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Biology

एक transmembrane प्रोटीन के पुनर्गठन, माइक्रोस्कोपी और पैच दबाना अध्ययन के लिए विशालकाय unilamellar vesicles में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल, KvAP,

Published: January 22, 2015 doi: 10.3791/52281
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

Summary

electroformation, और जेल की सहायता की सूजन - विशाल unilamellar पुटिकाओं (GUVs) में transmembrane प्रोटीन, KvAP, के पुनर्गठन दो निर्जलीकरण-पुनर्जलीकरण तरीकों के लिए प्रदर्शन किया है। दोनों तरीकों में, प्रोटीन युक्त छोटे unilamellar पुटिकाओं तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा अध्ययन किया जा सकता है कि GUVs फार्म करने के लिए एक साथ जुड़े हुए हैं।

Abstract

विशालकाय unilamellar पुटिकाओं (GUVs) झिल्ली जुड़े घटना के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय biomimetic व्यवस्था कर रहे हैं। हालांकि, आमतौर पर GUVs कार्यात्मक transmembrane प्रोटीन युक्त GUVs फार्म के क्रम में संशोधित किया जाना चाहिए विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया। Electroformation और जेल की सहायता की सूजन - - वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल, KvAP युक्त GUVs फार्म करने के लिए यह लेख दो निर्जलीकरण-पुनर्जलीकरण विधियों का वर्णन है। दोनों तरीकों में, प्रोटीन युक्त छोटे unilamellar vesicles के एक समाधान तो एक पुनर्जलीकरण बफर में प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति दी है जो झिल्ली का एक ढेर, फार्म करने के लिए आंशिक रूप से निर्जलित है। एक एसी मैदान फिल्म पुनर्जलीकरण के दौरान लागू किया जा सकता है, ताकि electroformation विधि के लिए, फिल्म प्लैटिनम इलेक्ट्रोड पर जमा किया जाता है। इसके विपरीत, जेल की सहायता की सूजन विधि फिल्म पुनर्जलीकरण को बढ़ाने के लिए एक agarose जेल सब्सट्रेट का उपयोग करता है। दोनों तरीकों (जैसे, 5 मिमी) कम और शारीरिक (जैसे, 100 मिमी) नमक सांद्रता में GUVs उत्पादन कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप GUVs प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से की विशेषता है, और पुनर्गठन चैनलों के समारोह के अंदर-बाहर पैच दबाना विन्यास का उपयोग करके मापा। एक बारी बिजली के क्षेत्र (electroformation) की उपस्थिति में सूजन दोष मुक्त GUVs की एक उच्च उपज देता है, वहीं जेल की सहायता की सूजन विधि एक और अधिक सजातीय प्रोटीन वितरण पैदा करता है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है।

Introduction

रहने वाले सिस्टम को नियंत्रित करने वाले भौतिक सिद्धांतों का अध्ययन करते हैं, तो नीचे अप दृष्टिकोण एक experimentalist प्रणाली संरचना और आसानी से सेल आधारित सिस्टम एक में हेरफेर नहीं कर रहे हैं कि अन्य मानकों को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देते हैं। - 10 वे माइक्रोस्कोपी अध्ययन और micromanipulation 8 के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं के रूप में 7 - झिल्ली आधारित प्रक्रियाओं के लिए, विशालकाय unilamellar पुटिकाओं (GUVs, व्यास ~ 1-100 माइक्रोन) एक बहुत ही उपयोगी biomimetic प्रणाली 2 साबित किया है। GUVs निर्माण करने के लिए कई अलग अलग प्रोटोकॉल रहे हैं, सबसे दो श्रेणियों में आते हैं - 16 - आधारित पायस एक लिपिड फिल्म 13 rehydrating के आधार पर 11,12 और तकनीक दृष्टिकोण। पायस आधारित विधियों में, guv झिल्ली के भीतर और बाहर पत्रक पानी / तेल इंटरफेस में लिपिड monolayers से क्रमिक रूप से इकट्ठा कर रहे हैं। इस दृष्टिकोण के साथ घुलनशील प्रोटीन encapsulating के लिए आदर्श हैGUVs में, और असममित पत्रक लिपिड रचना के साथ GUVs बनाने के लिए। हालांकि, emulsions के गठन से GUVs झिल्ली के यांत्रिक गुणों 17 बदलने कि विलायक के निशान रखने कर सकते हैं, और दृष्टिकोण पार झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन करने के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है।

