Summary
Genoprettelse af det transmembrane protein, KvAP, i gigantiske unilamelblærer (GUVs), er dokumenteret i to dehydrering-rehydrering metoder - electroformation og gel-assisteret hævelse. I begge fremgangsmåder er små unilamellare vesikler indeholdende proteinet fusioneret sammen for at danne GUVs, som derefter kan studeres ved fluorescensmikroskopi og patch-clamp elektrofysiologi.
Abstract
Giant unilamelblærer (GUVs) er et populært biomimetisk system til at studere membranassocieret fænomener. Men almindeligt anvendte protokoller til at vokse GUVs skal ændres for at danne GUVs indeholder funktionelle transmembrane proteiner. Denne artikel beskriver to dehydrering-rehydrering metoder - electroformation og gel-assisteret hævelse - at danne GUVs der indeholder spændingsstyret kaliumkanal, KvAP. Ved begge metoder en opløsning af proteinholdige små unilamellare vesikler er delvis dehydreret til dannelse af en stabel af membraner, som derefter lov til at kvælde i en rehydrering buffer. For electroformation fremgangsmåde filmen deponeret på platinelektroder, således at en AC felt kan påføres under film rehydrering. I modsætning hertil gel-assisteret hævelse metode anvender en agarosegel underlag til forøgelse film rehydrering. Begge metoder kan producere GUVs i lav (fx 5 mM) og fysiologiske (f.eks, 100 mM) saltkoncentrationer. De resulterende GUVs karakteriseres via fluorescensmikroskopi, og funktionen af rekonstituerede kanaler målt under anvendelse af inside-out patch-clamp-konfiguration. Mens hævelse i nærvær af et alternerende elektrisk felt (electroformation) giver et højt udbytte af fejlfri GUVs, gel-assisteret hævelse metode giver en mere homogen protein distribution og kræver ikke særligt udstyr.
Introduction
Når man undersøger de fysiske principper, der styrer levende systemer, bottom-up tilgange tillade en experimentalist at kontrollere systemets sammensætning og andre parametre, der ikke let manipulerede i cellebaserede systemer 1. For membran-baserede processer, har Giant unilamelvesikler (GUVs, diameter ~ 1-100 um) vist sig at være en meget nyttig biomimetisk System 2 - 7, da de er velegnede til mikroskopi studier og mikromanipulering 8-10. Selvom der er mange forskellige protokoller til at producere GUVs, de fleste falder i to kategorier - emulsion tilgange 11,12 og teknikker baseret på rehydrering en lipidfilm 13-16. I emulsionsbaserede fremgangsmåder er de indre og ydre foldere af GUV membraner samles sekventielt fra lipidmonolag på vand / olie-grænseflader. Denne fremgangsmåde er velegnet til indkapsling af opløselige proteiner medi GUVs, og til at danne GUVs med asymmetrisk brochure lipid sammensætning. GUVs dannet af emulsioner, kan dog beholde spor af opløsningsmiddel, som ændrer membranens mekaniske egenskaber 17, og den tilgang er ikke specielt velegnet til trans-membranprotein rekonstitution.
Film rehydrering metoder påberåbe sig, at tørring (dehydrering) forårsager mange lipidblandinger at danne en multi-lamellar stak af membraner. Hvis denne stak derefter anbringes i kontakt med en vandig buffer, vil membranerne i stakken bevæge sig fra hinanden som opløsningsmiddel strømme mellem dem og på overfladen af stablen kan individuelle membraner frigøre til dannelse GUVs 13,18 (samt en veritabel zoo andre lipidiske objekter). Men selv for optimale buffer- og lipidsammensætninger Dette klassiske "spontan hævelse" -metoden har et relativt lavt udbytte af fejlfri GUVs. En udbredt metode til at øge udbyttet af fejlfri GUVs er "electroformation221 ;, hvor en (AC) felt vekselstrøm påføres under film rehydrering. Mens mekanismen dårligt forbliver forstås "electroformation" kan give spektakulære GUV udbytter (> 90% under gunstige omstændigheder) for lavt saltindhold koncentrations- puffere (<5 mM) 14,19, og kan endda arbejde i fysiologiske puffere (~ 100 mm) under anvendelse en højere frekvens (500 Hz versus 10 Hz) AC felt og platinelektroder 15. En alternativ fremgangsmåde til at øge udbyttet af fejlfri GUVs er "gel-assisteret hævelse", hvor lipidopløsningen afsættes på en polymergel substrat snarere end den passive (f.eks glas, PTFE) substrater, der anvendes i klassisk "spontan hævelse ". Når den resulterende lipid / gel film rehydratiseres kan GUVs hurtigt danne selv for fysiologiske buffere 16,20.
Alle disse metoder kan producere lipid kun GUVs som kan anvendes til at studere membranassocierede fænomener såsomsamspillet mellem opløselige proteiner og membraner. For at inkorporere en trans-membranprotein i GUVs er væsentlige ændringer nødvendige for at sikre, at proteinet forbliver i en funktionel tilstand hele opløsningsprocessen. Mens opløsninger af lipider i organiske opløsningsmidler (fx chloroform, cyclohexan) er ideel til fremstilling af lipidfilm, trans-membranproteiner er typisk kun er stabilt, når deres hydrofobe transmembrane domæne er indlejret i et lipiddobbeltlag, eller omgivet af et detergent micelle ( fx under proteinoprensning). Således udgangsmaterialet til en opløsning er typisk native membraner, oprensede protein i en detergentopløsning, eller små unilamellare protein-holdige vesikler (Proteo-SUV'er) og / eller multi-lamellare vesikler (Proteo-MLV'er) dannet ved detergentfjernelse i tilstedeværelsen af lipider. De fleste metoder til at indarbejde disse membranproteiner i GUVs opdeles i tre kategorier.
Direkte insertion: Trans-membranprotein suspenderet i vaskemiddel blandes med pre-formet, lipid-only, mildt vaskemiddel opløste GUVs og vaskemiddel fjernes derefter ved hjælp Biobeads 21. Mens begrebsmæssigt enkel, denne metode kræver præcis styring af detergentkoncentrationen, som en for høj detergentkoncentration kan opløse GUVs mens en for lav koncentration kan forårsage, at proteinet foldes ud eller aggregat.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUV'er kombineres med præ-formet, lipid-kun GUVs og fusion lettes med særlige fusogene peptider 22 eller vaskemiddel 21. Typisk omfanget af fusion er begrænset fører til GUVs med lav protein tæthed.
Dehydrering / Rehydrering: Et protein, der indeholder lipid film dannes ved delvis dehydrering af en Proteo-SUV (eller Proteo-MLV) opløsning og GUVs dyrkes derefter som for en ren lipidfilm. Den indlysende udfordring er at beskytte proteinet under den delvise dehydratipå trin 23, men metoden er med succes blevet anvendt til at rekonstituere trans-membran proteiner såsom bacteriorhodopsin, Calcium-ATPase, Integrin og VDAC i GUVs 7,23 - 25.
