Summary
전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.
Abstract
거대한 단일 층 소포 (GUVs)는 멤브레인 관련 현상 연구를위한 인기있는 생체 모방 시스템이다. 그러나, 일반적으로 트랜스 GUVs 기능적 단백질을 함유 GUVs 형성하기 위해 수정되어야 성장 프로토콜을 사용했다. 전기 주조 및 겔을 이용한 붓기 - - 전압 - 문이 칼륨 채널, KvAP를 포함 GUVs을 형성하기 위해이 문서에서는 두 탈수 수분 보충 방법을 설명합니다. 두 방법 모두에서, 단백질 - 함유 작은 단층 라멜라 소포 용액을 재수 버퍼 팽윤시킨다 막 스택을 형성하기 위해 부분적으로 탈수된다. AC 필드 막 재수 동안에인가 될 수 있도록 전기 주조 방법의 경우, 필름은 백금 전극 상에 증착된다. 대조적으로, 보조 팽윤 겔 방법은 막 재수 향상 아가 로스 겔 기판을 사용한다. 두 방법 (예를 들어, 5 mM)을 낮은 생리 (예를 들어, 100 mM)을 소금 농도 GUVs를 생성 할 수 있습니다. 얻어진 GUVs는 형광 현미경을 통해 특성화되고, 재구성 된 채널의 기능은 인사이드 아웃 (inside-out) 패치 - 클램프 구성을 사용하여 측정. 교번 전계 (전기 주조)의 존재 하에서 팽윤 무 결함 GUVs의 고 수율을 제공하는 동안, 보조 팽윤 겔 방법은보다 균일 한 분포 단백질을 생산 및 특별한 장치를 필요로하지 않는다.
Introduction
살아있는 시스템을 지배하는 물리적 원리를 연구하면, 상향식 접근법 실험가 시스템 조성물 쉽게 셀 기반 시스템 (1)에 조작되지 않은 다른 매개 변수를 제어 할 수있다. 10 - 그들은 현미경 연구 및 미세 조작 8에 적합하다로 7 - 멤브레인 기반 프로세스의 경우, 거대한 단일 층 소포 (GUVs, 직경 ~ ~ 100 μm의)는 매우 유용한 생체 모방 시스템 2를 입증했다. GUVs을 생산하는 여러 가지 프로토콜이 있지만, 대부분은 두 가지 범주로 구분 - 16 - 기반 에멀젼은 지질 필름 (13)을 재수에 따라 11, 12 및 기술에 접근한다. 에멀젼 계 방법에서, GUV 막의 내측과 외측 소엽 물 / 오일 계면에서 지질 단층으로부터 순차적으로 조립된다. 이 접근 방식과 수용성 단백질을 캡슐화에 이상적입니다GUVs, 그리고 비대칭 전단지 지질 조성 GUVs을 형성. 그러나, 에멀젼으로부터 형성된 GUVs 멤브레인의 기계적 특성을 변경 (17) 용매의 흔적을 유지할 수 있고, 방법은 트랜스 멤브레인 단백질 재구성에 특히 적합하지 않다.
필름 재수 방법 (탈수)에 의한 건조 막의 다중 층상 스택을 형성하기 위해 많은 지질 혼합물을 유발한다는 사실에 의존한다. 이 스택이어서 수성 완충액으로 접촉하여 배치되는 경우, 스택 막은 그들 사이 스택의 표면에서 떨어져 용매 흐름을 이동 개별 막은 GUVs 13,18 (도 전함 동물원을 형성하도록 분리 할 다른 지질 개체). 그러나, 최적의 버퍼와 지질 조성에 대해,이 고전 "자연 붓기"방법은 결함이없는 GUVs의 상대적으로 낮은 수율을 가지고있다. 무 결함 GUVs의 수율을 향상하기위한 한 방법은 널리 사용되는 "전기 주조 인교류 (AC) 필드가 막 중에 수분 공급 적용한 221 ;,. 메커니즘이 제대로 이해 남아있는 동안, "전기 주조"아름다운 GUV 수익률을 제공 할 수 있습니다 (> 유리한 상황에서 90 %) 낮은 소금 농도 버퍼 (<5 mM)을 14,19, 심지어 (~ 100 mM)을 생리 학적 버퍼에서 작업 할 수 사용 더 높은 주파수 (10 Hz에서 500 Hz로 대) AC 필드 백금 전극 (15). 무 결함 GUVs의 수율을 높일 수있는 대안이되는 지질 용액 (예, 유리, PTFE) 기판이 클래식 "자발적 팽창에 사용보다는 수동보다는 중합체 겔 기판 상에 증착되며,"겔 - 보조 팽윤 "입니다 ". 얻어진 지질 / 겔 막을 재수되면 GUVs 급속 심지어 생리 버퍼 16, 20에 대해 형성 할 수있다.
이러한 모든 방법들은 같은 멤브레인 관련된 현상을 연구하는데 사용될 수있는 전용 GUVs 지질을 생산할 수있다수용성 단백질과 세포막 사이의 상호 작용. 그러나 GUVs로 트랜스 막 단백질을 포함하는, 상당한 변형 단백질 재구성 절차 내내 작동 상태로 유지되도록 요구된다. 유기 용매 (예, 클로로포름, 시클로 헥산)에 지질 용액은 리피드 필름의 제조에 적합하지만 소수성 트랜스 멤브레인 도메인이 지질 이중층에 내장되거나 세제 미셀에 의해 포위되는 경우, 트랜스 멤브레인 단백질은 전형적으로 안정 ( 예를 들어, 단백질 정제 동안). 이와 같이, 재구성을위한 출발 물질은 통상적 세제를 제거함으로써 형성 네이티브 막, 세제 용액 중의 정제 된 단백질, 또는 작은 단일 라멜라 단백질 - 함유 소포 (proteo-의 SUVs) 및 / 또는 멀티 라멜라 베 시클 (proteo-MLVs) 인 지질의 존재. GUVs에 이러한 막 단백질을 포함하는 대부분의 방법은 세 가지 범주로 분류된다.
직접 InsertioN : 세제 현탁 트랜스 멤브레인 단백질이 예비 형성된 지질 단지 약간 용해 GUVs 세제와 혼합 한 후 biobeads 세제 (21)를 사용하여 제거된다. 개념적으로 단순하지만,이 방법은 너무 높은 세정제 농도는 단백질 농도가 전개 또는 응집의 원인이 너무 낮 동안 GUVs을 용해 할 수있는 바와 같이, 세제 농도의 정밀 제어를 필요로한다.
GUV / Proteo-SUV 퓨전 : proteo - 포드 SUV의 단백질은 미리 형성, 지질 전용 GUVs와 결합 및 융합 특별한 융해 펩티드 (22) 또는 세제 (21)와 용이하게된다. 일반적으로 융합의 정도가 낮은 단백질 밀도 GUVs을 선도 제한됩니다.
탈수 / 재수 : 단백질 함유 지질 필름 부분 proteo-SUV의 탈수 (또는 proteo-MLV) 솔루션과 GUVs에 의해 형성된다은 순수한 지질 필름으로 성장하고 있습니다. 명백한 도전 부분 dehydrati 동안 단백질을 보호하기위한 것이다25 - 23 단계 있지만 방법에서 성공적으로 GUVs 7,23 박테리오로돕신 예컨대 칼슘 ATP 아제, 인테그린 VDAC와 같은 트랜스 막 단백질을 재구성하는 데 사용되어왔다.
이 문서는 하이퍼 고온 성 고세균, 에로 피 룸속의 pernix에서 전압 개폐 칼륨 통로, KvAP을 함유 GUVs 있도록 탈수 / 재수 프로토콜을 설명한다. KvAP 진핵 전압 의존성 칼륨 채널 (26)에 높은 상 동성 및 공지 된 결정 구조를 갖는 27 전압 게이팅의 메커니즘을 공부 그것에게 좋은 모델을 만들기. proteo-SUV 차량의 생산 이전에 상세하게 설명이 튜토리얼 26,28,29의 일부가되었습니다. 중요한 KvAP의 proteo-한 SUV들이 장시간 (> 1 년)에 대해 -80 ° C에서 작은 (예를 들면, 10 μL) 분취 액에 저장 될 수 있으므로, 각 GUV 제제에서 제조 할 필요가 없다. 전기 주조또는 겔을 이용한 붓기는 KvAP의 proteo - 포드 SUV에서 GUVs을 성장하는 데 사용 (또는 proteo-MLVs) 할 수 있습니다.
전기 주조 프로토콜의 핵심 단계는도 1에 도시되어있다. 단백질을 포함 SUV 차량 용액의 방울 (도 2에 도시), 백금 와이어 상에 증착된다. SUV 현탁액 부분 탈수 SUV 차량의 융합을 통하여 지질 단백질 막의 형성을 유도. 재수 화 동안 AC 필드 GUVs을 박리하고 형성하는 지질 층을 돕기 위해 전극에인가된다. "저염"를 사용하는 경우 10 Hz의 필드가 잘 작동 (<5 mM)을 재수 버퍼 (28)와 GUVs는 몇 시간이 걸릴 성장합니다. 대조적으로, 생리 학적 완충액은 낮은 전압, 500 Hz의 AC 필드에서 잘 작동하지만, 필요 (~ 100 mM의 염을 포함하는) 장기간 (~ 12 시간) 동안 15 팽윤. 이 방법은 ITO (24)를 슬라이드하여 초기 프로토콜에 기초하지만, 맞춤 챔버를 계속 이용한다그림 2와 같이 두 개의 백금 와이어를 aining (간단한을위한 설계 세부 사항 및 제안 사항에 대한 설명을 참조하십시오, 챔버를 즉석에서).
도 3은 보조 팽윤 겔 방법을 나타내는 도면. 이 프로토콜은, 생리 소금 농도 버퍼와 함께 잘 작동 신속하고,보다 균일 한 단백질 분포 GUVs을 생산하고 있습니다. 그러나, 절연, 분명히 결함이없는 GUVs의 수율 (즉, GUV 막은 균일 한 광 길이 규모에 있고, 어떤 물체를 동봉하지 않음)에서 패치 클램프 및 마이크로 조작 실험에 충분한을 제공하지만, 낮은 . 이 방법은 지질 전용 GUVs 16을 제조하고 전기 주조 방법보다 덜 특수한 장비를 필요로 아가 로스 겔을 사용하는 프로토콜에 기초 하였다.
형광 현미경과 GUVs의 특성은 표준 패치 클램프 설정 최대를 사용하는 절차뿐만 아니라, 설명"인사이드 아웃 (inside-out)"에 KvAP 활동을 측정 멤브레인 패치를 절제.
성장 단백질 함유 GUVs 지질 전용 GUVs보다 더 어려울 수 있습니다. 특히, 최종 GUV 수율은 막 스택을 형성하는 방법을 정확히 SUV 용액이 증착되고, 탈수에 민감하게 의존 할 수있다. GUVs와 이전의 경험이없는 사람의 경우, 제 막 필름이 유기 용매로부터 지질을 증착함으로써 형성되는 종래의 프로토콜 15,16 다음 지질 GUVs 만 성장하는 것이 도움이 될 수있다. 기존의 프로토콜이 잘 작동되면, SUV의 증착 및 부분적인 탈수는 새로운 지질 조성물 프로토콜을 조정할 때 매우 유용 지질 전용 SUV 차량을 사용하여 마스터 할 수 있습니다. GUVs 지질 전용 SUV 차량에서 안정적 성장할 때 proteo-SUV의 발 - 함유 단백질을 생산하는 GUVs 단지 작은 단계 후이다.
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Protocol
1. 솔루션 준비
- 5 mM의 KCl을, 1 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 트리스 (산도 7.5), 2 mM의 트레 할로 오스를 포함하는 'SUV 버퍼'5 mL를 준비합니다. 0.2 μm의 주사기 필터 버퍼를 여과하고 -20 ℃에서 저장 될 수 1ml의 분취 량으로 나눈다.
참고 : 시약 및 장비에 대한 추가 세부 사항이 물질 목록에 나와 있습니다. - 영화 재수 동안 GUV 내부를 채울 것이다 GUV '성장 버퍼'40 ml의를 준비합니다. '저염'성장의 경우, 5 mM의 KCl을, 1 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 1 mM 트리스 (PH 7.5), 그리고 ~ 400 밀리미터 자당을 결합한다. '생리 소금의 성장을 위해, 100 mM의 KCl을, 5 mM의 HEPES (PH 7.4) 또는 5 mM 트리스 (PH 7.5), 그리고 ~ 200 밀리미터 자당을 결합한다.
- 100 mM의 KCl을 5 mM의 HEPES (PH 7.4), 5 mM 트리스 (PH 7.5) 및 ~ 200 mM의 글루코스를 조합하여 실험 챔버 외부 솔루션 '관측의 버퍼 40㎖의 준비.
참고 :이 버퍼는 엑사 있습니다mples. 다른 실험에 대한 버퍼를 적응할 수있는 설명을 참조하십시오. - osmometer와 성장과 관찰 버퍼의 osmolarities을 측정합니다. GUVs가 용해 또는 관찰 챔버로 성장 실로부터 이송 될 때 붕괴되지 않도록 1 % 이내로 일치하도록 그들을 자당 또는 글루코오스의 과립을 추가한다.
참고 : 자당의 1 ㎜ (13.7 40ml의 당 MG) 또는 포도당 (40 ml를 당 7.2 mg)을 추가하는이 농도 범위에서 1 ~ mOsm하여 삼투압을 증가시킨다. - 0.2 μm의 필터로 성장과 관찰 버퍼를 필터 및 세균의 성장을 억제하기 위해 4 ℃에서 저장합니다.
- GUVs가 스틱 확산 버스트 않도록 실험 챔버의 표면을 패시베이션하기 위해 필요한 5 ㎎ / ㎖ 베타 - 카제인 용액을 형성하는 20 mM TRIS (PH 7.5) 완충액 10ml에 베타 - 카제인 50mg을 녹인다. 베타 - 카제인 완전히 0.5 ml의 분취 량으로, 필터 (0.2 μm의) 정보 (39 ° C에서 몇 시간까지)에 용해되면 플래시 냉동 저장할 수있는나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 (4 ℃에서 보관 해동 된 분액 전형적 일주까지 사용할 수있다).
2. SUV 준비
- 준비하고 이전에 발행 된 상세한 프로토콜 (28) 다음 proteo - 포드 SUV의 분량을 동결. KvAP 형광 (질량) 1:10 지질 비율로 단백질에 DPhPC SUV 차량으로 재구성 알렉사-488 말레이 미드 (10 ㎎ / ㎖)로 표지를 사용하십시오.
참고 : 야생 형 KvAP는 세포 내 C 말단 (아미노산 247) 근처에있는 단량체 당 하나의 시스테인이 포함되어 있습니다. - 형광등, 지질 전용 포드 SUV :
참고 : 니트릴 장갑과 보안경을 착용 흄 후드 클로로포름을 처리합니다. 클로로포름을 용해시킬 수있는 플라스틱의 사용을 피하십시오. 클로로포름 용액은 테플론 캡 호박색 유리 바이알에 저장 유리 주사기를 사용하여 전송 될 수있다. 이전과 지질을 피펫 팅 한 후 클로로포름으로 적어도 5-10 번 모든 유리를 씻어주의하십시오.- 100 ㎕를 준비텍사스 레드 DHPE 용액 8.2 μL (1 ㎎ / ㎖로 DPhPC 용액 100 ㎕ (클로로포름 내의 10 ㎎ / ㎖)를 혼합하여 적색 형광 지질, 텍사스 레드 DHPE, 0.5 몰 %를 함유하는 10 ㎎ / ㎖ DPhPC SUV의 1.5 ml의 호박 유리 병)에 메탄올.
- 바이알을 회전시키면서 화학 후드에서 질소 기류하에 지질을 건조. 영화는 건조로 표시되면, 잔류 용매를 제거하기 위해 3 시간 동안 진공 상태에서 지질을 배치합니다.
- 지질에 SUV 버퍼의 100 μl를 추가하고, 소용돌이 적극적에는 지질은 유리 병의 벽에 붙어 남아 있지 않을 때까지 액이 균일하게 유백색이다.
- SUV 차량을 형성하는 지질 용액을 초음파 처리. 초음파가 가장 움직임이 발생 될 때까지 병의 위치를 조정하고 유리 병 내부의 흐름, 불필요하게 솔루션을 열주의 바랍니다. 가능하면 용액이 투명해질 때까지 초음파를 계속하거나, 투명 (팁 초음파 2-5 분 ~ 목욕 초음파 20 분).
- Aliquot의 SUV 차량 (예를 들어, 10 μL, 20 μL)와 동결 (-20 ° C)에 대한 나중에 사용하기.
참고 : 지질, 특히 불포화 지질, 쉽게 고장. 아르곤에서 20 ° C (80 ° C)에서 보관 지질 솔루션 및 6 개월 이내에 사용한다. 지질 분해 산물을 박층 크로마토 그래피로 검출 할 수있다.
전기 주조 3. GUV 성장
- 전기 주조 챔버를 준비합니다.
- 챔버를 청소하지 않은 경우, 창문을 모두 제거 실란트와 기름을 닦아, 전선을 추출, 린스 물과 교대로 에탄올 (≥70 %)를 사용하여 조직과 챔버를 문질러.
- 잘 전선을 문질러 아세톤에 전선 및 챔버 잠수함, 5 분 동안 초음파 처리. 조직이 다시 아세톤을 이용하여 모든 닦습니다. 5 분 동안 에탄올과 초음파 처리에 실을 넣어.
- 관통 구멍 와이어를 삽입하여 챔버를 조립하고, 회전하고 아칸소 확인 와이어 닦아전자 깨끗한. 증류수 챔버 넣어 5 분 동안 초음파 처리하고, 질소 또는 공기의 흐름과 함께 챔버를 건조.
- SUV 버퍼에 3 ㎎ / ㎖ SUV 현탁액의 30 μl를 준비합니다. 단백질 함유 GUVs을 형성 proteo - 포드 SUV의 8 μl를 결합 (DPhPC 10 ㎎ / ㎖ KvAP 1시 10분), 형광 SUV 차량의 2 μL (10 ㎎ / ㎖ DPhPC, 0.5 몰 % TexasRed-DHPE)과 SUV의 20 μL 12.5 및 0.1 몰 % TexasRed-DHPE : 1의 지질 (질량) 비율에 최종 단백질을 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 버퍼. 적극적으로 솔루션을 섞는다.
- 또한, 단순히 형광 SUV 차량의 10 μl를 결합, 지질 전용 포드 SUV와 프로토콜을 연습 할 수있는 (10 ㎎ / DPhPC 0.5 몰 % TexasRed-DHPE ㎖)을 20 μL의 SUV 버퍼와.
- SUV 솔루션을 입금.
- 전선의 SUV 솔루션의 작은 (<0.2 μL) 방울을 입금 2 μL 피펫 또는 5 μL 유리 주사기를 사용합니다. 약 1 ㎕의 용액을 따라 일련의 방울을 형성하는데 필요한와이어의 1cm. 방울 충분히 작고 충분히 그들이 만지거나 퓨즈하지 않는 것이 떨어져 있는지 확인합니다.
- 증착 된 포드 SUV가 야외에서 30 분 ~에 대한 건조 시키십시오. 모든 상품이 정착되면 지질 보증금은 현미경으로 관찰하기 쉽게 때문에, 와이어를 회전 할 수 있습니다.
주 : SUV 차량이 충분히 건조되지 않으면 성장 버퍼가 추가 될 때 단백질을 손상시킬 수있는 너무 많은 건조하는 동안, 그들은 단지, 와이어 씻어있다. 습도는 건조 속도, 건조 시간 및 / 또는 습도에 영향 때문에 최적의 결과 (30)를 조정할 수있다. 전선의 지질 필름은 현미경으로 볼 수 있어야합니다.
- 챔버를 조립합니다.
- 상공 회의소 아래 인쇄 :이 틈없이 준수 있도록 챔버 바닥을 밀봉에 대해 세 개의 우물 주위의 챔버의 바닥에 진공 그리스를 적용하고 부드럽게 40mm X 22mm 커버 슬립을 눌러 주사기를 사용합니다. 챔버의 측면 (전선 출구)와 인감붙여 넣기를 밀봉. 세 개의 우물을 요약 챔버의 상부에 진공 그리스를 적용합니다.
- 각 웰이 정상에 채워질 때까지 천천히 성장 버퍼를 추가합니다. 이 전극 떨어져 지질 필름을 벗겨 수있는 우물에서 솔루션의 빠른 움직임을 피하십시오.
- 하단 커버 슬립을 제거 않도록주의하면서, 그리스에 부드럽게 상단 커버 슬라이드를 눌러 챔버를 닫습니다. 상단 커버 슬립의 가장자리에 버퍼의 방울을 제거하기 위해 조직을 사용합니다.
참고 :이 지질 필름이 전선에 남아 있는지 확인하기 위해 현미경 실을 검사 할 수있는 좋은 시간입니다.
- 두 악어 클립을 사용하여 와이어 신호 발생기를 연결한다. 낮은 / 높은 소금 버퍼 광장 (Vrms의)을 의미하는 주파수 (저 / 고 소금 버퍼 10 Hz에서 / 500 Hz의 정현파)를 설정하고 측정하고 0.7 / 0.35 V 루트에 전선에서의 전압을 조정하는 멀티 미터를 사용합니다. 형광 광으로부터 보호를 위해 알루미늄 호일로 덮고 챔버. t을 남겨주세요그는 GUVs 낮은 소금 버퍼 2 ~ 3 시간, 그리고 높은 소금 버퍼에 대한 12 시간 또는 O / N에 대한 성장합니다.
- 발전기에서 챔버를 분리하고 조심스럽게 GUV 성장을 평가하기 위해 거꾸로 현미경에 놓습니다. 중간에 전선에서 GUVs를 분리 할 수있다 우물에 느린, 꾸준한 운동 또는 유체 흐름을 사용합니다.
참고 : 아무 곳이나 전선의 아래쪽에 GUVs는 표면 형광로 볼 수 있습니다 동안 와이어 가장자리에 GUVs는 위상차 (40 배 긴 작동 거리 목적)에서 일반적으로 볼 수 있습니다. 더 GUVs 볼 수없는 경우, 상부면을보고 전선을 돌려보십시오. GUVs 며칠 동안 성장 챔버에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
젤 이용한 붓기 4. GUV 성장
- 순수한 물 10 mL로 100 mg의 아가로 오스를 혼합하여 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖를 준비한다. 그것이 ~ 20 초 동안 480 W에서 전자 레인지에 배치하여 끓을 때까지 가열한다. 아가로 오스가 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 저어.
참고 :이 솔루션4 ° C에 저장하고 필요할 때 다시 가열 될 수있다. - 플라즈마 청소 (에어 플라즈마) 아가로 오스 솔루션이 멋지게 확산되도록 1 분의 커버 슬라이드. 플라즈마 세정의 효과가 빨리 닳아으로 다음 15 분 이내에 커버 슬라이드를 사용합니다.
- 전체 표면을 적시 솔루션 있도록 각 22 X 22mm 2 슬라이드에 따뜻한 아가로 오스 솔루션 200 μl를 적용합니다. 수직 슬라이드를 기울여 물기를 제거하고 슬라이드에 아가로 오스의 단지 얇은 부드러운 층을 떠날 조직에 하단을 터치합니다.
- 60 ° C에서 핫 플레이트 또는 오븐에 슬라이드를 삽입하고 적어도 30 분 동안 건조 둡니다. 아가로 오스 필름은 눈에 거의 볼 수 있습니다. 슬라이드를 실온으로 냉각 한 후, 즉시 사용하거나 4 ° C에서 밀폐 용기에 1 주일까지 저장합니다.
- 표준 3.5 cm 페트리 접시에 아가로 오스 코팅 커버 슬립을 놓습니다.
- 3.2 절과 SUV 솔루션을 준비하고 적용 ~ SUV 용액 (3 ㎎ / ㎖ 지질)에 15 μL~ 아가로 오스 표면에 30 아주 작은 방울 부드럽게. 너무 많은 아가로 오스 층을 왜곡하지 않도록주의하십시오.
- 약 10 ~ 15 분 동안 질소의 부드러운 흐름에서 슬라이드를 놓고 방울 건조로 눈으로 버퍼의 증발을 따릅니다.