फिल्म पुनर्जलीकरण तरीकों (निर्जलीकरण) सुखाने झिल्ली का एक बहु तहदार स्टैक फार्म के लिए कई लिपिड मिश्रण का कारण बनता है कि इस तथ्य पर भरोसा करते हैं। यह स्टैक तो एक जलीय बफर के साथ संपर्क में रखा जाता है, तो ढेर में झिल्ली उन दोनों के बीच और स्टैक की सतह पर अलग विलायक के रूप में बहती कदम होगा, व्यक्तिगत झिल्ली GUVs 13,18 (के रूप में अच्छी तरह से एक सत्य चिड़ियाघर के फार्म करने के लिए अलग कर सकते हैं अन्य lipídic वस्तुओं)। हालांकि, यहां तक ​​इष्टतम बफर और लिपिड रचनाओं के लिए, इस शास्त्रीय "सहज सूजन" विधि दोष मुक्त GUVs की एक अपेक्षाकृत कम उपज है। दोष मुक्त GUVs की पैदावार को बढ़ावा देने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि "electroformation हैएक बारी वर्तमान (एसी) क्षेत्र फ़िल्म पुनर्जलीकरण के दौरान लागू किया जाता है, जिसमें 221 ;,। तंत्र खराब समझ बनी हुई है, "electroformation" शानदार guv पैदावार दे सकते हैं (> अनुकूल परिस्थितियों में 90%) कम नमक एकाग्रता buffers के लिए (<5 मिमी) 14,19, और यहां तक कि (~ 100 मिमी) शारीरिक बफ़र्स में काम कर सकते हैं का उपयोग कर एक उच्च आवृत्ति (10 हर्ट्ज बनाम 500 हर्ट्ज) एसी क्षेत्र और प्लैटिनम इलेक्ट्रोड 15। दोष मुक्त GUVs की पैदावार को बढ़ावा देने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जिसमें लिपिड समाधान (जैसे, ग्लास, PTFE) substrates के शास्त्रीय "सहज सूजन में इस्तेमाल किया बल्कि निष्क्रिय से एक polymeric जेल सब्सट्रेट पर जमा किया जाता है," जेल की सहायता की सूजन है " "। परिणामी लिपिड / जेल फिल्म rehydrated है, जब GUVs तेजी से भी शारीरिक बफ़र्स 16,20 के लिए फार्म कर सकते हैं।

इन सभी तरीकों जैसे झिल्ली जुड़े घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो लिपिड केवल GUVs उत्पादन कर सकते हैंघुलनशील प्रोटीन और झिल्ली के बीच बातचीत। हालांकि, GUVs में एक पार झिल्ली प्रोटीन को शामिल करने, महत्वपूर्ण संशोधनों प्रोटीन पुनर्गठन प्रक्रिया के दौरान एक कार्यात्मक राज्य में रहता है कि यह सुनिश्चित करने की जरूरत है। कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, क्लोरोफॉर्म, cyclohexane) में लिपिड का समाधान लिपिड फिल्मों का निर्माण करने के लिए आदर्श होते हैं, जबकि उनके हाइड्रोफोबिक पार झिल्ली डोमेन एक लिपिड bilayer में एम्बेडेड, या एक साबुन मिसेल से घिरा हुआ है, जब पार झिल्ली प्रोटीन आम तौर पर केवल स्थिर रहे हैं ( जैसे, प्रोटीन शुद्धि के दौरान)। इस प्रकार, एक पुनर्गठन के लिए शुरू सामग्री आम तौर पर में डिटर्जेंट हटाने का गठन करके देशी झिल्ली, एक साबुन के घोल में शुद्ध प्रोटीन, या छोटे unilamellar प्रोटीन युक्त पुटिकाओं (Proteo-एसयूवी) और / या बहु तहदार पुटिकाओं (Proteo-MLVs) है लिपिड की उपस्थिति। GUVs में इन झिल्ली प्रोटीन को शामिल करने के लिए सबसे तरीकों को तीन श्रेणियों में गिर जाते हैं।

डायरेक्ट insertioN: डिटर्जेंट में निलंबित कर दिया ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन पूर्व गठित, लिपिड केवल हल्का डिटर्जेंट solubilized GUVs के साथ मिश्रित है, और डिटर्जेंट तो biobeads 21 का उपयोग कर निकाल दिया जाता है। धारणात्मक सरल है, इस विधि भी एक उच्च डिटर्जेंट एकाग्रता एक एकाग्रता प्रोटीन प्रकट करना या कुल करने के लिए पैदा कर सकता है बहुत कम है, जबकि GUVs भंग कर सकते हैं, के रूप में डिटर्जेंट एकाग्रता की सटीक नियंत्रण की आवश्यकता है।

