Rekonstituering av trans protein, KvAP, i gigantiske unilamellære blemmer (GUVs) er vist for to dehydrering-rehydrering metoder – electroformation og gel-assistert hevelse. I begge fremgangsmåter, er små unilamellære vesikler som inneholder proteinet smeltet sammen for å danne GUVs som kan deretter bli undersøkt ved fluorescens mikroskopi og patch-clamp elektrofysiologi.
Giant unilamellær Blemmer (GUVs) er en populær biomimetisk system for å studere membranassosiert fenomener. Imidlertid, som vanligvis brukes protokoller til å vokse GUVs må modifiseres for å danne GUVs som inneholder funksjonelle transmembranproteiner. Denne artikkelen beskriver to dehydrering-rehydrering metoder – electroformation og gel-assistert hevelse – å danne GUVs inneholder spennings gated kalium kanal, KvAP. I begge fremgangsmåter, er en oppløsning av protein-inneholdende små unilamellære vesikler delvis dehydratisert for å danne en stabel av membraner, som deretter tillatt å svelle i en rehydrering buffer. For electroformation fremgangsmåte blir filmen avsettes på platinaelektroder, slik at en vekselfelt kan brukes under film rehydrering. I motsetning til dette, benytter den gel-assistert svellende fremgangsmåte en agarosegel substrat for å forbedre film rehydrering. Begge metoder kan produsere GUVs i lave (f.eks, 5 mm) og fysiologiske (f.eks 100 mm) saltkonsentrasjoner. De resulterende GUVs er preget via fluorescens mikroskopi, og funksjonen av rekonstituert kanaler målt med innsiden ut patch-clamp konfigurasjon. Mens svelling i nærvær av et vekslende elektrisk felt (electroformation) gir et høyt utbytte av feilfrie GUVs, produserer den gel-assistert svellende fremgangsmåte en mer homogen proteinfordeling, og krever ikke noe spesielt utstyr.
Når studere de fysiske prinsippene som styrer levende systemer, bottom-up tilnærminger tillate en experimentalist å kontrollere systemet sammensetning og andre parametere som ikke er lett manipulert i cellebaserte systemer 1. For membranbaserte prosesser, har Giant unilamellær Blemmer (GUVs, diameter ~ 1-100 mikrometer) vist seg å være et svært nyttig biomimetisk system 2 – 7 som de er godt egnet for mikroskopi studier og micromanipulation 8-10. Mens det er mange forskjellige protokoller for å produsere GUVs, de fleste faller inn i to kategorier – emulsjon basert nærmer 11,12 og teknikker basert på rehydrere et lipid film 13-16. I emulsjonsbaserte fremgangsmåter, er de indre og ytre brosjyrer av Guv membraner sammen i rekkefølge fra lipid monolag ved vann / oljegrenseflater. Denne tilnærmingen er ideell for innkapsling av vannløselige proteiner medi GUVs, og for dannelse av GUVs med asymmetrisk paknings lipid sammensetning. Imidlertid kan GUVs dannet fra emulsjonene beholder spor av løsningsmiddel som endrer membranens mekaniske egenskaper for 17, og tilnærmingen er ikke særlig godt egnet til trans-membranprotein rekonstituering.
Film rehydrering metoder er avhengige av det faktum at tørking (dehydrering) forårsaker mange lipid-blandinger til å danne et multi-lamellære stabel av membraner. Dersom denne stabel blir deretter plassert i kontakt med en vandig buffer, blir membranene i stabelen beveger seg fra hverandre som oppløsningsmiddel flyter mellom dem, og på overflaten av stabelen, kan individuelle membraner løsner å danne GUVs 13,18 (samt en veritabel zoo andre lipidic objekter). Men selv for optimale buffer og lipid komposisjoner, har denne klassiske "spontan hevelse" metode en relativt lav avkastning av feilfrie GUVs. En mye brukt metode for å øke utbyttet av feilfrie GUVs er "electroformation221 ;, i hvilken en vekselstrøm (AC) felt påføres på film rehydrering. Mens mekanismen forblir dårlig forstått, "electroformation" kan gi fantastisk Guv utbytter (> 90% under gunstige forhold) for lav saltkonsentrasjon buffere (<5 mM) 14,19, og kan også arbeide i fysiologiske buffere (~ 100 mM) under anvendelse av en høyere frekvens (500 Hz versus 10 Hz) AC-feltet og platina elektroder 15. En alternativ tilnærming for å øke utbyttet av feilfrie GUVs er "gel-assistert svelling", der lipidoppløsningen er avsatt på en polymer gel substrat i stedet for den passive (for eksempel glass, PTFE) substrater anvendt i klassiske "spontan svelling ". Når den resulterende lipid / gel-filmen er rehydrert, kan GUVs raskt danner selv for fysiologiske buffere 16,20.