- 즉시 건조 SUV 차량 것처럼, 슬라이드면을 덮도록 성장 버퍼를 추가한다. 작은 3.5 cm 페트리 접시 사용 버퍼의 ~ 1 ml의하십시오.
- 붓기는 30 분 ~ 동안 진행 한 후 위상차 또는 차동 간섭 대비 (DIC)과 거꾸로 현미경을 사용하여 실 GUVs의 성장을 검사 할 수 있습니다.
주 : 표면 형광 관측으로 인해, 아가 로스 겔의 자동 형광 강한 형광의 배경으로 어렵다.
5. 수확 및 관측 GUVs
- 관찰 챔버 (예를 들어, 작은 페트리 접시 또는 유리 커버 슬립) GUVs 스틱하지 않도록, 확산 챔버 바닥에 버스트 보호막을. 참 커버BER 베타 - 카제인 용액과 바닥은, 5 분 동안 부화 공기 또는 질소 스트림으로 건조 순수한 물 카제인 용액을 씻어 내고, 마지막 관찰 완충액 추가 (예를 들면, ~ 작은 배양 접시에 5 mm 깊이).
- GUVs을 수확. 오프닝이 더 큰 (~ 2mm 직경) 그래서 100 μL 피펫 팁의 끝을 잘라 쉽게 GUVs를 파괴 할 수 피펫의 전단 응력으로 천천히 열망.
- 전기 형성 GUVs를 들어, 부드럽게 상단 커버 슬립을 제거하여 성장 챔버를 엽니 다. GUVs를 분리 와이어를 따라 피펫 팁을 이동하는 동안 ~ 각 전선 및 흡인 바로 위에 50 μl를 피펫 팁을 놓습니다.
주 : 와이어의 "다른 쪽"에 GUVs를 수집하는 와이어를 회전하는 데 도움이 될 수 있습니다. - "젤 이용한 붓기"GUVs를 들어, 첫 번째 GUVs가 커버 슬립 표면에서 분리하는 데 도움이되는 몇 번 페트리 접시의 측면을 누릅니다. P 동안 50 μL 단지 커버 슬립과 흡인 위의 피펫 팁의 위치를다시 표면 위에 팁을 ulling. 직접 최대 1 주일 동안 4 ° C에 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 관찰 챔버, 또는 저장소에 수확 GUVs을 전송합니다.
- 전기 형성 GUVs를 들어, 부드럽게 상단 커버 슬립을 제거하여 성장 챔버를 엽니 다. GUVs를 분리 와이어를 따라 피펫 팁을 이동하는 동안 ~ 각 전선 및 흡인 바로 위에 50 μl를 피펫 팁을 놓습니다.
- , 거꾸로 현미경에서 관찰 챔버를 놓고 관찰 챔버에 GUVs을 추가하고 GUVs 챔버 바닥에 정착 몇 분을 기다립니다.
- 빠르고 부드러운, 구형 ( '무 결함') "GUV 후보"를 찾습니다 위상 대비 또는 DIC와 챔버를 조사. 내부 중첩 된 모든 포함하는 작은 리포좀을 제외 표면 형광의 각 "GUV 후보"를 검사합니다. 마지막으로, 지질 형광 강도가 단일 막 (즉, 단일 층)와 균일하고 호환되는지 확인합니다.
참고 : 그들은 위상 대비 또는 DIC 이미지에서 단일 층 나타나도록 일부 bilamellar (또는 다중 층상) 소포에서, 멤브레인은 해결 될 너무 가까이 있습니다. 그러나, 이들 객체는 실제 unilame 구별 될 수있다두 번 (또는 그 이상)의 밝은 자신의 지질 형광에 의해 llar GUVs.
6. 패치 클램핑 GUVs
- 피펫 풀러 추천 프로그램을 사용하여 표준 붕규산 모세관 유리에서 1-2 μm의 팁 직경 패치 피펫을 확인합니다.
참고 : 화재 연마 같은 특수 치료가 필요하지 않으며, 피펫은 그들이 닫힌 상자에 보관하는 경우가 당겨 한 후 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. - GUVs가 부착 챔버 표면 상에 확산되고 파열되지 않도록 베타 - 카제인 용액 (5 ㎎ / ㎖)로 배양하여 챔버 보호막. 5 분 후 카제인을 씻어.
- 접지 전극을 삽입 관찰 버퍼 챔버를 작성 단계 5.2 및 5.3에 설명 된대로 GUV 현탁액의 10 μl를 전송하고, GUVs가 바닥에 정착 몇 분을 기다립니다.
- 솔루션 (관찰 버퍼 또는 다른 삼투압 용액)와 신선한 패치 피펫을 입력하고패치 클램프 증폭기 headstage에 마운트.
- 챔버를 통해 검색 5.4 절에 설명 된대로 "무 결함"GUV을 찾은이 형광 단백질이 포함되어 있는지 확인합니다.
- 일정한 양의 압력 적용 (> 100 파를, 또는 약 1cm 압력계의 H 2 O) 깨끗 한 인테리어 패치 피펫을 유지하고, 챔버에 패치 피펫을 삽입합니다. 시야에 패치 피펫을 가져와 / 측정 오프셋 및 저항 피펫 전압을 보상하고, 끝이 깨끗한 지 확인하기 위해 형광 조명 아래 피펫을 검사 테스트 펄스를 적용합니다.
- GUV으로 패치 피펫을 지참하고, 필요한 경우 동시에 "도망"GUV을하지 않는 패치 피펫에서 바깥쪽으로 흐름 있도록 긍정적 인 압력을 줄일 수 있습니다. 패치 피펫 GUV에 가까운 경우, 패치 피펫에 대한 GUV를 당겨 (5cm H 2 O까지) 부압을 적용합니다. 같은 저항을 모니터 "; GUV 막 혀 "패치 피펫과 기가 시일 형태로 들어갑니다.
- 기가 시일이 형성되지 않은 경우, 챔버에서 패치 피펫을 제거하고 6.4 단계로 돌아갑니다. 막 패치가 기가 시일을 형성하지만, GUV가 피펫에 부착 된 상태로 유지하는 경우, GUV 떼어 파열 GUV을 실 바닥에, 또는 간단히 솔루션에서 피펫을 이동하여 패치를 절제.
- 인사이드 - 아웃 막 패치 GUV로부터 잘라 내고 기가 시일이 안정되면, 시험 펄스를 스위치 오프 및도 13에 도시 한 바와 같이 전압 프로토콜을 적용한다.
참고 : 그림 13은 현재 패치 전극에 흐르는 "긍정적"인 내부 아웃 패치에 대한 표준 전기 생리학 규칙을 따르며, V = V 목욕 - V 피펫. 음의 전위 패치를 잡고 (예를 들어, V = -100 MV) 휴식 상태에서 ~ 30 초 장소 KvAP을위한 단계 동안 (10긍정적 인 전위 (예를 들어, V = 100 MV)이 다음 실시 (즉, 개방) 활성 상태로 구동 할 수있는 5 초에 0 밀리 초). - 막 패치에 대한 측정을 완료 한 후, 보내 겠 또는 압력 펄스로 패치를 끊고 패치 전극의 오프셋 전압이 표류하지 않았 음을 확인합니다. 챔버에서 패치 피펫을 제거하고 6.4 단계로 돌아갑니다.
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Representative Results
GUVs의 성장을 현미경으로 신속하게 성장 실을 조사함으로써 평가 될 수있다. 전기 주조를 들어 GUVs도 4에 도시 된 바와 같이, 백금 와이어 다발을 따라 성장하는 경향이있다. 겔 - 보조 팽윤 중에 GUVs 빠르게 성장하고 (그림 5)이 함께 융합 구형 구조로 나타난다.
결함이없는 GUVs보다 쉽게 파악하고 관찰 챔버에 전송 한 후 평가됩니다. 캘리브레이션 측정들은 엄격 GUV 품질을 평가하는 데 필요하고, 체계적인 정량화는 이전 28 출판되었습니다. 그러나 경험적인 가이드로, "좋은"GUVs 안에 하나, 부드러운, 구형 외막이, (등 즉, 튜브, 중첩 된 소포) 어떤 객체를 포함 할 수 없습니다 (즉,하지 클러스터) 격리되어야하고, "표준"지질 형광 수준이 (밝은 물체는 통상적으로 바이 - 또는 멀티 아르층상). 그림 6은 삼투압 포도당 용액에 전송 한 후 '무결점'GUV의 DIC와 표면 형광 이미지를 보여줍니다. DIC에 대비 수크로오스 가득 GUV 및 글루코스 용액을 함유하는 욕 간의 광학 밀도의 차이에 기인한다. KvAP 함유 GUVs의 굴절률 대비 종종 KvAP 자체가 자당이나 포도당에 투과성 안하더라도, 시간이 지남에 따라 감소한다. GUV 막에 균일 한 단백질은 형광 KvAP GUV에 포함된다 (즉,이 지질 막에 잔류하지 않았다) 및 마이크론 스케일 (또는 그 이상) 응집체를 형성하지 않았 음을 확인한다.
저급 - 염 전기 주조 프로토콜, 생리적 염 전기 주조 프로토콜 및 겔 - 보조 팽윤 프로토콜에 의해 제조 GUVs부터도 7, 8, 지질 및 단백질의 형광도 9는 공 촛점 이미지. 형광 지질 (마젠타) 및 단백질단위 면적 (단백질 농도) 당 단백질의 낮은 / 높은 번호 GUVs 오버레이 이미지 (오른쪽 열)에서 마젠타 / 녹색 그늘이되도록 (녹색) 신호는, 동일한 평균 강도를 확장 한과 GUVs 동안 단백질 평균 밀도는 백색이다. 격리 된, 무 결함 GUVs 식별하고 GUV 크기 분포는도 10에 도시되어있다. 일반적으로 전기 주조 겔 - 보조 팽윤 이상 무 결함 GUVs을 생성하지만, 전기 주조에 의해 제조 GUVs은 작다.도 11을 유추 된 단백질의 농도 분포를 나타내고 GUVs의 형광에서. 높은 소금 버퍼와 전기 주조는 단백질 밀도가 대장에 GUV 크게 변화하는 GUVs을 생산하고 있습니다. 젤 지원 부종에 의해 생산 GUVs의 단백질 밀도가 매우 균일 한 반면 개인 GUVs의 단백질 농도가 낮은 소금 버퍼와 전기 주조에 대한 훨씬 더 다양하다.
패치 클램프 기술은 널리 사용이다예컨대 KvAP 같은 전압 관문 이온 채널의 기능을 연구하기위한 D 방법. "인사이드 아웃 (inside-out)"기록에서, 깨끗한 유리 "패치"피펫은 GUV에서 막 패치를 절제하는 데 사용됩니다. 패치 피펫 내부 전극은 막 패치에 흐르는 전류를 생성 된 전압을 적용하고 측정하는데 사용된다. 멤브레인 패치 조성물은 세포 / GUV (31)의 나머지 부분에서 크게 다를 수 있지만, "인사이드 아웃 (inside-out)"구성은 여전히 단일 채널 컨덕턴스 이온 선택성 및 전압 의존적 게이팅 측정에 매우 유용하다. 이 세 가지 특성은 전류가 아티팩트 (예를 들면, 기가 시일 문제) 또는 오염 물질 (정제에서 예를 들어, 세균 porins)에 기인하지 않은 것을 입증 할 수있는 좋은 방법이며, GUVs의 기능 KvAP 채널이 있습니다.
채널 컨덕턴스 가장 쉽게 하나 또는 두 개의 활성 채널 패치 측정된다. EXA에서막을 -100 Mv로 유지 될 때 +100 Mv로, 개별 채널 개구 명확히 확인할 수있는 반면도 12에 도시 mple은 어떠한 채널 개구부는 관찰되지 않는다. 현재 히스토그램은 폐쇄 및 개방 상태에 대응하는 2 개의 피크를 보여주고, 이중 가우시안 함수로 피팅하는 것은 (100 mM의 KCl을)에서 109.2 ± 8.5 P의 전도도에 해당하는 10.9 ± 0.85 Pa의 단일 채널 전류를 산출한다. 단일 채널 전도도는 솔루션 (특히 칼륨 농도) 및 막 조성 (32, 33)에 따라 다를 수 있습니다.
다른 많은 K-채널, 개별 KvAP 채널 전시처럼 빠른 개방과 폐쇄의 버스트를 "수다". 또, 전술 한 바와 같이, 칼륨 선택성 패치 피펫 상이한 용액을 사용하여 시험 될 수있다 (예를 들면, 패치 피펫 용액 90의 NaCl, 10mM의 KCl) 28.
전압 가변 게이팅 종종 S이고보다 쉽게 앙상블 평균을 얻기 위하여, 다수의 채널과 패치에 tudied. "인사이드 아웃 (inside-out)"막 패치에 명백한 (GUV 내부에 세포 내 도메인) 생리를 선호하는 메커니즘과 역 (GUV 외부에서 세포 내 도메인) GUVs에 KvAP의 삽입을,이 없지만 기능 채널의 대부분이 " 생리 "삽입 (28).도 13은 5 초 탈분극 일련의 단계에 다수 함유 막 패치의 응답 (> 10)의 채널을 나타낸다. 각 단계 사이에, 패치는 "생리"삽입과 채널들이 휴식 상태로 돌아 할 수 있도록 30 초 동안 -100 MV에서 개최된다. 전위가 충분히 마이너스 인 경우 (예를 들어, V <-60 MV) 현재 대부분 기가 시일 누출에 기인 한 "역"삽입을 가질 가능성이있는 하나 또는 두 개의 채널의 개구 가끔. 긍정적 pote 할 사항은개별 개구 및 폐쇄가 더 이상 분해 될 수 없도록 많은 ntials 없을 때까지, 채널의 수가 증가가 관찰된다. 따라서, 채널의 개방 가능성은 명확 전위 의존성이다. KvAP 활성화 및 불 활성화 동력학 블랙 지질 막 (BLMs) (26)과의 사이 GUVs 상당히 다르지만 Kv 값이 채널 게이팅 막 조성물과 상태 (34)에 민감 할 수 있다는 이전의보고와 일치한다.
도 1 GUV 전기 주조 설계도 :. SUVs를 함유하는 물방울 전극 상에 증착 용액의 일부가 탈수 SUV 차량이 막 스택을 형성하기 위해 융합시킨다. 완충액을 첨가하고, AC 전계인가. 막 팽윤 같이, 개별 막은 GUVs을 형성하는 스택으로부터 분리. (이 수치는 모드 (mod)되었습니다 Aimon 등. 28 ified하게)
도 2 GUV 전기 주조 챔버. 챔버는 세 개의 웰 (10mm 직경, 깊이 5mm)와 PTFE 블록에서 분쇄된다. 두 0.5 mm 직경 백금 와이어 3mm (가장자리까지의 거리)에 의해 분리하고, 와이어의 이미징을 용이하게하기 위해 상기 챔버의 바닥에 가까이 위치한다. 하단과 상단 커버 전표는 진공 그리스와 장소에서 개최되며, 밀봉 페이스트쪽에있는 와이어 구멍에서 누출을 방지 할 수 있습니다. AC 발전기는 와이어에 악어 클립 접속되어있다. 챔버는 에르네스토 Ambroggio 루이스 Bagatolli에서 개발 한 기반으로합니다. (이 수치는 Aimon 등 알에서 수정되었습니다. 28)
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도 3 자발적인 붓는다 회로도를 이용한 젤 : SUV 현탁액을 함유하는 물방울은 아가 로스 겔 상에 증착되는 액적 탈수 효소로서, SUV 차량은 지질막을 형성하도록 융합.. 성장 버퍼를 첨가하는 경우, 필름은 재수 화 및 GUVs 표면에 형성한다. GUVs은 붓기와 이웃 GUVs와 융합 ~ 10 ㎛의 크기로 성장한다.
높은 소금 버퍼에 백금 와이어에 성장 KvAP를 포함 DPhPC의 GUVs 그림 4. 대표 이미지. GUVs 와이어를 따라 포도 송이를 닮은. 40X LWD 목표를 사용하여 위상 대비 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아가 로스 젤에 붓기 KvAP를 포함하는 그림 5. DPhPC의 GUVs. GUVs 10 μm의 ~의 직경 희미한 분야로 볼 수 있습니다. 어두운 / 밝은 반점은 소포가 팽창하는 지질 / 아가로 오스 집계입니다. 40X LWD 목표와 위상 대비 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 결함이없는 GUV 6. 이미지. 알렉사-488으로 표시 KvAP를 포함하는 (계란-PC : 계란-PA 9 질량 1) 왼쪽 : DIC, 오른쪽 : 알렉사-488 표면 형광. 여진 : 50분의 470 nm에서 : 75분의 545 ㎚이다. 눈에 보이는 집계와 KvAP에서 균일 한 형광을합니다. 81fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 낮은 소금 버퍼에서 재배 전주 GUVs에서 지질 (마젠타), 단백질 (녹색) 형광 7. 공 초점 이미지 (달걀 PC : 계란-PA 9 : 1 질량) (A) 흰색 화살표 표시 (가능성이). GUVs는 동안 빨간색 화살표가 높은 지질 형광과 잠재적으로 이중 층상 소포를 표시합니다. 형광 강도 때문에보기의 매우 큰 필드의이 이미지의 중심에서 밝게합니다. (B) 확대 GUVs의 작은 그룹을 표시합니다. 왼쪽 (마젠타) : TexasRed-DHPE 여기 : 543 nm의 레이저 라인, 방출 : 70분의 605 nm의. 센터 (녹색) : 알렉사-488 여기로 표지 KvAP : 488 nm의 레이저 라인, 방출 : 30분의 515 nm의. 오른쪽 : 오버레이.OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 생리 소금 농도에서 재배 전주 GUVs에서 지질 (마젠타), 단백질 (녹색) 형광 8. 공 초점 이미지 (달걀 PC : 계란-PA 9 : 1 질량). (A) GUVs (흰색 화살표 가능성이 단일 층 보여 예) 더 스파 스 저염 프로토콜에 비교되고 매우 다른 단백질 농도 (빨간색 화살표)를 가질 수있다. (B) 확대 GUVs의 작은 그룹을 표시합니다. 왼쪽 (마젠타) : TexasRed-DHPE 여기 : 543 nm의 레이저 라인, 방출 : 70분의 605 nm의 중간 (녹색) : 알렉사-488 여기로 표지 KvAP : 488 nm의 레이저 라인, 방출 : 30분의 515 nm의. 오른쪽 :. 오버레이 하세요 C이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 핥아.
그림 9. 지질 (마젠타)와 젤 지원은 생리 소금 농도 버퍼와 부종에 의해 형성 GUVs (DPhPC)의 단백질 (녹색) 형광 공 초점 이미지. GUVs 생리 버퍼를 준비 전주 GUVs보다 더 균일 한 단백질 농도를 보여줍니다. 왼쪽 (마젠타) : BPTR-CER 0.1 % 여자 : 543 nm의 레이저 라인, 방출 : 70분의 605 nm의. 중동 (녹색) : 알렉사-488 여기로 표지 KvAP : 488 nm의 레이저 라인, 방출 : 30분의 515 nm의. 오른쪽 :. 두 채널의 병합 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11. GUV 단백질 밀도 히스토그램 : 단백질 밀도가 낮은 소금 버퍼 (5 mM의 KCl을, DPhPC)와 GUVs의 전주의 (단위 면적 당 단백질의 수) 생리 소금 농도 (100 mM의 KCl을, 달걀 PC보다 덜 달라집니다 계란을 -PA 9 :. 1 질량)은 젤 이용한 생리 소금 버퍼에 부종에 의해 성장 GUVs의 단백질 농도 (DPhPC)는 최소한의 변화를 보여줍니다. 단백질 농도는 이러한 농도 28 KvAP-A488의 형광 강도에 비례하고, 각 히스토그램에서 형광 농도의 분포는 평균으로 정규화된다. (가운데 패널은 수정 된) Aimon 등. 28
GUV 막 패치 (DPhPC '인사이드 아웃 (inside-out)'전압 규칙)의 그림 12. 단일 채널 활동은. 대장 백금 와이어에 100 mM의 KCl을, 5 mM의 HEPES pH가 7.4에서 성장했다. 패치에 100 MV 잠재력을 적용 후 열기 단일 채널. 인셋의 오른쪽에있는 하나의 채널 컨덕턴스를 계산하는 데 사용 히스토그램이다. 빨간색 선은 109.2 ± 8.5 P의 전도도에 해당하는 4.70 ± 0.27 PA와 15.62 ± 0.58 펜실베니아 최대와 이중 가우스 함수에 적합합니다. 트레이스는 4 극 베셀 필터로 여과하여 10 kHz에서 50 kHz로 기록 하였다.
그림 13. 전압 dependen 높은 염 완충액 아가 형성 GUV (DPhPC '인사이드 - 아웃'전압 협약)에서 멤브레인 패치 t 게이팅 채널. 전압의 과도 단계로 패치 막 전류 (A) 응답. 피펫 및 목욕 솔루션 모두 100 mM의 KCl을 포함, 멤브레인 연속 전압 단계 사이 -100 MV에서 30 초 동안 개최되었다. 가까운 검사에서 하나는 추적이 음의 전압을 열 것 1 개 또는 2 개의 채널을 포함하는 것을 볼 수 있습니다. 삽입 된) 지연 열고 삽입 된 B) 채널의 폐쇄가 지연의 줌을 보여줍니다. 전류는 10 kHz에서 4 극 베셀 필터로 여과시키고, 51.3 kHz에서 기록되었다. 추적이 513 Hz로 다운 샘플링 오프라인. 음 용량 과도은 -150 펜실베니아 차단합니다. 단계 전압 대 (B) 평균 전류 (<t <5 초 0.25 초). 채널 오픈 확률이 전압에 의존하기 때문에 긍정적 인 전압에서 전류가 크다.세틸 / ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 모방 모델 시스템은 단백질과 세포막의 특성과 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구입니다. BLMs 또는 지원 지질막과 같은 다른 재구성 시스템에 비해 GUV 시스템에게 상당한 막 조성, 긴장과 형상 제어뿐만 아니라 진정되는 오일 프리를 포함하여 현재 여러 기회를 기반으로. 그러나 GUVs로, 같은 KvAP으로 횡단 단백질을 포함하는 지질 전용 GUVs에 대한 기존의 프로토콜의 상당한 적응을 필요로한다. 여기에 제시된 전기 주조 프로토콜은 이전에 특성화 만곡 멤브레인 2,4,35에서 세포막 단백질 분포 및 역학 생물 물리학 적 원리를 연구에 사용 하였다. 이 작품은 GUVs 단백질의 재구성을위한 방법의 세트에 추가, 새로운 젤 이용한 붓기 프로토콜을 보여줍니다. 내부 아웃 패치에 결함이없는 KvAP의 높은 밀도를 포함 GUVs 및 측정을 생산할 수있는 두 프로토콜을 모두 확인자체의 GUVs 기능성 칼륨 선택적, 전압에 의존하는 채널이 포함되어 있습니다.
방법은 두 가지 서로 다른 강점과 약점을 가지고 있습니다. 저염 조건을 사용할 수있는 경우, 전기 주조는 GUV 수율 및 균일 한 단백질 농도 사이 좋은 타협을 제공합니다. 전기 주조는 여전히 생리적 염 농도 적당한 수율을 제공하지만, 밀도는 단백질 (도 8 및도 11 참조) 사이 GUVs 크게 달라질 수있다. 밀도 변화는 성장이 더 이상 2 시간 이상 계속되면 저염 완충액 성장으로서도 실질적인 농도 변화를 가질 수 있으며, 전기 주조의 기간에 연결된 것으로 보인다. 대조적으로, 겔 - 보조 팽창에 의해 제조 GUVs 심지어 생리 버퍼, 현저하게 균일 한 단백질 농도를 갖는다. 그러나, 멀티 라멜라 소포 분획은 크고, 아가 자동 형광 낮은 단백질 정량화 16 밀도를 복잡하게한다. PLA에 폴리 비닐 알코올을 사용한아가로 오스의 CE는 지질 클로로포름 (20) 증착 할 때 젤 보조 GUV 수율을 개선하기 위해보고, 그러나 우리는 SUV 솔루션과 폴리 비닐 알코올을 사용하여 GUVs를 생성 할 수 없습니다되었습니다. 결함이없는 GUVs의 낮은 수율이 허용하는 경우, 젤 이용한 붓기가 균일 한 단백질 분포를 필요로 실험에 대한 명확한 장점이있다.
전기 주조 및 겔을 이용한 붓기도 매우 다른 장비 요구 사항이 있습니다. 겔 붓기 보조 프로토콜은 깨끗 친수성 유리를 제조하는 많은 다른 방법이 있기 때문에 필수적인 것은 아니다 플라즈마 세정기를 제외한 거의 특수 장비를 사용한다. 반면, 전기 주조 와이어 전극을 사용자 정의 챔버가 필요합니다. 백금선은 비싸지 만이 프로토콜에 대한 GUVs 티탄 백금 와이어보다 더욱 용이하게 성장하고, 생리적 염 농도를 사용하는 경우에 ITO 성장하지 않았다 GUVs 슬라이드. 전극 (0.5 mm)의 직경이다 COMPR전극 표면과 가격 사이의 omise. 도 2에 도시 한 챔버 (15)와 루이스 Bagatolli 네스 Ambroggio 의해 설계에 기초하여, 대부분의 용매로 세척 할 수 있도록 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)으로부터 가공 하였다. 그러나, 폴리 아세탈 또는 폴리 염화 비닐 (PVC)도 잘 작동합니다. 공격적 세정에 백금선을 제거하는 능력은 중요하며, 제 프로토콜을 학습하면, 바닥 커버 슬라이드를 통해 상피내 GUV 성장을 관찰 할 수있는 것이 매우 유용하다. 작은 우물이 앞뒤로 출렁에서 솔루션을 방지하고 또한 병렬로 여러 지질 조성의 시험을 허용 마감했다. 밖으로 시작하는 때, 특별한 사용자 정의 챔버는하지 필수적이다. 예를 들어, 간단한 단일 잘 챔버는 작은 유리 병의 캡을 통해 파고 단순히 작은 페트리 접시의 맨 아래로 두 개의 와이어를 시침, 또는 두 개의 유리 슬라이드 사이에 샌드위치로 실링 왁스를 사용하거나에 의해 즉흥적으로 할 수 있습니다.
전기 주조 및 겔 - 보조 팽윤 프로토콜 모두 미세 조작 및 패치 클램프 실험 무 결함 GUVs 충분한 수를 생성한다. SUV 용액 부분적 탈수 그러나 GUV 수율은 이중층의 스택의 형성에 민감하게 의존한다. 어려움은 성장 GUVs에서 발생하는 경우 (즉, NO 또는 몇 GUVs이 성장 챔버에서 표시 임), 그것은 매우 SUV 차량 15,16 대신 지질 / 클로로포름 용액을 사용하여 지질 전용 GUVs 성장 도움 (그리고 낮을 수있다 염 완충액). GUVs는 지질 / 클로로포름 영화에서 잘 성장하지 않는 경우, 기본적인 뭔가 잘못 (예를 들어, 잘못된 지질 솔루션 또는 버퍼, 전극, 잘못된 전압이나 주파수 등의 기름이나 먼지)입니다. GUVs 지질 / 클로로포름 필름 아니지만 SUV 막 성장할 경우, 다음 문제는 부분적으로 탈수 될 것으로 예상된다.
부분적인 탈수 단계이다가장 쉽게 과도한 탈수 "변성"지질의 위험이 없기 때문에 전용 SUV의 지질을 사용하여 최적화. SUV 방울이 방울이 증착 된 각각의 스폿에서 밝은 형광 리피드가 확인 건조되도록 한 후 전기 주조를 들어, 와이어를 검토하는 것이 도움이 될 수있다. 챔버이어서, 성장 용액으로 채워지고 지질 형광가 사라지면 어느 성장 용액보다 조심스럽게 첨가되어야하거나 SUV 같은 정도로 막이 와이어보다 견고 부착 이상 탈수 할 필요가있다. 성장하는 동안, 챔버 내에서 확인 전선이나 솔루션 이동 (예를 들어, 현미경 실을 놓을 때) 전선 떨어져 GUVs을 제거 피하기 위해도합니다. GUVs 잘 성장하면, 그들은 일반적으로 위상 콘트라스트 이미지에서 쉽게 볼 수 있습니다. 그러나, 작은 GUVs 또한 멤브레인 스택이 성장하는 동안 어떻게 변했는지보고 도움이됩니다 지질 형광을 이용하여 자주 명확하다. 의 모든 표면을 검사모든 우물에서 와이어 (내부, 외부, 상단과 하단)뿐만 아니라 수익률이 다른 하나의 지점에서 상당히 다양 할 수 있기 때문에, 성장을 폐기하기 전에 챔버 바닥.
취급 및 GUVs의 저장 세포에 단순 비교되지만 GUVs는 삼투압 스트레스, 전단력 및 접착에 매우 민감하다. 수확 또는 GUVs 전송시 매끄럽고 부드러운 동작이 중요하고, 그 부착 및 파열을 방지하기 GUVs 표면 보호막을하는 것이 중요하다. 보호 솔루션 수 없습니다 코트 패치 피펫하고 기가 시일 형성을 방지하도록 그러나, 패치 클램프 실험 챔버는 철저하게 보호 한 후 세척해야합니다. 패시베이션, 베타 - 카제인 치료 간단하고, 효과적이며 지질 수송 기능을 갖는 소 혈청 알부민에 비해 인 베타 - 카제인 지질 이중층으로 더 제한된 상호 작용을 가지며 GUVs (36)로 작업 할 때 바람직 할 것이다. 배양 시간을 변화시킴으로써, 그래가능한 얻을 수 GUVs는 폭발하지 않고 준수합니다. 그러나, GUVs 커버 슬라이드로 단단히으로 세포에 부착하지 않으며, 그래서 여전히 (챔버를 이동, 예를 들어, 버퍼 관류) 챔버의 흐름을 유도 할 수있는 절차를 수행하는 동안주의해야합니다 관심.
패치 클램프 녹음 KvAP 같은 전압 문이 이온 채널 연구를위한 고전적인 방법이며,이 프로토콜은 부착 세포에서 "인사이드 아웃 (inside-out)"패치를 얻기위한 표준 기술에서 파생됩니다. 패치 피펫 비스듬하게 하강하는 표준 패치 클램프 세트 업 (예를 들어, 수평에서 30 ~ 60도) 작은 페트리 접시에 잘 작동합니다. 그러나, 패치 피펫 기가 시일 영역의 선명한 이미지를 커버 슬립을 챔버 상부 및 하부 (~ 1mm 분리) 따라서 측면으로부터 수평으로 입력 할 수있는 패치 피펫을 형성하는 챔버를 사용하여 얻을 수있다. 큰 패치 피펫 압력이 필요하지 않기 때문에, 압력은 편리를 c 수주사기 ontrolled 및 간단한 압력 측정기 (예를 들어, 즉흥적 물 압력계)를 모니터링. 이 지질 / 클로로포름 용액과 저염 완충액을 이용한 성장 지질 전용 GUVs와 제 연습 패치 클램프 실험하는 것이 도움이 될 수있다. 결함이없는 GUVs의 수율이 매우 높기 때문에, 많은 실험 챔버로 수확 및 전송 중에 파괴 된 경우에도 작동하도록 완벽한 GUVs 많이있을 것입니다.
약간의 연습으로, 안정적인 gigaseals와 절제 막 패치는 쉽게 DPhPC GUVs 및 KvAP-DPhPC GUVs에서 얻을 수 있습니다. 높은 성공률을 달성하기 위해, 신중하게 라운드를 선택하는 데 도움이,하지만 약간 급변, 결함이없는 GUVs 패치 피펫가 깨끗한 지 확인은 기가 시일을 형성하기 전에 (형광 지질을 찾고). 막 "혀"패치 피펫을 입력하면 기가 시일는 일반적으로 강한 흡입 또는 구체적으로 지정을위한 필요없이 신속하게 (<1 초)을 형성한다C의 유지 전압. 막 패치 피펫으로 더 크롤 링 나쁜 시일이 향상 될 수 있지만, 자주 피펫 내부가 오염 되었기 때문에 시일이 여전히 좋지 그것은 새로운 패치 피펫 및 GUV로 시작하는 것이 필요하다. DPhPC 양식도 높은 전압 (예, 150 MV를 ±)에서 우수한 씰 저항 막 패치 (수십 분) 매우 안정적입니다. SOPC : 콜레스테롤 (3 : 1 몰)도 매우 안정적 패치를 형성 할 수 있지만, 달걀 PC 패치보다 쉽게 않는 것 같습니다 동안, 인감 높은 흡입을 필요로 할 수 있습니다.
이상 패치 - 클램프 세션 그것은 챔버 용액의 삼투압을 조절하는 것이 필요할 수있다. 삼투압이 GUV 성장 버퍼보다 너무 낮 으면, GUVs 부풀고 시제 구면되어 있으며 기가 시일을 형성하도록 패치 피펫으로 충분히 GUV 막을 흡인하는 것이 가능하지 않을 수있다. 이것은 종종 단순히 실에서 증발로 10 ~ 20 분을 기다리고 해결할 수 있습니다 내선 증가ernal 솔루션 삼투압 GUVs이 수축과 변동하기 시작 때까지. 챔버가 너무 오래 열려 경우 GUVs이, 관 모양과 꽃 봉오리를 수축 할 때까지 반대로, 외부 용액의 삼투압이 증가 할 수 있습니다. 이는 증발 물을 교체하는 증류수를 주기적으로 첨가 (광유, 예) 챔버로부터 증발을 차단 또는 방지 할 수 있습니다.
막 단백질 절제 패치 (31)로부터 배제 할 수 있으므로, 절개 패치 활성 채널의 개수는 단순히 GUV 막 단백질의 농도에 관련이 없다. 형광 측정은 패치 막의 KvAP의 농도가 28 GUV보다 훨씬 낮다 제안하고 채널 단지 소수를 포함하는 패치를 아주 쉽게 얻을 수있다. 그러나, 패치는 단일 채널 기록 너무 많은 채널, 작은 팁 패치 피펫을 사용하여 및 / 또는 단백질 D 간 지질을 저하시키는 단계를 포함 명백한 경우SUV 믹스 ensity이 효과적이다. 대조적으로, 많은 채널을 포함하는 패치에 앙상블 측정을 수행하기 위해서는, 비교적 높은 단백질 농도로 시작하는 것이 도움이 될 수있다 (예를 들면, 중량 지질 1:10, 단백질), 높은 단백질 밀도 GUVs을 선택하는 단백질의 형광을 사용 큰 패치 피펫을 사용 (예를 들어, 2 미크론 팁 직경 3) 및 흡인 빠르게 빠르게 시일을 형성하려고합니다. 분명히, "전체 셀"형 구성 (즉, '전체 대장') GUV에 모든 채널의 특성을 이상적 일 것이다,하지만 불행히도 "전체 GUV"구성은 여러 가지 기술적 인 문제 (37) 포즈.
이 입문서 용액, 지질 및 단백질 농도는 단지 시작점으로 제공되고, 다음 고려 사항 몇 특정 실험의 필요에 맞게 변경 될 수있다.
모든 솔루션은 HEPES 등의 pH 버퍼를 포함해야또는 TRIS는 단백질의 pH의 극한에 노출되지 않도록합니다. 용질 농도는 부분적으로 탈수 단계 동안 증가 및 높은 염 농도는 단백질을 변성하거나 빠르게에 지질막을 일으킬 수 SUV 버퍼는, (예를 들어, 5 mM의 염 또는 저급) 용인 것 단백질로서 용질의 낮은 농도를 가져야 재수 단계에서 박리. 트레할로스 등의 당류의 소량 (예를 들면, 1mm 이상 5 mm)를 23 일 동안 탈수 단백질을 보호하는 것으로 생각된다. 트레할로스 anhydrobiosis에 연루되어 건조되도록하고 (38)에 대해 막 단백질을 보호 할 것으로 생각되지만, 수 크로스 또는 글루코스는 동일하게 잘 작동 할 수있다.
성장 버퍼, 염 농도가 최적이 GUV 성장 (예를 들어, 전기 주조의 전압, 주파수 및 지속 시간)에 대한 매개 변수에 영향을 미칠 것이다로서 특히 중요하다. 반면에, 관찰에 대한 기본 버퍼 제약은 t이며모자 그것은 성장 버퍼와 동일한 삼투압을 가져야한다. GUV 내부와 외부 사이의 굴절률 차이가 위상 콘트라스트에 도움 동안 "성장 버퍼"및 "관측 버퍼"에 크로스 및 / 또는 포도당의 포함은 관찰 챔버의 아래쪽 GUVs 침전물을 보장하는 것이 도움이 될 수있다 DIC 현미경. 전기 생리학은 종종 세포막에 기가 시일 형성을 향상시키기 위해 목욕 및 / 또는 패치 피펫 솔루션 칼슘 또는 마그네슘 이온을 포함하지만, 이러한 GUVs을 위해 필수적인 것으로 나타나지 않습니다. 실제로, 마그네슘과 칼슘 가의 이온은 지질 상 분리를 유도 접착을 촉진하기 때문에 이러한 문제가 발생할 경우 1 mM의 EDTA를 추가하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
분명히, 재구성 된 세포에 비해 시스템의 주요 매력은 지질 조성물을 제어 할 수있는 능력이다. DPhPC GUVs 잘 성장하고 안정을 절제 막 패치를 형성하고, 이러한 프로토콜은 또한 EF 근무fectively 지질 포스파티딜콜린 (PC)를 포함하는 혼합물, 포스파티딜 에탄올 아민 (PE), 포스파티딜 글리세롤 (PG), 포스 산 (PA), 포스파티딜 세린 (PS)과 콜레스테롤. 그러나 GUV 성장은, 모두 지질 조성에 민감 15 버퍼링 등 프로토콜 파라미터 (예 : 지질의 양 증착, 전기 주조의 전압 / 주파수) PE 고농도 함유 된 지질의 혼합물에 따라 조정해야 할 수도, (PG를 지질 청구 PA, PS), 또는 콜레스테롤. 아웃 시작하면, 달걀 PC, DOPC 또는 DPhPC 좋은 첫번째 선택하며, 그것은 GUV 성장을 관찰하기 위해 두 개 이상의 이중층 가진 다중 층 소포로부터 GUVs 구별 형광 지질을 포함하는 것이 매우 유용하다. 지질 (온도 개별 상 전이 온도보다 높은 경우), 부분 탈수 단계 동안 혼합 지질로서 혼합물은, 스톡 용액의 SUV 현탁액을 조합함으로써 제조 할 수있다. (높은 SUV 농도를 사용하여 예를 들면,10 ㎎ / ㎖) 스톡 용액은 상당한 유연성을 허용하고, 그 다음이 3 mg의 / ㎖ 현탁액을 탈수하기 전에 희석 될 수있다.
다른 트랜스 멤브레인 단백질이 프로토콜을 적용하려고해도, 2 개의 직접 GUVs 단백질 및 테스트 기능으로 단백질의 결합을 관찰 할 수있는 것이 매우 중요하다. KvAP하지 문제 동안 재수 화 동안 트랜스 멤브레인 단백질이 지질 전용 GUVs의 형성으로 이어지는 멤브레인 스택 단계에 남아있을 가능성이 항상 존재한다. 이 GUVs에 단백질 결합을 관찰하고 또한 GUVs 내에서 집계를 확인하기 위해 신속하고 명확한 방법을 제공하기 때문에 단백질의 형광 라벨이 매우 편리합니다. 이는 단백질이 재구성 과정에서 손상되지 않았 음을 확인하는 GUVs 단백질 기능을 테스트하는 것도 매우 중요하다. KvAP 같은 이온 채널의 경우, 패치 클램프 측정 기능적 채널의 존재를 확립 할GUVs. 그러나, 형광 표지, 고친 화성 리간드 (예를 들어, 독소, 기판 또는 항 체)도 GUVs 단백질의 상태를 테스트하기 위해 매우 도움이 될 것이다.
요약하면,이 문서는 전압 문이 칼륨 채널 KvAP를 포함 proteo-GUVs를 생산하고 형광 현미경 및 전기 생리학을 사용하여 특성화하는 방법을 보여줍니다. 희망이 방법은 막 단백질의 새로운 클래스에 적응하고 공부하고 근본적인 구성 요소에서 생명체 구축을 위해 더 복잡한 체외 시스템을위한 기반을 제공 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
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