Summary
electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.
Abstract
Dev lamelli kesecikler (GUVs) membran ilişkili olayları incelemek için popüler bir biomimetic sistemi vardır. Ancak, genel olarak GUVs fonksiyonel transmembran proteinleri içeren GUVs oluşturmak üzere tadil edilmesi gerekmektedir büyümeye protokolleridir. Electroformation ve jel destekli şişme - - voltaj-kapılı potasyum kanalı, KvAP içeren GUVs oluşturmak için Bu makalede, iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri açıklanmaktadır. Her iki yöntemde de, protein ihtiva eden küçük tek lamelli vesiküller bir çözeltisi daha sonra bir rehidrasyon tamponu içinde şişmeye bırakıldı membran bir yığın oluşturmak üzere kısmen dehidre edilmiştir. AC alanı film rehidrasyon esnasında uygulanabilir ve böylece electroformation yöntemi için, film, platin elektrot üzerine bırakılır. Bunun tersine, jel destekli şişme yöntem filmi rehidrasyon geliştirmek üzere bir agaroz jel alt tabakayı kullanır. Her iki yöntem de (örneğin, 5 mM) ile, düşük ve fizyolojik (örneğin, 100 mM) tuzu konsantrasyonlarında GUVs üretebilir. Elde GUVs floresan mikroskobu ile karakterize edilir ve yeniden kanalların fonksiyonu iç-dış yama-kelepçe yapılandırmayı kullanarak ölçtü. Alternatif elektrik alanı (electroformation) mevcudiyetinde şişen hatasız GUVs yüksek bir verim sağladığını birlikte, jel destekli şişme yöntem daha homojen bir protein dağılımı sağlar ve herhangi bir özel ekipman gerektirir.
Introduction
Canlı sistemleri yöneten fiziksel ilkeleri incelerken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar bir Deneyciler sistemi kompozisyon ve kolayca hücre tabanlı sistemler 1 manipüle olmayan diğer parametreleri kontrol etmenizi sağlar. 10 - bunlar mikroskop çalışmaları ve mikromanüplasyon 8 için uygun olarak 7 - membran bazlı işlemler için, Dev tek katmanlı veziküller (GUVs, çap ~ 1-100 um) çok yararlı biomimetik sistemi 2 olduğu kanıtlanmıştır. GUVs üretmek için birçok farklı protokoller olmakla birlikte, en fazla iki kategoriye ayrılır - 16 - bazlı emülsiyon, bir lipit filme 13 rehidrasyon dayalı 11,12 ve teknikleri yaklaşır. Emülsiyon bazlı yöntemlerde, GUV membran iç ve dış bildiriler su / yağ ara yüzlerinde lipit mono tabakaları arka arkaya monte edilir. Bu yaklaşım ile çözülebilir proteinlerin kapsüllenmesinde için idealdirGUVs olarak ve asimetrik yaprakçık lipit bileşimiyle GUVs oluşturulması için. Bununla birlikte, emülsiyonlar meydana GUVs zarın mekanik özellikleri 17 değiştirmek çözücünün izlerini tutabilen ve bu yaklaşım, trans-membran proteini yeniden için özellikle çok uygundur değildir.
Film rehidrasyon yöntemleri (dehidratasyon), kurutma zarların çoklu katmanlı yığını oluşturmak için birçok lipit karışımları neden olduğu gerçeğine dayanır. Bu yığın daha sonra sulu bir tampon maddesi ile temas içinde yerleştirilir, yığındaki membranlar aralarında ve yığın yüzeyinde ayrı çözücü akışı hareket eder, ayrı ayrı membranlar GUVs 13,18 (aynı zamanda, gerçek bir hayvanat bahçesi oluşturmak üzere ayırabilirisiniz Diğer lipidik nesneler). Bununla birlikte, daha iyi bir tampon ve lipid bileşimleri için, bu klasik "kendiliğinden şişme" yöntemi hatasız GUVs nispeten düşük bir verime sahiptir. Hatasız GUVs verimini artırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir "electroformation olduğunuBir alternatif akım (AC) alanı film rehidrasyon esnasında uygulandığı 221 ;,. Mekanizma henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, "electroformation" Muhteşem GUV verimleri verebilir (> olumlu koşullarda% 90), düşük tuz konsantrasyonu tamponlar için (<5 mM) 14,19, ve hatta (~ 100 mM) fizyolojik tamponlar çalışabilir kullanarak bir yüksek frekans (10 Hz karşı 500 Hz), AC alanı ve platin elektrotları 15. Hatasız GUVs verimini artırmak için alternatif bir yaklaşım, lipid çözeltisi (örneğin, cam, PTFE), alt-tabakalar, klasik "bir anda şişme kullanılan pasif değil, bir polimerik jel alt-tabaka üzerine biriktirilmektedir," jel destekli şişme "bir ". Elde edilen yağ / jel ince tabaka rehidrate zaman, GUVs bile hızlı bir fizyolojik tampon 16,20 için oluşabilir.
Tüm bu yöntemler, örneğin zara bağlı olayları incelemek için kullanılabilir lipid tek GUVs üretebilirçözünür proteinler ve zarlar arasındaki etkileşimi kapsamaktadır. Bununla birlikte, GUVs bir trans-membran proteini birleştirmek için önemli değişiklikler proteinin yeniden oluşturma işlemi boyunca işlevsel bir durumda kalmasını sağlamak için gereklidir. Organik çözücüler (örneğin kloroform, sikloheksan) lipidlerin çözeltileri lipit film üretmek için idealdir birlikte, hidrofobik zar-ötesi domeni bir lipid iki-tabaka içinde gömülü ya da bir deterjan misel içine alındığında, trans-membran proteinleri tipik olarak, sadece kararlı olan ( Örneğin, protein saflaştırma sırasında). Bu nedenle, bir yeniden başlangıç malzemesi tipik olarak deterjan çıkarılmasıyla oluşan doğal membran, bir deterjan çözeltisi içinde saflaştırılmış proteini ya da küçük tek lamelli protein içeren veziküller (proteolitik-SUV) ve / veya çok-lamelli veziküller (proteolitik-MLV'ler) 'dir lipidlerin mevcudiyeti. GUVs içine bu zar proteinleri dahil çoğu yöntemleri üç kategoriye ayrılır.
Doğrudan insertioN: deterjan içinde süspansiyon haline trans-membran proteini önceden oluşturulmuş, lipid sadece hafif deterjan çözündürülmüş GUVs ile karıştırılır ve daha sonra deterjan Biobeads 21 kullanılarak kaldırılır. Kavramsal olarak basit olmakla birlikte, bu yöntem çok yüksek bir deterjan konsantrasyonunun bir konsantrasyon proteini açığa veya agregat neden olabilir çok düşük ise GUVs eritmesi olarak, deterjan konsantrasyonunun hassas kontrolünü gerektirir.
GUV / Proteo SUV Füzyon: proteolitik-SUV Protein, önceden oluşturulmuş, lipid sadece GUVs ile birleştirilir ve füzyon özel füzyojenik peptidler 22 veya deterjan 21 ile kolaylaştırılır. Tipik füzyon ölçüde düşük protein yoğunluğu ile GUVs lider kısıtlıdır.
Dehidrasyon / Rehidrasyon: bir protein ihtiva eden lipid filmi kısmi bir proteolitik-SUV dehidrasyon (ya da proteolitik-MLV) çözeltisi ve GUVs oluşturduğu sonra saf bir lipit film için büyütülür. bariz zorluk kısmi dehydrati sırasında protein korumak25 - Adım 23, ancak yöntemi başarılı bir şekilde GUVs 7,23 içine örneğin bakteriyorodopsin, Kalsiyum-ATPaz, integrin ve SSVD'de trans-membran proteinleri oluşturmak için kullanılan edilmiştir.