Denne artikel beskriver dehydrering / rehydrering protokoller til at gøre GUVs indeholdende spændingsstyret kaliumkanal, KvAP fra hyper-termofile Archaea, Aeropyrum pernix. KvAP har en høj grad af homologi med eukaryot spændingsafhængige kaliumkanaler 26 og en kendt krystalstruktur 27 , hvilket gør det en god model til at studere den mekanisme af spænding gating. Produktionen af de Proteo-SUV'er er blevet beskrevet i detaljer tidligere, og er ikke en del af denne gennemgang 26,28,29. Vigtigere, do KvAP Proteo-SUV'er ikke at blive fremstillet for hver GUV forberedelse, da de kan opbevares i små (fx 10 pi) portioner ved -80 ° C i længere tid (> 1 år). Electroformationeller gel-assisteret hævelse kan derefter anvendes til at dyrke GUVs fra KvAP Proteo-SUV'er (eller Proteo-MLV'er).
De vigtigste trin i den electroformation protokol er illustreret i figur 1. Dråber af en opløsning af SUV'er indeholder proteinet aflejres på platin tråde (vist i figur 2). Delvis dehydrering af SUV suspension fører til dannelsen af en lipid-protein film ved fusion af SUV'er. Under rehydrering, er en AC felt påføres elektroderne for at bistå lipidlag at delaminere og danne GUVs. En 10 Hz felt fungerer godt, når du bruger "lav-salt" (<5 mm) rehydrering buffer 28 og GUVs tage flere timer at vokse. I modsætning hertil fysiologiske puffere (indeholdende ~ 100 mM salt) fungerer godt med en lavere spænding, 500 Hz AC område, men kræver en forlænget (~ 12 timer) hævelse periode 15. Denne metode er baseret på en tidligere protokol ved hjælp ITO slides 24, men bruger en brugerdefineret kammer containing to platin ledningerne som vist i figur 2 (se diskussionen for design detaljer og forslag til enklere, improviserede kamre).
Figur 3 illustrerer gel-assisteret hævelse metode. Protokollen fungerer godt med puffere med fysiologiske saltkoncentrationer, er hurtig, og producerer GUVs med en mere homogen protein distribution. Men (dvs. GUV membranen er ensartet på optiske længde-skalaer og ikke vedlægge nogen genstande) udbyttet af isolerede, tilsyneladende fejlfri GUVs er lavere, selv om det giver et tilstrækkeligt antal til patch-clamp og mikro-manipulation eksperimenter . Denne metode er baseret på en protokol anvendelse agarosegel for at fremstille lipid-only GUVs 16 og kræver mindre specialudstyr end electroformation metode.
Karakteriseringen af GUVs med fluorescens mikroskopi beskrives, samt procedurer ved hjælp af en standard patch-clamp set-up tilmåle KvAP aktivitet i "inside-out" udskåret membran patches.
Dyrkning proteinholdige GUVs kan være sværere end lipid kun GUVs. Navnlig kan den endelige GUV udbytte afhænger følsomt på præcis hvordan SUV opløsningen deponeret og dehydreres til dannelse af membranen stakken. For en person uden tidligere erfaring med GUVs, kan det være nyttigt først at vokse lipid kun GUVs efter en konventionel protokol 15,16 i hvilken membranen film dannes ved at deponere lipider fra et organisk opløsningsmiddel. Når den konventionelle protokol fungerer godt, kan SUV deposition og delvis dehydrering derefter mestrer hjælp lipid-kun SUV'er, som også er meget nyttigt, når justering af protokol for en ny lipid sammensætning. Når GUVs vokse pålideligt mod lipid-kun SUV'er, så er det kun et lille skridt til at producere proteinholdige GUVs fra Proteo-SUV'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af opløsning
- Forbered 5 ml "SUV buffer", der indeholder 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7,4) eller tris (pH 7,5) og 2 mM trehalose. Filtreres buffer med et 0,2 um sprøjtefilter og opdele i 1 ml alikvoter, som kan opbevares ved -20 ° C.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger om reagenser og instrumenter er anført i listen materialer. - Forbered 40 ml GUV "Vækst Buffer", som vil fylde GUV interiør under film rehydrering. For en "lav salt" vækst, kombinere 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7,4) eller 1 mM Tris (pH 7,5), og ~ 400 mM saccharose. For en "fysiologisk salt" vækst, kombinere 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7,4) eller 5 mM Tris (pH 7,5), og ~ 200 mM saccharose.
- Forbered 40 ml Observationsenhed Buffer "for den eksterne opløsning i den eksperimentelle kammer ved at kombinere 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7,4) eller 5 mM Tris (pH 7,5), og ~ 200 mM glucose.
BEMÆRK: Disse buffere er kun EXAmples. Se diskussionen at tilpasse buffere til andre forsøg. - Mål osmolariteter i vækst- og observation buffere med en osmometer. Tilføj granulat af saccharose eller glucose til at matche dem til inden for 1%, således at GUVs ikke lysere eller kollapse, når de overføres fra kammeret vækst observationskammeret.
BEMÆRK: I dette koncentrationsområde, tilsætning af 1 mM saccharose (13,7 mg pr 40 ml) eller glucose (7,2 mg pr 40 ml) øger osmolariteten af ~ 1 mOsm. - Filter vækst og observation buffere med et 0,2 um filter, og opbevar dem ved 4 ° C for at inhibere bakterievækst.
- Opløs 50 mg beta-casein i 10 ml 20 mM TRIS (pH 7,5) buffer til dannelse af en 5 mg / ml beta-casein løsning nødvendig for at passivere overfladen af eksperimentelle kamre så GUVs ikke klæber, spredning og burst. Når beta-casein er fuldstændig opløst (op til flere timer ved 4 ° C), filtreres (0,2 um) den i 0,5 ml portioner, der kan lynfrosset og opbevaretved -20 ° C til senere brug (optøede portioner opbevares ved 4 ° C kan typisk anvendes i op til en 1 uge).
2. SUV Forberedelse
- Forbered og fryse portioner af Proteo-SUV'er efter tidligere offentliggjorte detaljeret protokol 28. Brug KvAP fluorescensmærket med Alexa-488 maleimid, rekonstitueret i DPhPC SUV'er (10 mg / ml) på et protein til lipid forhold på 1:10 (efter vægt).
BEMÆRK: Vildtype KvAP indeholder et cystein pr monomer ligger i nærheden af intra-cellulære C-terminus (aminosyre 247). - Fluorescerende, lipid-only SUV'er:
BEMÆRK: Håndter chloroform under en emhætte iført nitril handsker og sikkerhedsbriller. Undgå brug af enhver plast chloroform kan opløse dem. Chloroformopløsninger kan opbevares i ravfarvet hætteglas med Teflon hætter og overføres ved hjælp glassprøjter. Pas at skylle alt glasudstyr mindst 5 til 10 gange med chloroform før og efter pipettering lipider.- Forbered 100 pi10 mg / ml DPhPC SUV'er indeholdende 0,5 mol% af den røde fluorescerende lipid, Texas Red-DHPE, ved at blande 100 pi DPhPC opløsning (10 mg / ml i chloroform) med 8,2 pi af Texas Red-DHPE opløsning (1 mg / ml i methanol) i et 1,5 ml ravfarvet hætteglas.
- Tør lipiderne ned under en strøm af nitrogen i en kemisk hætte under rotation af hætteglasset. Når filmen synes at være tør, placere lipiderne under vakuum i 3 timer for at fjerne enhver resterende opløsningsmiddel.