Guv / Proteo-एसयूवी संलयन: Proteo-एसयूवी में प्रोटीन पूर्व गठित, लिपिड केवल GUVs के साथ संयुक्त है और फ्यूजन विशेष fusogenic पेप्टाइड्स 22 या डिटर्जेंट 21 के साथ मदद की है। आमतौर पर संलयन की हद तक कम प्रोटीन घनत्व के साथ GUVs के लिए अग्रणी सीमित है।

निर्जलीकरण / पुनर्जलपूरण: एक प्रोटीन युक्त लिपिड फिल्म आंशिक एक Proteo-एसयूवी की निर्जलीकरण (या Proteo-MLV) समाधान और GUVs द्वारा बनाई है तो एक शुद्ध लिपिड फिल्म के लिए के रूप में बड़े हो रहे हैं। स्पष्ट चुनौती आंशिक dehydrati दौरान प्रोटीन की रक्षा के लिए है25 - कदम 23 है, लेकिन विधि पर सफलतापूर्वक GUVs 7,23 में ऐसे Bacteriorhodopsin, कैल्शियम-ATPase, Integrin से और VDAC के रूप में ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

यह लेख हाइपर-थर्मोफिलिक आर्किया, Aeropyrum pernix से वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल, KvAP युक्त GUVs बनाने के लिए निर्जलीकरण / पुनर्जलीकरण प्रोटोकॉल का वर्णन है। KvAP यूकेरियोटिक वोल्टेज निर्भर पोटेशियम चैनल 26 अनुरूपता के एक उच्च डिग्री और एक ज्ञात क्रिस्टल संरचना है 27 वोल्टेज gating के तंत्र के अध्ययन के लिए यह एक अच्छा मॉडल बना रही है। Proteo-एसयूवी का उत्पादन पहले से विस्तार से वर्णित है और इस ट्यूटोरियल 26,28,29 का हिस्सा नहीं है किया गया है। महत्वपूर्ण बात है, KvAP Proteo-एसयूवी वे समय की विस्तारित अवधि (> 1 वर्ष) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर छोटे (उदाहरण के लिए, 10 μl) aliquots में संग्रहित किया जा सकता है, के रूप में प्रत्येक guv तैयार करने के लिए उत्पादन किया जा करने के लिए नहीं है। Electroformationया जेल की सहायता की सूजन तब KvAP Proteo-एसयूवी से GUVs विकसित करने के लिए प्रयोग किया जाता है (या Proteo-MLVs) किया जा सकता है।

electroformation प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण कदम चित्रा 1 में सचित्र हैं। प्रोटीन युक्त एसयूवी की एक समाधान की बूंदों (चित्रा 2 में दिखाया गया है) प्लैटिनम तारों पर जमा कर रहे हैं। एसयूवी निलंबन की आंशिक निर्जलीकरण एसयूवी के विलय के माध्यम से एक लिपिड प्रोटीन फिल्म के गठन की ओर जाता है। पुनर्जलीकरण के दौरान, एक एसी क्षेत्र GUVs delaminate और फार्म के लिए लिपिड परतों की सहायता के लिए इलेक्ट्रोड के लिए लागू किया जाता है। "कम नमक" का उपयोग करते समय एक 10 हर्ट्ज क्षेत्र में अच्छी तरह से काम करता है (<5 मिमी) पुनर्जलीकरण बफर 28 और GUVs कई घंटे लग विकसित करने के लिए। इसके विपरीत, शारीरिक बफ़र्स एक कम वोल्टेज, 500 हर्ट्ज एसी क्षेत्र के साथ अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन आवश्यकता होती है (नमक ~ 100 मिमी युक्त) एक लंबे समय तक (~ 12 घंटा) की अवधि 15 सूजन। इस विधि आईटीओ 24 स्लाइड का उपयोग करते हुए पहले के एक प्रोटोकॉल पर आधारित है, लेकिन एक कस्टम चैम्बर शेष भाग का उपयोग करता हैचित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में दो प्लैटिनम तारों aining (सरल के लिए डिजाइन विवरण और सुझावों के लिए चर्चा देखते हैं, कक्षों तात्कालिक)।