Bu makalede, hiper-termofilik Archaea, Aeropyrum pernix voltaj kapılı potasyum kanal KvAP içeren GUVs için dehidratasyon / rehidrasyon protokollerini tasvir eder. KvAP ökaryotik voltaja bağımlı potasyum kanalları 26 homoloji derecesi yüksek ve bilinen bir kristal yapıya sahip olan 27 , gerilim yolluk mekanizması okuyan için iyi bir modeli yapma. Proteolitik-SUV üretimi, daha önce detaylı bir şekilde tarif edilmiş ve bu yazının 26,28,29 bir parçası değildir edilmiştir. Önemli olarak, KvAP proteolitik-SUV da uzun bir süre (> 1 yıl), -80 ° C'de küçük (örneğin, 10 ul) bölümler halinde saklanabilir gibi her GUV hazırlanması için imal edilmesi gerekmez. Electroformationya da jel destekli şişme sonra KvAP proteolitik-SUV'lerden GUVs büyütmek için kullanılan (ya da proteolitik-MLV'ler) olabilir.
electroformation protokolü için temel aşamalar, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Protein içeren SUV solüsyonu damlalar (Şekil 2'de gösterilmiştir) platin tellerden birikirler. SUV süspansiyonun kısmi dehidrasyon SUV füzyon yoluyla bir lipit, protein film tabakasının oluşmasına neden olur. Rehidrasyon esnasında, bir AC alanı GUVs delamine oluşturmak üzere, lipid tabakaları yardımcı olmak için elektrotlara uygulanır. "Düşük tuz" kullanılırken 10 Hz alanı iyi çalışıyor (<5 mM) rehidrasyon tampon 28 ve GUVs birkaç saat sürebilir büyümeye. Buna karşılık, fizyolojik tamponlar düşük gerilim, 500 Hz AC alanı ile iyi çalışır, ancak gerektirir (tuz ~ 100 mM içeren) bir uzun (~ 12 saat) dönemi 15 şişlik. Bu yöntem İTO 24 slaytlar kullanarak bir önceki protokol dayalı, ama özel bir odası cont kullanırŞekil 2'de görüldüğü gibi iki platin tel, geri kalan (basit tasarım detayları ve önerileriniz için tartışma bakın, odaları doğaçlama).
Şekil 3, jel destekli şişme yöntemi göstermektedir. Protokol, fizyolojik tuz konsantrasyonlarına sahip tampon maddeler ile iyi çalışır hızlı ve daha homojen olan bir protein dağılımı GUVs üretir. Ancak, izole, görünüşe göre hatasız GUVs verimi (yani, GUV membran üniforma optik uzunluk-ölçeklerde ve herhangi bir nesne içine değil) bu yama-kelepçe ve mikro-manipülasyon deneyler için yeterli sayıda sağlamasına rağmen, düşük . Bu yöntem, lipid sadece GUVs 16 üretmek electroformation yöntemine göre daha az özel ekipman gerektirir agaroz jel kullanılarak bir protokole dayanmaktadır.
floresan mikroskobu ile GUVs karakterizasyonu standart yama-kelepçe set-up kullanarak prosedürler yanı sıra, açıklanan"inside-out" in KvAP aktivitesini ölçmek membran yamaları çıkarıldı.
Büyüyen protein ihtiva eden GUVs lipid tek GUVs daha zor olabilir. Özellikle, son GUV verimi membran yığını oluşturmak için tam olarak nasıl SUV çözümü yatırılır ve susuz üzerinde hassas güvenebilirsiniz. GUVs herhangi bir önceki deneyim, bir kimse için, ilk membran film, organik bir çözücü lipitleri biriktirilmesiyle oluşturulduğu bilinen bir protokol 15,16 aşağıdaki lipid tek GUVs büyümeye yardımcı olabilir. Geleneksel protokol iyi çalışıyor sonra, SUV biriktirme ve kısmi dehidratasyon sonra yeni bir lipit kompozisyonu için protokol ayarlarken de çok yararlı olan lipit sadece SUV'lar kullanılarak hakim olabilir. GUVs lipid tek SUV ile ilgili güvenilir büyüdüklerinde, bu proteolitik-SUV protein ihtiva eden GUVs üretmek için sadece küçük bir adım daha sonra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çözüm hazırlanması
- 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7.4) veya tris (pH 7.5) ve 2 mM trehaloz içeren "SUV tamponu" 5 ml hazırlayın. 0.2 um'lik bir şırınga filtresi ile filtre tampon ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir, 1 ml'lik porsiyonlar halinde böler.
NOT: reaktif ve aletler için ek ayrıntılar malzemeleri listesinde verilmiştir. - Film rehidrasyon sırasında GUV içini dolduracak Şef 'Büyüme Tampon' 40 ml hazırlayın. 'Düşük bir tuzu büyümesi için, 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7.4) ya da 1 mM TRIS (pH 7.5) ve ~ 400 mM sukroz birleştirir. Bir fizyolojik tuz "büyüme için, 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7.4) veya 5 mM Tris (pH 7.5), ve yaklaşık 200 mM sukroz birleştirir.
- 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7.4) veya 5 mM Tris (pH 7.5), ve yaklaşık 200 mM glukoz birleştirerek deney odası içinde dış çözüm 'Gözlem Tamponu' 40 ml hazırlayın.
NOT: Bu tamponlar sadece exa vardırörnek olarak şunlar verilebilir. Diğer deneyler için tamponlar adapte tartışma bakın. - Bir Osmometer ile büyüme ve gözlem tamponlarının osmolarities ölçün. GUVs lize ya da gözlem odasına büyüme odasına transfer katlanmayacak olmayacak şekilde% 1 içinde eşleştirmek için sakaroz veya glukoz ilave et.
Not: sükroz, 1 mM (13.7, 40 ml başına mg), glikoz (40 ml başına 7.2 mg) ilave edildikten bu konsantrasyon aralığında, içinde yaklaşık 1 mOsm sureti ile osmolaritenin arttırır. - 0.2 um'lik bir filtre ile büyüme ve gözlem tamponlar filtre edin ve bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için 4 ° C'de saklayın.
- GUVs, sopa yaymak ve kayma olmayacak şekilde deney odası yüzeyleri pasifleştirilmesi için gerekli bir 5 mg / ml p-kasein çözelti oluşturmak için 20 mM TRIS (pH 7.5) tampon maddesi içinde 10 ml p-kazein 50 mg eritin. Beta-kazeın tamamen 0.5 mi alikotlar içinde, filtre (0.2 um) o (4 ° C'de birkaç saat kadar) içinde çözülür sonra hızlı dondurulmuş ve saklanabildiğiDaha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de (4 ° C'de saklandı çözülmüş alikolar tipik olarak 1 hafta için kullanılabilir).
2. SUV Hazırlık
- Hazırlayın ve daha önce yayınlanmış detaylı protokolü 28 aşağıdaki proteo-SUV hacimde dondurma. KvAP floresan (kütlece) 01:10 lipid oranının bir protein DPhPC SUV içine yeniden Alexa-488 maleimid (10 mg / ml) ile etiketlenmiş kullanın.
Not: Yabani-tür KvAP hücre içi C-terminali (amino asit 247) yer alır monomer için bir sistein ihtiva eder. - Floresan, Lipid-tek SUV:
NOT: nitril eldiven ve koruyucu gözlük takan bir davlumbaz altında kloroform tutun. Kloroform onları çözülür gibi herhangi bir plastik kullanmaktan kaçının. Kloroform çözeltileri Teflon kapaklı ile amber cam viyaller içinde depolanmış ve cam şırınga kullanılarak aktarılabilir. Öncesi ve lipidler pipetle sonra kloroform ile en az 5 ila 10 kat, tüm cam durulama özen gösterin.- 100 ul hazırlayınTexas Red-DPHE çözeltisinin 8.2 ul (1 mg / ml ile DPhPC çözeltisi 100 ul kloroform (10 mg / ml) ile karıştırmak suretiyle kırmızı flöresanlı lipid, Teksas Kırmızısı-DHPE, 0.5 mol% ihtiva eden, 10 mg / ml DPhPC SUV 1.5 ml amber cam şişe içinde) metanol.
- Şişe döndürülerek kimyasal başlığı içinde bir azot akışı altında lipitleri kurutun. Film kuru göründüğünde, kalan solventin çıkması için 3 saat vakum altında lipit yerleştirin.
- Lipidler SUV tampon 100 ul ekleyin ve vorteks şiddetle hiçbir lipit flakon duvarlarına yapışmış kalana kadar ve çözüm eşit süt olduğunu.
- SUV oluşturmak üzere, lipid çözeltisi sonikasyon. Ultrason çoğu hareketi neden kadar flakon konumunu ayarlayın ve flakon içine akış ve gereksiz çözüm ısıtmak için değil umurumda almak. Zaman olası çözüm saydam hale gelene kadar devam edin sonikasyon, ya da, şeffaf (uç sonication için 2-5 dakika, ~ banyo sonication için 20 dakika).
- Aliquot SUV (örneğin 10 ul veya 20 ul) ve dondurma (-20 ° C) daha sonra kullanmak.
NOT: Yağlar, özellikle doymamış lipidler, kolayca arıza. Argon altında, 20 ° C (veya 80 ° C) mağazası lipit çözeltiler ve 6 ay içinde kullanın. Lipid yıkım ürünleri İnce Tabaka Kromatografisi ile tespit edilebilir.
Electroformation 3. GUV Büyüme
- Electroformation odasını hazırlayın.
- Odası temizlenmiş değilse, pencereleri kaldırmak tüm dolgu macunu ve yağ silin, teller ayıklamak ve durulayın ve su ve dönüşümlü etanol (≥70%) kullanarak bir dokuya sahip odasına fırçalayın.
- Iyi teller Rub aseton teller ve odasına daldırın ve 5 dakika sonikasyon. Bir doku tekrar aseton kullanarak her şeyi silin. 5 dakika boyunca etanol ve sonikasyon odasına koyun.
- Deliklerden kabloları takarak odasına monte, ve döndürmek ve ar emin olmak için teller silinE temiz. Damıtılmış su içinde odasına koyun, 5 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır ve bir azot ya da hava akımı ile bölme kurutun.
- SUV tamponu içinde 3 mg / ml SUV süspansiyonu 30 ul hazırlayın. , Protein ihtiva eden GUVs meydana proteolitik-SUV 8 ul birleştirmek için (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), flüoresan SUV 2 ul (10 mg / ml DPhPC,% 0.5 mol TexasRed-DPHE) ve SUV 20 ul 12.5 ve 0.1 mol% 'si TexasRed-DHPE: 1 lipid (kütle) oranında bir nihai protein için bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tampon eklendi. Şiddetle çözüm karıştırın.
- Alternatif olarak, sadece flüoresan SUV 10 ul birleştirme, lipid sadece SUV ile protokolü uygulama (10 mg / DPhPC ve% 0.5 mol TexasRed-DPHE mi), 20 | il SUV tamponu ile yıkandı.
- SUV Çözüm yatırın.
- Teller üzerinde SUV çözümün küçük (<0.2 ul) damlacıkları yatırmak için 2 ul pipet veya 5 ul cam şırınga kullanın. Yaklaşık çözeltisi 1 ul boyunca damla bir dizi meydana getirmek üzere gerekli olanTel 1 cm. Damla yeterince küçük ve yeterince onlar dokunmak veya sigorta olmadığını aralıklı emin olun.
- Yatırılan SUV açık havada 30 dakika ~ için kurumasını bekleyin. Tüm damla yerleşti zaman lipit mevduat mikroskop ile gözlemlemek kolay, böylece, tel döndürün.
NOT: SUV yeterince kuru değil yoksa büyüme tampon eklendiğinde protein zarar verebilir çok kurutma sırasında, onlar sadece, teller kapalı yıkayabilirsiniz. Hava nem kurutma oranı, kuruma süresi ve / veya hava nemi etkiler nedeniyle optimum sonuçlar 30 ayarlanabilir. teller üzerinde lipid filmi mikroskop altında görünür olmalıdır.
- Odasına birleştirin.
- Oda Bottom Seal: Bir boşluk olmadan yapışır, böylece bölme alt mühür karşı üç kuyu etrafında odasının tabanına vakum gres sürün ve nazikçe bir 40 mm x 22 mm lamel basın bir şırınga kullanın. Odasının kenarlarına (teller çıkış) ile Sealmacun sızdırmazlık. Üç kuyu özetleyen odasının üstünde vakum gres sürün.
- Her kuyu üstüne dolana kadar yavaşça büyüme tampon ekleyin. Bu elektrotlar kapalı lipit filmi şerit gibi kuyularda herhangi bir çözüm hızlı hareket kaçının.
- Alt lamel çıkarmak için özen, gres üzerine hafifçe üst kapak slayt basarak odasına kapatın. Üst kapak kayma kenarlarında tampon herhangi bir damla kaldırmak için bir doku kullanın.
NOT: Bu lipit film, teller üzerinde kalmıştır onaylamak için mikroskop altında odasını incelemek için iyi bir zaman.
- İki timsah klipleri kullanarak telleri sinyal jeneratörü bağlayın. Düşük / yüksek tuz tamponu için kare (Vrms) ortalama frekans (düşük / yüksek tuz tamponu için 10 Hz / 500 Hz sinüs dalga) ayarlayın ve ölçmek ve 0.7 / 0.35 V kök teller arasındaki gerilimi ayarlamak için bir multimetre kullanın. Işıktan florofor korumak için alüminyum folyo ile bölmesi kapağı. T bırakınO GUVs düşük tuz tamponu için 2 ila 3 saat, ve yüksek tuz tamponu için 12 saat veya O / N için büyümeye.
- Jeneratörden odasına ayırın ve dikkatlice GUV büyümesini değerlendirmek için bir ters mikroskop üzerine yerleştirin. Erken teller GUVs ayırmak olabilir kuyularda yavaş, istikrarlı hareketleri veya sıvı akışını kullanın.
NOT: her yerde tellerin alt yarısında GUVs epifluoresan ile görülebilir ise tel kenarlarında GUVs, faz kontrast (40X uzun çalışma mesafesi objektif) genellikle görebilir. Hiçbir GUVs görünür ise, üst yüzeye bakmak için teller döndürmeyi deneyin. GUVs birkaç gün boyunca bir büyüme odasında 4 ° C'de saklanabilir.
Jel-destekli Şişme tarafından 4. GUV Büyüme
- Saf 10 ml su ile agaroz 100 mg karıştırılmasıyla bir% 1 agaroz çözeltisi 10 ml hazırlayın. O ~ 20 sn için 480 W mikrodalga yerleştirerek kaynar kadar ısıtın. Agaroz tamamen eriyene emin olmak için karıştırın.
NOT: Çözelti4 ° C'de saklandı ve gerektiğinde yeniden ısıtılabilir. - Plazma-temiz (hava plazma) agaroz çözüm üzerinde güzel yayılır böylece 1 dakika için bir kapak-slayt. Plazma temizleme etkisi çabuk giyer sonraki 15 dakika içinde kapak-slaytlar kullanın.
- Bütün yüzeyi ıslatır çözelti, böylece, her 22 x 22 mm, 2 slayt sıcak agaroz çözeltisi 200 ul uygulanır. Dikey slayt eğin ve aşırı sıvı kaldırmak ve slayt üzerinde agaroz sadece ince bir tabaka pürüzsüz bırakmak için bir dokuya alt kenarı dokunun.
- 60 ° C'de bir sıcak plaka ya da fırın slayt yerleştirin ve en az 30 dakika kurumaya bırakın. Agaroz filmi gözle zor görülür. Slaytlar RT soğumaya sonra, hemen bunları kullanmak veya 4 ° C'de kapalı bir kapta kadar bir hafta saklayabilirsiniz.
- Standart 3,5 cm Petri kabındaki agaroz kaplı lamel yerleştirin.
- Bölüm 3.2'de SUV çözelti hazırlanır ve uygulanır ~ SUV çözeltisi (3 mg / ml lipid) içinde 15 ul~ Agaroz yüzeyine 30 çok küçük damla yavaşça. Çok agaroz katmanı deforme etmemeye dikkat edin.
- Yaklaşık 10-15 dakika boyunca hafif bir azot akımı altında slayt yerleştirin ve damlacıklar, kuru olarak gözle tampon buharlaşma takip edin.
- En kısa sürede SUV kurutulmuş gibi, slayt yüzeyini kapsayacak şekilde büyüme tampon ekleyin. Küçük 3,5 cm Petri kabı kullanımı tampon ~ 1 ml için.