- Tilsæt 100 pi SUV buffer til lipider, og vortex kraftigt, indtil der ikke lipid sætter sig fast i siderne af hætteglasset, og opløsningen er ensartet mælkehvid.
- Soniker lipidopløsningen til dannelse af SUV'er. Juster hætteglasset stilling, indtil ultralyd forårsager mest bevægelse og flow inde i hætteglasset, og passe på ikke at opvarme opløsningen unødigt. Fortsæt lydbehandling indtil opløsningen bliver gennemsigtigt, eller når det er muligt, transparent (2-5 min for tip lydbehandling, ~ 20 min til bad lydbehandling).
- Aliquot SUV'er (f.eks 10 ul eller 20 pi) og fryse (-20 ° C) til senere brug.
BEMÆRK: Lipider, især umættede lipider, kan let opdeling. Store lipidopløsninger ved 20 ° C (eller 80 ° C) under argon og anvendes inden for 6 måneder. Lipid nedbrydningsprodukter kan påvises med tyndtlagskromatografi.
3. GUV Vækst af Electroformation
- Forbered electroformation kammer.
- Hvis kammeret ikke er blevet renset, fjerne vinduerne, tørre al fugemasse og fedt, ekstrakt ledningerne, og skyl og krat kammeret med en serviet med vand og ethanol (≥70%) skiftevis.
- Gnid ledningerne godt, dykke ledningerne og kammer i acetone, og sonikeres i 5 min. Tør alt med et væv igen med acetone. Sæt kammeret i ethanol og sonikeres i 5 minutter.
- Saml kammeret ved at indsætte ledningerne gennem hullerne, og drej og tør ledningerne for at sikre de are ren. Sæt kammeret i destilleret vand, sonikeres i 5 minutter og tørre kammer med en strøm af nitrogen eller luft.
- Forbered 30 pi 3 mg / ml SUV suspension i SUV buffer. Til dannelse af proteinholdige GUVs, kombinere 8 pi Proteo-SUV'er (DPhPC 10 mg / ml KvAP 1:10), 2 pi af fluorescerende SUV'er (10 mg / ml DPhPC, 0,5 mol% TexasRed-DHPE) og 20 pi SUV buffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør til en endelig proteinkoncentration lipid (masse) forholdet 1: 12,5 og 0,1 mol% TexasRed-DHPE. Bland opløsningen kraftigt.
- Alternativt at øve protokollen med lipid-only SUV'er, blot kombinere 10 pi fluorescerende SUV'er (10 mg / ml DPhPC og 0,5 mol% TexasRed-DHPE) med 20 pi SUV buffer.
- Deponere SUV Solution.
- Anvend en 2 pi pipette eller glassprøjte 5 pi at deponere små (<0,2 pi) dråber af SUV løsning på ledningerne. Ca. 1 ml af opløsningen er nødvendig for at danne en række dråber langs1 cm af tråd. Sørg dråberne er små nok og anbragt langt nok fra hinanden, at de ikke rører eller sikring.
- Lad de deponerede SUV'er tørre i ~ 30 minutter i fri luft. Når alle dråberne har afgjort, dreje tråden, så lipidaflejringer er lettere at observere med mikroskopet.
BEMÆRK: Hvis SUV'er ikke tørre tilstrækkeligt, kan de bare vaske ledningerne, når der tilsættes buffer vækst, mens tørring for meget kan skade proteinet. Fordi luftfugtighed påvirker hastigheden af tørring, tørretiden og / eller luftfugtighed kan justeres for at opnå optimale resultater 30. Lipid film på ledningerne skal være synlige under et mikroskop.
- Saml kammeret.
- Seal kammerbunden: Brug en sprøjte til at anvende vakuum fedt til bunden af kammeret omkring de tre brønde og tryk på en 40 mm x 22 mm dækglas forsigtigt mod det at forsegle kammeret bund, således at det klæber uden et hul. Forsegl kammerets sider (hvor ledninger exit) medforsegling pasta. Påfør vakuum fedt på toppen af kammeret skitserer de tre brønde.
- Tilsæt langsomt vækst buffer indtil hver brønd fyldes til toppen. Undgå hurtige bevægelser af opløsningen i brøndene, da dette kan fratage lipidfilmen fra elektroderne.
- Kammeret lukkes ved at trykke på topdækslet glide forsigtigt på fedt, pas på ikke at fjerne den nederste dækglas. Brug et væv for at fjerne eventuelle dråber buffer ved kanterne af topdækslet slip.
BEMÆRK: Dette er et godt tidspunkt at undersøge kammeret under mikroskop for at bekræfte, at lipidfilmen er forblevet på ledningerne.
- Tilslut signal generator til ledningerne ved hjælp af to krokodillenæb. Indstil frekvens (10 Hz / 500 Hz sinusbølge for lav / høj salt buffer) og bruge et multimeter til at måle og justere spændingen over ledningerne til 0,7 / 0,35 V effektiv spændingsværdi (Vrms) for lav / høj salt buffer. Dæk kammeret med aluminiumfolie for at beskytte fluoroforer mod lys. Lad than GUVs at vokse i 2 til 3 timer for lav salt buffer, og 12 timer eller O / N for den høje salt buffer.
- Afbryd kammeret fra generatoren og omhyggeligt placere den på et inverteret mikroskop til at evaluere GUV vækst. Brug langsom, stabil bevægelser eller flydende flow i brøndene kan utide løsrive GUVs fra ledningerne.
BEMÆRK: GUVs på wiren kanter er normalt synlige i fase kontrast (40X lang arbejdsafstand mål), mens GUVs overalt på den nederste halvdel af ledningerne kan ses med epifluorescens. Hvis der ikke GUVs er synlige, prøv dreje trådene til at se på den øvre overflade. GUVs kan opbevares ved 4 ° C i et vækstkammer i flere dage.
4. GUV Vækst af Gel-assisteret Hævelse
- Forbered 10 ml af en 1% agarose-opløsning ved at blande 100 mg af agarose med 10 ml rent vand. Varm det, indtil det koger ved at placere det i en mikrobølgeovn ved 480 W for ~ 20 sek. Rør for at sikre agarose er helt opløst.
BEMÆRK: Løsningenkan opbevares ved 4 ° C og genopvarmes når nødvendigt. - Plasma-clean (luft plasma) et cover-dias i 1 min, så agaroseopløsning vil sprede pænt på det. Brug cover-slides inden for de næste 15 min, da effekten af plasma rengøring aftager hurtigt.
- Påfør 200 pi varm agaroseopløsning på hver 22 x 22 mm 2 slide så løsningen væder hele overfladen. Vip dias lodret og berøre den nederste kant til et væv for at fjerne overskydende væske og lad blot et tyndt glat lag af agarose på objektglasset.
- Placer dias på en varm plade eller ovn ved 60 ° C, og lad det tørre i mindst 30 min. Den agarose film er næppe synlig med det blotte øje. Efter dias afkøle til stuetemperatur, så brug dem med det samme, eller gemme dem i op til en uge i en lukket beholder ved 4 ° C.
- Placer agarose-coatede dækglas i en standard 3,5 cm petriskål.
- Forbered SUV løsning som i afsnit 3.2 og anvende ~ 15 ul af SUV-opløsning (3 mg / ml lipid) i~ 30 meget små dråber forsigtigt på agarose overflade. Pas på ikke at fordreje den agarose lag for meget.
- Placér under en blid nitrogenstrøm i ca. 10-15 minutter, og følg afdampning af buffer ved øjet som dråberne tørre.
- Så snart SUV'er er tørret, tilsættes vækst buffer til at dække glideflade. For en lille 3,5 cm petriskål brug ~ 1 ml buffer.
- Tillad ekspandering til at fortsætte i ~ 30 minutter og derefter undersøge væksten af GUVs i kammeret under anvendelse af et omvendt mikroskop med fasekontrast eller differentiel interferens kontrast (DIC).
BEMÆRK: epifluorescens observation er vanskelig på grund af stærk baggrund af fluoroforer i gelen og autofluorescens af agarosen.
5. Høst og observere GUVs
- Passivere observationskammeret (f.eks lille petriskål eller dækglas), så GUVs ikke klæber, spredes og brast i kammeret bunden. Dæk chamber bund med beta-casein opløsning inkuberes i 5 minutter, skylles kasein opløsningen med rent vand, tør med en strøm af luft eller nitrogen, og endelig tilsættes observation puffer (f.eks ~ 5 mm dybde for en lille petriskål).
- Høste GUVs. Skær enden af en 100 pi pipettespidser, så åbningen er større (~ 2 mm diameter), og stræber langsomt som forskydningsspændingen af pipettering kan let ødelægge GUVs.
- For elektro-formet GUVs Åbn kammeret vækst ved forsigtigt at fjerne det øverste dækglas. Placér pipettespidsen direkte over hver ledning og aspirer ~ 50 pi mens du flytter pipettespidsen langs wiren at afmontere GUVs.
BEMÆRK: Det kan hjælpe til at rotere tråden at indsamle GUVs på "den anden side" af tråden. - For "gel-assisteret hævelse" GUVs, først trykke på siden af petriskålen et par gange for at hjælpe GUVs løsnes fra dækglasset overflade. Placer pipettespidsen lige over dækglasset og aspirer 50 pi mens pulling spidsen tilbage over overfladen. Direkte overføre høstet GUVs til en observation kammer, eller butik i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved 4 ° C i op til 1 uge.
- For elektro-formet GUVs Åbn kammeret vækst ved forsigtigt at fjerne det øverste dækglas. Placér pipettespidsen direkte over hver ledning og aspirer ~ 50 pi mens du flytter pipettespidsen langs wiren at afmontere GUVs.
- Placer observationskammeret på et omvendt mikroskop, tilsæt GUVs til observationslisten kammer, og vent et par minutter for GUVs til afvikling på kammeret nederst.
- Opmål kammeret med fasekontrast eller DIC til hurtigt at finde glatte, sfæriske ('defekt frie ")" GUV kandidater ". Undersøg hver "GUV kandidat" i epifluorescens at udelukke eventuelle indeholder mindre liposomer indlejret i. Endelig kontrollere, at lipid fluorescensintensitet er ensartet og kompatibel med en enkelt membran (dvs. unilamellare).
BEMÆRK: I nogle bilamellar (eller flere lamellare) vesikler, membranerne er for tæt sammen for at blive løst, så de vises unilamellære i fase kontrast eller DIC billeder. Dog kan skelnes disse objekter fra egentlig unilameLlar GUVs ved deres lipid fluorescens, som er to gange (eller mere) lysere.
6. Patch-fastspænding GUVs
- Gør patch pipetter med et 1-2 um spids diameter fra standard borosilikat kapillær glas ved hjælp af programmet anbefales til pipette aftrækker.
BEMÆRK: Særlige behandlinger såsom brand polering er ikke nødvendig, og pipetter kan anvendes til flere dage efter at de er trukket, hvis de opbevares i en lukket kasse. - Passivere kammeret ved inkubering med en beta-casein-opløsning (5 mg / ml) for at sikre, at GUVs ikke overholder, spredning og brud på kammerets flader. Skyl kasein ud efter 5 min.
- Sæt jordelektroden, fylde kammeret med observation buffer, overføres 10 ul af GUV suspension som beskrevet i trin 5.2 og 5.3, og vent et par minutter for GUVs at bosætte i bunden.
- Fyld en frisk patch pipette med opløsning (observation buffer eller anden iso-osmotisk opløsning) ogmontere den på plasteret-clamp forstærker hovedtrin.
- Søg gennem kammeret for at finde en "fejlfri" GUV som beskrevet i afsnit 5.4, og kontrollér, at den indeholder fluorescerende protein.
- Påfør et konstant overtryk (> 100 Pa eller ca. 1 cm H2O i et manometer) for at holde plasteret pipette interiør ren, og sæt plasteret pipette ind i kammeret. Bring patch pipette ind i synsfeltet, gælder Testimpulser måle / kompensere pipetten spænding offset og modstand, og undersøge pipetten under fluorescerende belysning for at bekræfte, at spidsen er ren.
- Bring patch pipette mod GUV, og om nødvendigt, samtidigt at reducere det positive tryk, så den udadgående strømning fra patch pipette gør ikke GUV "løbe væk". Når patch-pipetten er tæt på GUV anvende et negativt tryk (op til 5 cm H2O) at trække GUV mod plasteret pipette. Overvåg modstand som "; Tunge "af GUV membran ind i patch pipette og gigaseal former.
- Hvis en gigaseal ikke dannes, fjernes patch pipette fra kammeret og vende tilbage til trin 6.4. Hvis membranen plaster dannede en gigaseal, men GUV stadig er forbundet med pipette, punktafgifter plasteret ved at trække væk fra GUV, sprængfyldt af GUV mod kammerets bund, eller kortvarigt flytter pipetten ud af opløsningen.
- Når inside-out membran patch er blevet udskåret fra GUV og gigaseal er stabil, slukke testimpulserne og anvende en spænding protokol som den er vist i figur 13.
BEMÆRK: Figur 13 følger den standard elektrofysiologiske overenskomst til en inside-out patch, hvor strøm, der går ind i patch-elektrode er "positiv", og V = V bath - V pipette. Hold plasteret på et negativt potentiale (f.eks V = -100 mV) for ~ 30 sek steder KvAP i hviletilstand, mens trin (100 ms til 5 sek) til mere positive potentialer (fx kan V = 100 mV) og derefter køre det ind i ledende (dvs. åbne) aktive stater. - Efter målinger på en membran patch er færdig, bryde plaster med en zap eller tryk puls og kontrollere, at spændingen opvejes af plasteret elektroden ikke er drevet. Fjern patch pipette fra kammeret, og vende tilbage til trin 6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Væksten af GUVs hurtigt kan vurderes ved at undersøge kammeret vækst under mikroskopet. For electroformation de GUVs tendens til at vokse i bundter langs platintråde, som vist i figur 4. Under gel-assisteret hævelse, GUVs vises som sfæriske strukturer, der hurtigt vokser og smelter sammen (figur 5).
