3 mg / ml de lípidos) en~ 30 gotas muy pequeñas suavemente sobre la superficie de agarosa. Tenga cuidado de no distorsionar la capa de agarosa demasiado.
- Colocar el portaobjetos bajo una corriente suave de nitrógeno durante aproximadamente 10-15 min y seguir la evaporación de la memoria intermedia por el ojo como las gotitas se secan.
- Tan pronto como las SUVs se han secado, añadir tampón de crecimiento para cubrir la superficie de deslizamiento. Para un pequeño 3,5 cm placa de Petri de uso ~ 1 ml de tampón.
- Deje que la hinchazón de proceder para ~ 30 min, y luego examinar el crecimiento de GUVs en la cámara usando un microscopio invertido con contraste de fase o de contraste de interferencia (DIC).
NOTA: la observación de epifluorescencia es difícil debido a la sólida formación de fluoróforos en el gel y la auto-fluorescencia de la agarosa.
5. La cosecha y de Observación GUVs
- Pasivar la cámara de observación (por ejemplo, pequeña placa de Petri o cubreobjetos de vidrio) para que GUVs no se pegan, se extendió y estalló en el fondo de la cámara. Cubra el chamBER parte inferior con una solución de beta-caseína, incubar durante 5 min, enjuagar la solución de caseína con agua pura, seca con una corriente de aire o nitrógeno, y finalmente añadir tampón de observación (por ejemplo, ~ 5 mm de profundidad para una pequeña placa de Petri).
- Recoger las GUVs. Corte el extremo de unos 100 puntas de pipeta mu l por lo que la apertura es más grande (~ 2 mm de diámetro), y aspirar lentamente a medida que la tensión de corte de pipeteo puede destruir fácilmente GUVs.
- Para GUVs electro-formado, abrir la cámara de crecimiento quitando suavemente el cubreobjetos superior. Coloque la punta de la pipeta directamente sobre cada cable y aspirar ~ 50 l mientras se mueve la punta de la pipeta a lo largo del alambre para desprender las GUVs.
NOTA: Puede ser útil para hacer girar el alambre para recoger GUVs en el "otro lado" del alambre. - Para GUVs "gel asistida inflamación", primero toque el lado de la placa de Petri un par de veces para ayudar a los GUVs se desprenden de la superficie de cubreobjetos. Coloque la punta de la pipeta justo por encima del cubreobjetos y aspirado de 50 l mientras que Pulling la punta hacia atrás sobre la superficie. Transferir directamente GUVs cosechadas a una cámara de observación, o almacenar en un tubo de 1.5 ml a 4 ° C hasta por 1 semana.
- Para GUVs electro-formado, abrir la cámara de crecimiento quitando suavemente el cubreobjetos superior. Coloque la punta de la pipeta directamente sobre cada cable y aspirar ~ 50 l mientras se mueve la punta de la pipeta a lo largo del alambre para desprender las GUVs.
- Coloque la cámara de observación en un microscopio invertido, agregue las GUVs a la cámara de observación, y espere unos minutos para que los GUVs que se depositan en el fondo de la cámara.
- Encuesta de la cámara con contraste de fase o CID para localizar rápidamente, esféricas ('defecto libres ")" candidatos GUV "lisas. Examine cada "candidato GUV" en epifluorescencia para excluir cualquier liposomas más pequeños que contienen anidadas dentro. Por último, compruebe que la intensidad de la fluorescencia de lípidos es uniforme y compatible con una sola membrana (es decir, unilaminar).
NOTA: En algunos bilaminar (o multi-lamelares) vesículas, las membranas son demasiado juntos por resolver para que aparezcan unilaminar en contraste de fase o DIC imágenes. Sin embargo, estos objetos se pueden distinguir de unilame realGUVs llar por su fluorescencia de lípidos, que es dos veces (o más) más brillantes.
6. GUVs Parche de sujeción
- Haga pipetas de parche con un diámetro de la punta 1-2 micras de vidrio estándar capilar borosilicato utilizando el programa recomendado para el extractor de la pipeta.
NOTA: Los tratamientos especiales tales como pulido al fuego no son necesarios, y las pipetas se pueden utilizar durante varios días después de haber sido tirados si se mantienen en una caja cerrada. - Pasivar la cámara mediante la incubación con una solución de beta-caseína (5 mg / ml) para asegurar que GUVs no se adhieren, se propagan y ruptura en superficies de la cámara. Enjuague la caseína después de 5 min.
- Inserte el electrodo de tierra, llenar la cámara con tampón de observación, transferir 10 l de la suspensión GUV como se describe en el paso 5.2 y 5.3, y espere unos minutos para que los GUVs se asienten en la parte inferior.
- Llenar una pipeta parche nuevo con la solución (buffer de observación u otra solución iso-osmótica) ymontarlo en el patch-clamp amplificador cabezal de la platina.