- Şişme, 30 dakika daha devam ~ ve daha sonra faz-kontrast veya farklılık belirleyici kontrast (DIC), bir ters mikroskop kullanılarak odasında GUVs büyümesini incelemek için izin verir.
NOT: Epifloresans gözlem, jel ve agaroz otomatik floresanstaki fluorophores güçlü bir arka plan zordur.
5. Hasat ve Gözlem GUVs
- Gözlem odasını (örneğin, küçük Petri veya cam lamel) GUVs batmıyor, böylece yayıldı ve oda altta patlama pasifleştiren. Cham Kapakber beta-kazeın çözeltisi ile alt, 5 dakika boyunca inkübe hava ya da bir azot akımı ile kuru saf su ile kazein solüsyonu çalkalamak ve son gözlem tampon eklemek (örneğin, ~ küçük bir petri 5 mm derinlik).
- GUVs Hasat. Açılış büyük (~ 2 mm çapında) yani 100 ul pipet uçları sonuna kesin ve kolayca GUVs yok edebilir pipetleme kesme stres gibi yavaş yavaş talip.
- Elektro-oluşturulmuş GUVs için, yavaşça üst lamel kaldırarak büyüme odasına açın. GUVs ayırmak için tel boyunca pipet hareket ederken ~ her tel ve aspirat üzerinde doğrudan 50 ul pipet yerleştirin.
NOT: Bu tel "diğer tarafında" GUVs toplamak için tel döndürmek için yardımcı olabilir. - "Jel destekli şişme" GUVs için, ilk GUVs lamel yüzeyinden ayırmak yardımcı olmak için birkaç kez petri yan dokunun. S ise 50 ul sadece lamel ve aspirat üzerinde pipet yerleştiringeri yüzeyi üzerinde ucu ulling. Doğrudan kadar 1 hafta boyunca 4 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde bir gözlem odasına veya saklamak için hasat GUVs aktarın.
- Elektro-oluşturulmuş GUVs için, yavaşça üst lamel kaldırarak büyüme odasına açın. GUVs ayırmak için tel boyunca pipet hareket ederken ~ her tel ve aspirat üzerinde doğrudan 50 ul pipet yerleştirin.
- , Bir ters mikroskop gözlem odasına yerleştirin gözlem odasına GUVs ekleyebilir ve GUVs odası altındaki yerleşmek için bir kaç dakika bekleyin.
- Hızla pürüzsüz, küresel ('kusur ücretsiz') "GUV adayları" bulmak için faz kontrast veya DIC ile odasına Anketi. Içinde yuvalanmış herhangi birini içeren küçük lipozomlar dışlamak için Epifloresans her "GUV aday" inceleyin. Son olarak, lipit floresan yoğunluğu tek bir zar (yani, tek katmanlı) ile homojen ve uyumlu olduğunu kontrol edin.
NOT: faz kontrast ya da DIC görüntüler tek katmanlı görünür yüzden bazı bilamellar (ya da çok-tabakalı) kesecikler içinde zarlar çözülmesi için birbirine çok yakındır. Bununla birlikte, bu nesneleri, fiili unilame ayırt edilebilirİki kez (veya daha fazla) parlak lipit floresan tarafından llar GUVs.
6. Patch-sıkma GUVs
- Pipet çektirmesi için önerilen programı kullanarak standart borosilikat kılcal cam bir 1-2 mikron ucu çapı ile yama pipetler olun.
NOT: yangın parlatma gibi özel tedaviler gerekli değildir, ve pipetler bir kapalı bir kutuda muhafaza edilir, eğer bunlar çekme sonucu birkaç gün sonra da kullanılabilir. - GUVs, uygun odası yüzeyleri üzerine yayıldı ve kopma yok olmasını sağlamak için bir beta-kazeın çözeltisi (5 mg / ml) ile inkübe edilerek bölmeyi pasifleştiren. 5 dakika sonra kazein durulayın.
- , Toprak elektrot yerleştirin gözlem tamponu ile odasını doldurmak, adım 5.2 ve 5.3 açıklandığı gibi GUV süspansiyonu 10 ul transferi ve GUVs altındaki yerleşmek için bir kaç dakika bekleyin.
- Solüsyon (gözlem tampon ya da başka bir iso-ozmotik çözelti) ile taze bir yama pipet doldurun veyama-kelepçe amplifikatör headstage üzerine monte edin.
- Odasından aracılığıyla arama bölümünde 5.4 açıklandığı gibi bir "hatasız" Şef bulun ve floresan proteini içerdiğini kontrol etmek.
- Sabit pozitif basınç uygulayın (> 100 Pa, ya da kabaca 1 cm manometre H 2 O) temiz iç yama pipet tutmak ve odasına yama pipet eklemek için. , Görüş alanı içine yama pipet getir / ölçmek ofset ve direnç pipet gerilimini telafi ve ucu temiz olduğunu teyit floresan aydınlatma altında pipet incelemek için test darbeleri uygulayın.
- GUV doğru yama pipet getir, ve gerekirse, aynı anda "run away" patron yapmaz yama pipet dışarıya doğru akışı, böylece pozitif basıncı azaltmak. Yama pipet GUV yakın olduğunda, yama pipet karşı patron çekmek için (5 cm H 2 O kadar) negatif basınç uygulayın. Olarak direnç Monitor "; GUV membran dil "yama pipet ve gigaseal formları girer.
- Bir gigaseal formu olmasaydı, odasından yama pipet kaldırmak ve 6.4 adıma dönün. Membran yama gigaseal kurdu, ancak GUV pipet bağlı kalırsa, GUV sıyrılmış patlama patron odası dibine, ya da kısaca çözümün dışına pipet hareket ettirerek yama tüketim.
- Iç-dış zar yama GUV çıkarıldı ve gigaseal stabil olmuştur, test darbeleri kapatmak ve Şekil 13'te gösterilen gibi bir voltaj protokolü uygulanır.
NOT: Şekil 13 Geçerli yama-elektrot akan "olumlu" olduğu bir iç-out yama için standart elektrofizyolojik kuralı izler ve V = V banyosu - V pipet. Negatif potansiyelde yama tutarak (örneğin, V = -100 mV) dinlenme durumunda ~ 30 sn yerleri KvAP için adımlar ise (10Daha olumlu potansiyeller (örneğin, V = 100 mV) sonra iletken (yani, açık) aktif devletler içine sürebilirsin 5 sn 0 msn). - Bir membran yama üzerinde ölçümler bittikten sonra, bir zap veya basınç darbesi ile yama kırmak ve yama elektrot ofset gerilimi sürüklendi olmadığını kontrol ediniz. Odasından yama pipet çıkarın ve 6.4 adıma dönmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GUVs büyümesi hızlı bir şekilde bir mikroskop altında bir büyüme odası incelenerek değerlendirilebilir. Electroformation için GUVs Şekil 4'te gösterildiği gibi, platin teli boyunca demet büyürler. Jel destekli şişme sırasında GUVs hızla büyümeye ve (Şekil 5), birbirine kaynaşmasına küresel yapılar olarak görünür.
Hata içermeyen GUVs bilgilerin daha kolay tanımlanabildiği ve bir gözlem odasına transfer edildikten sonra değerlendirilir. Kalibrasyon ölçümleri titizlikle GUV kalitesini değerlendirmek için gereklidir, ve sistematik bir miktar daha önce 28 yayımlanmıştır. Ancak, bir ampirik rehber olarak, "iyi" GUVs içinde tek bir düzgün, küresel dış zarı var, (vb yani, tüpler, iç içe veziküller) hiçbir nesneleri içeren, (yani, bir kümede) izole edilmeli ve "Standart" lipit floresan seviyesine sahip (parlak nesneler genellikle iki ya da çok vardırYapraklı). Şekil 6 bir iso-ozmotik glukoz solüsyonu transferinden sonra bir 'hatasız' GUV DIC ve Epifloresans görüntüleri gösterir. DIC kontrast sükroz dolu GUV ve glikoz ihtiva eden banyo çözeltisi arasında optik yoğunluk farkından kaynaklanmaktadır. KvAP içeren GUVs kırılma endeksi kontrastı genellikle KvAP kendisi sakaroz veya glukoz geçirgen olmamalıdır bile, zaman içinde azalır. GUV zarında üniforma protein floresan KvAP GUV dahil (yani, lipid film kalmadı) ve mikron ölçekli (veya daha büyük) agrega oluşmuş değil onaylar.
Düşük tuz electroformation protokolü, fizyolojik tuz electroformation protokolü ve jel destekli şişme protokolü tarafından üretilen GUVs gelen Şekil 7, 8 ve lipid ve protein floresans 9, konfokal ve görüntüler. floresan lipit (kırmızı) ve proteinBirim alan (protein yoğunluğu) başına proteinlerin düşük / yüksek sayıda GUVs bindirme görüntüleri (sağ sütun) bir kırmızı / yeşil gölge var ki (yeşil) sinyalleri, aynı ortalama yoğunluk ölçekli olan bir ile GUVs ise Ortalama protein yoğunluğu beyaz. İzole edilmiş, hatasız GUVs tespit edilmiş ve GUV boyutu dağılımı, Şekil 10'da gösterilmektedir. Tipik olarak electroformation jel destekli şişme daha hatasız GUVs oluşturur, ancak electroformation tarafından üretilen GUVs daha küçüktür. Şekil 11 türetilmiş protein yoğunluğu dağılımını göstermektedir GUVs bir floresans. Yüksek tuz tamponu ile Electroformation protein yoğunluğu Şef için GUV büyük ölçüde değişir hangi GUVs üretir. jel destekli şişme ile üretilen GUVs protein yoğunluğu önemli ölçüde homojen iken tek GUVs protein yoğunluğu, düşük tuz tamponu ile electroformation için çok daha az değişmektedir.
Parça sıkıştırma tekniğinin bir çok kullanımlıkBöyle KvAP gibi voltaj-kapılı iyon kanalları, işlevini okuyan d yöntemi. "Inside-out" kayıtlarında, temiz bir cam "yama" pipet, bir GUV gelen zarın bir yama tüketim için kullanılır. Yama pipet içindeki bir elektrot daha sonra membran yama akan Elde edilen akım gerilim uygulamak ve ölçmek için kullanılır. membran yama bileşimi hücre / GUV 31 geri kalanından çok farklı olabilir, ancak "iç-dış" yapılandırma hala tek kanal iletkenliği, iyonik seçicilik ve voltaj-bağımlı yolluk ölçmek için çok faydalıdır. Bu üç özellik akımların eserler (örneğin, gigaseal konular) veya kirletici (saflaştırma örn, bakteriyel porinler) bağlı olmadığını belirlemek için mükemmel bir yoldur, ve GUVs fonksiyonel KvAP kanalları vardır.
Kanal iletkenlik en kolay, sadece bir ya da iki aktif kanalları yamalar olarak ölçülür. EXA içindeMembran -100 mV'de tutulduğunda 100 mV'de, tek kanal açıklıkları açıkça çözülebilir ise Şekil 12'de gösterilen şekilde yapıldığı Örnek, herhangi bir kanal açıklıkları görülmektedir. Mevcut histogramı kapalı ve açık durumlarda karşılık gelen iki doruklarını gösterir, ve bir çift Gauss fonksiyonu ile parçasının (100 mM KCl) 109.2 ± 8.5 pS iletkenlik tekabül eden, 10.9 ± 0.85, pA tek bir kanal akımını üretmektedir. Tek kanallı iletkenlik solüsyonu (özellikle potasyum konsantrasyonu) ve membran bileşimine 32,33 bağlı olduğunu unutmayın.
Diğer birçok K-kanalları, bireysel KvAP kanalları sergi gibi hızlı açılıp kapanma patlamaları "gevezelik". Daha önce gösterildiği gibi, potasyum seçiciliği yama pipet bir başka çözelti kullanılarak test edilebilir (örneğin, yama pipet çözeltisi 90 mM NaCI, 10 mM KCI) 28.
Voltaj bağımlı yolluk genellikle s olduğudaha kolay bir topluluk ortalama elde etmek için, birden fazla kanal ile yer yer tudied. "Inside-out" zar yamalar belirgin (GUV içte hücre içi etki) fizyolojik lehine mekanizması ve ters (GUV dışta hücre içi etki) GUVs içinde KvAP sokulması, orada iken işlevsel kanalların çoğunluğu var " fizyolojik "ekleme 28. Şekil 13 5 saniyelik depolarize bir dizi adım için birden fazla ihtiva eden bir membran yama tepkisini (> 10) kanallar gösterir. Her adımda Arasında, yama "fizyolojik" ekleme ile kanal istirahat durumuna geri dönmek için izin 30 sn -100 mV tutulur. Potansiyel yeterince negatif olduğunda (örneğin, V <-60 mV) Mevcut en gigaseal sızıntısı nedeniyle, ve "ters" ekleme olması muhtemeldir bir ya da iki kanal sıra açıklıklar. Daha olumlu kapların adımları içinBireysel açıklıklar ve kapanması artık çözülebilir o kadar çok var kadar ntials, kanalların artan sayıda gözlenir. Bu durumda, kanalın açık olasılık açıkça voltaj bağlıdır. KvAP aktivasyonu ve inaktivasyonu kinetik Siyah Lipid Membranlar (BLMs) 26 ve GUVs arasında önemli farklılık, ancak bu Kv kanal yolluk membran kompozisyonu ve devlete 34 duyarlı olabilir önceki raporlarla uyumludur.
Şekil 1. GUV Electroformation şematik:. SUV içeren damlacıklar, bir elektrot üzerine yatırılması çözeltisinin kısmi dehidrasyon SUV membran yığını oluşturmak için kaynaşmasına neden. Tampon ilave edilir ve bir AC elektrik alan uygulandığında. Film şişer gibi, bireysel membranlar GUVs oluşturmak için yığından ayırmak. (Bu rakam mod olmuştur Aimon ve diğ., 28'den ified)
Şekil 2. GUV Electroformation Odası. Haznesi üç kuyu (10 mm çap, 5 mm derinlik) olan bir PTFE-blok dışarı öğütülür. İki 0,5 mm çapında platin teller, 3 mm (uçtan uca mesafesi) ile ayrılır ve tellerin görüntülemeyi kolaylaştırmak için bölmenin tabanına yakın konumlandırılır. Alt ve üst kapak fişleri vakum gres ile yerinde tutulur ve sızdırmazlık macunu tarafındaki tel deliklerden herhangi sızıntıları önler. AC jeneratör telleri timsah klipler ile bağlanır. kamara Ernesto Ambroggio ve Luis Bagatolli tarafından geliştirilen bir dayanmaktadır. (Bu şekil, Aimon diğerleri modifiye edilmiştir. 28)
"/>
Şekil 3. Spontan Şişme şematik Jel-destekli: Bir SUV süspansiyonu içeren damlacıklar bir agaroz jel üzerine yatırılır damlacık dehydrates gibi, SUV bir lipid film oluşturmak üzere sigorta.. Büyüme tamponu ilave edildiğinde, filmin yeniden hidratlar ve GUVs yüzeyinde oluşturur. GUVs şişme ve komşu GUVs ile kaynaştırarak ~ 10 um arasında bir büyüklüğe kadar büyür.
Bir yüksek tuz tamponu içerisinde platin tel üzerinde büyüyen KvAP içeren DPhPC GUVs Şekil 4. Örnek görüntüsü. GUVs tel boyunca üzüm demet benzer. 40X LWD objektif kullanarak Faz Kontrast görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Agaroz jeli üzerinde şişme KvAP içeren Şekil 5. DPhPC GUVs. GUVs 10 um ~ bir çapı olan soluk küreler olarak görebilir. karanlık / aydınlık noktalar veziküller şişer hangi lipit / agaroz agregalardır. 40X LWD amacı ile Faz Kontrast görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil hatasız GUV 6. Görüntüler. Alexa-488 ile etiketlenmiş KvAP içeren (Yumurta-PC: Yumurta-PA 9 kütlece 1) Sol: DIC, sağ: Alexa-488 Epifloresans. Tahrik: 470/50 nm, emisyon: 545/75 nm. Görünür bir agrega ile KvAP gelen homojen floresan edin. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil düşük tuz tamponu yetiştirilen Elektro-GUVs gelen lipid (eflatun) ve protein (yeşil) floresan 7. Konfokal görüntüleri (Yumurta-PC: Yumurta-PA 9: kütle ile 1) (A) beyaz oklar işareti (büyük olasılıkla). GUVs iken kırmızı ok yüksek lipit floresan ile bir potansiyel iki katmanlı vezikül işaretler. Floresan yoğunluğu nedeniyle görüş son derece büyük alan bu görüntünün merkezinde parlak olduğunu unutmayın. (B) Yakınlaştırma GUVs küçük bir grup gösteren. Sol (kırmızı): TexasRed-DPHE uyarım: 543 nm lazer hattı, emisyon: 605/70 nm. Merkezi (yeşil): Alexa-488 uyarma ile etiketlenmiş KvAP: 488 nm lazer hattı, emisyon: 515/30 nm. Sağ: bindirme.OAD / 52.281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil fizyolojik tuz konsantrasyonunda yetişen Elektro-GUVs gelen lipid (eflatun) ve protein (yeşil) floresan 8. Konfokal görüntüleri (Yumurta-PC: Yumurta-PA 9: kütle ile 1). (A) GUVs (beyaz oklar olasılıkla tek katmanlı göstermek örnekler) daha seyrek düşük tuz protokolüne karşılaştırılır ve son derece farklı protein konsantrasyonları (kırmızı ok) sahip olabilir. (B) Yakınlaştırma GUVs küçük bir grup gösteren. Sol (kırmızı): TexasRed-DPHE uyarım: 543 nm lazer hattı, emisyon: 605/70 nm orta (yeşil): Alexa-488 uyarma ile etiketlenmiş KvAP: 488 nm lazer hattı, emisyon: 515/30 nm. Sağ:. Yerleşimi Lütfen cBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak.
Şekil 9. lipid (kırmızı) ve jel destekli bir fizyolojik tuz konsantrasyonu, tampon maddesi ile kabarmasıyla oluşturulmuştur GUVs (DPhPC) protein (yeşil) floresans Konfokal görüntüsü. GUVs fizyolojik tampon ile hazırlanan Elektro-GUVs daha homojen olan bir protein yoğunluğu göstermektedir. Sol (kırmızı): BPTR-Cer% 0.1 uyarım: 543 nm lazer hattı, emisyon: 605/70 nm. Orta (yeşil): Alexa-488 uyarma ile etiketlenmiş KvAP: 488 nm lazer hattı, emisyon: 515/30 nm. Sağ:. İki kanal birleştirme , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 11. GUV proteini yoğunluğu histogramları: Protein yoğunluğu düşük tuzlu tampon (5 mM KCI, DPhPC) ile GUVs Elektro-bir (birim alan başına proteinleri sayısı), fizyolojik tuz konsantrasyonunun (100 mM KCI, Yumurta PC ile daha az farklılık gösterir: yumurta -PA 9:. kütlece 1) jel destekli fizyolojik tuz tamponu şişlik büyüdü GUVs protein yoğunluğu (DPhPC) en az değişiklik gösterir. Protein yoğunluğu bu konsantrasyonlarda 28 için KvAP-A488 floresan yoğunluğu ile orantılıdır ve her histogramda floresan yoğunlukları dağılımı ortalaması ile normalize edilir. (Orta panel değiştirilmiş) Aimon ve ark. 28
GUV Membran Yamalar (DPhPC 'iç-out' gerilim kongre) Şekil 12. Tek kanallı etkinliği. GUV platin teller 100 mM KCl, 5 mM HEPES pH 7.4 yetiştirildi. Yama üzerinde 100 mV potansiyel uygulandıktan sonra açık Tekli kanallar. Içerlek sağında tek kanallı iletkenlik hesaplamak için kullanılan bir histogramdır. Kırmızı çizgi 109.2 ± 8.5 pS bir iletkenliğe karşılık, 4.70 ± 0.27 pA ve 15.62 ± 0.58 pA de maxima ile bir çift Gauss fonksiyonu bir seçimdir. iz 4-kutuplu Bessel filtresi ile 10 kHz süzülür ve 50 kHz kaydedildi.
Şekil 13. Voltaj bağımlı hazırlık yüksek tuz tamponunda agaroz üzerinde oluşturulan bir GUV (DPhPC, 'iç-dış' gerilim kongre) membran yama t yolluk kanalları. gerilimi geçici bir adım yama membran akımı (A) Tepki. Pipet ve banyo çözümleri hem 100 mM KCI içeren, ve membran ardışık gerilim adımlar arasında -100 mV 30 saniye boyunca tutuldu. Yakın inceleme üzerine bir iz negatif gerilimleri ile açmak gibi 1 veya 2 kanal içerdiğini görebilirsiniz. Ankastre a) gecikmeli açma ve içerlek b) kanal gecikmiş kapanış bir zoom göstermektedir. Akımlar 10 kHz 4-kutuplu Bessel filtresi ile süzülür ve 51.3 kHz kaydedildi. Iz 513 Hz aşağı-numune alındı çevrimdışı. Negatif kapasite geçici -150 pA de kesilir. Adım gerilimi karşı (B) Ortalama akım (<t <5 sn 0.25 sn). Kanal açık olasılık voltaj bağımlı olduğundan pozitif gerilimlerde Akımlar büyüktür.iles / ftp_upload / 52.281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biomimetic model sistemler, protein ve membran özellikleri ve etkileşimler üzerinde çalışmak için önemli bir araçtır. BLMs veya desteklenen lipid zarlar gibi diğer sulandırılmış sistemlerle karşılaştırıldığında, GUV sistemlerini önemli membran bileşimi, gerilim ve geometri kontrolü yanı sıra gerçekten olmanın petrol-ücretsiz dahil olmak üzere mevcut birçok fırsatlar tabanlı. Bununla birlikte, GUVs içine, örneğin KvAP transmembran proteinleri içeren lipid sadece GUVs için bilinen protokoller önemli uyarlamaları gerektirmektedir. Burada sunulan electroformation protokol daha önce karakterize edilen ve kavisli membran 2,4,35 membran proteini dağıtım ve dinamikleri biyofiziksel ilkeleri incelemek için kullanılmıştır. Bu çalışma GUVs protein yeniden yöntemleri grubu ekleyerek, yeni bir jel destekli şişme protokolünü gösterir. Iç-out yamaları hatasız KvAP yüksek yoğunluklara içeren GUVs ve ölçümleri üretebilir Her iki protokol teyitse GUVs işlevsel potasyum seçici, voltaja bağımlı kanalları içerir.
İki yaklaşım farklı güçlü ve zayıf yönleri vardır. Düşük tuz koşulları kullanılabilir zaman, electroformation GUV verimi ve homojen bir protein yoğunluğu arasında iyi bir denge sağlar. Electroformation hala fizyolojik tuz konsantrasyonları ile makul verim verir, fakat protein yoğunluğu (Şekil 8 ve 11 bakınız) GUVs arasında büyük ölçüde değişebilir. yoğunluk değişimleri büyüme çok daha uzun 2 saat daha devam ederse, düşük tuz tampon büyüme de önemli yoğunluk varyasyonları olabilir, electroformation süresi ile bağlantılı gibi görünüyor. Bunun tersine, jel destekli şişme ile üretilen GUVs da fizyolojik tampon maddeler, son derece düzgün bir protein yoğunluğuna sahiptir. Bununla birlikte, çok-tabakalı kesecikler ve fraksiyon daha büyüktür ve agaroz oto-floresan düşük protein miktarının belirlenmesi 16 yoğunluklarından zorlaştırmaktadır. Pla polivinil alkol kullanmaAgaroz ce lipitleri kloroform 20 tevdi edildiğinde jel destekli GUV verimini artırmak için bildirilen, ancak biz SUV çözümleri ile polivinil alkol kullanan GUVs üretmek koyamadık olmuştur. Hatasız GUVs daha düşük bir verim kabul edilebilir ise, jel destekli şişme muntazam bir protein dağılımı gerektiren deneyler için açık bir avantaja sahiptir.
Electroformation ve jel destekli şişlik de oldukça farklı ekipman gereksinimleri vardır. Jel-destekli şişme protokolü temiz, hidrofil cam üretmek için birçok alternatif yöntem vardır gibi önemli değildir plazma temizleyici, dışında çok az özel ekipman kullanır. Buna karşılık, electroformation teli ile özel bir odasını gerektirir. Platin tel pahalı, ama bu protokol için GUVs titanyum teller daha platin ile daha kolay büyüdü, ve fizyolojik tuz konsantrasyonları kullanırken İTO üzerinde büyümek değil GUVs slaytlar. elektrotlar (0.5 mm) çapında bir Compr olanelektrot yüzeyi ve fiyat arasındaki omise. Şekil 2'de gösterildiği gibi bölme Luis Bagatolli 15 ve Ernesto Ambroggio bir tasarıma dayanan, ve en çok çözücü ile temizlenmesini sağlamak üzere Politetrafloroetilen (PTFE) talaşlı edildi. Bununla birlikte, poliasetal veya polivinil klorür (PVC), aynı zamanda iyi çalışmaktadır. agresif temizlik için platin telleri kaldırmak için yeteneği önemlidir, ilk protokol öğrenirken, bu alt kapak slayt aracılığıyla yerinde GUV büyümesini gözlemlemek mümkün oldukça yararlıdır. küçük, kuyular geriye ve ileriye sloshing gelen çözümü engellemek ve aynı zamanda paralel olarak çeşitli lipit bileşimlerin testleri izin kapattı. Başlayan Ancak, bir özel özel odası değil esastır. Örneğin, basit, tek gözlü odaları küçük şişenin kapağı yoluyla alay sadece küçük bir petri tablasının tabanına aşağı iki teli yapışma, ya da iki cam slaytlar arasında sandviç bunları sızdırmazlık kaplama ile ya da doğaçlama edilebilir.
Electroformation ve jel destekli şişme protokoller hem mikro-manipülasyon ve yama-kelepçe deneyler için hatasız GUVs yeterli sayıda üretmek gerekir. SUV çözümü kısmen susuz olduğunda ancak, GUV verimi iki katmanlı yığının oluşumunda hassas bağlıdır. Zorluklar artan GUVs karşılaşılan (yani, hiç veya çok az GUVs büyüme odasında görebilir), çok SUV 15,16 yerine bir lipit / kloroform çözeltisi kullanılarak lipid tek GUVs büyümeye yardımcı (ve düşük olabilir tuz tamponu). GUVs bir lipid / kloroform filmden iyi büyümek yoksa o zaman temel şeyler yanlış (örn, yanlış lipit solüsyonları veya tamponlar, elektrotlar, yanlış voltaj veya frekans, vb yağ veya kir) 'dir. GUVs lipit / kloroform filmler değil SUV filmler büyümek Ancak, daha sonra konu kısmi dehidratasyon ile olması muhtemeldir.
Kısmi dehidratasyon adımEn kolay aşırı dehidrasyon tarafından "denatüre" lipidlerin riski yoktur, çünkü lipid yalnızca SUV kullanılarak optimize. SUV damlacıkları damlacık tevdi edilmiş her noktada aydınlık lipit floresan olduğunu kontrol etmek için kurumaya bırakılır edildikten sonra electroformation için, bu teller incelemek yararlı olabilir. Kamara sonra, büyüme çözeltisi ile doldurulur sonra lipit floresan kaybolursa ya büyüme çözümü daha dikkatli eklenecek olan, ya da SUV yani filmin tel daha sıkı bağlanır uzun süre kurutmak gerekir. Büyüme sırasında, odanın içinde emin teller ne de çözüm hareketini (örneğin, mikroskop odasını koyarak) teller kapalı GUVs sıyırma önlemek için ne yapmak. GUVs iyi büyür, onlar genellikle faz kontrast görüntüleri görmek kolaydır. Ancak, küçük GUVs da zar yığını büyüme sırasında nasıl değiştiğini görmek için yardımcı olan lipit floresan kullanarak sık sık temizdir. Tüm yüzeylerini inceleyinTüm kuyularda teller (iç, dış, alt ve üst) yanı sıra verimleri başka bir noktadan önemli ölçüde değişebilir, çünkü büyüme atılmadan önce odası zemin.
taşıma ve GUVs depolama hücreleri basit oranla, fakat GUVs ozmotik stres, kesme kuvveti ve yapışma oldukça duyarlıdır. Hasat veya GUVs aktarırken Pürüzsüz, yumuşak hareketler önemlidir, ve yapışmış ve patlayan gelen GUVs önlemek için yüzeylerin pasifize etmek için önemlidir. Pasivasyon çözüm olamaz kat yama pipetler ve gigaseal oluşumunu önlemek böylece Ancak, yama kelepçe deneyler için odası iyice pasivasyon sonra durulanmalıdır. Pasivasyon için, beta-kazeın tedavi basit ve etkili, ve bir yağ taşıma fonksiyonu olan sığır serum albümini ile karşılaştırıldığında, bir beta-kazein lipid çift tabakaları ile sınırlı etkileşime girer ve GUVs 36 çalışırken tercih edilmelidir. Inkübasyon süresi değiştirilerek, bununalmak mümkün GUVs patlayan olmadan uymak için. Bununla birlikte, GUVs kapak sürgü kadar katı bir şekilde hücrelere bağlı değildir ve bu yüzden yine (bölme hareketli, örneğin, tampon perfüzyon) bölmesi içinde akmalarını sağlayan herhangi bir işlem sırasında alınmalıdır bakım.
Patch-kelepçe kayıt KvAP gibi voltaj kontrollü iyon kanallarını incelemek için klasik bir yöntem olup, bu protokol yapışık hücreler "iç-dış" yamalar elde etmek için, standart tekniklerle elde edilir. Yama pipet eğik iner hangi bir standart yama-kelepçe kurulum (örneğin, yatay 30-60 derece), küçük bir Petri kabı içine iyi çalışması gerekir. Ancak, yama pipet ve gigaseal bölgenin net görüntüler kapak slipleri odası üst ve alt (~ 1 mm ayırma) yani yan yatay girebilirsiniz yama pipet oluşturduğu bir odayı kullanılarak elde edilebilir. Büyük yama pipet basınçları gerekli olmadığından, basınç elverişli c olabilirBir şırınga ile ontrolled ve herhangi bir basit basınç ölçer (örneğin, doğaçlama su manometre) ile izlenir. Bir lipit / kloroform çözeltisi ve düşük tuz tamponu kullanılarak yetiştirilen lipit sadece GUVs ilk uygulama yama kelepçe deneyler için yararlı olabilir. Hatasız GUVs verimi çok yüksek olduğu için, birçok deneysel odasına hasat ve transfer sırasında tahrip bile çalışmak için mükemmel GUVs bol olacak.
Küçük bir uygulama ile, istikrarlı gigaseals ile eksize membran yamalar kolayca DPhPC GUVs ve KvAP-DPhPC GUVs elde edilebilir. Yüksek bir başarı oranı elde etmek için, dikkatli yuvarlak seçmek için yardımcı olur, ama biraz dalgalı-, hatasız GUVs ve yama pipet temiz olup olmadığını kontrol gigaseal oluşturmak denemeden önce (floresan lipidler arıyor). Bir zar "dil" yama pipet girdiğinde, gigaseal tipik güçlü emme veya specifi için herhangi bir ihtiyaç olmadan hızlı (<1 sn) oluştururc tutma gerilimi. Membran yama pipet içine daha fazla tarar gibi kötü bir mühür geliştirmek olsa da, sık sık pipet iç kontamine çünkü mühür zayıf kalır ve bir taze yama pipet ve GUV ile başlamak gerekir. DPhPC formları bile yüksek gerilim (örn, 150 mV ±) mükemmel bir sızdırmazlık direnci ile membran yamalar (on dakika) çok kararlı. SOPC: kolesterol (3: mol 1) de çok kararlı yamaları oluşturabilir ancak Yumurta-PC yamalar daha kolay kırmak gibi görünüyor ise, mühür yüksek emme gerektirebilir.
Uzun patch-clamp oturumları için bu bölme, solüsyonun osmolaritesini ayarlamak gerekli olabilir. Ozmolaritenin GUV büyüme tampon daha çok düşükse, GUVs, şişmiş gergin ve küresel olmak ve bir gigaseal oluşturmak için yama pipet içine yeterince GUV membran aspire mümkün olmayabilir. Bu genellikle sadece odasından buharlaşma olarak 10 veya 20 dakika bekliyor sabit olabilir ext artırırernal çözüm osmolaritesi GUVs Söndür ve dalgalanma başlayana kadar. Odası çok uzun süre açık kalırsa GUVs, tubulate ve tomurcuk deflate kadar Tersine, dış çözümün ozmolaritesi artırabilir. Bu buharlaştıktan su yerine damıtılmış su ilave periyodik olarak (Mineral yağ ile, örneğin), bölme buharlaşmayı engelleyen ya da önlenebilir.
Proteinler kesilmiş zar yamalar 31 dahil edilebilir olduğundan, bir, çıkarılan yama aktif kanal sayısı sadece GUV zarında bulunan proteininin yoğunluğu ile ilgili değildir. Floresans ölçümleri, yama zarında KvAP konsantrasyonu GUV 28 daha düşük olduğunu göstermektedir ve bu kanallar sadece küçük bir sayı içeren yamalar elde etmek için oldukça kolay olabilir. Ancak, yamalar tek kanallı kayıt için çok fazla kanal, daha küçük ipuçları ile yama pipetler kullanılarak ve / veya protein-lipid düşürücü d bariz adımlar içeriyorsaSUV karışımı densite etkilidir. Bunun aksine, çok sayıda kanallar içeren yamaları topluluğu ölçümler yapmak için, görece yüksek protein yoğunluğu ile başlamak için yararlı olabilir (örneğin, ağırlıkça lipide 01:10, bir protein), yüksek protein yoğunluğuna sahip GUVs seçmek için, protein floresan kullanımı , büyük yama pipet kullanın (örneğin, 2 mikron ucu çapı 3) ve aspire hızlı hızlı mühür oluşturmak için denemek için. Açıkçası, "tam hücreli" tipi yapılandırması (yani, 'tam GUV') bir GUV tüm kanalları karakterize ideal olacaktır, ama ne yazık ki "tüm GUV" yapılandırma çeşitli teknik sorunlar 37 pozlar.
Bu eğitim solüsyonlar, yağlar ve protein konsantrasyonları, sadece bir başlangıç noktası olarak verilmiştir ve birkaç hususlar aşağıdaki belirli bir deney ihtiyaçlarına uygun olarak değiştirilebilir.
Bütün çözeltiler, HEPES gibi bir pH tamponu içermelidirveya TRIS proteinleri pH aşırı maruz kalmadıklarını. Çözünmüş madde konsantrasyonları kısmi dehidrasyon aşaması esnasında artırmak ve yüksek tuz konsantrasyonları, protein denatüre veya hızlı bir şekilde lipid filmi neden olabilir SUV tamponu (örneğin, 5 mM tuzu ya da daha düşük) tolere edecek proteini olarak çözünen kadar düşük bir konsantrasyona sahip olmalıdır rehidrasyon aşaması esnasında delamine. Örneğin trehaloz gibi şekerler ve küçük miktarlarda (örneğin, 5 mM, 1 mM) dehidrasyon 23 sırasında proteinin korunması için düşünülmektedir. Trehaloz anhidrobiyosis implike edilmiştir ve dessication 38 karşı membran ve proteinleri korumak inanılmaktadır birlikte, sakaroz ya da glikoz aynı şekilde iyi bir şekilde çalışabilir.
Büyüme tampon için, tuz konsantrasyonu, bu optimum GUV büyümesi (ör electroformation voltaj, frekans ve süre) için parametreleri etkileyen gibi özellikle önemlidir. Buna karşılık, gözlem tampon için birincil kısıt tşapka büyüme tampon aynı ozmolariteyi olmalıdır. GUV iç ve dış arasındaki kırılma indeksi farkı faz kontrastı veya yardımcı olur ise "büyüme tampon" ve "gözlem tamponu" olarak sukroz ve / ya da bir glukoz dahil, gözlem odasına alt GUVs tortu sağlamak için yardımcı olabilir DIC mikroskopi. Elektrofizyolojistler genellikle hücre membranları ile gigaseal oluşumunun arttırılması için banyo ve / veya yama pipet çözümleri, kalsiyum veya magnezyum iyonları arasında, ancak bu GUVs için gerekli olduğu gibi görünmektedir. Gerçekten de, örneğin magnezyum ve kalsiyum gibi çift değerli iyonlar, lipit fazı ayrılmasına neden ve yapışmayı kolaylaştıran, bu nedenle bu sorunların ortaya çıkması durumunda bu, 1 mM EDTA ilave etmek yararlı olabilir olabilir.
Açıktır ki, hücreleri ile karşılaştırıldığında yeniden sistemlerin bir çekicilik lipit bileşimi kontrol etme yeteneğidir. DPhPC GUVs iyi büyür ve istikrarlı eksize membran yamaları oluşturmak ve bu protokoller de ef çalıştıtutmadaki lipit fosfatidilkolin (PC) içeren karışımlar, fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilgliserol (PG), fosfatidik asit (PA), fosfatidilserin (PS) ve kolesterol için. Bununla birlikte, GUV büyüme lipit bileşimine duyarlıdır ve 15 tamponları ve benzeri protokol parametrelerini (örneğin, yağ miktarı biriken, electroformation gerilim / frekans) PE yüksek konsantrasyonlarını ihtiva eden lipit karışımları için ayarlanması gerekebilir (PG yüklü lipidler PA, PS), ya da kolesterol. Dışarı başlatırken, Yumurta-PC, DOPC ya DPhPC iyi bir ilk tercihi vardır ve GUV büyümesini gözlemlemek ve iki veya daha fazla bilayers ile çok katmanlı veziküller gelen GUVs ayırt etmek bir floresan lipid içermesi de çok yararlıdır. Lipidler (sıcaklık bir tek faz geçiş sıcaklığından daha yüksek olması koşuluyla) kısmi dehidrasyon aşaması esnasında karışımı gibi lipid karışımları, stok çözeltileri SUV süspansiyonlar birleştirilmesiyle hazırlanabilir. (Yüksek SUV konsantrasyonu kullanılarak, örneğin,10 mg / ml) stok çözeltileri önemli bir esneklik sağlar ve bu daha sonra 3 mg / ml'lik bir süspansiyon dehidrasyon önce seyreltilebilir.
Diğer trans-membran proteinlerine bu protokolleri adapte teşebbüs ederse, hem doğrudan GUVs ve test protein fonksiyonunun içine protein katılmasını gözlemlemek mümkün olmak çok önemlidir. KvAP ile bir sorun iken, rehidrasyon sırasında trans-membran proteini lipid sadece GUVs oluşumuna yol açan zar yığını kalacak adım ihtimali her zaman vardır. Bu GUVs içine protein birleşmesini gözlemlemek ve aynı zamanda GUVs içinde toplama kontrol etmek için hızlı ve kesin bir yol sağlar gibi protein Floresan etiketleme çok uygundur. Bu, protein yeniden oluşum işlemi sırasında zarar olmadığını teyit etmek için GUVs protein fonksiyonunu test etmek için de çok önemlidir. KvAP gibi iyon kanalları için, yama-kelepçe ölçümleri fonksiyonel kanalların varlığı kurabilirGUVs. Bununla birlikte, bir floresan etiketli, yüksek afiniteli ligandı (örneğin, toksin, alt-tabaka ya da anti-vücut) de GUVs protein durumunu test edilmesi için çok yararlı olacaktır.
Özetle, bu makale voltaj kapılı potasyum kanal KvAP içeren proteo-GUVs üretmek ve floresan mikroskobu ve elektrofizyoloji kullanarak onları karakterize gösterilmiştir. Umarım bu yöntemler zar proteinlerinin yeni sınıflar adapte ve eğitim ve temel bileşenlerinden konuyu canlı kurmak için daha karmaşık in vitro sistemleri için bir temel sağlamak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