Alle disse metoder kan produsere lipid-bare GUVs som kan brukes til å studere membran forbundet fenomener sominteraksjon mellom løselige proteiner og membraner. Imidlertid, for å innlemme et trans-membranprotein i GUVs, er betydelige modifikasjoner for å sikre at proteinet forblir i en funksjonell tilstand gjennom omdanningsprosedyren. Mens oppløsninger av lipider i organiske løsningsmidler (f.eks, kloroform, cykloheksan) er ideelle for fremstilling av lipid-film, trans-membranproteiner er typisk bare stabile når deres hydrofobe transmembrandomenet er innleiret i et lipid-dobbeltlag, eller omgitt av en detergent micelle ( for eksempel i løpet av protein rensing). Således er utgangsmaterialet for en rekonstituering typisk innfødte membraner, renset protein i en detergentoppløsning, eller små unilamellære proteinholdige vesikler (Proteo-SUVer) og / eller multi-lamellære vesikler (proteo-MLV) ble dannet ved fjerning av detergent i tilstedeværelse av lipider. De fleste metoder for å innlemme disse membran proteiner i GUVs faller inn i tre kategorier.
Direkte Insertion: Trans-membran protein suspendert i vaskemiddel er blandet med pre-formet, lipid-bare, mildt vaskemiddel solubiliserte GUVs, og vaskemiddel deretter fjernes ved hjelp biobeads 21. Mens konseptuelt enkel, denne metoden krever nøyaktig kontroll av konsentrasjonen vaskemiddel, som for høy konsentrasjon vaskemiddel kan oppløse GUVs mens for lav konsentrasjon kan føre til proteinet for å brette eller aggregat.
GUV / Proteo-SUV Fusion: Protein i Proteo-SUVer er kombinert med pre-formet, lipid-bare GUVs og fusjon er tilrettelagt med spesielle fusogene peptider 22 eller vaskemiddel 21. Vanligvis omfanget av fusjon er begrenset fører til GUVs med lavt proteintetthet.
Dehydrering / Rehydrering: Et protein inneholdende lipid film blir dannet ved delvis dehydratisering av en proteo-SUV (eller proteo-MLV) løsning og GUVs dyrkes så som for en ren lipidfilm. Den åpenbare utfordringen er å beskytte protein under den delvise dehydratipå trinn 23, men metoden har blitt brukt til å rekonstituere trans-membran proteiner som Bakteriorodopsin, kalsium-ATPase, Inte og VDAC inn GUVs 7,23 – 25.
Denne artikkelen beskriver dehydrering / rehydrering protokoller for å gjøre GUVs inneholder spennings gated kalium kanal, KvAP, fra den hyper-varmekrevende Archaea, Aeropyrum pernix. KvAP har en høy grad av homologi til eukaryote spenningsavhengige kaliumkanaler 26 og en kjent krystallstruktur 27 , noe som gjør det en god modell for å studere mekanismen av spennings gating. Produksjonen av de Proteo-SUVer har blitt beskrevet i detalj tidligere, og er ikke en del av denne opplæringen 26,28,29. Viktigst, KvAP Proteo-SUVer ikke å bli produsert for hver GUV preparat, som de kan lagres i små (for eksempel 10 mikroliter) alikvoter ved -80 ° C i lengre tidsperioder (> 1 år). Electroformationeller gel-assistert hevelse kan deretter brukes til å vokse GUVs fra KvAP Proteo-SUVer (eller proteo-MLV).
De viktigste fremgangsmåten for electroformation protokollen er vist i figur 1. Dråper av en oppløsning av SUV inneholdende proteinet avsettes på platinatråder (vist i figur 2). Delvis dehydrering av SUV-suspensjonen fører til dannelse av en lipid proteinfilm ved fusjon av SUVer. Under rehydratisering, er en AC-feltet påtrykkes elektrodene for å bistå lipid lagene å delaminere og danner GUVs. Et felt 10 Hz fungerer godt når du bruker "low-salt" (<5 mm) rehydrering buffer 28 og GUVs ta flere timer å vokse. I motsetning til dette, fysiologiske buffere (inneholdende ~ 100 mM salt) fungere godt med en lavere spenning, 500 Hz AC-feltet, men krever en langvarig (~ 12 timer) svellende periode 15. Denne metoden er basert på en tidligere protokollen med ITO glir 24, men bruker en tilpasset kammer fortsinnelukker to platinatråder som vist i figur 2 (se diskusjonen for designdetaljer og forslag til enklere, improvisert kamre).