- Buscar a través de la cámara de la localización de un GUV "sin defectos" como se describe en la sección 5.4, y compruebe que contiene proteína fluorescente.
- Aplique una presión positiva constante (> 100 Pa, o aproximadamente 1 cm H 2 O en un manómetro) para mantener el parche pipeta interior limpio e inserte la pipeta parche en la cámara. Traiga la pipeta parche en el campo de visión, aplicar pulsos de prueba para medir / compensar el desplazamiento y la resistencia de tensión pipeta, y examinar la pipeta con iluminación fluorescente para confirmar que la punta esté limpio.
- Lleve el parche pipeta hacia el GUV, y si es necesario, al mismo tiempo reducir la presión positiva por lo que el flujo hacia el exterior de la pipeta parche no hace que el GUV "huir". Cuando el parche pipeta está cerca del GUV, aplique una presión negativa (hasta 5 cm H 2 O) para tirar del GUV contra la pipeta parche. Vigilar la resistencia como la "; La lengua "de la membrana GUV entra en la pipeta de parche y las formas gigaseal.
- Si un gigaseal no se formó, retire el parche pipeta de la cámara y vuelva al paso 6.4. Si el parche de la membrana forma una gigaseal, pero el GUV permanece unido a la pipeta, escindir el parche tirando lejos de la GUV, estallando la GUV contra el fondo de la cámara, o brevemente mover la pipeta de la solución.
- Cuando el parche de membrana de dentro a fuera se ha escindido del GUV y la gigaseal es estable, apagar los pulsos de prueba y aplicar un protocolo de voltaje tal como la que se muestra en la Figura 13.
NOTA: La Figura 13 sigue la convención electrofisiológico estándar para un parche de dentro a fuera, en la que la corriente que fluye en el parche-electrodo es "positivo", y V = V baño - V pipeta. Sosteniendo el parche a un potencial negativo (por ejemplo, V = -100 mV) para ~ 30 seg KvAP lugares en el estado de reposo, mientras que los pasos (100 ms a 5 s) a potenciales más positivos (por ejemplo, V = 100 mV) se puede conducir en la realización (es decir, abiertos) estados activos. - Después de que se terminaron las mediciones en un parche de membrana, romper el parche con un pulso zap o presión y comprobar que el desplazamiento del electrodo de conexión de tensión no se ha desviado. Retire el parche pipeta de la cámara, y vuelva al paso 6.4.
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Representative Results
El crecimiento de GUVs se puede evaluar de forma rápida mediante el examen de la cámara de crecimiento bajo el microscopio. Para electroformation, los GUVs tienden a crecer en racimos a lo largo de los alambres de platino, como se muestra en la Figura 4. Durante la hinchazón gel asistida, GUVs aparecen como estructuras esféricas que crecen y se fusionan juntos (Figura 5) rápidamente.
GUVs sin defectos son más fácilmente identificados y evaluados después de transferir a una cámara de observación. Se necesitan medidas de calibración para evaluar rigurosamente la calidad GUV, y una cuantificación sistemática ha sido publicado previamente 28. Sin embargo, como una guía empírica, "buenas" GUVs deben ser aislados (es decir, no en un clúster), tienen una sola membrana, liso, exterior esférico, no contienen objetos (es decir, tubos, vesículas anidados, etc.) en el interior, y tener el nivel de fluorescencia de lípidos "estándar" (los objetos más brillantes suelen ser bi o multi-lamelar). La figura 6 muestra DIC y epifluorescencia imágenes de un Jefe "sin defectos" después de la transferencia a una solución de glucosa iso-osmótica. El contraste en la DIC se debe a la diferencia de densidad óptica entre la sacarosa lleno GUV y la solución del baño que contiene glucosa. El contraste de índice de refracción de KvAP que contiene GUVs menudo disminuye con el tiempo, aunque en sí KvAP no debe ser permeable a la sacarosa o glucosa. La fluorescencia de proteína uniforme en la membrana GUV confirma que KvAP se incorpora en el GUV (es decir, no permaneció en la película de lípido) y no se ha formado a escala micrométrica (o más grandes) agregados.
Las figuras 7, 8 y 9 muestran imágenes confocales de fluorescencia de lípidos y proteínas de GUVs producidos por el protocolo inferior-sal electroformation, protocolo electroformation salina fisiológica, y el protocolo de la hinchazón gel asistida. El lípido fluorescente (magenta) y proteínasSeñales (verde) se han reducido a la misma intensidad media, de modo que GUVs con un alto número de proteínas por unidad de superficie (densidad de proteína) bajo / tienen un magenta / verde sombra en las imágenes superpuestas (columna derecha), mientras que con un GUVs la densidad media de la proteína son blancos. GUVs, libres de defectos aislados fueron identificados y la distribución del tamaño GUV se muestra en la Figura 10. Típicamente electroformation produce más GUVs libres de defectos que hinchazón gel asistida, pero los GUVs producidos por electroformation son más pequeñas. La Figura 11 muestra la distribución de la densidad de proteína inferida de la fluorescencia de las GUVs. Electroformation con tampón de alta salinidad produce GUVs en el que la densidad de proteína varía enormemente de GUV al jefe. La densidad de la proteína de GUVs individuales varía mucho menos para electroformation con tampón de baja salinidad, mientras que la densidad de proteína de GUVs producidos por hinchazón gel asistida es notablemente uniforme.
La técnica de patch-clamp es un uso ampliamented método para estudiar la función de los canales iónicos dependientes de voltaje, tales como KvAP. En las grabaciones de "inside-out", un vaso pipeta limpia "parche" se utiliza para extirpar un parche de membrana de una GUV. Un electrodo dentro de la pipeta de parche se utiliza entonces para aplicar tensión, y medir la corriente resultante que fluye a través del parche de membrana. La composición del parche de membrana puede diferir en gran medida del resto de la célula / GUV 31, pero la configuración "de dentro a fuera" todavía es muy útil para medir la conductancia de un solo canal, la selectividad iónica, y gating dependiente de la tensión. Estas tres propiedades son una excelente manera de establecer que las corrientes no son debido a los artefactos (por ejemplo, problemas gigaseal) o contaminantes (por ejemplo, porinas bacterianas de la purificación), y hay canales KvAP funcionales en los GUVs.
La conductancia del canal se mide más fácilmente en los parches con sólo uno o dos canales activos. En el example muestra en la Figura 12, no se observan aberturas de canal cuando la membrana se mantiene a -100 mV, mientras que a 100 mV, aberturas de canales individuales pueden ser claramente resueltos. El histograma actual muestra dos picos correspondientes a la cerrada y los estados abierto y equipándolos con una función gaussiana doble produce una sola corriente de canal de 10,9 ± 0,85 pA, que corresponde a una conductancia de 109,2 ± 8,5 pS (en mM KCl 100). Tenga en cuenta que la conductancia de un solo canal depende de la solución (especialmente la concentración de potasio) y composición de la membrana 32,33.
Al igual que muchos otros canales K, individuo canales KvAP exposición "chattering" ráfagas de aperturas y cierres rápidos. Como se ha demostrado anteriormente, la selectividad de potasio se puede comprobar mediante el uso de una solución diferente en la pipeta de parche (por ejemplo, NaCl solución de la pipeta de parche 90 mM, KCl 10 mM) 28.
Gating tensión dependiente es a menudo estudied en parches con múltiples canales, a fin de obtener más fácilmente una media de conjunto. Si bien no existe un mecanismo obvio favoreciendo la (dominio intracelular en GUV interior) fisiológica e inversa (dominio intracelular en el GUV exterior) inserción de KvAP en GUVs, en parches de membrana "dentro-fuera" la mayoría de los canales funcionales tienen la " "inserción fisiológica 28. Figura 13 muestra la respuesta de un parche de membrana que contiene múltiple (> 10) canales para una serie de 5-segundos pasos despolarizantes. Entre cada paso, el parche se mantiene a -100 mV durante 30 segundos para permitir que los canales con la inserción "fisiológico" para volver a su estado de reposo. Cuando el potencial es suficientemente negativa (por ejemplo, V <-60 mV) la mayor parte de la corriente es debido a la fuga gigaseal, y las aberturas ocasionales de uno o dos canales que son propensos a tener la inserción "inversa". Para ver los pasos a pote más positivantials, se observan un mayor número de canales hasta que no son tantas que las aperturas y cierres individuales ya no pueden ser resueltos. Por lo tanto, la probabilidad de apertura del canal es claramente dependiente de la tensión. La cinética de activación e inactivación KvAP difieren considerablemente entre los negros de lípidos membranas (BLM) 26 y GUVs, pero esto es coherente con los informes anteriores de que Kv canal gating puede ser sensible a la composición de la membrana y el estado 34.
Figura 1. GUV Electroformation Esquema:. Gotitas que contienen SUVs se depositan sobre un electrodo deshidratación parcial de la solución hace que las SUVs se fusionen para formar una pila de membranas. A continuación se añade tampón y un campo eléctrico de CA aplicada. Como las olas de cine, las membranas individuales se desprenden de la pila para formar GUVs. (Esta cifra se ha mod cado de Aimon et al. 28)
Figura 2. GUV Cámara Electroformation. La cámara se muele de un PTFE-bloque con tres pozos (10 mm de diámetro, 5 mm de profundidad). Dos 0,5 mm de diámetro hilos de platino están separados por 3 mm (distancia de borde a borde) y se colocan cerca de la parte inferior de la cámara para facilitar la obtención de imágenes de los cables. Cubres parte inferior y superior se mantienen en su lugar con grasa de vacío, y la pasta de sellado impide cualquier fuga de los agujeros del alambre en el lado. El generador de CA está conectado con pinzas de cocodrilo a los cables. La cámara se basa en uno desarrollado por Ernesto y Luis Ambroggio Bagatolli. (Esta cifra ha sido modificado desde Aimon et al. 28)
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Figura 3. Gel-asistida espontánea Hinchazón Esquema: gotitas que contienen una suspensión de SUV se depositan sobre un gel de agarosa como la gotita deshidrata, las SUVs se fusionan para formar una película lipídica.. Cuando se añade el tampón de crecimiento, la película rehidrata y GUVs forman en la superficie. GUVs crecen hasta un tamaño de ~ 10 micras por la hinchazón y la fusión con GUVs vecinos.
Figura 4. Imagen representativa de GUVs DPhPC contienen KvAP creciente en el alambre de platino en un tampón de alta salinidad. Los GUVs se parecen racimos de uvas a lo largo del alambre. Imagen de contraste de fase usando un objetivo 40X LWD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. GUVs DPhPC que contienen KvAP hinchazón en gel de agarosa. Los GUVs son visibles como esferas débiles con un diámetro de ~ 10 m. Las manchas oscuras / brillantes son agregados de agarosa / lípidos a partir del cual las vesículas se hinchan. Imagen de contraste de fase con objetivo de 40X LWD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Imágenes de una GUV sin defectos. (Egg-PC: Huevo-PA 9: 1 en masa) que contengan KvAP etiquetada con Alexa-488 a la izquierda: DIC, derecha: Alexa-488 epifluorescencia. Excitación: 470/50 nm, emisión: 545/75 nm. Nota la fluorescencia uniforme desde KvAP sin agregados visibles. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Confocal imágenes de lípidos (magenta) y proteínas (verde) de fluorescencia de GUVs electroformados cultivadas en un tampón de baja salinidad (Egg-PC: Huevo-PA 9: 1 en masa) (A) La marca de flechas blancas (probable). GUVs, mientras que la flecha roja marca una vesícula potencialmente bi-laminar con mayor fluorescencia de lípidos. Tenga en cuenta que la intensidad de fluorescencia es más brillante en el centro de esta imagen debido a la extremadamente amplio campo de visión. (B) El zoom muestra un pequeño grupo de GUVs. Izquierda (magenta): TexasRed-DHPE excitación: línea de láser 543 nm, emisión: 605/70 nm. Centro (verde): KvAP etiquetada con Alexa-488 de excitación: línea de láser de 488 nm, emisión: 515/30 nm. Derecha: superposición.oad / 52281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Las imágenes confocales de lípidos (magenta) y proteína (verde) fluorescencia de GUVs electroformados cultivadas en la concentración de sal fisiológica (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 en masa). (A) Los GUVs (flechas blancas muestran probable unilamelar ejemplos) son más escasa en comparación con el protocolo de bajo contenido de sal y pueden tener muy diferentes concentraciones de proteína (flecha roja). (B) El zoom muestra un pequeño grupo de GUVs. Izquierda (magenta): TexasRed-DHPE excitación: línea de láser 543 nm, emisión: 605/70 nm medio (verde): KvAP etiquetada con Alexa-488 de excitación: línea de láser de 488 nm, emisión: 515/30 nm. Derecha:. Overlay favor clamer aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. imagen confocal de lípidos (magenta) y proteína (verde) de fluorescencia de GUVs (DPhPC) formado por gel con ayuda de la inflamación con un tampón de concentración salina fisiológica. GUVs muestran una densidad de proteína más homogénea que GUVs electroformados preparados con tampón fisiológico. Izquierda (magenta): BPTR-Cer 0,1% de excitación: 543 línea láser nm, emisión: 605/70 nm. Medio (verde): KvAP etiquetada con Alexa-488 de excitación: línea de láser de 488 nm, emisión: 515/30 nm. Derecha:. Fusión de los dos canales Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11. GUV histogramas de densidad de proteínas: La densidad de proteína (número de proteínas por unidad de superficie) de GUVs electroformada con tampón de baja salinidad (5 mM KCl, DPhPC) varía menos que con la concentración salina fisiológica (100 mM KCl, Huevo-PC: Huevo -PA. 9: 1 en masa) La densidad de la proteína de GUVs (DPhPC) creció un gel asistida hinchazón en tampón salino fisiológico muestra la menor variación. Densidad de proteína es proporcional a la intensidad de fluorescencia KvAP-A488 para estas concentraciones de 28, y en cada histograma las intensidades de fluorescencia se normalizaron por la media de la distribución. (El panel central se ha modificadode Aimon et al. 28)
Figura 12. actividad de un solo canal de GUV Membrana Parches ("adentro hacia afuera" convención tensión DPhPC). El GUV se cultivó en 100 mM KCl, 5 mM HEPES pH 7,4 en hilos de platino. Canales individuales abiertas después de aplicar 100 potencial mV en el parche. A la derecha de la inserción es un histograma utilizado para calcular la conductancia de un solo canal. La línea roja es un ajuste a una función gaussiana doble con máximos a 4,70 ± 0,27 pA y 15,62 ± 0,58 pA, que corresponde a una conductancia de 109,2 ± 8,5 pS. La traza se filtró a 10 kHz con un filtro Bessel de 4 polos y grabado en 50 kHz.
Figura 13. Tensión-dependen canales t de compuerta en el parche de membrana de una GUV formado en agarosa en un tampón de alta salinidad (DPhPC, convención tensión 'adentro hacia afuera "). (A) Respuesta de corriente de membrana parche a un paso transitorio de la tensión. Pipeta y baño soluciones ambos contenían 100 mM KCl y la membrana se llevó a cabo durante 30 segundos a -100 mV entre los pasos sucesivos de tensión. En una inspección de cerca se puede ver que la traza contiene 1 ó 2 canales que parecen abrir con tensiones negativas. El recuadro a) muestra un zoom de la apertura retardada y la inserción b) el cierre tardío de la canal. Las corrientes se filtraron con un filtro de Bessel de 4 polos en 10 kHz y registrados a 51,3 kHz. Fuera de línea la traza fue muestreada a 513 Hz. El transitorio capacitancia negativa se corta a -150 pA. (B) Corriente media (0,25 seg <t <5 s) en función de voltaje paso. Corrientes de tensiones positivas son más grandes porque la probabilidad de apertura del canal es dependiente de la tensión.iles / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Sistemas de modelos biomiméticos son una herramienta importante para el estudio de las propiedades e interacciones de proteínas y membranas. En comparación con otros sistemas reconstituidos como BLM o membranas de lípidos compatibles, GUV sistemas basados presentes varias oportunidades incluyendo considerable control de la composición de la membrana, la tensión y la geometría, así como ser verdaderamente libre de aceite. Sin embargo, la incorporación de proteínas transmembrana, como KvAP, en GUVs requiere adaptaciones significativas de protocolos convencionales para GUVs lípidos solamente. El protocolo electroformation que aquí se presenta se caracterizó y se utiliza para el estudio de los principios biofísicos de la distribución de las proteínas de membrana y la dinámica en las membranas curvas 2,4,35 previamente. Este trabajo demuestra un nuevo protocolo hinchazón gel asistida, añadiendo al conjunto de métodos para la reconstitución de proteínas en GUVs. Ambos protocolos pueden producir GUVs libres de defectos que contienen altas densidades de KvAP, y las medidas en parches dentro-fuera confirman que elGUVs sí contienen, canales dependientes de voltaje en potasio selectiva funcionales.
Los dos enfoques tienen diferentes fortalezas y debilidades. Cuando se pueden usar condiciones de poca sal, electroformation ofrece un buen compromiso entre el rendimiento y la densidad GUV proteína uniforme. Electroformation todavía da rendimientos razonables con concentraciones fisiológicas de sal, pero la densidad de proteína puede variar en gran medida entre GUVs (véanse las figuras 8 y 11). Las variaciones de densidad parecen estar vinculados a la duración de electroformation, como el crecimiento tampón bajo en sal también puede tener variaciones sustanciales de densidad si el crecimiento continúa mucho más tiempo que 2 hr. En contraste, GUVs producidos por hinchazón gel asistida tienen una densidad proteína notablemente uniforme, incluso para tampones fisiológicos. Sin embargo, la fracción de vesículas multilamelares es mayor, y agarosa auto-fluorescencia complica la cuantificación de proteína baja densidades de 16. El uso de alcohol polivinílico en place de agarosa se ha reportado para mejorar el rendimiento GUV gel asistida cuando los lípidos se depositaron a partir de cloroformo 20, pero fueron incapaces de producir GUVs utilizando alcohol de polivinilo con soluciones de SUV. Si un menor rendimiento de GUVs libres de defectos es aceptable, hinchazón gel asistida tiene una clara ventaja para los experimentos que requieren una distribución uniforme de la proteína.
Electroformation y la hinchazón gel asistida también tienen muy diferentes requerimientos de equipo. El protocolo hinchazón gel asistida utiliza poco equipo especializado excepto por el limpiador de plasma, que no es esencial, ya que hay muchos métodos alternativos para producir limpio, de vidrio hidrofílico. En contraste, electroformation requiere una cámara de medida con electrodos de alambre. Alambre de platino es caro, pero para este protocolo GUVs creció más fácilmente con el platino que los alambres de titanio, y GUVs no crecieron en ITO desliza al utilizar concentraciones salinas fisiológicas. El diámetro de los electrodos (0,5 mm) es una compromise entre la superficie de electrodo y el precio. La cámara de muestra en la Figura 2 se basa en un diseño de Luis Bagatolli 15 y Ernesto Ambroggio, y fue mecanizado a partir de politetrafluoroetileno (PTFE) para permitir la limpieza con la mayoría de los disolventes. Sin embargo, el cloruro de poliacetal o de polivinilo (PVC) también debería funcionar bien. La capacidad de eliminar los hilos de platino para la limpieza agresiva es importante, y cuando está aprendiendo el protocolo, es muy útil para poder observar el crecimiento GUV in situ a través de la tapa deslizante inferior. El más pequeño, cerrado pozos impiden la solución de chapoteo hacia atrás y hacia adelante y también permiten que las pruebas de varias composiciones de lípidos en paralelo. Sin embargo, una cámara de encargo especial no es esencial cuando se inicia. Por ejemplo, las cámaras simples, de un solo pozo pueden improvisarse al virar dos cables hacia la parte inferior de una pequeña placa de petri, o el uso de cera de sellado de sándwich de ellos entre dos portaobjetos de vidrio, o simplemente empuja a través de la tapa de un pequeño vial.
Tanto el electroformation y protocolos de hinchamiento del gel asistida deben producir un número suficiente de GUVs libres de defectos para micro-manipulación y experimentos de patch-clamp. Sin embargo, el rendimiento GUV depende sensiblemente de la formación de la pila bicapa cuando la solución SUV es parcialmente deshidratado. Si se encuentran dificultades en GUVs crecimiento (es decir, pocos o ningún GUVs son visibles en la cámara de crecimiento), que puede ser muy útil para crecer GUVs lípidos sólo utilizando una solución de lípidos / cloroformo en lugar de 15,16 SUVs (y una baja tampón de sal). Si GUVs no crecen bien a partir de una película de lípido / cloroformo y después algo fundamental es (por ejemplo, soluciones incorrectas lípidos o tampones, grasa o suciedad en los electrodos, voltaje o de frecuencia incorrecta, etc.) equivocadas. Sin embargo, si GUVs crecen de películas de lípidos / cloroformo, pero no las películas de SUV, entonces el problema es probable que con la deshidratación parcial.
La etapa de deshidratación parcial esmás fácilmente optimizado usando lípidos sólo para SUVs porque no hay riesgo de "desnaturalización" lípidos por deshidratación excesiva. Para electroformation, puede ser útil examinar los cables después de las gotitas de SUV se han dejado secar para comprobar que hay una fluorescencia de lípidos en cada lugar donde se depositó una gota. Si la fluorescencia de lípidos desaparece después de la cámara se llena con solución de crecimiento, entonces o bien la solución de crecimiento tiene que ser añadido más cuidadosamente, o los SUVs necesita para deshidratar por más tiempo de lo que la película se adhiere más firmemente al alambre. Durante el crecimiento, asegurarse de que los cables ni el movimiento ni solución dentro de la cámara (por ejemplo, al poner la cámara en el microscopio) para evitar la extracción GUVs fuera de los cables. Cuando GUVs crecen bien, por lo general son fáciles de ver en las imágenes de contraste de fase. Sin embargo, GUVs más pequeños suelen ser más clara utilizando fluorescencia de lípidos, que también es útil para ver cómo la pila de membranas ha cambiado durante el crecimiento. Examine todas las superficies delos cables (dentro, fuera, arriba y abajo) en todos los pozos, así como el suelo de la cámara antes de desechar el crecimiento, ya que los rendimientos pueden variar considerablemente de un lugar a otro.
La manipulación y almacenamiento de GUVs es simple en comparación con las células, pero GUVs son muy sensibles al estrés osmótico, fuerzas de cizallamiento y adhesión. Lisas, suaves movimientos son importantes cuando se cosecha o transferir GUVs, y es importante para pasivar superficies para prevenir GUVs se adhiera y la explosión. Sin embargo, para los experimentos de pinzamiento zonal de la cámara debe ser enjuagado a fondo después de pasivación para que la solución de pasivación no puede cubrir las pipetas de parche y evitar la formación de gigaseal. Para la pasivación, el tratamiento de beta-caseína es simple y eficaz, y en comparación con albúmina de suero bovino, que tiene una función de transporte de lípidos, beta-caseína tiene interacciones más limitadas con bicapas lipídicas y debe ser preferido cuando se trabaja con GUVs 36. Al variar el tiempo de incubación, esposible conseguir GUVs se adhieran sin explotar. Sin embargo, los GUVs no se adherirán a la corredera de cobertura tan firmemente como las células, y así cuidar aún debe ser tomada durante cualquier procedimiento que puede inducir el flujo en la cámara (por ejemplo, la perfusión de amortiguamiento, moviendo la cámara).
Grabación de patch-clamp es un método clásico para el estudio de los canales iónicos dependientes de voltaje como KvAP y este protocolo se deriva de las técnicas estándar para la obtención de parches "dentro-fuera" de células adherentes. Un estándar de patch-clamp puesta a punto en el que el parche pipeta desciende oblicuamente (por ejemplo, 30 a 60 grados respecto a la horizontal) en una pequeña placa de Petri debería funcionar bien. Sin embargo, las imágenes más claras de la pipeta de parche y la región gigaseal se pueden obtener usando una cámara en la que cubres forman la cámara superior e inferior (~ 1 mm de separación) de manera que el parche pipeta puede entrar horizontalmente desde el lado. Debido a las presiones de pipeta gran parche no son necesarios, la presión puede ser convenientemente controlled con una jeringa y controlado con cualquier medidor de presión sencilla (por ejemplo, manómetro de agua improvisada). Puede ser útil para practicar experimentos primero patch clamp con GUVs lípidos sólo cultivadas utilizando una solución de lípidos / cloroformo y el tampón de bajo contenido de sal. Debido a que el rendimiento de GUVs libres de defectos es muy alto, habrá un montón de GUVs perfectos para trabajar con aunque muchos se destruyen durante la recogida y traslado a la cámara experimental.
Con un poco de práctica, los parches de membrana extirpados con gigaseals estables pueden obtenerse fácilmente a partir de DPhPC GUVs y KvAP-DPhPC GUVs. Para lograr una alta tasa de éxito, ayuda a seleccionar cuidadosamente ronda, pero ligeramente fluctuante, GUVs libres de defectos y compruebe que el parche pipeta está limpio (en busca de los lípidos en la fluorescencia) antes de tratar de formar la gigaseal. Cuando una membrana "lengua" entra en la pipeta de parche, la gigaseal forma típicamente rápidamente (<1 seg) sin ninguna necesidad de una fuerte succión o específic tensión de retención. Mientras que un mal sellado puede mejorar a medida que la membrana se arrastra más hacia la pipeta de parche, a menudo el sello sigue siendo pobre porque el interior de la pipeta estaba contaminada y es necesario volver a empezar con una pipeta de parche nuevo y GUV. DPhPC formas muy estables parches de membrana (decenas de minutos) con una resistencia excelente sellado incluso a altas tensiones (por ejemplo, ± 150 mV). SOPC: colesterol (3: 1 en moles) también pueden formar parches muy estables pero pueden requerir mayor de succión para sellar, mientras que los parches PC de huevo parecen romperse más fácilmente.
Para las sesiones de patch-clamp más largos puede ser necesario ajustar la osmolaridad de la solución de cámara. Si la osmolaridad es demasiado bajo que el buffer de crecimiento GUV, GUVs se hinchan, tensa y esférica y puede que no sea posible para aspirar la membrana GUV lo suficiente dentro de la pipeta parche para formar un gigaseal. A menudo, esto se puede solucionar simplemente esperar 10 o 20 minutos como la evaporación de la cámara aumenta la extosmolaridad solución ernal hasta los GUVs desinflan y comienzan a fluctuar. En cambio, si la cámara se deja abierta durante demasiado tiempo la osmolaridad de la solución externa puede aumentar hasta GUVs desinflan, tubulate y yema. Esto se puede evitar mediante el bloqueo de la evaporación de la cámara (por ejemplo, con aceite mineral) o periódicamente la adición de agua destilada para reemplazar el agua que se ha evaporado.
Debido a que las proteínas pueden ser excluidos de los parches de membrana extirpados 31, el número de canales activos en un parche extirpado no está simplemente relacionada con la densidad de la proteína en la membrana GUV. Las mediciones de fluorescencia sugieren que la concentración de KvAP en la membrana parche es mucho menor que el GUV 28 y puede ser bastante fácil de obtener parches que contienen sólo un pequeño número de canales. Sin embargo, si parches contienen demasiados canales para la grabación de un solo canal, los pasos obvios de la utilización de pipetas de parche con puntas más pequeñas y / o la reducción de la d-proteína a lípidoensity en la mezcla de SUV son eficaces. En contraste, para realizar mediciones de conjunto sobre parches que contienen muchos canales, puede ser útil comenzar con una densidad relativamente alta en proteínas (por ejemplo, 1:10, la proteína de lípidos en peso), proteína de fluorescencia utilizar para seleccionar GUVs con una alta densidad de proteínas , utilizar pipetas de parche más grandes (por ejemplo, de 2 a 3 micras diámetro de la punta) y aspirado rápidamente para tratar de formar el sello rápidamente. Es evidente que la configuración del tipo "de células enteras" (es decir, "todo-GUV ') sería ideal para caracterizar todos los canales en un GUV, pero por desgracia el"-GUV conjunto "configuración plantea varias cuestiones técnicas 37.
Las soluciones, los lípidos y las concentraciones de proteína en este tutorial se proporcionan simplemente como punto de partida, y se pueden modificar para adaptarse a las necesidades de un determinado experimento siguientes algunas consideraciones.
Todas las soluciones deben incluir un tampón de pH tales como HEPESo TRIS para asegurar proteínas no están expuestos a condiciones extremas de pH. El tampón de SUV debe tener una concentración tan baja de solutos como la proteína va a tolerar (por ejemplo, sal de 5 mM o inferior), como las concentraciones de soluto aumentan durante la etapa de deshidratación parcial y altas concentraciones de sal pueden desnaturalizar la proteína o causar la película de lípido para rápidamente deslaminarse durante la etapa de rehidratación. Pequeñas cantidades de azúcares tales como trehalosa (por ejemplo, 1 mm a 5 mm) se cree que protegen la proteína durante la deshidratación 23. Si bien la trehalosa ha sido implicado en anhidrobiosis y se cree para proteger la membrana y proteínas contra la desecación 38, sacarosa o glucosa pueden funcionar igual de bien.
Para el tampón de crecimiento, la concentración de sal es especialmente importante ya que esto influye en los parámetros de crecimiento GUV óptima (por ejemplo, voltaje electroformation, frecuencia y duración). En contraste, la principal limitación para el búfer de observación es tsombrero debe tener la misma osmolaridad que el tampón de crecimiento. La inclusión de sacarosa y / o glucosa en el "buffer de crecimiento" y "tampón de observación" puede ser útil para asegurar GUVs sedimento en el fondo de la cámara de observación, mientras que una diferencia en el índice de refracción entre GUV interior y exterior con ayuda de contraste de fase o microscopía DIC. Electrophysiologists a menudo incluyen iones calcio o magnesio a las soluciones de baño y / o de pipeta de parche para mejorar la formación gigaseal con las membranas celulares, pero estos no parecen ser esenciales para GUVs. En efecto, los iones divalentes tales como magnesio y calcio pueden inducir la separación de fases de los lípidos y facilitar la adhesión, así que si surgen estos problemas puede ser útil añadir EDTA 1 mM.
Claramente, una atracción clave de los sistemas reconstituidos cuando se compara con células es la capacidad de controlar la composición de lípidos. DPhPC GUVs crece bien y forman parches de membrana extirpados estables, y estos protocolos también han trabajado eftivamente para las mezclas de lípidos que contienen fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilglicerol (PG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilserina (PS) y el colesterol. Sin embargo, el crecimiento GUV es sensible tanto a la composición de lípidos y amortigua 15, y así los parámetros de protocolo (por ejemplo, la cantidad de lípidos depositados, voltaje electroformation / frecuencia) puede necesitar ser ajustado por mezclas de lípidos que contienen altas concentraciones de PE, lípidos cargados (PG, PA, PS), o colesterol. Al comenzar, Huevo-PC, DOPC o DPhPC son una buena primera opción, y también es muy útil incluir un lípido fluorescente para observar el crecimiento GUV y distinguir GUVs de vesículas multilaminares con dos o más bicapas. Mezclas de lípidos se pueden preparar mediante la combinación de suspensiones de SUV de las soluciones madre, ya que los lípidos se mezclan durante la etapa de deshidratación parcial (siempre que la temperatura es más alta que cualquier temperatura de transición de fase individual). Uso de mayor concentración SUV (por ejemplo,10 mg / ml) de soluciones madre permite una flexibilidad considerable, y estos entonces se puede diluir a 3 mg / ml antes de la deshidratación de la suspensión.
Si el intento de adaptar estos protocolos a otras proteínas trans-membrana, es muy importante ser capaz tanto de observar directamente la incorporación de proteína en la función GUVs y proteína de prueba. Aunque no es un problema con KvAP, siempre existe la posibilidad de que durante la rehidratación paso la proteína trans-membrana permanecerá en la pila de membranas que conduce a la formación de GUVs lípidos solamente. Etiquetado fluorescente de la proteína es muy conveniente, ya que proporciona una forma rápida e inequívoca de observar la incorporación de proteínas en GUVs y comprobar además agregación dentro GUVs. También es muy importante probar la función de proteínas en los GUVs confirmar que la proteína no fue dañada durante el proceso de reconstitución. Para los canales de iones como KvAP, las mediciones de patch-clamp pueden establecer la presencia de canales funcionales en elGUVs. Sin embargo, un marcado con fluorescencia-ligando de alta afinidad (por ejemplo, la toxina, sustrato o anti-cuerpo) también sería muy útil para probar el estado de las proteínas en GUVs.
En resumen, este artículo se muestra cómo producir Proteo-GUVs contienen la tensión cerrada canal de potasio KvAP y caracterizarlos utilizando microscopía de fluorescencia y electrofisiología. Esperamos que estos métodos pueden adaptarse a las nuevas clases de proteínas de la membrana y proporcionan una base para sistemas más complejos in vitro para el estudio y la construcción de la materia viva de sus componentes fundamentales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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