Fejlfri GUVs lettere identificeres og evalueres efter overførsel til en observation kammer. Kalibreringsmålinger er nødvendige for strengt vurdere GUV kvalitet, og en systematisk kvantificering er blevet offentliggjort tidligere 28. Men som en empirisk vejledning, "gode" GUVs skal isoleres (dvs. ikke i en klynge), har et enkelt, glat, kugleformet ydre membran, indeholder ingen genstande (dvs. rør, indlejret vesikler etc.) inde, og har den "standard" lipid fluorescens niveau (lysere objekter er typisk bi- eller multi-lamellar). Figur 6 viser DIC og epifluorescens billeder af en "fejlfri" GUV efter overførsel til en iso-osmotisk glucoseopløsning. Kontrasten i DIC skyldes forskellen i optisk densitet mellem saccharose fyldt GUV og glucose indeholdende badopløsning. Brydningsindekset kontrast KvAP-holdige GUVs ofte falder med tiden, selvom KvAP selv ikke skal være permeabel for saccharose eller glucose. Den ensartede protein fluorescens i GUV membranen bekræfter, at KvAP er indarbejdet i GUV (dvs., det ikke forblive i lipid film), og har ikke dannet micron skala (eller større) aggregater.
7, 8 og 9 viser konfokale billeder af lipid og protein fluorescens fra GUVs produceret af det nederste salt electroformation protokol, fysiologisk salt electroformation protokol, og gel-assisteret hævelse protokol. Den fluorescerende lipid (magenta) og protein(Grøn) signaler er blevet skaleret til samme gennemsnitlige intensitet, så GUVs med et lavt / højt antal proteiner per arealenhed (protein tæthed) har en magenta / grøn nuance i overlay billeder (højre kolonne), mens GUVs med en gennemsnitlige protein tæthed er hvide. Isolerede, fejlfri GUVs blev identificeret og GUV størrelsesfordeling er vist i figur 10. Typisk electroformation producerer mere fejlfri GUVs end gel-assisteret hævelse, men de GUVs produceret af electroformation er mindre. Figur 11 viser protein tæthed fordeling udledes fra fluorescensen af GUVs. Electroformation med høj-salt buffer producerer GUVs hvor proteinet tæthed varierer meget fra GUV til guv. Proteinet tæthed af individuelle GUVs varierer meget mindre for electroformation med lav salt buffer, mens proteinet densitet GUVs fremstillet ved gel-assisteret hævelse er bemærkelsesværdigt ensartet.
Plasteret-clamp teknik er en udbredt brugd metode til undersøgelse af funktionen i de spændingsafhængige ionkanaler, såsom KvAP. I "inside-out" optagelser, er et rent glas "patch" pipette anvendes til at udskære et stykke membran fra en GUV. En elektrode inde i patch pipette anvendes derefter til at anvende spænding, og måle den resulterende strøm gennem membranen patch. Sammensætningen af membranen plaster kan afvige meget fra resten af cellen / GUV 31, men "inside-out" konfiguration er stadig meget nyttig til måling af den indre kanal konduktans ioniske selektivitet, og spændingsafhængig gating. Disse tre egenskaber er en glimrende måde at fastslå, at strømme ikke skyldes artefakter (f.eks gigaseal spørgsmål) eller kontaminanter (f.eks bakterielle poriner fra rensning), og der er funktionelle KvAP kanaler i GUVs.
Kanal konduktans er lettest måles i pletter med kun en eller to aktive kanaler. I EXAmple vist i figur 12, er der ikke kanalåbninger observeret når membranen holdes på -100 mV, mens på +100 mV, individuelle kanalåbninger klart kan løses. Den nuværende histogram viser to toppe svarende til den lukkede og åbne tilstande, og udstyres med en dobbelt Gauss-funktion giver en enkelt kanal strøm på 10,9 ± 0,85 pA, svarende til en ledningsevne på 109,2 ± 8,5 pS (i 100 mM KCI). Bemærk, at den enkelt kanal ledningsevne afhænger af opløsningen (især koncentration kalium) og membransammensætning 32,33.
Ligesom mange andre K-kanaler, individuel KvAP kanaler udviser "snakkende" byger af hurtige åbninger og lukninger. Som påvist tidligere kan kalium selektivitet testes ved hjælp af en anden løsning i patch pipette (fx patch pipette opløsning 90 mM NaCl, 10 mM KCI) 28.
Spændingsafhængige gating er ofte studied i pletter med flere kanaler, således at lettere opnå et ensemble gennemsnit. Mens der ikke er nogen indlysende mekanisme begunstige den fysiologiske (intracellulære domæne på GUV indvendig) og omvendt (intra-cellulære domæne på GUV udvendigt) indsættelse af KvAP i GUVs, i "inside-out" membran patches de fleste funktionelle kanaler har " fysiologisk "insertion 28. Figur 13 viser responset af en membran plaster indeholdende flere (> 10) kanaler til en række 5-sekunders depolariserende trin. Mellem hvert trin, er plasteret holdes på -100 mV i 30 sek for at tillade kanaler med "fysiologisk" insertion at vende tilbage til deres hvilende tilstand. Når potentialet er tilstrækkeligt negativt (fx V <-60 mV) de fleste af de nuværende skyldes gigaseal læk, og lejlighedsvis åbninger af en eller to kanaler, som vil kunne få den "omvendte" indsættelse. For trin til mere positiv potentials er et stigende antal kanaler, overholdes, indtil der er så mange, at de enkelte åbninger og lukninger ikke længere kan løses. Således åbne sandsynlighed af kanalen er klart spændingsafhængig. Kinetik KvAP aktivering og inaktivering varierer betydeligt mellem sort lipidmembraner (BLMs) 26 og GUVs, men dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter, at Kv kanal gating kan være følsomme over for komposition membranen og stat 34.
Figur 1. GUV Electroformation Skematisk:. Droplets indeholder SUV'er afsættes på en elektrode delvis dehydrering af opløsningen forårsager SUV'er til at smelte til dannelse af en stabel af membraner. Buffer tilsættes derpå, og en AC elektrisk felt påføres. Da filmen svulmer, individuelle membraner løsnes fra stakken til at danne GUVs. (Dette tal er blevet Mod ceret fra Aimon et al. 28)
Figur 2. GUV Electroformation salen. Kammeret er fræset ud af en PTFE-blok med tre brønde (10 mm diameter, 5 mm dybde). To 0,5 mm diameter platintråde er adskilt af 3 mm (kant-til-kant afstand) og er placeret tæt på bunden af kammeret for at lette billeddannelse af ledningerne. Bunden og toppen dækglas holdes på plads med vakuum fedt, og forsegling pasta forhindrer eventuelle lækager fra tråden huller på siden. AC generator er forbundet med krokodillenæb til ledningerne. Kammeret er baseret på et udviklet af Ernesto Ambroggio og Luis Bagatolli. (Dette tal er blevet ændret fra Aimon et al. 28)
"/>
Figur 3. Gel-assisteret Spontan Hævelse Skematisk: Dråber, der indeholder en SUV suspension afsættes på en agarose gel som dråben dehydrerer, SUV'er fusionerer for at danne en lipidfilm.. Når der tilsættes buffer vækst filmen rehydrerer og GUVs dannes ved overfladen. GUVs vokse til en størrelse på ~ 10 um ved hævelse og fusionere med nabolandene GUVs.
Figur 4. Repræsentant billede af DPhPC GUVs indeholder KvAP vokser på platintråden i en høj salt buffer. De GUVs ligne klaser af druer langs tråden. Fase kontrast billede ved hjælp af en 40X LWD mål. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. DPhPC GUVs indeholdende KvAP hævelse på agarosegel. De GUVs er synlige som svage kugler med en diameter på ~ 10 um. De mørke / lyse pletter er lipid / agarose aggregater hvorfra vesiklerne svulme. Fase kontrast billede med 40X LWD målsætning. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Billeder af en fejlfri GUV. (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 efter vægt) indeholder KvAP mærket med Alexa-488 venstre: DIC, højre: Alexa-488 epifluorescens. Excitation: 470/50 nm, emission: 545/75 nm. Bemærk den ensartede fluorescens fra KvAP med ingen synlige aggregater. 81fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Konfokale billeder af lipid (magenta) og protein (grøn) fluorescens fra elektroformet GUVs dyrket i en lav salt buffer (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 efter vægt) (A) Den hvide pile markerer (sandsynligvis). GUVs, mens den røde pil markerer en potentielt bi-lamelformet vesikel med højere lipid fluorescens. Bemærk, at fluorescensintensiteten er lysere i midten af billedet på grund af den ekstremt stort synsfelt. (B) Zoom viser en lille gruppe af GUVs. Venstre (magenta): TexasRed-DHPE excitation: 543 nm laser linje, emission: 605/70 nm. Center (grøn): KvAP mærket med Alexa-488 excitation: 488 nm laser linje, emission: 515/30 nm. Til højre: overlay.OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 8. Konfokale billeder af lipid (magenta) og protein (grøn) fluorescens fra elektroformet GUVs dyrket i fysiologisk saltkoncentration (Egg-PC: Egg-PA 9: 1 efter vægt). (A) De GUVs (hvide pile viser sandsynligvis unilamellær eksempler) er mere sparsomt i forhold til den lave salt-protokollen og kan have meget forskellige proteinkoncentrationer (rød pil). (B) Zoom viser en lille gruppe af GUVs. Venstre (magenta): TexasRed-DHPE excitation: 543 nm laser linje, emission: 605/70 nm midten (grøn): KvAP mærket med Alexa-488 excitation: 488 nm laser linje, emission: 515/30 nm. Til højre:. Overlay venligst cslikke her for et større version af dette tal.
Figur 9. Konfokal billede af lipid (magenta) og protein (grøn) fluorescens af GUVs (DPhPC) dannet ved gel-assisteret hævelse med en fysiologisk saltkoncentration buffer. GUVs viser en mere homogen protein densitet end elektroformet GUVs fremstillet med fysiologisk puffer. Venstre (magenta): BPTR-Cer 0,1% excitation: 543 nm laser linje, emission: 605/70 nm. Middle (grøn): KvAP mærket med Alexa-488 excitation: 488 nm laser linje, emission: 515/30 nm. Til højre:. Fletningen af de to kanaler Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 11. GUV protein tæthed histogrammer: Proteinet densitet (antal proteiner per arealenhed) af GUVs elektroformede med lav salt buffer (5 mM KCl, DPhPC) varierer mindre end med koncentration fysiologisk salt (100 mM KCl, Egg-PC: Egg -PA 9:. 1 efter vægt) Proteinet tæthed GUVs (DPhPC) vokset med gel-assisteret hævelse i fysiologisk salt buffer viser mindst variation. Protein tæthed er proportional med KvAP-A488 fluorescens til disse koncentrationer 28 intensitet, og i hvert histogram fluorescensintensiteterne normaliseres ved middelværdien af fordelingen. (Den midterste panel er blevet ændretfra Aimon et al. 28)
Figur 12. Enkelt kanal aktivitet GUV Membrane Patches (DPhPC 'inside-out "spænding konvention). Den GUV blev dyrket i 100 mM KCI, 5 mM HEPES pH 7,4 på platin ledninger. Enkelte kanaler åbne efter anvendelse 100 mV potentiale på plasteret. Til højre for den indsatte er et histogram anvendes til beregning af enkelt kanal ledningsevne. Den røde linje er en tilpasning til en dobbelt Gauss-funktion med maksima ved 4,70 ± 0,27 pa og 15.62 ± 0,58 pA, svarende til en ledningsevne på 109,2 ± 8,5 pS. Sporet blev filtreret ved 10 kHz med en 4-polet Bessel-filter og registreres ved 50 kHz.
Figur 13. Spænding-dependen t gating kanaler i membranen patch fra en GUV dannet på agarose i en høj salt buffer (DPhPC, "inside-out" spænding konvention). (A) Reaktion af patch membran strøm til en forbigående skridt i spænding. Pipette og bad løsninger både indeholdt 100 mM KCI, og membranen blev holdt i 30 sekunder ved -100 mV mellem successive spænding trin. På en nøje undersøgelse kan man se, at spor indeholder 1 eller 2 kanaler, der synes at åbne med negative spændinger. Indsat a) viser en zoom på den forsinkede åbning og indsat b) den forsinkede lukning af kanalen. Strømme blev filtreret med en 4-polet Bessel-filter på 10 kHz og registreres på 51,3 kHz. Offline spor blev ned-samplet til 513 Hz. Den negative kapacitans forbigående afskæres på -150 pA. (B) Gennemsnitlig strøm (0,25 sek <t <5 sek) versus trin spænding. Strømme ved positive spændinger større, fordi den kanal åben sandsynlighed er spænding afhængige.Iles / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biomimetiske modelsystemer er et vigtigt redskab til at studere de egenskaber og interaktioner af proteiner og membraner. Sammenlignet med andre rekonstituerede systemer som BLMs eller støttet lipidmembraner, GUV baserede systemer til stede flere muligheder, herunder en betydelig kontrol over membranens sammensætning, spænding og geometri, samt blive virkelig oliefri. Men inkorporering transmembrane proteiner, såsom KvAP, i GUVs kræver betydelige tilpasninger af konventionelle protokoller for lipid kun GUVs. Den electroformation protokol præsenteres her er tidligere karakteriseret og anvendt til at studere de biofysiske principper for membranprotein distribution og dynamik i buede membraner 2,4,35. Dette arbejde viser en ny gel-assisteret hævelse protokol, hvilket bidrager til det sæt af metoder til protein rekonstituering i GUVs. Begge protokoller kan producere fejlfri GUVs indeholdende høje tætheder af KvAP, og målinger på inside-out patches bekræfter, atSE GUVs indeholde funktionelle kaliumholdige selektive, spændingsafhængige kanaler.
De to tilgange har forskellige styrker og svagheder. Hvornår kan bruges lave saltbetingelser, electroformation tilbyder et godt kompromis mellem GUV udbytte og ensartet protein tæthed. Electroformation stadig giver rimelige udbytter med fysiologiske saltkoncentrationer, men proteinet tæthed kan variere meget mellem GUVs (se figur 8 og 11). Tætheden variationer synes at være knyttet til varigheden af electroformation, så lav-salt buffer vækst kan også have betydelige tæthedsvariationer hvis væksten fortsætter meget længere end 2 timer. I modsætning hertil GUVs fremstillet ved gel-assisteret hævelse har et bemærkelsesværdigt ensartet protein tæthed, selv for fysiologiske buffere. Men den del af multi-lamellare vesikler er større, og agarose auto-fluorescens komplicerer kvantificering af lav protein tætheder 16. Brug polyvinylalkohol i place af agarose er blevet rapporteret at forbedre gel-assisteret GUV udbytte, når lipider blev deponeret fra chloroform 20, men vi var ikke i stand til at producere GUVs hjælp af polyvinylalkohol med SUV-løsninger. Hvis et lavere udbytte af fejlfri GUVs er acceptabel, gel-assisteret hævelse har en klar fordel for eksperimenter, der kræver en ensartet protein distribution.
Electroformation og gel-assisteret hævelse har også helt andre krav til udstyr. Gel-assisteret hævelse protokollen bruger lidt specialudstyr bortset fra plasma renere, hvilket er ikke afgørende, da der er mange alternative metoder til at producere ren, hydrofil glas. I modsætning hertil electroformation kræver en brugerdefineret kammer med trådelektroder. Platin tråd er dyrt, men for denne protokol GUVs voksede lettere med platin end titanium ledninger, og GUVs ikke vokser på ITO slides ved brug af fysiologiske saltkoncentrationer. Diameteren af elektroderne (0,5 mm) er en kompressorOmiše mellem elektrodeoverflade og pris. Det er vist i figur 2 kammer er baseret på et design af Luis Bagatolli 15 og Ernesto Ambroggio, og blev fremstillet af polytetrafluorethylen (PTFE), at rengøringen med de fleste opløsningsmidler. Imidlertid bør polyacetal eller polyvinylchlorid (PVC) også fungerer godt. Evnen til at fjerne platin ledningerne for aggressiv rengøring er vigtig, og når først lære protokollen, er det meget nyttigt at kunne observere GUV vækst in situ gennem bunddækslet dias. De mindre, lukkede brønde forhindre løsning fra skvulpende bagud og fremad og også tillade test af flere lipidsammensætninger i parallel. Men er ikke afgørende en speciel brugerdefineret kammer, når du starter ud. For eksempel kan simple single-brønds kamre blive improviseret ved krydse to ledninger ned til bunden af en lille petriskål eller ved hjælp af lak til sandwich dem mellem to glasplader, eller blot stikke dem gennem hætten af en lille hætteglas.
Både electroformation og gel-assisteret hævelse protokoller skal producere et tilstrækkeligt antal fejlfri GUVs til mikro-manipulation og patch-clamp-forsøg. Men GUV afkast afhænger følsomt på dannelsen af dobbeltlaget stakken, når SUV løsning er delvis dehydreret. Hvis der opstår vanskeligheder med voksende GUVs (dvs. ingen eller få GUVs er synlige i kammeret vækst), kan det være meget nyttigt til at vokse lipid kun GUVs hjælp af en lipid / chloroform opløsning i stedet for SUV'er 15,16 (og en lav salt buffer). Hvis GUVs ikke vokser godt fra en lipid / chloroform film så noget fundamentalt galt (f.eks forkerte lipid løsninger eller buffere, fedt eller snavs på elektroderne, forkert spænding eller frekvens, etc.). Hvis GUVs vokse fra lipid / chloroform film men ikke de SUV-film, så er problemet er dog sandsynligt, at den delvis dehydrering.
Den delvise dehydrering trin erlettest optimeret ved hjælp af lipid-kun SUV'er fordi der ikke er nogen risiko for "denaturerende" lipider ved overdreven dehydrering. For electroformation, kan det være nyttigt at undersøge ledningerne efter SUV dråber har fået lov til at tørre for at kontrollere, at der er lys lipid fluorescens ved hvert sted, hvor en dråbe blev deponeret. Hvis lipid fluorescens forsvinder efter kammeret er fyldt med en vækst opløsning, derefter enten væksten løsning tilføjes mere omhyggeligt, eller SUV'er nødvendigt at dehydrere længere så filmen lægger mere fast til tråden. Under væksten, skal du sørge for hverken ledninger eller løsning flytte i kammeret (fx når de lægger kammeret på mikroskopet) for at undgå stripning GUVs fra ledningerne. Når GUVs vokser godt, de er som regel let at se i fase kontrast billeder. Men mindre GUVs ofte tydeligere ved hjælp af lipid fluorescens, som også er nyttige for at se, hvordan membranen stakken er ændret i vækst. Undersøg alle overfladerledningerne (indeni, udenfor, top og bund) i alle brønde samt kammeret gulvet før de kasserer væksten, fordi renterne kan variere betydeligt fra sted til et andet.
Håndtering og opbevaring af GUVs er enkel sammenlignet med celler, men GUVs er ganske følsomme over for osmotisk stress, forskydningskræfter og vedhæftning. Glat, blide bevægelser er vigtige, når høst eller overførsel GUVs, og det er vigtigt at passivere overflader for at forhindre GUVs i at klæbe og eksploderer. Men for patch clamp-forsøg kammeret skal skylles grundigt efter passivering så passivering løsning ikke kan overtrække patch pipetter og forhindre gigaseal formation. Til passivering, beta-casein behandling er enkel og effektiv, og sammenlignet med bovint serumalbumin, der har et lipid transport funktion, har mere begrænsede interaktioner med lipiddobbeltlag og bør foretrækkes når der arbejdes med GUVs 36 beta-casein. Ved at variere inkubationstiden, er detmuligt at få GUVs at overholde uden at eksplodere. Dog vil de GUVs ikke klæbe til dækning slide så meget som celler, og så pleje skal stadig tages under enhver procedure, der kan fremkalde flow i kammeret (fx buffer perfusion, flytte kammeret).
Patch-clamp optagelse er en klassisk metode til at studere spændingsstyrede ionkanaler som KvAP og denne protokol er afledt af standardteknikker til opnåelse af "inside-out" patches fra adhærente celler. En standard patch-clamp set-up, hvor plasteret pipette ned skråt (f.eks 30-60 grader fra vandret) i en lille petriskål bør arbejde godt. Imidlertid kan klarere billeder af patch-pipetten og gigaseal region opnås ved anvendelse af et kammer, hvori cover-glider danner kammeret top og bund (~ 1 mm adskillelse), så patch-pipetten kan indtaste horisontalt fra siden. Fordi store patch pipette pres ikke er nødvendige, kan trykket hensigtsmæssigt være controlled med en sprøjte og overvåges med en hvilken som helst enkel trykmåler (f.eks improviseret vand manometer). Det kan være nyttigt først praksis patch clamp-forsøg med lipid kun GUVs dyrket under anvendelse af et lipid / chloroformopløsning og lav-salt buffer. Da udbyttet af fejlfri GUVs er meget høj, vil der være masser af perfekte GUVs at arbejde med, selv om mange er ødelagt under høst og overførsel til den eksperimentelle kammer.
Med lidt øvelse, kan udskårne membran patches med stabile gigaseals let opnås fra DPhPC GUVs og KvAP-DPhPC GUVs. For at opnå en høj succesrate, hjælper det at omhyggeligt vælge runde, men lidt-fluktuerende, fejlfri GUVs og kontrollér, at patch pipetten er ren (søger lipider i fluorescens), før du forsøger at danne gigaseal. Når en membran "tunge" ind i patch pipette, det gigaseal danner typisk hurtigt (<1 sek) uden behov for en stærk sugning eller specic bedrift spænding. Mens en dårlig forsegling kan forbedre som membranen kravler længere ind i patch pipette, ofte forseglingen forbliver fattige, fordi pipetten interiør var forurenet, og det er nødvendigt at starte forfra med en frisk patch pipette og GUV. DPhPC formularer meget stabile membran patches (ti minutter) med en fremragende forsegling modstand selv ved høje spændinger (f.eks ± 150 mV). SOPC: cholesterol (3: 1 mol) kan også danne meget stabile patches, men kan kræve højere sugning at forsegle, mens Egg-PC patches synes at bryde lettere.
For længere patch-clamp sessioner kan det være nødvendigt at justere osmolariteten af kammeret opløsning. Hvis osmolariteten er for meget lavere end den buffer GUV vækst, GUVs bliver hævede, anspændt og sfæriske og det er måske ikke muligt at aspirere GUV membran langt nok ind i patch pipette til at danne en gigaseal. Dette kan ofte fastsættes ved blot at vente 10 eller 20 minutter, da fordampning fra kammeret øger external løsning osmolaritet indtil GUVs punktere og begynder at svinge. Omvendt, hvis kammeret er åben for længe osmolariteten af den eksterne løsning kan stige indtil GUVs punktere, tubulate og opløbet. Dette kan undgås ved at blokere fordampning fra kammeret (f.eks, med mineralolie) eller periodisk tilsætning af destilleret vand til at erstatte det vand, der er fordampet.
Fordi proteiner kan udelukkes fra udskårne membran patches 31, er antallet af aktive kanaler i en udskåret patch ikke bare relateret til densiteten af proteinet i GUV membranen. Fluorescensmålinger tyder koncentrationen af KvAP i plasteret membranen er meget lavere end GUV 28 og det kan være ganske let at opnå plastre indeholdende kun et lille antal af kanaler. Men hvis plastre indeholder for mange kanaler til enkelt kanal optagelse, de indlysende skridt at bruge patch pipetter med mindre tips og / eller sænke protein-til-lipid density i SUV mix er effektive. I modsætning til at udføre ensemble målinger på plastre indeholdende mange kanaler, kan det være nyttigt at starte med et relativt højt proteinindhold tæthed (f.eks 1:10, protein og lipid efter vægt), bruge protein fluorescens til at vælge GUVs med et højt proteinindhold densitet bruge større patch pipetter (f.eks 2 til 3 mikron tip diameter) opsuges hurtigt at forsøge at danne forseglingen hurtigt. Det er klart, ville det "hel-celle" -type konfiguration (dvs. "hele-GUV«) være ideelt at karakterisere alle kanalerne i en GUV, men desværre "hel-GUV" konfiguration udgør flere tekniske spørgsmål 37.
Løsningerne, lipider og protein koncentrationer i denne tutorial kun stilles som udgangspunkt, og kan ændres til at passe til behovene i en bestemt eksperiment efter et par overvejelser.
Alle opløsninger bør omfatte en pH-buffer såsom HEPESeller TRIS at sikre proteiner ikke udsættes for ekstreme pH. SUV buffer bør have så lav en koncentration af opløste stoffer som protein vil tolerere (f.eks, 5 mM salt eller lavere), som opløste koncentrationer øges under den delvise dehydrering trin og høje saltkoncentrationer kan denaturere proteinet eller forårsage lipidfilmen til hurtigt delaminere under rehydrering trin. Små mængder af sukkere såsom trehalose (f.eks 1 mm til 5 mm) menes at beskytte proteinet under dehydrering 23. Mens trehalose er blevet impliceret i anhydrobiosis og menes at beskytte membranen og proteiner mod udtørring 38 kan saccharose eller glucose arbejde lige så godt.
For buffer vækst saltkoncentrationen er især vigtigt, da dette vil påvirke parametrene for optimal vækst GUV (f.eks electroformation spænding, frekvens og varighed). I modsætning hertil den primære hindring for observation buffer er that, bør have samme osmolaritet som buffer vækst. Medtagelsen af saccharose og / eller glucose i "vækst buffer" og "observation buffer" kan være nyttigt for at sikre GUVs sediment på bunden af den observation kammer, mens en forskel i brydningsindeks mellem GUV indvendig og udvendig hjælper med fasekontrast eller DIC mikroskopi. Elektrofysiologer omfatter ofte calcium eller magnesium ioner til badet og / eller patch pipette løsninger til at forbedre gigaseal formation med cellemembraner, men disse synes ikke at være afgørende for GUVs. Faktisk kan divalente ioner, såsom magnesium og calcium inducerer lipid faseadskillelse og lette vedhæftning, så hvis der opstår disse problemer kan det være nyttigt at tilføje 1 mM EDTA.
Klart, at en vigtig attraktion af rekonstituerede systemer, når sammenlignet med celler er evnen til at kontrollere lipidsammensætning. DPhPC GUVs vokser godt og danner stabile udskårne membran patches, og disse protokoller har også arbejdet effectively for lipidblandinger indeholdende phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidinsyre (PA), phosphatidylserin (PS) og kolesterol. Men GUV vækst er følsom over for både lipidsammensætning og buffere 15 og så protokolparametre (fx mængden af lipid deponeres, electroformation spænding / frekvens), kan være nødvendigt at justere for lipidblandinger indeholdende høje koncentrationer af PE, ladede lipider (PG, PA, PS) eller cholesterol. Når du starter ud, Egg-PC, DOPC eller DPhPC er et godt første valg, og det er også meget nyttigt at inkludere en fluorescerende lipid at observere GUV vækst og til at skelne GUVs fra multilamellare vesikler med to eller flere dobbeltlag. Lipid blandinger kan fremstilles ved at kombinere SUV suspensioner af stamopløsninger, som lipiderne blandes under den delvise dehydrering trin (forudsat at temperaturen er højere end en individuel faseovergangstemperatur). Brug højere koncentration SUV (f.eks10 mg / ml) stamopløsninger tillader betydelig fleksibilitet, og disse kan derefter fortyndes til 3 mg / ml før dehydrering suspensionen.
Hvis du forsøger at tilpasse disse protokoller til andre trans-membran proteiner, er det meget vigtigt at være i stand til både direkte observere inkorporering af proteinet i GUVs og testproteinet funktion. Selvom det ikke er et problem med KvAP, er der altid mulighed for, at der under rehydrering trin det transeuropæiske membranprotein vil forblive i membranen stakken fører til dannelsen af lipid-kun GUVs. Fluorescerende mærkning af proteinet er meget praktisk, da det giver en hurtig og entydig måde at observere protein inkorporering i GUVs og også kontrollere for sammenlægning inden GUVs. Det er også meget vigtigt at teste proteinfunktion i GUVs at bekræfte, at protein ikke blev beskadiget under rekonstituering processen. For ionkanaler som KvAP kan patch-clamp målinger påvisning af funktionelle kanaler iGUVs. Men en fluorescens-mærket, høj affinitetsligand (f.eks toksin, substrat eller anti-organ) ville også være meget nyttigt til afprøvning af tilstanden af proteiner i GUVs.
Sammenfattende denne artikel viser, hvordan man producerer Proteo-GUVs indeholder spændingen gated kaliumkanal KvAP og karakterisere dem ved hjælp af fluorescens mikroskopi og elektrofysiologi. Forhåbentlig kan tilpasses disse metoder til nye klasser af membranproteiner og giver et fundament for mere komplekse in vitro systemer til at studere og opbygge levende materiale fra dens grundlæggende komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