Figur 3 illustrerer den gel-assistert svelling metode. Protokollen fungerer godt med buffere med fysiologiske saltkonsentrasjoner, er hurtig, og produserer GUVs med en mer homogen proteinfordeling. Men (det vil si, er at GUV membran uniform på optiske lengde-skalaer og ikke vedlegge gjenstander) utbyttet av isolerte, tilsynelatende feilfrie GUVs er lavere, selv om det gir et tilstrekkelig antall for patch-clamp og mikro-manipulasjon eksperimenter . Metoden var basert på en protokoll ved hjelp av agarosegel for å produsere lipid-bare GUVs 16 og krever mindre spesialisert utstyr enn electroformation metoden.
Karakteriseringen av GUVs med fluorescensmikroskopi er beskrevet, samt fremgangsmåter ved bruk av en standard patch-clamp set-up tomåle KvAP aktivitet i "inside-out" utskåret membran patcher.
Voksende proteinholdig GUVs kan være vanskeligere enn lipid-bare GUVs. Spesielt kan den endelige GUV utbytte avhenger følsomt av nøyaktig hvordan SUV oppløsningen avsettes og dehydratiseres for å danne membranstabelen. For noen uten noen tidligere erfaring med GUVs, kan det være nyttig først å vokse lipid-bare GUVs etter en konvensjonell protokoll 15,16 hvori membranfilmen dannes ved avsetning av lipider i et organisk oppløsningsmiddel. Når den konvensjonelle protokollen fungerer godt, kan SUV deponering og delvis dehydrering da bli mestret ved hjelp av lipid-bare SUVer, som også er veldig nyttig når du justerer protokollen for en ny fettsammensetning. Når GUVs vokse pålitelig fra lipid-bare SUVer, er det da bare et lite skritt for å produsere proteinholdig GUVs fra Proteo-SUVer.
Biomimetic modellsystemer er et viktig verktøy for å studere egenskapene og interaksjoner av proteiner og membraner. Sammenlignet med andre rekonstituert systemer som BLMs eller støttes lipidmembraner, GUV baserte systemer presentere flere muligheter, inkludert en betydelig styring av membran sammensetning, spenning og geometri, samt å være virkelig oljefri. Imidlertid, som omfatter transmembranproteiner, så som KvAP, inn GUVs krever betydelige tilpasninger av konvensjonelle protokoller for lipid-bare GUVs. Den el…
The authors have nothing to disclose.
We thank Susanne Fenz for discussing the possibility of reconstituting proteins by agarose swelling, Feng Ching Tsai for current measurements, and present and former members of the Bassereau group for support and assistance. The project was funded by the Agence Nationale de la Recherche (grant BLAN-0057-01), by the European Commission (NoE SoftComp), by the Université Pierre et Marie Curie (grant from the FED21, Dynamique des Systèmes Complexes). M.G. was supported by an Institut Curie International PhD Fellowship, S.A. by a fellowship from the Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T. by a Marie Curie Incoming International Fellowship from the European Commission and a grant from the Université Pierre et Marie Curie. The publication fees were covered by the Labex ‘CelTisPhyBio’ (ANR-11-LABX0038).
Name of the Material/Equipment |
Company | Catalog Number | Comments/ Description |
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
Amber vials and teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
Parafilm | VWR | 291-1214 | |
microcentrifuge tube | eppendorf | diverse | |
Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
KCl | Sigma | P9333-1kg | |
Hepes | Sigma | H3375-100G | |
TRIS | Euromex | EU0011-A | |
Osmometer | Wescor | Vapro | |
pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
Syringe filter 0.2µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
Function generator | TTi | TG315 | |
Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d=0.5mm |
Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
Cover slides 22×40 mm No1,5 | VWR | 631-0136 | |
Cover slides 22×22 mm No1,5 | VWR | 631-0125 | |
plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cmx1cm |
patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
Labview | National Instruments | version 8.6 | |
Glass pipettes boro silicate OD 1mm ID 0.58mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
pipette puller | Sutter | P-2000 | |
Camera | ProSilica | GC1380 | |
Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
Objective | Zeiss | 40x long working distance, Phase contrast | |
Objective | Zeiss | 100x Plan-Apochromat NA 1.3 | |
Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
Objective | Nikon | Plan Fluor 100× NA1.3 | |
matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |