Summary
ويتجلى إعادة تشكيل البروتين الغشاء، KvAP، إلى الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) للطريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation، وبمساعدة هلام التورم. في كلتا الطريقتين، وتنصهر الحويصلات unilamellar صغيرة تحتوي على البروتين معا لتشكيل GUVs التي يمكن بعد ذلك دراستها من قبل المجهري مضان والتصحيح، المشبك الكهربية.
Abstract
عملاق Unilamellar الحويصلات (GUVs) هي نظام بيوميمتيك شعبية لدراسة الظواهر المرتبطة الغشاء. ومع ذلك، وتستخدم عادة بروتوكولات لتنمو يجب أن يتم تعديل GUVs من أجل تشكيل GUVs تحتوي على البروتينات عبر الغشاء وظيفية. توضح هذه المقالة طريقتين الجفاف-الإماهة - electroformation وبمساعدة هلام تورم - لتشكيل GUVs تحتوي على قناة البوتاسيوم الجهد بوابات، KvAP. في كلتا الطريقتين، وهو حل من الحويصلات التي تحتوي على البروتين unilamellar صغيرة هو المجففة جزئيا لتشكيل كومة من الأغشية، والتي يتم بعد ذلك يسمح للتضخم في منطقة عازلة الإماهة. للتعرف على طريقة electroformation، وتودع الفيلم على أقطاب البلاتين بحيث يمكن تطبيق حقل AC خلال فيلم الإماهة. في المقابل، يستخدم الأسلوب بمساعدة هلام تورم هلام الركيزة الاغاروز لتعزيز فيلم الإماهة. ويمكن لكل من طرق إنتاج GUVs في (على سبيل المثال، 100 ملم) تركيزات منخفضة (على سبيل المثال، 5 ملم) والفسيولوجية الملح. وتتميز GUVs الناتجة عن طريق المجهر مضان، وظيفة من القنوات أعيد قياسها باستخدام التكوين التصحيح، المشبك من الداخل إلى الخارج. في حين تورم في وجود حقل كهربائي متناوب (electroformation) يعطي عالية الغلة من GUVs خالية من العيوب، وتنتج طريقة بمساعدة هلام تورم توزيع البروتين أكثر تجانسا ويتطلب أي معدات خاصة.
Introduction
عند دراسة المبادئ الفيزيائية التي تحكم الأنظمة الحية، ونهج من أسفل إلى أعلى تسمح للالتجريبي للسيطرة على تكوين النظام وغيرها من المعالم التي لم يتم التلاعب بها بسهولة في النظم القائمة على خلية 1. للعمليات التي تعتمد على الأغشية، العملاق Unilamellar الحويصلات (GUVs، قطر ~ 1-100 ميكرون) وقد ثبت أن نظام بيوميمتيك مفيدة جدا 2-7 كما هي مناسبة تماما للدراسات الفحص المجهري والمجهرية 8-10. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات المختلفة لإنتاج GUVs، ومعظم تقع في فئتين - مستحلب أساس النهج 11،12 والتقنيات التي تعتمد على إعادة إماهة فيلم الدهون 13-16. في الأساليب المستندة إلى مستحلب، يتم تجميع النشرات الداخلية والخارجية من الأغشية GUV بالتتابع من الطبقات الوحيدة الدهون في واجهات المياه / النفط. هذا النهج هو المثالي لتغليف البروتينات القابلة للذوبان معفي GUVs، وتشكيل GUVs مع غير المتماثلة تكوين النشرة الدهون. ومع ذلك، يمكن GUVs تشكلت من المستحلبات تحتفظ آثار مذيب أن تغيير خصائص الغشاء والميكانيكية 17، والنهج ليس وخاصة مناسبة تماما لالعابرة للغشاء البروتين إعادة.
طرق معالجة الجفاف الفيلم تعتمد على حقيقة أن تجفيف (الجفاف) يسبب العديد من خليط الدهن لتشكيل كومة متعددة رقائقي من الأغشية. إذا ثم يتم وضع هذا المكدس في اتصال مع وجود مخزن مؤقت مائي، والأغشية في المكدس تتحرك التدفقات بصرف النظر المذيبات فيما بينها وعلى سطح المكدس، يمكن الأغشية الفردية فصل لتشكيل GUVs 13،18 (وكذلك حديقة حيوانات حقيقية ل الأجسام شحمي أخرى). ومع ذلك، حتى بالنسبة المثلى العازلة والدهون التراكيب، وهذا "تورم عفوية" الكلاسيكية الأسلوب لديه العائد المنخفض نسبيا من GUVs خالية من العيوب. واحد الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لزيادة العائد من GUVs خالية من العيوب هو "electroformation221 ؛، التي يتم تطبيق (AC) الحقل التيار المتردد خلال فيلم الإماهة. في حين لا تزال الآلية غير مفهومة، "electroformation" يمكن أن تعطي عوائد GUV مذهلة (> 90٪ في الظروف مواتية) لمخازن تركيز الملح منخفضة (<5 ملم) 14،19، ويمكن أن تعمل حتى في مخازن الفسيولوجية (~ 100 ملم) باستخدام تردد أعلى (500 هرتز مقابل 10 هرتز) AC المجال وأقطاب البلاتين 15. نهج بديل لزيادة العائد من GUVs خالية من العيوب هو "بمساعدة هلام تورم"، الذي وتودع الحل الدهون على هلام الركيزة البوليمرية بدلا من السلبي (على سبيل المثال، والزجاج، PTFE) ركائز المستخدمة في الكلاسيكية "تورم العفوي ". عندما يتم ممهى الناتجة الفيلم الدهون / هلام، يمكن GUVs تشكل بسرعة حتى لمخازن الفسيولوجية 16،20.
ويمكن لجميع هذه الأساليب تنتج GUVs-الدهون الوحيد الذي يمكن استخدامه لدراسة غشاء المرتبطة الظواهر مثلالتفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان والأغشية. ومع ذلك، لإدراج البروتين العابر للغشاء في GUVs، هناك حاجة إلى تعديلات كبيرة لضمان أن البروتين لا يزال في حالة وظيفية في جميع أنحاء الإجراء إعادة. في حين حلول الدهون في المذيبات العضوية (على سبيل المثال، والكلوروفورم، الهكسان الحلقي) مثالية لإنتاج الأفلام الدهون والبروتينات عبر الغشاء وعادة ما تكون مستقرة فقط عندما يتم تضمين مسعور المجال الخاص بها عبر الغشاء في طبقة ثنائية الدهون، أو محاطة مذيلة المنظفات ( على سبيل المثال، خلال تنقية البروتين). وهكذا، فإن المواد بدءا من أجل إعادة هي عادة الأغشية الأم، البروتين النقي في حل المنظفات، أو الحويصلات التي تحتوي على البروتين unilamellar صغيرة (PROTEO-سيارات الدفع الرباعي) و / أو حويصلات متعددة رقائقي (PROTEO-MLVs) التي شكلتها إزالة المنظفات في وجود الدهون. معظم طرق لدمج هذه البروتينات الغشاء إلى GUVs تقع في ثلاث فئات.
مغرز مباشرةن: يتم خلط عبر غشاء البروتين معلقة في المنظفات مع، الدهون فقط، GUVs تذوب المنظفات أقل ما يقال شكلت مسبقا، والمنظفات ثم إزالة باستخدام biobeads 21. في حين بسيطة من الناحية المفاهيمية، يتطلب هذا الأسلوب مراقبة دقيقة من تركيز المنظفات، وتركيز عالية جدا المنظفات يمكن أن يحل GUVs في حين منخفضة جدا تركيز يمكن أن يسبب البروتين لتتكشف أو مجموع المباراتين.
يتم الجمع بين البروتين في PROTEO-سيارات الدفع الرباعي مع شكلت مسبقا، الدهون فقط GUVs ويتم تسهيل الاندماج مع الببتيدات fusogenic الخاصة 22 أو المنظفات 21: GUV / PROTEO-SUV فيوجن. وعادة ما مدى الانصهار ومحدودة يؤدي إلى GUVs مع انخفاض كثافة البروتين.
الجفاف / الإماهة: يتم تشكيل لفيلم الدهون التي تحتوي على البروتين بسبب الجفاف الجزئي لPROTEO-SUV (أو PROTEO-MLV) حل وGUVs يتم بعد ذلك نمت كما لفيلم الدهن النقي. التحدي الواضح هو حماية البروتين خلال dehydrati جزئيعلى الخطوة 23، ولكن الأسلوب وقد استخدم بنجاح لإعادة البروتينات العابرة للغشاء مثل رودوبسين جرثومي، الكالسيوم أتباز، إنتغرين وVDAC إلى GUVs 7،23 - 25.
توضح هذه المقالة بروتوكولات الجفاف / الإماهة لجعل GUVs تحتوي على قناة الجهد بوابات البوتاسيوم، KvAP، من فرط حرارة الأركيا، Aeropyrum pernix. KvAP لديه درجة عالية من التماثل إلى الجهد حقيقية النواة قنوات البوتاسيوم تعتمد 26 والتركيب البلوري المعروف 27 ، مما يجعلها نموذجا جيدا لدراسة آلية الجهد النابضة. وقد وصفت إنتاج PROTEO-سيارات الدفع الرباعي بالتفصيل سابقا وليس جزءا من هذا البرنامج التعليمي 26،28،29. الأهم من ذلك، KvAP PROTEO-سيارات الدفع الرباعي لا يجب أن يتم إنتاجها لكل إعداد GUV، لأنها يمكن خزنها في صغيرة (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر) aliquots في -80 ° C لفترات طويلة من الزمن (> 1 سنة). Electroformationأو بمساعدة هلام تورم ويمكن بعد ذلك أن تستخدم لزراعة GUVs من KvAP PROTEO-سيارات الدفع الرباعي (أو PROTEO-MLVs).
ويوضح الخطوات الرئيسية لبروتوكول electroformation في الشكل 1. تترسب قطرات من محلول سيارات الدفع الرباعي التي تحتوي على البروتين على أسلاك البلاتين (كما هو موضح في الشكل 2). الجفاف الجزئي للتعليق SUV يؤدي إلى تشكيل لفيلم البروتين الدهني من خلال مزيج من سيارات الدفع الرباعي. أثناء الإماهة، يتم تطبيق حقل AC إلى الأقطاب لمساعدة طبقات الدهون لdelaminate وتشكيل GUVs. حقل 10 هرتز يعمل بشكل جيد عند استخدام "قليل الملح" (<5 مم) الإماهة عازلة 28 و GUVs يستغرق عدة ساعات لتنمو. في المقابل، مخازن الفسيولوجية (التي تحتوي على ~ 100 ملم الملح) تعمل بشكل جيد مع الجهد أقل، 500 هرتز AC المجال ولكن تحتاج إلى فترات طويلة (~ 12 ساعة) مدة 15 التورم. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول سابق باستخدام الشرائح ITO 24، ولكن يستخدم تابع غرفة مخصصةaining اثنين من الأسلاك البلاتين كما هو مبين في الشكل 2 (انظر مناقشة للحصول على تفاصيل تصميم واقتراحات لبساطة وبدائية غرف).
ويوضح الشكل (3) طريقة تورم بمساعدة هلام. بروتوكول يعمل بشكل جيد مع مخازن مع تركيز الملح الفسيولوجية، سريع، وينتج GUVs مع توزيع البروتين أكثر تجانسا. ومع ذلك، فإن العائد من معزولة، GUVs المجانية عيب، على ما يبدو (أي الغشاء GUV موحد في موازين طول البصرية ولا أرفق أي كائنات) هو أقل من ذلك، على الرغم من أنها توفر عدد كاف لالتصحيح، المشبك والتجارب الصغيرة التلاعب . واستند هذا الأسلوب على البروتوكول باستخدام هلام الاغاروز لإنتاج الدهون الوحيد GUVs 16 ويتطلب معدات متخصصة أقل من الطريقة electroformation.
يوصف توصيف GUVs مع مضان المجهري، وكذلك الإجراءات باستخدام معيار التصحيح، المشبك مجموعة المتابعة لقياس النشاط KvAP في "الداخل إلى الخارج" رفعه بقع الغشاء.
يمكن المتزايدة GUVs التي تحتوي على البروتين أن يكون أكثر صعوبة من GUVs-الدهون الوحيد. على وجه الخصوص، يمكن أن العائد GUV النهائي يعتمد على بحساسية بالضبط كيف وتودع الحل SUV والمجففة لتشكيل كومة الغشاء. لشخص دون أي خبرة سابقة مع GUVs، قد يكون من المفيد أن ينمو أولا GUVs-الدهون الوحيد التالية بروتوكول التقليدي 15،16 في الذي يتكون الفيلم الغشاء عن طريق إيداع الدهون من المذيبات العضوية. وبمجرد أن البروتوكول التقليدي يعمل بشكل جيد، SUV ترسب والجفاف الجزئي ويمكن بعد ذلك أن يتقن استخدام سيارات الدفع الرباعي-الدهون فقط، التي هي أيضا مفيدة جدا عند ضبط بروتوكول لتكوين الدهون الجديد. عندما تنمو GUVs موثوق من سيارات الدفع الرباعي-الدهون فقط، وعندها فقط خطوة صغيرة لإنتاج GUVs التي تحتوي على البروتين من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحل
- إعداد 5 مل من "عازلة SUV" تحتوي على 5 ملي بوكل، 1 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو تريس (7.5 درجة الحموضة)، و 2 ملي طرهالوز. تصفية المخزن المؤقت مع فلتر حقنة 0.2 ميكرون وتقسيمها إلى 1 مل مأخوذة التي يمكن تخزينها في -20 ° C.
ملاحظة: يتم إعطاء تفاصيل إضافية للمواد والأدوات في قائمة المواد. - إعداد 40 مل من "الواق النمو" GUV التي سوف تملأ GUV الداخلية خلال فيلم الإماهة. لنمو "الملح المنخفض"، والجمع بين 5 ملي بوكل، 1 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو 1 ملم تريس (7.5 درجة الحموضة)، و~ 400 ملي السكروز. لنمو "الملح الفسيولوجي"، والجمع بين 100 ملي بوكل، 5 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو 5 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، و~ 200 ملي السكروز.
- إعداد 40 مل من "الواق مراقبة" من أجل حل خارجي في الغرفة التجريبية من خلال الجمع بين 100 ملي بوكل، 5 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة) أو 5 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، و~ 200 ملي الجلوكوز.
ملاحظة: هذه المخازن هي إكساء فقطmples. الاطلاع على المناقشات لتكييف مخازن للتجارب أخرى. - قياس osmolarities من النمو والمراقبة مخازن مع مقياس التناضح. إضافة حبيبات من السكروز أو الغلوكوز لمباراة لهم في حدود 1٪ بحيث GUVs لا ليز أو تنهار عند نقلها من غرفة النمو إلى غرفة المراقبة.
ملاحظة: في هذا النطاق التركيز، مضيفا 1 ملم من السكروز (13.7 ملغ لكل 40 مل) أو الجلوكوز (7.2 ملغ لكل 40 مل) يزيد الأسمولية التي كتبها ~ 1 الميلي أسمول. - تصفية النمو والمراقبة مخازن مع 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية لمنع نمو البكتيريا.
- حل 50 ملغ من البيتا الكازين في 10 مل من 20 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة) العازلة لتشكيل 5 ملغ / مل حل بيتا الكازين اللازمة لإيقاف فاعلية أسطح الغرف التجريبية بحيث GUVs لا عصا، تنتشر وتنفجر. مرة واحدة يتم حله تماما بيتا الكازين (تصل إلى عدة ساعات في 4 درجة مئوية)، ومرشح (0.2 ميكرون) أنه إلى 0.5 مل مأخوذة التي يمكن تجميدها وتخزينها فلاشفي -20 ° C لاستخدامها لاحقا (مأخوذة إذابة تخزينها في 4 ° C يمكن عادة أن تستخدم لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع).
2. إعداد SUV
- تحضير وتجميد aliquots من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي بعد بروتوكول مفصل نشرت سابقا 28. استخدام KvAP fluorescently المسمى مع اليكسا-488 maleimide، أعادت إلى DPhPC سيارات الدفع الرباعي (10 ملغ / مل) في البروتين إلى نسبة الدهون 1:10 (من الكتلة).
ملاحظة: من نوع البرية KvAP يحتوي على السيستين واحد لكل مونومر تقع بالقرب من داخل الخلوية C-محطة (الأحماض الأمينية 247). - الفلورسنت،-الدهن الوحيد سيارات الدفع الرباعي:
ملاحظة: التعامل مع الكلوروفورم تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات النتريل ونظارات السلامة. تجنب استخدام أي البلاستيكية والكلوروفورم يمكن حل لها. ويمكن تخزين حلول الكلوروفورم في قوارير الزجاج العنبر مع قبعات تفلون ونقل باستخدام المحاقن الزجاجية. الحرص على شطف جميع الأواني الزجاجية على الأقل من 5 إلى 10 مرات مع الكلوروفورم قبل وبعد pipetting لنسبة الدهون.- إعداد 100 ميكرولتر من10 سيارات الدفع الرباعي ملغ / مل DPhPC تحتوي على 0.5 مول٪ من الدهون أحمر فلوري، تكساس الأحمر DHPE، عن طريق خلط 100 ميكرولتر من حل DPhPC (10 ملغ / مل في الكلوروفورم) مع 8.2 ميكرولتر من حل تكساس الأحمر DHPE (1 ملغ / مل في الميثانول) في كوب 1.5 مل العنبر قنينة.
- تجفيف الدهون أسفل تحت سيل من النيتروجين في غطاء الكيميائية في حين تناوب القارورة. عندما يظهر الفيلم أن تكون جافة، ضع الدهون تحت فراغ لمدة 3 ساعة إلى إزالة أي المذيبات المتبقية.
- إضافة 100 ميكرولتر من العازلة SUV إلى الدهون، ودوامة بقوة حتى لا يبقى الدهون عالقة على جدران القارورة والحل هو موحد حليبي.
- يصوتن الحل الدهون لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. ضبط الموقف قارورة حتى يتسبب في الموجات فوق الصوتية في معظم الحركة والتدفق داخل القارورة، والحرص على عدم تسخين حل دون داع. مواصلة صوتنة حتى يصبح الحل شفاف، أو عندما يكون ذلك ممكنا، شفافة (2-5 دقيقة للطرف صوتنة، ~ 20 دقيقة للحمام صوتنة).
- أليكور سيارات الدفع الرباعي (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر أو 20 ميكرولتر) وتجميد (-20 ° C) لاستخدامها لاحقا.
ملاحظة: الدهون، وخاصة الدهون غير المشبعة، ويمكن بسهولة الانهيار. حلول تخزين الدهون عند 20 درجة مئوية (أو 80 درجة مئوية) تحت الأرجون وتستخدم في غضون 6 أشهر. ويمكن الكشف عن المنتجات انهيار الدهون مع اللوني طبقة رقيقة.
3. GUV النمو التي كتبها Electroformation
- إعداد غرفة electroformation.
- إذا لم يتم تنظيف الغرفة، وإزالة النوافذ، وتمحو كل تسرب والشحوم، واستخراج الأسلاك، وشطف وتنظيف الغرفة مع النسيج باستخدام الماء والإيثانول (≥70٪) بالتناوب.
- فرك الأسلاك جيدا، وغمر الأسلاك وغرفة في الأسيتون، ويصوتن لمدة 5 دقائق. مسح كل شيء بمنديل مرة أخرى باستخدام الأسيتون. وضع الغرفة في الإيثانول ويصوتن لمدة 5 دقائق.
- غرفة تجميع عن طريق إدراج الأسلاك من خلال الثقوب، وتدوير ومسح الأسلاك للتأكد من أنها عالبريد نظيفة. وضع الغرفة في الماء المقطر، يصوتن لمدة 5 دقائق وتجفيف الغرفة مع تيار من النيتروجين أو الهواء.
- إعداد 30 ميكرولتر من 3 ملغ / مل تعليق SUV في المخزن SUV. لتشكيل GUVs التي تحتوي على البروتين، والجمع بين 8 ميكرولتر من PROTEO-سيارات الدفع الرباعي (DPhPC 10 ملغ / مل KvAP 01:10)، 2 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي الفلورسنت (10 ملغ / مل DPhPC، 0.5٪ مول TexasRed-DHPE) و 20 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي عازلة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لبروتين النهائي الدهون (الكتلة) نسبة 1 إلى: 12.5٪ و 0.1 مول TexasRed-DHPE. مزيج الحل بقوة.
- بدلا من ذلك، لممارسة بروتوكول مع سيارات الدفع الرباعي الدهون فقط، وذلك ببساطة الجمع بين 10 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي الفلورسنت (10 ملغ / مل DPhPC و 0.5 مول٪ TexasRed-DHPE) مع 20 ميكرولتر عازلة SUV.
- إيداع الحل SUV.
- استخدام ماصة 2 ميكرولتر أو 5 ميكرولتر الزجاج حقنة لإيداع صغيرة (<0.2 ميكرولتر) قطرات من الحل SUV على الأسلاك. تقريبا هو مطلوب 1 ميكرولتر من حل لتشكيل سلسلة من قطرات على طول1 سم من السلك. تأكد من قطرات صغيرة بما فيه الكفاية ومتباعدة بعيدا بما فيه الكفاية بعيدا أنهم لا تلمس أو الصمامات.
- السماح للسيارات الدفع الرباعي المودعة الجافة ~ 30 دقيقة في الهواء الطلق. عندما استقروا كل قطرات، وتناوب السلك حتى ودائع الدهون هي أسهل لمراقبة مع المجهر.
ملاحظة: إذا السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات لا يجف بما فيه الكفاية، فإنها يمكن أن يغسل قبالة الأسلاك عند إضافة عازلة النمو، في حين تجفيف أكثر من اللازم يمكن أن تتلف البروتين. بسبب الرطوبة الجوية يؤثر على معدل التجفيف، ووقت التجفيف و / أو رطوبة الهواء يمكن تعديلها لتحقيق أفضل النتائج 30. وينبغي أن يكون الفيلم الدهون على الأسلاك مرئية تحت المجهر.
- تجميع الغرفة.
- ختم أسفل الغرفة: استخدام حقنة لتطبيق الشحوم فراغ إلى الجزء السفلي من الغرفة حول الآبار الثلاثة والضغط على 40 ملم × 22 ملم ساترة بلطف ضدها لختم أسفل الغرفة بحيث تتمسك دون فجوة. ختم الجانبين من الغرفة (حيث خروج أسلاك) معختم لصق. تطبيق الشحوم فراغ على رأس غرفة تحدد الآبار الثلاثة.
- إضافة ببطء عازلة النمو حتى يتم شغل كل بئر إلى الأعلى. تجنب أي حركة سريعة من الحل في الآبار وهذا يمكن أن تجريد فيلم الدهون قبالة الأقطاب.
- إغلاق الغرفة عن طريق الضغط على أعلى الشريحة غطاء بلطف على الشحوم، مع الحرص على عدم طرد ساترة القاع. استخدام منديل ورقي لإزالة أي قطرات من عازلة على حواف الغطاء العلوي زلة.
ملاحظة: هذا هو الوقت المناسب للنظر في غرفة تحت المجهر للتأكد من أن الفيلم الدهون ظلت على الأسلاك.
- توصيل مولد إشارة إلى الأسلاك باستخدام اثنين من مقاطع التمساح. ضبط التردد (10 هرتز / 500 هرتز موجة جيبية لانخفاض / ارتفاع عازلة الملح) واستخدام المتعدد لقياس وضبط الجهد عبر الأسلاك إلى 0.7 / 0.35 V الجذر يعني مربع (VRMS) لمنخفض / عالية عازلة الملح. تغطية غرفة بورق الألمنيوم لحماية fluorophores من ضوء. ترك رانه GUVs لتنمو لمدة 2 إلى 3 ساعات لعازلة المنخفض الملح، و 12 ساعة أو O / N لعازلة عالية من الملح.
- افصل غرفة من المولد وبعناية وضعه على مجهر مقلوب لتقييم النمو GUV. استخدام بطيئة، وحركات ثابتة أو تدفق السوائل في الآبار قد فصل قبل الأوان GUVs من الأسلاك.
ملاحظة: GUVs على حواف الأسلاك وعادة ما تكون وضوحا في مرحلة النقيض (40X الهدف مسافة العمل الطويل)، في حين GUVs في أي مكان على النصف السفلي من الأسلاك ويمكن رؤية مع epifluorescence. إذا لم يكن هناك GUVs مرئية، في محاولة الدورية للأسلاك لإلقاء نظرة على السطح العلوي. ويمكن تخزين GUVs في 4 درجات مئوية في غرفة النمو لعدة أيام.
4. GUV النمو التي كتبها تورم جل بمساعدة
- إعداد 10 مل من محلول الاغاروز 1٪ عن طريق خلط 100 ملغ من الاغاروز مع 10 مل من الماء النقي. الحرارة حتى يغلي عن طريق وضعها في الميكروويف في 480 W ل~ 20 ثانية. اثارة للتأكد من حل الاغاروز تماما.
ملاحظة: الحلويمكن تخزينها في 4 ° C وإعادة تسخينها عند الحاجة. - البلازما نظيفة (البلازما الجوية) غطاء الشريحة لمدة 1 دقيقة بحيث الحل الاغاروز سوف تنتشر بشكل جيد على ذلك. استخدام غطاء الشرائح داخل 15 دقيقة القادم حيث تأثير التنظيف البلازما يلبس بسرعة.
- تطبيق 200 ميكرولتر من الحل الاغاروز الحار كل 22 × 22 مم 2 الشريحة بحيث الحل يبلل السطح بأكمله. إمالة الشريحة عموديا ولمس الحافة السفلية للنسيج لإزالة السائل الزائد وترك مجرد طبقة ملساء رقيقة من الاغاروز على الشريحة.
- ضع الشريحة على طبق ساخن أو الفرن على 60 درجة مئوية وتترك لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل. الفيلم الاغاروز لا يكاد يكون مرئيا بالعين. بعد تبريد الشرائح لRT، واستخدامها على الفور، أو تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد في حاوية مغلقة في 4 درجات مئوية.
- ضع ساترة المغلفة الاغاروز في معيار 3.5 سم طبق بتري.
- إعداد الحل SUV كما في القسم 3.2 و تطبيق ~ 15 ميكرولتر من الحل SUV (3 ملغ / مل الدهون) في~ 30 قطرات صغيرة جدا بلطف على سطح الاغاروز. والحرص على عدم تشويه طبقة الاغاروز أكثر من اللازم.
- ضع الشريحة تحت تيار لطيف من النيتروجين لمدة 10-15 دقيقة واتبع تبخر العازلة العين كما قطرات تجف.
- في أقرب وقت جفت سيارات الدفع الرباعي، إضافة عازلة النمو لتغطية سطح الشريحة. لصغير 3.5 سم بيتري استخدام طبق ~ 1 مل من العازلة.
- السماح للتورم والمضي قدما ل~ 30 دقيقة، ومن ثم دراسة نمو GUVs في الغرفة باستخدام مجهر مقلوب مع المرحلة على النقيض أو التفاضلي التباين التدخل (DIC).
ملاحظة: الملاحظة Epifluorescence صعبة نظرا للخلفية قوية من fluorophores في هلام وصناعة السيارات في مضان من الاغاروز.
5. حصاد ومراقبة GUVs
- إيقاف فاعلية غرفة المراقبة (على سبيل المثال، طبق بيتري صغيرة أو الزجاج ساترة) بحيث GUVs لا عصا، تنتشر وتنفجر على الجزء السفلي غرفة. تغطية شامنوفمبر أسفل مع حل بيتا الكازين، احتضان لمدة 5 دقائق، شطف خارج الحل الكازين مع مياه نقية وجافة مع تيار من الهواء أو النيتروجين، وأخيرا إضافة عازلة المراقبة (على سبيل المثال، ~ 5 مم عمق لطبق بيتري صغير).
- حصاد GUVs. قطع نهاية 100 نصائح ماصة ميكرولتر ذلك افتتاح أكبر (~ 2 مم)، وتطمح ببطء مثل إجهاد القص من pipetting ليمكن أن تدمر بسهولة GUVs.
- لGUVs شكلت الكهربائية، وفتح غرفة النمو عن طريق إزالة بلطف ساترة العليا. مكان غيض ماصة مباشرة فوق كل سلك ونضح ~ 50 ميكرولتر بينما تتحرك طرف ماصة على طول السلك لفصل GUVs.
ملاحظة: قد تساعد على تدوير الأسلاك لجمع GUVs على "الجانب الآخر" من السلك. - لGUVs "بمساعدة هلام تورم"، انقر أولا على جانب طبق بتري عدة مرات لمساعدة GUVs فصل من سطح ساترة. ضع طرف ماصة فقط فوق ساترة ونضح 50 ميكرولتر بينما صulling طرف إلى أكثر من السطح. نقل مباشرة GUVs حصادها إلى غرفة المراقبة، أو مخزن في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
- لGUVs شكلت الكهربائية، وفتح غرفة النمو عن طريق إزالة بلطف ساترة العليا. مكان غيض ماصة مباشرة فوق كل سلك ونضح ~ 50 ميكرولتر بينما تتحرك طرف ماصة على طول السلك لفصل GUVs.
- ضع غرفة المراقبة على مجهر مقلوب، إضافة GUVs إلى غرفة المراقبة، والانتظار بضع دقائق لGUVs ليستقر في قاع الغرفة.
- مسح الغرفة مع النقيض من المرحلة أو مدينة دبي للإنترنت لتحديد مكان بسرعة نحو سلس، كروية ('الحرة عيب') "المرشحين GUV". فحص كل "مرشح GUV" في epifluorescence لاستبعاد أي التي تحتوي على الجسيمات الشحمية أصغر تداخل داخل. وأخيرا، تأكد من أن كثافة الدهون مضان هي موحدة ومتوافقة مع غشاء واحد (أي unilamellar).
ملاحظة: في بعض bilamellar (أو متعددة رقائقي) الحويصلات، الأغشية هي قريبة جدا معا لحلها بحيث تظهر unilamellar في مرحلة التباين أو الصور DIC. ومع ذلك، هذه الكائنات يمكن تمييزها عن unilame الفعليةGUVs llar من قبل مضان الدهون، والتي هي مرتين (أو أكثر) أكثر إشراقا.
6. GUVs-لقط التصحيح
- جعل ماصات التصحيح التي يبلغ قطرها 1-2 ميكرون غيض من معيار الزجاج البورسليكات الشعرية باستخدام برنامج الموصى بها لمجتذب ماصة.
ملاحظة: العلاجات الخاصة مثل تلميع النار ليست ضرورية، والماصات يمكن استخدامها لعدة أيام بعد أن تم سحبها إذا تكون مسجونة في صندوق مغلق. - إيقاف فاعلية الغرفة التي يحتضنها مع حل بيتا الكازين (5 ملغ / مل) لضمان أن GUVs لا تلتزم، انتشر وتمزق على الأسطح الغرفة. شطف الكازين بعد 5 دقائق.
- إدراج القطب الأرض، وملء الغرفة مع العازلة المراقبة، ونقل 10 ميكرولتر من تعليق GUV كما هو موضح في الخطوة 5.2 و 5.3، والانتظار بضع دقائق لGUVs ليستقر في القاع.
- ملء ماصة التصحيح جديدة مع الحل (عازلة للمراقبة أو حل ايزو الاسموزي آخر) وتركيبها على مكبر للصوت headstage التصحيح، المشبك.
- البحث من خلال الغرفة لتحديد موقع GUV "خالية من العيوب" كما هو موضح في القسم 5.4، والتحقق من أنه يحتوي على بروتين فلوري.
- تطبيق الضغط الايجابي المستمر (> 100 با، أو ما يقرب من 1 سم H 2 O في مقياس ضغط الدم) للحفاظ على ماصة التصحيح الداخلية نظيفة، وإدراج ماصة التصحيح في الغرفة. جلب ماصة التصحيح في مجال الرؤية، وتطبيق اختبار لقياس نبضات / تعويض الجهد ماصة تعويض والمقاومة، ودراسة ماصة تحت إضاءة الفلورسنت للتأكد من أن الطرف نظيف.
- جلب ماصة التصحيح نحو GUV، وإذا لزم الأمر، والحد في وقت واحد ضغط إيجابي حتى تدفق نحو الخارج من ماصة التصحيح لا يجعل GUV "الهرب". عندما ماصة التصحيح على مقربة من GUV، وتطبيق الضغط السلبي (حتى 5 سم H 2 O) لسحب GUV ضد ماصة التصحيح. مراقبة مقاومة باسم "، اللسان "من غشاء GUV يدخل ماصة التصحيح وأشكال gigaseal.
- إذا لم يكن gigaseal تشكيل، وإزالة ماصة التصحيح من الغرفة والعودة إلى الخطوة 6.4. إذا شكلت التصحيح غشاء gigaseal، ولكن GUV لا تزال تعلق على ماصة، استئصال التصحيح عن طريق سحب بعيدا عن GUV، متخلصا من GUV ضد قاع الغرفة، أو لفترة وجيزة تحريك ماصة للخروج من الحل.
- عندما تم رفعه للمن الداخل إلى الخارج التصحيح غشاء من GUV وgigaseal مستقر، وإيقاف نبضات اختبار وتطبيق بروتوكول الجهد مثل واحد هو مبين في الشكل (13).
يتبع الشكل 13 اتفاقية الكهربية القياسية لالتصحيح من الداخل إلى الخارج الذي التيار المار في التصحيح القطب هو "الإيجابي"، وV = V حمام - V ماصة: ملاحظة. عقد التصحيح في السلبية المحتملة (مثل V = -100 بالسيارات) ل~ 30 ثانية الأماكن KvAP في حالة الراحة، في حين أن الخطوات (100 مللي ثانية إلى 5 ثانية) إلى إمكانات أكثر إيجابية (على سبيل المثال، V = 100 فولت) ويمكن بعد قيادتها إلى إجراء (أي فتح) الدول النشطة. - بعد الانتهاء من القياسات على رقعة غشاء، وكسر التصحيح مع نبض انطلق أو الضغط وتحقق من أن الجهد إزاحة القطب التصحيح لم انجرف. إزالة ماصة التصحيح من الغرفة، والعودة إلى الخطوة 6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نمو GUVs يمكن تقييمها بسرعة عن طريق فحص غرفة النمو تحت المجهر. لelectroformation، وGUVs تميل إلى النمو في عناقيد على طول الأسلاك البلاتين، كما هو مبين في الشكل (4). وخلال بمساعدة هلام تورم، وتظهر GUVs عن الهياكل الكروية التي تنمو وتلتحم مع بعضها (الشكل 5) بسرعة.
يتم تحديدها بسهولة أكبر GUVs خالية من العيوب وتقييمها بعد نقل إلى غرفة المراقبة. وهناك حاجة إلى معايرة لتقييم صارم نوعية GUV، ولقد تم نشر الكمي منهجي سابقا 28. ومع ذلك، بمثابة دليل عملي، GUVs "جيدة" يجب أن تكون معزولة (أي ليس في كتلة)، لديها، على نحو سلس، الغشاء الخارجي كروي واحد، لا تحتوي على الأجسام (أي والأنابيب والحويصلات متداخلة، وما إلى ذلك) في الداخل، و لديهم "المعيار" مستوى الدهون مضان (كائنات أكثر إشراقا هي عادة ثنائية أو متعددةرقائقي). ويبين الشكل 6 DIC وepifluorescence صور لGUV "خالية من العيوب" بعد نقل إلى حل الجلوكوز-ISO الاسموزي. ويرجع ذلك إلى الاختلاف في الكثافة الضوئية بين السكروز شغل GUV والجلوكوز التي تحتوي على حل حمام التباين في مدينة دبي للإنترنت. مؤشر الانكسار النقيض من KvAP التي تحتوي على GUVs غالبا ما ينخفض مع مرور الوقت، على الرغم من KvAP نفسه لا ينبغي أن تكون قابلة للاختراق إلى السكروز أو الغلوكوز. مضان البروتين موحد في الغشاء GUV يؤكد أن أدرج KvAP في GUV (أي أنه لم يبق في الفيلم الدهن) ولم شكلت ميكرون على نطاق و(أو أكبر) المجاميع.
أرقام 7 و 8 و 9 تظهر الصور مبائر من الدهون والبروتين مضان من GUVs التي تنتجها بروتوكول الملح أقل electroformation، الفسيولوجية بروتوكول electroformation الملح، وبروتوكول تورم بمساعدة هلام. الدهون الفلورسنت (أرجواني) والبروتينتم تحجيمها (الأخضر) إشارات إلى متوسط بنفس الشدة، بحيث GUVs مع انخفاض / ارتفاع عدد البروتينات في وحدة المساحة (الكثافة البروتين) لديها أرجواني / الظل الأخضر في الصور تراكب (العمود الأيمن)، في حين GUVs مع متوسط كثافة البروتين من البيض. تم تحديد معزولة، GUVs خالية من العيوب ويظهر توزيع حجم GUV في الشكل 10. عادة electroformation تنتج المزيد من GUVs خالية من العيوب من بمساعدة هلام تورم، ولكن GUVs التي تنتجها electroformation هي أصغر الشكل 11 يبين توزيع كثافة البروتين الاستدلال من مضان من GUVs. Electroformation مع العازلة عالية من الملح تنتج GUVs فيها كثافة البروتين تختلف اختلافا كبيرا من GUV إلى جوف. كثافة البروتين من GUVs الفردية تختلف أقل من ذلك بكثير لelectroformation مع انخفاض عازلة الملح، في حين أن كثافة البروتين من GUVs التي تنتجها بمساعدة هلام تورم غير ملحوظ موحدة.
تقنية التصحيح، المشبك هي استخدام على نطاق واسعطريقة د لدراسة وظيفة القنوات الأيونية الجهد بوابات، مثل KvAP. في تسجيلات "من الداخل إلى الخارج"، يتم استخدام الزجاج "التصحيح" ماصة نظيفة لاستئصال رقعة من الغشاء من GUV. ثم يتم استخدام إلكترود داخل ماصة التصحيح لتطبيق الجهد، وقياس التيار الناتجة تتدفق من خلال التصحيح الغشاء. تكوين التصحيح الغشاء يمكن أن تختلف بشكل كبير عن بقية الخلية / GUV 31، ولكن التكوين "من الداخل إلى الخارج" لا تزال مفيدة جدا لقياس تصرف واحد قناة والانتقائية الأيونية، والتي تعتمد على الجهد النابضة. هذه الخصائص الثلاث هي وسيلة ممتازة لإثبات أن التيارات ليست بسبب القطع الأثرية (على سبيل المثال، وقضايا gigaseal) أو الملوثات (على سبيل المثال، porins البكتيرية من تنقية)، وهناك قنوات KvAP الوظيفية في GUVs.
يتم قياس تصرف القناة الأكثر بسهولة في بقع مع القنوات النشطة واحد فقط أو اثنين. في إكساءmple هو مبين في الشكل 12، ويلاحظ أي فتحات قناة عند عقد الغشاء في بالسيارات -100، بينما في +100 بالسيارات، وفتحات قناة فردية يمكن حلها بوضوح. ويظهر الرسم البياني الحالي قمتين الموافق المغلقة والدول المفتوحة، وتركيبها، مع وظيفة جاوس مزدوجة غلة قناة تيار واحد من 10.9 ± 0.85 السلطة الفلسطينية، المقابلة لتصرف من 109.2 ± 8.5 PS (في 100 ملي بوكل). لاحظ أن قناة تصرف واحد يعتمد على حل (وخاصة تركيز البوتاسيوم) وتكوين غشاء 32،33.
مثل العديد من K-قنوات أخرى، الفردية قنوات KvAP معرض "الثرثرة" رشقات نارية من فتحات السريع وإغلاقها. كما هو موضح سابقا، والانتقائية البوتاسيوم يمكن اختبار باستخدام حلا مختلفا في ماصة التصحيح (على سبيل المثال، حل ماصة التصحيح 90 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل) 28.
تعتمد على الجهد النابضة في كثير من الأحيان لياليtudied في بقع مع قنوات متعددة، وذلك للحصول على أكثر سهولة في المتوسط الفرقة. في حين لا توجد آلية واضحة لصالح الفسيولوجية (المجال داخل الخلايا على GUV الداخلية) ومعكوس (المجال داخل الخلوي على GUV الخارجي) إدخال KvAP في GUVs، في "الداخل إلى الخارج" بقع غشاء غالبية قنوات وظيفية لديها " الفسيولوجية "الإدراج 28 الشكل 13 يوضح استجابة رقعة غشاء تحتوي متعددة (> 10) القنوات لسلسلة من 5 ثاني خطوات إزالة إستقطاب. بين كل خطوة، ويقام في التصحيح -100 بالسيارات لمدة 30 ثانية للسماح للقنوات مع "الفسيولوجية" الإدراج للعودة إلى حالة الراحة الخاصة بهم. عندما إمكانات سلبية بما فيه الكفاية (على سبيل المثال، V <-60 بالسيارات) هو الأكثر للتيار بسبب تسرب gigaseal، وفتحات عرضية من واحد أو اثنين من القنوات التي من المحتمل أن يكون "معكوس" الإدراج. لخطوات لبوتيه أكثر إيجابيةntials، لوحظ تزايد أعداد القنوات حتى هناك الكثير أن فتحات الفردية وإغلاق لم يعد من الممكن حلها. وهكذا، فإن الاحتمال مفتوحا للقناة هو واضح تعتمد على التيار الكهربائي. حركية تنشيط KvAP وتعطيل تختلف اختلافا كبيرا بين الأسود الدهن الأغشية (BLMs) 26 و GUVs، ولكن هذا ما يتفق مع التقارير السابقة التي كيلو فولت قناة النابضة يمكن أن تكون حساسة لتكوين الغشاء والدولة (34).
الشكل 1. GUV Electroformation تخطيطي: تودع قطرات تحتوي على سيارات الدفع الرباعي على إلكترود الجفاف الجزئي من الحل يتسبب في سيارات الدفع الرباعي لتلتحم لتشكل كومة من الأغشية. ثم يضاف العازلة وحقل كهربائي AC تطبيقها. كما تتضخم الفيلم، والأغشية الفردية فصل من كومة لتشكيل GUVs. (وقد وزارة الدفاع هذا الرقم ified من Aimon وآخرون. 28)
الشكل 2. GUV غرفة Electroformation. يطحن الغرفة للخروج من PTFE لبنة مع ثلاثة آبار (10 مم، 5 ملم العمق). يتم فصل اثنين من 0.5 ملم أسلاك قطرها البلاتين بنسبة 3 مم (المسافة من الحافة إلى الحافة) والمتمركزة بالقرب من الجزء السفلي من الغرفة لتسهيل التصوير من الأسلاك. وتعقد أسفل وأعلى زلات الغطاء في مكانه مع الشحوم فراغ، وختم معجون يمنع أي تسرب من ثقوب الأسلاك على الجانب. توصيل مولد التيار المتردد مع مقاطع التمساح إلى الأسلاك. ويستند الغرفة على واحد التي وضعتها ارنستو Ambroggio ولويس Bagatolli. (تم تعديل هذا الرقم من Aimon وآخرون. 28)
"/>
الشكل 3. جل بمساعدة عفوية تورم تخطيطي: تودع قطرات تحتوي على تعليق SUV على هلام الاغاروز كما يجفف الحبرية، وسيارات الدفع الرباعي الصمامات لتشكيل الفيلم الدهون. عند إضافة عازلة النمو، الفيلم rehydrates وGUVs تشكل على السطح. GUVs تنمو إلى حجم ~ 10 ميكرون من التورم والصمامات مع GUVs المجاورة.
الشكل 4. صورة الممثل من GUVs DPhPC تحتوي على KvAP المتزايد على سلك البلاتين في منطقة عازلة الملح العالية. وGUVs تشبه عناقيد العنب على طول السلك. المرحلة النقيض من الصورة باستخدام الهدف 40X LWD. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. GUVs DPhPC تحتوي على KvAP تورم على agarose هلام. وGUVs مرئية كما باهتة المجالات التي يبلغ قطرها 10 ميكرومتر ~. البقع السوداء / مشرق هي المجاميع الاغاروز / الدهون التي الحويصلات تنتفخ. المرحلة صورة النقيض مع الهدف 40X LWD. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. صور من GUV خالية من العيوب. (البيض-PC: البيض-PA 9: 1 من الكتلة) التي تحتوي على KvAP المسمى مع اليكسا-488 الأيسر: مدينة دبي للإنترنت، والحق: اليكسا-488 epifluorescence. الإثارة: 470/50 نانومتر، الانبعاثات: 545/75 نانومتر. لاحظ مضان موحد من KvAP مع عدم وجود المجاميع مرئية. 81fig6large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. الصور متحد البؤر من الدهون (أرجواني) والبروتين (الأخضر) مضان من GUVs كهربي تزرع في منطقة عازلة منخفض الملح (البيض-PC: البيض-PA 9: 1 من الكتلة) (A) علامة السهام البيضاء (مرجح). GUVs، في حين يمثل السهم الأحمر حويصلة يحتمل أن تكون ثنائية رقائقي مع ارتفاع الدهون مضان. لاحظ أن كثافة مضان هو أكثر إشراقا في وسط هذه الصورة بسبب حقل كبير للغاية من الرأي. (B) التكبير تظهر مجموعة صغيرة من GUVs. اليسار (أرجواني): TexasRed-DHPE الإثارة: خط ليزر 543 نانومتر، الانبعاثات: 605/70 نانومتر. مركز (أخضر): KvAP المسمى مع اليكسا-488 الإثارة: خط ليزر 488 نانومتر، الانبعاثات: 515/30 نانومتر. اليمين: تراكب.OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8. الصور متحد البؤر من الدهون (أرجواني) والبروتين (الأخضر) مضان من GUVs كهربي نمت في تركيز الملح الفسيولوجي (البيض-PC: البيض-PA 9: 1 من الكتلة). (A) وGUVs (السهام البيضاء تظهر unilamellar المرجح أمثلة) وأكثر متفرق مقارنة بروتوكول الملح منخفضة ويمكن أن يكون لها تركيزات بروتين مختلفة للغاية (السهم الأحمر). (B) التكبير تظهر مجموعة صغيرة من GUVs. اليسار (أرجواني): TexasRed-DHPE الإثارة: خط ليزر 543 نانومتر، الانبعاثات: 605/70 نانومتر منتصف (الأخضر): KvAP المسمى مع اليكسا-488 الإثارة: خط ليزر 488 نانومتر، الانبعاثات: 515/30 نانومتر. الحق: تراكب الرجاء جلعق هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تظهر الرقم 9. متحد البؤر صورة الدهون (أرجواني) والبروتين (الأخضر) مضان من GUVs (DPhPC) التي شكلتها بمساعدة هلام تورم مع العازلة تركيز الملح الفسيولوجي. GUVs كثافة البروتين أكثر تجانسا من GUVs كهربي أعدت مع العازلة الفسيولوجية. غادر (أرجواني): BPTR-حدات خفض الانبعاثات المعتمدة 0.1٪ الإثارة: 543 نانومتر خط ليزر، الانبعاثات: 605/70 نانومتر. الأوسط (الأخضر): KvAP المسمى مع اليكسا-488 الإثارة: خط ليزر 488 نانومتر، الانبعاثات: 515/30 نانومتر. الحق: دمج للقناتين الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يختلف كثافة البروتين (عدد البروتينات في وحدة المساحة) من GUVs كهربي مع العازلة الملح منخفضة (5 ملي بوكل، DPhPC) أقل من مع تركيز الملح الفسيولوجية (100 ملي بوكل، البيض-PC: الرقم 11. GUV المدرج الاحصائي كثافة البروتين البيض -PA 9: 1 من الكتلة) وتبين كثافة البروتين من GUVs (DPhPC) نما بنسبة بمساعدة هلام تورم في المخزن الملح الفسيولوجي أقل الاختلاف. كثافة البروتين يتناسب مع KvAP-A488 كثافة مضان لهذه التركيزات 28، وفي كل رسم بياني وتطبيع كثافة مضان من متوسط التوزيع. (تم تعديل وحة المتوسطةمن Aimon وآخرون. 28)
الرقم 12. النشاط قناة واحدة من GUV غشاء الرقع ('من الداخل إلى الخارج "اتفاقية الجهد DPhPC). وقد نما GUV في 100 ملي بوكل، 5 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 على أسلاك البلاتين. قنوات مفتوحة واحدة بعد تطبيق 100 بالسيارات إمكانات على التصحيح. إلى اليمين من أقحم هو الرسم البياني المستخدمة لحساب قناة تصرف واحد. الخط الأحمر هو يصلح لوظيفة جاوس مزدوجة مع ماكسيما في 4.70 ± 0.27 السلطة الفلسطينية و15.62 ± 0.58 السلطة الفلسطينية، المقابلة لتصرف من 109.2 ± 8.5 PS. تم تصفيتها التتبع في 10 كيلوهرتز مع 4-قطب بسل تصفية وسجلت في 50 كيلو هرتز.
الرقم 13.-dependen الجهد قنوات ر النابضة في التصحيح غشاء من GUV تشكلت على الاغاروز في منطقة عازلة الملح العالية (DPhPC، "من الداخل إلى الخارج" اتفاقية الجهد). (A) استجابة غشاء التصحيح الحالية إلى خطوة عابرة في التيار الكهربائي. ماصة وحمام الحلول على حد سواء احتوت 100 ملي بوكل، وعقدت الغشاء لمدة 30 ثانية في -100 بالسيارات بين الخطوات الجهد المتعاقبة. على تفتيش قريبة يمكن للمرء أن يرى أن أثر يحتوي على 1 أو 2 القنوات التي يبدو أن فتح مع الفولتية السلبية. أقحم أ) يدل على التكبير من افتتاح تأخر وأقحم ب) إغلاق تأخر القناة. تم تصفية التيارات مع 4-قطب بسل مرشح في 10 كيلوهرتز، وسجلت في 51.3 كيلو هرتز. حاليا تم أخذ عينات أسفل التتبع ل513 هرتز. يتم قطع السعة عابرة سلبي قبالة في السلطة الفلسطينية -150. (ب) متوسط الحالي (0.25 ثانية <t <5 ثانية) مقابل خطوة الجهد. التيارات في الفولتية الإيجابية هي أكبر لأن قناة احتمال مفتوح يعتمد الجهد.ديزيل / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظم نموذج المحاكاة البيولوجية هي أداة هامة لدراسة خصائص وتفاعلات البروتينات والأغشية. مقارنة بأنظمة أخرى مثل إعادة تشكيل BLMs أو الأغشية الدهنية المعتمدة، GUV النظم القائمة الحالية عدة فرص بما في ذلك سيطرة كبيرة من تكوين الغشاء والتوتر والهندسة، فضلا عن كونه حقا خالية من النفط. ومع ذلك، وتتضمن البروتينات عبر الغشاء، مثل KvAP، إلى GUVs يتطلب تعديلات كبيرة من البروتوكولات التقليدية لGUVs-الدهون الوحيد. بروتوكول electroformation المقدمة هنا تميزت سابقا وتستخدم لدراسة المبادئ الفيزيائية الحيوية من الغشاء توزيع البروتين وديناميكية في الأغشية منحنية 2،4،35. يوضح هذا العمل بروتوكول جديد تورم بمساعدة هلام، إضافة إلى مجموعة من الطرق لإعادة البروتين في GUVs. كلا البروتوكولين يمكن أن تنتج GUVs خالية من العيوب التي تحتوي على كثافة عالية من KvAP، والقياسات على بقع من الداخل إلى الخارج تؤكد أنGUVs حد ذاتها تحتوي على والقنوات التي تعتمد على الجهد والبوتاسيوم انتقائية وظيفية.
النهجين لها نقاط القوة والضعف مختلفة. عندما يمكن استخدامها الظروف الملح منخفضة، electroformation تقدم حلا وسطا جيدا بين العائد GUV وكثافة البروتين موحدة. Electroformation لا يزال يعطي عوائد معقولة مع تركيز الملح الفسيولوجية، ولكن كثافة البروتين يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين GUVs (انظر الأرقام 8 و 11). ويبدو أن التباين في الكثافة إلى أن ترتبط مدة electroformation، حيث أن النمو عازلة قليل الملح يمكن أن يكون أيضا اختلافات كبيرة كثافة إذا استمر النمو لفترة أطول من 2 ساعة. في المقابل، GUVs التي تنتجها بمساعدة هلام تورم لديها كثافة البروتين موحدة بشكل ملحوظ، حتى بالنسبة للمخازن الفسيولوجية. ومع ذلك، فإن جزء من الحويصلات المتعددة رقائقي أكبر، والاغاروز لصناعة السيارات في مضان يعقد الكمي للبروتين منخفض الكثافة 16. استخدام البولي فينيل الكحول في جيش التحرير الشعبى الصينىوقد أبلغ م من الاغاروز لتحسين GUV العائد بمساعدة هلام عندما ترسبت الدهون من الكلوروفورم 20، لكننا كنا غير قادر على إنتاج GUVs استخدام البولي فينيل الكحول مع حلول SUV. إذا كان العائد أقل من GUVs خالية من العيوب غير مقبول، بمساعدة هلام تورم لديه ميزة واضحة للتجارب التي تتطلب توزيع البروتين موحد.
Electroformation وبمساعدة هلام تورم أيضا الاحتياجات من المعدات مختلفة تماما. بروتوكول تورم بمساعدة هلام يستخدم القليل من المعدات المتخصصة باستثناء نظافة البلازما، وهي ليست ضرورية لأن هناك العديد من الطرق البديلة لإنتاج نظيف والزجاج ماء. في المقابل، electroformation يتطلب غرفة مخصصة مع الأقطاب الكهربائية الأسلاك. سلك البلاتين مكلف، ولكن لهذا البروتوكول GUVs نمت بسهولة أكبر مع البلاتين من الأسلاك التيتانيوم، وGUVs لم تنمو على ITO الشرائح عند استخدام تركيزات الملح الفسيولوجية. قطر الأقطاب (0.5 مم) هو ل compromise بين القطب السطحية والسعر. ويستند الغرفة هو مبين في الشكل 2 على تصميم لويس Bagatolli 15 و ارنستو Ambroggio، وكان تشكيله من تترافلوروإيثيلين (PTFE) للسماح للتنظيف مع معظم المذيبات. ومع ذلك، ينبغي كلوريد بولي أسيتال أو البولي فينيل (PVC) أيضا تعمل بشكل جيد. القدرة على إزالة الأسلاك البلاتين لتنظيف العدوانية أمر مهم، وعندما تعلم أولا البروتوكول، فإنه من المفيد جدا أن تكون قادرة على مراقبة نمو GUV في الموقع من خلال غطاء الشريحة السفلية. أصغر، أغلقت آبار تمنع حل من الخوض الوراء وإلى الأمام وأيضا تسمح اختبارات عدة مكونات الدهون في نفس الوقت. ومع ذلك، وغرفة مخصصة الخاصة ليست ضرورية عند البدء. على سبيل المثال، بسيطة، وغرف واحد جيدا يمكن المرتجلة التي تغير اتجاهها اثنين من الأسلاك وصولا الى قاع طبق بتري الصغيرة، أو باستخدام ختم الشمع لشطيرة منهم بين اثنين من الشرائح الزجاجية، أو ببساطة بدس لهم من خلال الغطاء من قارورة صغيرة.
كل من electroformation والبروتوكولات تورم بمساعدة هلام يجب أن ينتج عددا كافيا من GUVs خالية من العيوب لالدقيقة التلاعب والتجارب التصحيح، المشبك. ومع ذلك، فإن العائد GUV يعتمد بحساسية على تشكيل كومة طبقة ثنائية عندما حل SUV هو المجففة جزئيا. إذا واجهت صعوبات في GUVs متزايد (أي، لا أو قليلة GUVs مرئية في غرفة النمو)، فإنه يمكن أن تكون مفيدة جدا في النمو GUVs-الدهون فقط باستخدام حل الدهون / الكلوروفورم في مكان سيارات الدفع الرباعي 15،16 (ومنخفض عازلة الملح). إذا GUVs لا تنمو جيدا من فيلم الدهون / الكلوروفورم ثم شيء أساسي هو خاطئة (على سبيل المثال، حلول الدهون غير صحيحة أو مخازن، والشحوم أو التراب على الأقطاب، والجهد غير صحيح أو تردد، وما إلى ذلك). ومع ذلك، إذا تنمو GUVs من الأفلام الدهون / الكلوروفورم ولكن ليس الأفلام SUV، ثم من المرجح أن تكون مع الجفاف الجزئي القضية.
الخطوة الجفاف الجزئي لالأمثل الأكثر بسهولة باستخدام الدهون فقط سيارات الدفع الرباعي لأنه لا يوجد خطر "تغيير طبيعة" الدهون بسبب الجفاف المفرط. لelectroformation، فإنه يمكن أن تكون مفيدة لفحص الأسلاك بعد أن تم السماح للقطرات SUV لتجف للتأكد من عدم ومشرق مضان الدهون في كل بقعة حيث أودع قطرات. إذا يختفي مضان الدهون بعد يملأ الغرفة مع الحل النمو، ومن ثم إما الحل النمو لابد من إضافة المزيد بعناية، أو سيارات الدفع الرباعي تحتاج إلى يذوى لفترة أطول حتى الفيلم تعلق بشكل أكبر إلى السلك. خلال النمو، تأكد من لا أسلاك ولا حل التحرك داخل غرفة (على سبيل المثال، عندما وضع الغرفة على المجهر) لتجنب تجريد GUVs قبالة الأسلاك. عندما تنمو GUVs جيدا، وأنها عادة ما تكون من السهل أن نرى في الصور النقيض من المرحلة. ومع ذلك، GUVs الصغيرة غالبا ما تكون أكثر وضوحا باستخدام مضان الدهون، والتي هي أيضا مفيدة لرؤية كيف تغير كومة الغشاء أثناء النمو. دراسة جميع أسطحالأسلاك (داخل، خارج، أعلى وأسفل) في جميع الآبار وكذلك الطابق غرفة قبل رميه النمو، لأن العوائد يمكن أن تختلف إلى حد كبير من بقعة واحدة إلى أخرى.
مناولة وتخزين GUVs ومقارنة بسيطة لخلايا، ولكن GUVs حساسة جدا للإجهاد ناضح، قوى القص والالتصاق. على نحو سلس، الاقتراحات لطيف مهمة عندما حصاد أو نقل GUVs، وأنه من المهم لإيقاف فاعلية الأسطح لمنع GUVs من الانضمام وتنفجر. ومع ذلك، لإجراء التجارب المشبك التصحيح الغرفة يجب أن تشطف جيدا بعد التخميل بحيث الحل التخميل لا يمكن معطف ماصات التصحيح ومنع تشكيل gigaseal. لالتخميل، والمعاملة بيتا الكازين بسيطة وفعالة، ومقارنة مع ألبومين المصل البقري، الذي لديه وظيفة نقل الدهون، بيتا الكازين لديها تفاعلات محدودة مع طبقات ثنائية الدهون وينبغي تفضيل عند العمل مع GUVs 36. من خلال تغيير فترة حضانة، فمنمن الممكن الحصول GUVs على الانضمام دون أن ينفجر. ومع ذلك، فإن GUVs لا تلتزم الشريحة غطاء كما بحزم باسم خلايا، وهكذا الرعاية لا يزال يتعين اتخاذها أثناء أي إجراء من شأنه أن يمكن أن تحفز تدفق في غرفة (على سبيل المثال، عازلة التروية، والانتقال من غرفة).
تسجيل التصحيح، المشبك هو أسلوب الكلاسيكي لدراسة القنوات الأيونية الجهد بوابات مثل KvAP ويشتق هذا البروتوكول من التقنيات القياسية للحصول على بقع "من الداخل إلى الخارج" من الخلايا الملتصقة. وهناك معيار التصحيح، المشبك مجموعة المتابعة التي ماصة التصحيح تنحدر بشكل غير مباشر (على سبيل المثال، 30-60 درجة من الأفقي) في طبق بيتري صغير يجب أن تعمل بشكل جيد. ومع ذلك، صور أكثر وضوحا من ماصة التصحيح والمنطقة gigaseal يمكن الحصول عليها باستخدام غرفة فيها تغطية زلات تشكل أعلى وأسفل الغرفة (~ 1 ملم الفصل) حتى ماصة التصحيح يمكن أن تدخل أفقيا من الجانب. لأنه ليست هناك حاجة إلى الضغوط ماصة التصحيح واسع، ويمكن للضغط أن يكون مريح جontrolled مع حقنة ورصدها مع أي متر ضغط بسيط (على سبيل المثال، المرتجلة مقياس الماء). ويمكن أن تكون مفيدة لأول ممارسة التجارب المشبك التصحيح مع GUVs-الدهون الوحيد نمت باستخدام الدهون / حل الكلوروفورم وعازلة قليل الملح. لأن العائد من GUVs خالية من العيوب مرتفع جدا، وسوف يكون هناك الكثير من GUVs مثالية للعمل مع العديد منهم حتى لو دمرت خلال الحصاد ونقل إلى غرفة التجريبية.
مع القليل من الممارسة، والبقع غشاء رفعه مع gigaseals مستقرة يمكن الحصول عليها بسهولة من DPhPC GUVs وKvAP-DPhPC GUVs. لتحقيق نسبة نجاح عالية، فإنه يساعد على تحديد دقيق الجولة، ولكن قليلا، تقلب، GUVs خالية من العيوب وتحقق من أن التصحيح ماصة نظيفة (يبحثون عن الدهون في مضان) قبل محاولة لتشكيل gigaseal. عندما غشاء "اللسان" يدخل ماصة التصحيح، وgigaseal يشكل عادة بسرعة (<1 ثانية) دون أي حاجة لشفط قوي أو specifiج عقد الجهد. في حين ختم سيئة قد تحسن كما يزحف الغشاء الى مزيد من ماصة التصحيح، وغالبا ما يبقى ختم الفقراء لأنه كان ملوثة الداخلية ماصة وأنه من الضروري البدء من جديد مع ماصة التصحيح الطازجة وGUV. أشكال DPhPC مستقرة جدا بقع غشاء (عشرات دقيقة) مع المقاومة ختم ممتازة حتى في الفولتية العالية (على سبيل المثال، ± 150 فولت). SOPC: الكولسترول (3: 1 بواسطة الخلد) يمكن أيضا أن تشكل بقع مستقرة جدا ولكن يمكن أن تتطلب أعلى شفط لختم، في حين تبدو بقع البيض-PC لكسر بسهولة أكبر.
لدورات أطول التصحيح، المشبك قد يكون من الضروري لضبط الأسمولية من الحل الغرفة. إذا كان الأسمولية هو أقل بكثير جدا من المخزن المؤقت نمو GUV، GUVs تصبح متورمة، متوترة وكروية وأنه قد لا يكون من الممكن نضح الغشاء GUV بعيدا بما فيه الكفاية في ماصة التصحيح لتشكيل gigaseal. هذا وغالبا ما تكون ثابتة ببساطة عن طريق الانتظار 10 أو 20 دقيقة كما التبخر من الغرفة يزيد من تحويلةernal حل الأسمولية حتى GUVs تنكمش وتبدأ في التذبذب. وعلى العكس، إذا ما تركت الغرفة مفتوحة لفترة طويلة جدا والأسمولية من الحل الخارجي يمكن أن تزيد حتى GUVs تنكمش مما tubulate وبرعم. ويمكن تجنب ذلك من خلال منع التبخر من الغرفة (على سبيل المثال، مع الزيوت المعدنية) أو بشكل دوري إضافة الماء المقطر لتحل محل المياه التي تبخرت.
لأن البروتينات يمكن استبعادها من بقع غشاء رفعه 31، لا علاقة لعدد من القنوات النشطة في التصحيح المستأصل ببساطة لكثافة البروتين في غشاء GUV. وتشير القياسات مضان تركيز KvAP في الغشاء التصحيح هو أقل بكثير من GUV 28 ويمكن أن يكون من السهل جدا الحصول على لصقات تحتوي على عدد قليل فقط من القنوات. ومع ذلك، إذا بقع تحتوي على عدد كبير جدا من القنوات لتسجيل قناة واحدة، والخطوات واضحة لاستخدام ماصات التصحيح مع نصائح صغيرة و / أو خفض د البروتين إلى الدهونensity في مزيج SUV فعالة. في المقابل، لأداء القياسات الفرقة على لصقات تحتوي على العديد من القنوات، ويمكن ان يكون من المفيد أن تبدأ مع كثافة عالية نسبيا من البروتين (على سبيل المثال، 1:10، والبروتين إلى الدهون من حيث الوزن)، واستخدام البروتين مضان لتحديد GUVs مع كثافة البروتين عالية ، استخدام ماصات التصحيح أكبر (على سبيل المثال، 2 إلى 3 ميكرون قطر الحافة) ونضح بسرعة في محاولة لتشكيل ختم بسرعة. ومن الواضح أن "خلية كاملة" التكوين من نوع (أي، "كامل GUV ') يكون مثاليا لوصف كل القنوات في GUV، ولكن للأسف" GUV كله "التكوين يطرح العديد من القضايا الفنية 37.
ومجرد تقديم الحلول، والدهون وتركيزات البروتين في هذا البرنامج التعليمي كنقطة انطلاق، ويمكن تعديلها لتناسب احتياجات تجربة معينة باتباع بعض الاعتبارات.
وينبغي أن يشمل جميع الحلول منطقة عازلة درجة الحموضة مثل HEPESأو TRIS لضمان عدم تعرض البروتينات لدرجات الحموضة. وينبغي أن يكون المخزن المؤقت SUV منخفضة تصل تركيز المواد المذابة مثل البروتين لن تتسامح (على سبيل المثال، 5 ملي الملح أو أقل)، مع زيادة تركيزات المذاب خلال الخطوة الجفاف جزئية ويمكن أن تركيزات عالية من الملح تفسد البروتين أو تسبب الفيلم الدهون بسرعة ل delaminate خلال الخطوة الإماهة. كميات صغيرة من السكريات مثل طرهالوز (على سبيل المثال، 1 ملم إلى 5 ملم) ويعتقد أن حماية البروتين أثناء الجفاف 23. في حين طرهالوز وقد تورط في anhydrobiosis ويعتقد لحماية الغشاء والبروتينات ضد أصاب 38، والسكروز أو الغلوكوز قد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة.
لعازلة النمو، وتركيز الملح أهمية خاصة حيث سيؤدي ذلك إلى التأثير على المعلمات لالأمثل النمو GUV (على سبيل المثال، electroformation الجهد والتردد والمدة). في المقابل، فإن العائق الأساسي لعازلة الملاحظة هو رقبعة أنه ينبغي أن يكون لها نفس الأسمولية باعتبارها منطقة عازلة النمو. إدراج السكروز و / أو الجلوكوز في "عازلة النمو" و "عازلة المراقبة" يمكن أن تكون مفيدة لضمان GUVs الرواسب إلى أسفل غرفة المراقبة، في حين أن الاختلاف في معامل الانكسار بين GUV الداخل والخارج يساعد على النقيض من المرحلة أو مدينة دبي للإنترنت المجهري. وغالبا ما تشمل Electrophysiologists الكالسيوم أو المغنسيوم الأيونات إلى الحمام و / أو ماصة التصحيح حلول لتعزيز تشكيل gigaseal مع أغشية الخلايا، ولكن هذه لا تظهر على أنها ضرورية لGUVs. في الواقع، يمكن أن الأيونات ثنائية التكافؤ مثل المغنيسيوم والكالسيوم لحث فصل المرحلة الدهون وتسهيل التصاق، حتى إذا تنشأ هذه المشاكل قد يكون من المفيد لإضافة 1 ملم EDTA.
ومن الواضح أن أحد أبرز معالم المدينة أنظمة أعيد بالمقارنة مع خلايا هو القدرة على التحكم في تكوين الدهون. DPhPC GUVs تنمو بشكل جيد وتشكيل مستقرة بقع غشاء رفعه، وعملت هذه البروتوكولات أيضا EFfectively لمخاليط تحتوي على الدهون فسفاتيديل (PC)، فسفاتيديل إيثانولامين (PE)، phosphatidylglycerol (PG)، وحمض الفسفاتيديك (PA)، فسفاتيديل (PS) والكوليسترول. ومع ذلك، فإن النمو GUV حساس لكلا تكوين الدهون ومخازن 15، وهكذا المعلمات بروتوكول (على سبيل المثال، كمية الدهون المودعة، electroformation الجهد / التردد) قد تحتاج إلى تعديل لمخاليط الدهون التي تحتوي على تركيزات عالية من PE، اتهم الدهون (PG، PA، PS)، أو الكولسترول. عند البدء، البيض-PC، DOPC أو DPhPC هي الخيار الأول جيد، وأنه هو أيضا مفيد جدا لتشمل الدهون الفلورسنت لمراقبة نمو GUV والتمييز GUVs من الحويصلات عديد الصفاحات مع اثنين أو أكثر من طبقات ثنائية. يمكن خليط الدهون عن طريق الجمع بين تعليق SUV من الحلول الأوراق المالية على استعداد، لأن نسبة الدهون في مزيج خلال الخطوة الجفاف جزئية (شريطة كانت درجة الحرارة أعلى من أي الفردية درجة حرارة مرحلة انتقالية). باستخدام أعلى تركيز SUV (على سبيل المثال،10 ملغ / مل) حلول الأسهم يسمح قدرا كبيرا من المرونة، وهذه يمكن أن تضعف ثم إلى 3 ملغ / مل قبل التجفيف تعليق.
إذا محاولة للتكيف مع هذه البروتوكولات مع غيرها من البروتينات العابرة للغشاء، من المهم جدا أن تكون قادرة على حد سواء مراقبة مباشرة إدراج البروتين في وظيفة GUVs والبروتين الاختبار. في حين لا مشكلة مع KvAP، وهناك دائما احتمال أن أثناء الإماهة خطوة ستبقى البروتين العابرة للغشاء في المكدس الغشاء تؤدي إلى تشكيل GUVs-الدهون الوحيد. وضع العلامات الفلورية من البروتين غير مريحة للغاية، حيث أنه يوفر وسيلة سريعة وقاطعة لمراقبة البروتين إدراجها في GUVs وأيضا التحقق لتجميع داخل GUVs. بل هو أيضا مهم جدا لاختبار وظيفة البروتين في GUVs للتأكد من أن البروتين لم يتضرر خلال عملية إعادة. للالقنوات الأيونية مثل KvAP، يمكن أن القياسات التصحيح، المشبك تأسيس وجود قنوات وظيفية فيGUVs. ومع ذلك، فإن fluorescently المسمى، يجند عالية تقارب (على سبيل المثال، السم، الركيزة أو مكافحة الجسم) ستكون أيضا مفيدة جدا لاختبار حالة من البروتينات في GUVs.
وباختصار، يوضح هذا المقال كيفية إنتاج PROTEO-GUVs تحتوي على الجهد بوابات قناة البوتاسيوم KvAP وتوصيف لهم باستخدام المجهر مضان والكهربية. نأمل أن هذه الأساليب يمكن تكييفها لفئات جديدة من البروتينات الغشاء وتوفير أساس لأكثر تعقيدا نظم في المختبر لدراسة وبناء يعيشون النظر عن من مكوناته الأساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
- Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605 (2011).
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