चित्रा 3 जेल की सहायता की सूजन विधि दिखाता है। प्रोटोकॉल, शारीरिक नमक सांद्रता के साथ buffers के साथ अच्छी तरह से काम करता है तेजी से है, और एक अधिक सजातीय प्रोटीन वितरण के साथ GUVs पैदा करता है। हालांकि, पृथक, जाहिरा तौर पर दोष मुक्त GUVs की उपज है (यानी, guv झिल्ली वर्दी ऑप्टिकल लंबाई-तराजू पर है और किसी भी वस्तु लगा देना नहीं है) यह पैच दबाना और सूक्ष्म हेरफेर प्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या प्रदान करता है, कम है । इस विधि लिपिड केवल GUVs 16 उत्पादन और electroformation विधि से भी कम विशेष उपकरणों की आवश्यकता के लिए agarose जेल का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल पर आधारित था।

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ GUVs के लक्षण वर्णन के लिए एक मानक पैच दबाना सेट अप करने के लिए प्रयोग प्रक्रियाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वर्णित है"अंदर-बाहर" में KvAP गतिविधि को मापने झिल्ली पैच excised।

बढ़ रहा है प्रोटीन युक्त GUVs लिपिड केवल GUVs की तुलना में अधिक मुश्किल हो सकता है। विशेष रूप से, अंतिम guv उपज झिल्ली स्टैक के लिए फार्म बिल्कुल कैसे एसयूवी समाधान जमा किया जाता है और निर्जलित पर संवेदनशीलता निर्भर कर सकते हैं। GUVs के साथ किसी भी पिछले अनुभव के बिना किसी के लिए, यह पहली बार झिल्ली फिल्म एक कार्बनिक विलायक से लिपिड जमा करके बनाई है जिसमें एक पारंपरिक प्रोटोकॉल 15,16 निम्नलिखित लिपिड केवल GUVs विकसित करने के लिए सहायक हो सकता है। पारंपरिक प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम करता है एक बार, एसयूवी बयान और आंशिक निर्जलीकरण फिर एक नया लिपिड रचना के लिए प्रोटोकॉल का समायोजन जब भी बहुत मददगार रहे हैं जो लिपिड केवल एसयूवी का उपयोग कर महारत हासिल किया जा सकता है। GUVs लिपिड केवल एसयूवी से मज़बूती से बड़े होते हैं, यह Proteo-एसयूवी से प्रोटीन युक्त GUVs निर्माण करने के लिए केवल एक छोटा सा कदम तो है।

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Protocol

1. समाधान तैयारी

  1. 5 मिमी KCl, 1 मिमी HEPES (7.4 पीएच) या TRIS (पीएच 7.5), और 2 मिमी Trehalose युक्त 'एसयूवी बफर' के 5 मिलीलीटर तैयार करें। 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ बफर फ़िल्टर और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, जो 1 मिलीलीटर aliquots में विभाजित करते हैं।
    नोट: अभिकर्मकों और उपकरणों के लिए अतिरिक्त विवरण सामग्री सूची में दिए गए हैं।
  2. फिल्म पुनर्जलीकरण दौरान guv इंटीरियर भर जाएगा कि guv 'विकास बफर' के 40 एमएल तैयार करें। एक 'कम नमक के विकास के लिए, 5 मिमी KCl, 1 मिमी HEPES (7.4 पीएच) या 1 मिमी Tris (पीएच 7.5), और ~ 400 मिमी सूक्रोज गठबंधन। एक 'शारीरिक नमक' विकास के लिए, 100 मिमी KCl, 5 मिमी HEPES (7.4 पीएच) या 5 मिमी Tris (पीएच 7.5), और ~ 200 मिमी सूक्रोज गठबंधन।
  3. 100 मिमी KCl, 5 मिमी HEPES (7.4 पीएच) या 5 मिमी Tris (पीएच 7.5), और ~ 200 मिमी ग्लूकोज के संयोजन के द्वारा प्रायोगिक कक्ष में बाहरी समाधान के लिए 'अवलोकन बफर' के 40 एमएल तैयार करें।
    नोट: इन बफ़र्स केवल EXA हैंmples। अन्य प्रयोगों के लिए बफ़र्स अनुकूलित करने के लिए चर्चा देखें।
  4. एक osmometer के साथ विकास और प्रेक्षण buffers की osmolarities उपाय। GUVs lyse या अवलोकन चैम्बर के लिए विकास कक्ष से स्थानांतरित जब पतन नहीं होगा तो यह है कि 1% के भीतर करने के लिए उन्हें मैच के लिए सूक्रोज या ग्लूकोज की कणिकाओं जोड़ें।
    नोट: sucrose के 1 मिमी (13.7 से 40 मिलीलीटर प्रति मिलीग्राम) या ग्लूकोज (40 मिलीलीटर प्रति 7.2 मिलीग्राम) जोड़कर इस एकाग्रता रेंज में ~ एक mOsm द्वारा परासारिता बढ़ जाती है।
  5. 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ विकास और प्रेक्षण बफ़र्स फ़िल्टर और बैक्टीरियल विकास को बाधित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।
  6. GUVs, छड़ी फैला है और फट नहीं करते तो यह है कि प्रयोगात्मक कक्षों की सतहों passivate करने की जरूरत है एक 5 मिलीग्राम / एमएल बीटा-कैसिइन समाधान के लिए फार्म 20 मिमी Tris (पीएच 7.5) बफर के 10 एमएल में बीटा-कैसिइन के 50 मिलीग्राम भंग। बीटा-कैसिइन पूरी तरह से 0.5 मिलीलीटर aliquots में, फिल्टर (0.2 माइक्रोन) यह (4 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटे तक) भंग कर रहा है एक बार फ्लैश जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है, जोबाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत thawed aliquots के आम तौर पर एक एक सप्ताह तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।

2. एसयूवी तैयारी

  1. तैयार है और पूर्व में प्रकाशित विस्तृत प्रोटोकॉल 28 निम्नलिखित Proteo-एसयूवी की aliquots फ्रीज। KvAP fluorescently (मास) के द्वारा 01:10 के लिपिड अनुपात करने के लिए एक प्रोटीन पर DPhPC एसयूवी में पुनर्गठित एलेक्सा-488 maleimide, (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ लेबल का प्रयोग करें।
    नोट: जंगली प्रकार KvAP अंतर सेलुलर सी टर्मिनस (अमीनो एसिड 247) के पास स्थित मोनोमर प्रति एक सिस्टीन शामिल हैं।
  2. फ्लोरोसेंट, लिपिड केवल एसयूवी:
    नोट: nitrile दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहने एक धूआं हुड के तहत क्लोरोफॉर्म संभाल लेना। क्लोरोफॉर्म उन्हें भंग कर सकते हैं के रूप में किसी भी प्लास्टिक के प्रयोग से बचें। क्लोरोफॉर्म समाधान Teflon टोपी के साथ एम्बर कांच की शीशियों में संग्रहित और कांच सीरिंज का उपयोग करते हुए स्थानांतरित किया जा सकता है। पहले और लिपिड pipetting के बाद क्लोरोफॉर्म के साथ कम से कम 5 से 10 बार सभी कांच के बने पदार्थ कुल्ला करने के लिए ध्यान रखना।
    1. के 100 μl तैयार करेंटेक्सास रेड-DHPE समाधान के 8.2 μl (1 मिलीग्राम / एमएल के साथ DPhPC समाधान के 100 μl (क्लोरोफॉर्म में 10 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण से लाल फ्लोरोसेंट लिपिड, टेक्सास लाल DHPE, 0.5 मोल% से युक्त 10 मिलीग्राम / एमएल DPhPC एसयूवी एक 1.5 एमएल एम्बर कांच की शीशी में) मेथनॉल में।
    2. शीशी घूर्णन जबकि एक रासायनिक हुड में नाइट्रोजन की एक धारा के तहत लिपिड नीचे सूखी। फिल्म शुष्क होने के लिए प्रकट होता है, किसी भी अवशिष्ट विलायक दूर करने के लिए तीन घंटे के लिए एक वैक्यूम के अंतर्गत लिपिड जगह है।
    3. लिपिड के लिए एसयूवी बफर के 100 μl जोड़ें, और भंवर सख्ती कोई लिपिड शीशी की दीवारों से अटक रहता है और जब तक समाधान समान रूप से दूधिया है।
    4. एसयूवी के लिए फार्म लिपिड समाधान Sonicate। अल्ट्रासाउंड सबसे आंदोलन का कारण बनता है जब तक शीशी स्थिति को समायोजित करें और शीशी के अंदर प्रवाह है, और अनावश्यक रूप से समाधान करने के लिए गर्मी नहीं ख्याल रखना। जब संभव समाधान पारदर्शी हो जाता है जब तक sonication के लिए जारी रखें, या, पारदर्शी (टिप sonication के लिए 2-5 मिनट, ~ स्नान sonication के लिए 20 मिनट)।
    5. Aliquoटी एसयूवी (जैसे, 10 μl या 20 μl) और फ्रीज (-20 डिग्री सेल्सियस) के लिए बाद में उपयोग।
      नोट: lipids, विशेष रूप से असंतृप्त लिपिड, आसानी से कर सकते टूटने। आर्गन के तहत 20 डिग्री सेल्सियस (या 80 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर लिपिड समाधान और 6 महीने के भीतर का उपयोग करें। लिपिड टूटने उत्पादों पतली परत क्रोमैटोग्राफी के साथ पाया जा सकता है।

Electroformation द्वारा 3. guv ग्रोथ

  1. Electroformation चैम्बर तैयार करें।
    1. चैम्बर साफ नहीं किया गया है, खिड़कियों के सभी निकालें सीलेंट और तेल पोंछ, तारों निकालने, और कुल्ला और पानी और बारी-बारी से इथेनॉल (≥70%) का उपयोग कर एक ऊतक के साथ चैम्बर रगडें।
    2. , अच्छी तरह से तारों रगड़ो एसीटोन में तारों और चैम्बर डूब, और 5 मिनट के लिए sonicate। एक ऊतक फिर एसीटोन उपयोग करने के साथ सब कुछ साफ कर लें। 5 मिनट के लिए इथेनॉल और sonicate में चैम्बर रखो।
    3. छेद के माध्यम से तारों डालने से चैम्बर इकट्ठा, और बारी बारी से और वे गिरफ्तारी सुनिश्चित करने के लिए तारों पोंछई साफ। , आसुत जल में चैम्बर रखो 5 मिनट के लिए sonicate और नाइट्रोजन या हवा की एक धारा के साथ चैम्बर सूखी।
  2. एसयूवी बफर में 3 मिलीग्राम / एमएल एसयूवी निलंबन के 30 μl तैयार करें। , प्रोटीन युक्त GUVs फार्म Proteo-एसयूवी की 8 μl गठबंधन करने के लिए (DPhPC 10 मिलीग्राम / एमएल KvAP 1:10), फ्लोरोसेंट एसयूवी की दो μl (10 मिलीग्राम / एमएल DPhPC, 0.5 मोल% TexasRed-DHPE) और एसयूवी के 20 μl 12.5 और 0.1 मोल% TexasRed-DHPE: 1 के लिपिड (मास) के अनुपात में करने के लिए एक अंतिम प्रोटीन के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बफर। सख्ती समाधान मिलाएं।
    1. वैकल्पिक रूप से, बस फ्लोरोसेंट एसयूवी के 10 μl गठबंधन, लिपिड केवल एसयूवी के साथ प्रोटोकॉल अभ्यास करने के लिए (10 मिलीग्राम / DPhPC और 0.5 मोल% TexasRed-DHPE मिलीलीटर) 20 μl एसयूवी बफर के साथ।
  3. एसयूवी समाधान जमा।
    1. तारों पर एसयूवी समाधान के छोटे (<0.2 μl) बूंदों जमा करने के लिए एक दो μl पिपेट या 5 μl कांच सिरिंज का प्रयोग करें। लगभग समाधान के 1 μl साथ बूंदों की एक श्रृंखला के फार्म की जरूरत हैतार का एक सेमी। बूंदों काफी छोटे हैं और काफी दूर तक वे के लिए स्पर्श या फ्यूज नहीं है कि अलग स्थान सुनिश्चित करें।
    2. जमा एसयूवी खुली हवा में 30 मिनट ~ के लिए दो सूखी। सभी बूंदों तय हो चुका है जब लिपिड जमाओं माइक्रोस्कोप के साथ पालन करने के लिए आसान कर रहे हैं तो, तार बारी बारी से।
      नोट: एसयूवी पर्याप्त सूखी नहीं है, तो विकास बफर जोड़ा जाता है जब प्रोटीन को नुकसान पहुंचा सकता है बहुत ज्यादा सुखाने, जबकि वे सिर्फ तारों से दूर धो सकते हैं। हवा में नमी सूखने की दर, सुखाने समय और / या हवा में नमी को प्रभावित करती है क्योंकि इष्टतम परिणाम 30 के लिए समायोजित किया जा सकता है। तारों पर लिपिड फिल्म एक खुर्दबीन के नीचे दिखाई जानी चाहिए।
  4. चैम्बर इकट्ठे।
    1. चैंबर नीचे सील: यह एक अंतराल के बिना पालन करता है, ताकि यह चैम्बर नीचे सील करने के खिलाफ तीन कुओं के आसपास कक्ष के नीचे करने के लिए वैक्यूम तेल लागू करते हैं और धीरे से एक 40 मिमी x 22 मिमी coverslip के प्रेस करने के लिए एक सिरिंज का प्रयोग करें। चैंबर के पक्षों (जहां तारों से बाहर निकलें) के साथ सीलपेस्ट सील। तीन कुओं रूपरेखा चैम्बर के शीर्ष पर वैक्यूम तेल लागू करें।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से शीर्ष करने के लिए भर जाता है जब तक धीरे-धीरे विकास बफर जोड़ें। इस इलेक्ट्रोड बंद लिपिड फिल्म पट्टी कर सकते हैं के रूप में कुओं में समाधान के किसी भी तेजी से आंदोलन करने से बचें।
    3. नीचे coverslip बेदखल नहीं ख्याल रख रही है, तेल पर धीरे शीर्ष कवर स्लाइड दबाकर चैम्बर बंद करें। शीर्ष कवर पर्ची के किनारों पर बफर के किसी भी बूंदों को दूर करने के लिए एक ऊतक का प्रयोग करें।
      नोट: यह लिपिड फिल्म तारों पर बनी हुई है कि पुष्टि करने के लिए खुर्दबीन के नीचे चैम्बर की जांच करने के लिए एक अच्छा समय है।
  5. दो मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर तारों को संकेत जनरेटर से कनेक्ट करें। कम / उच्च नमक बफर के लिए वर्ग (VRMS) मतलब आवृत्ति (कम / उच्च नमक बफर के लिए 10 हर्ट्ज / 500 हर्ट्ज साइन लहर) सेट और मापने के लिए और 0.7 / 0.35 वी रूट करने के लिए तारों भर में वोल्टेज को समायोजित करने के लिए एक मल्टीमीटर का उपयोग करें। प्रकाश से fluorophores की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ चैम्बर कवर। टी छोड़ दोवह GUVs कम नमक बफर के लिए 2 से 3 घंटा, और उच्च नमक बफर के लिए 12 घंटा या हे / N के लिए विकसित करने के लिए।
  6. जनरेटर से चैम्बर डिस्कनेक्ट और ध्यान से guv विकास का मूल्यांकन करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप पर जगह है। समय से पहले तारों से GUVs अलग हो सकता है कुओं में धीमी गति से सतत आंदोलनों या द्रव का प्रवाह का उपयोग करें।
    नोट: कहीं भी तारों के निचले आधे पर GUVs epifluorescence के साथ देखा जा सकता है, जबकि तार किनारों पर GUVs, चरण विपरीत (40x लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य) में आम तौर पर दिखाई दे रहे हैं। कोई GUVs दिखाई दे रहे हैं, तो ऊपरी सतह को देखने के लिए तारों घूर्णन की कोशिश करो। GUVs कई दिनों के लिए एक विकास कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

जेल की सहायता की सूजन 4. guv ग्रोथ

  1. शुद्ध पानी की 10 मिलीलीटर के साथ agarose की 100 मिलीग्राम के मिश्रण से एक 1% agarose समाधान के 10 एमएल तैयार करें। यह ~ 20 सेकंड के लिए 480 डब्ल्यू में एक माइक्रोवेव में डाल द्वारा फोड़े जब तक यह गर्मी। Agarose पूरी तरह भंग कर रहा है सुनिश्चित करने के लिए हिलाओ।
    नोट: समाधान4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है और जब जरूरत reheated जा सकता है।
  2. प्लाज्मा-स्वच्छ हवा (प्लाज्मा) agarose समाधान उस पर अच्छी तरह से फैल जाएगा तो यह है कि एक मिनट के लिए एक कवर स्लाइड। प्लाज्मा सफाई का असर जल्दी बंद पहनता के रूप में अगले 15 मिनट के भीतर कवर स्लाइड्स का प्रयोग करें।
  3. पूरी सतह wets समाधान तो प्रत्येक 22 x 22 मिमी 2 स्लाइड करने के लिए गर्म agarose समाधान के 200 μl लागू करें। खड़ी स्लाइड झुकाएँ और अतिरिक्त तरल निकालने और स्लाइड पर agarose की सिर्फ एक पतली चिकनी परत को छोड़ने के लिए एक ऊतक के निचले किनारे को छूने।
  4. 60 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली या ओवन पर स्लाइड प्लेस और कम से कम 30 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए छोड़ दें। agarose फिल्म आंखों से मुश्किल से दिख रहा है। स्लाइड आरटी को शांत करने के बाद, उन्हें तुरंत उपयोग करें, या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक बंद कंटेनर में अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए उन्हें दुकान।
  5. एक मानक 3.5 सेमी पेट्री डिश में agarose लेपित coverslip रखें।
  6. धारा 3.2 के रूप में एसयूवी समाधान तैयार करने और लागू ~ एसयूवी समाधान (3 मिलीग्राम / एमएल लिपिड) में से 15 μl~ Agarose सतह पर 30 बहुत छोटी बूंदों धीरे। बहुत ज्यादा agarose परत विकृत करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
  7. के बारे में 10-15 मिनट के लिए नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा के तहत स्लाइड प्लेस और बूंदों से सूखे के रूप में आंखों से बफर के वाष्पीकरण का पालन करें।
  8. जैसे ही एसयूवी सूख गए हैं, के रूप में स्लाइड सतह को कवर करने के लिए विकास बफर जोड़ें। एक छोटे से 3.5 सेमी पेट्री डिश उपयोग बफर के ~ 1 एमएल के लिए।
  9. सूजन 30 मिनट ~ के लिए आगे बढ़ना है, और फिर चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कक्ष में GUVs के विकास की जांच करने की अनुमति दें।
    नोट: epifluorescence अवलोकन के कारण जेल और agarose की ऑटो प्रतिदीप्ति में fluorophores के मजबूत पृष्ठभूमि के लिए मुश्किल है।

5. फसल काटने वाले और देख GUVs

  1. अवलोकन कक्ष (जैसे, छोटे पेट्री डिश या कांच coverslip) GUVs छड़ी नहीं है, इसलिए है कि फैला है और चैम्बर तल पर फट passivate। चाम आवरणदिसंबर बीटा-कैसिइन समाधान के साथ नीचे, 5 मिनट के लिए सेते हवा या नाइट्रोजन की एक धारा के साथ सूखी शुद्ध पानी के साथ कैसिइन समाधान, बाहर कुल्ला, और अंत में अवलोकन बफर जोड़ने (जैसे, ~ एक छोटे से पेट्री डिश के लिए 5 मिमी गहराई)।
  2. GUVs हार्वेस्ट। उद्घाटन बड़ा (~ 2 मिमी व्यास) है तो एक 100 μl पिपेट सुझावों के अंत में कटौती, और आसानी से GUVs नष्ट कर सकते हैं, pipetting की कतरनी तनाव के रूप में धीरे-धीरे ख्वाहिश।
    1. विद्युत का गठन GUVs के लिए, धीरे शीर्ष coverslip हटाने के द्वारा विकास कक्ष खुला। GUVs अलग करने के लिए तार के साथ विंदुक टिप चलती है जबकि ~ प्रत्येक तार और महाप्राण सीधे ऊपर 50 μl विंदुक टिप रखें।
      नोट: यह तार की "दूसरी तरफ" पर GUVs इकट्ठा करने के लिए तार को घुमाने के लिए मदद मिल सकती है।
    2. "जेल की सहायता की सूजन" GUVs के लिए, पहली GUVs coverslip सतह से अलग करने में मदद करने के लिए एक बार कुछ पेट्री डिश के पक्ष नल। पी जबकि 50 μl सिर्फ coverslip और महाप्राण से ऊपर विंदुक टिप स्थित करेंवापस सतह पर टिप ulling। सीधे अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एक अवलोकन कक्ष, या स्टोर करने के लिए काटा GUVs हस्तांतरण।
  3. , एक औंधा माइक्रोस्कोप पर अवलोकन चैम्बर जगह अवलोकन चैम्बर के लिए GUVs जोड़ने के लिए, और GUVs चैम्बर तल पर व्यवस्थित करने के लिए कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  4. जल्दी से चिकनी, गोलाकार ('दोष मुक्त') "guv उम्मीदवारों" पता लगाने के लिए चरण विपरीत या डीआईसी के साथ चैम्बर सर्वेक्षण। अंदर नेस्ट किसी भी युक्त छोटे liposomes बाहर करने के लिए epifluorescence में प्रत्येक "guv उम्मीदवार" जांच करते हैं। अंत में, लिपिड प्रतिदीप्ति तीव्रता एक एकल झिल्ली (यानी, unilamellar) के साथ वर्दी और संगत है कि जाँच करें।
    नोट: वे चरण विपरीत या डीआईसी छवियों में unilamellar दिखाई देते हैं तो कुछ bilamellar (या बहु तहदार) में vesicles, झिल्ली हल किया जाना भी एक साथ बंद कर रहे हैं। हालांकि, इन वस्तुओं के वास्तविक unilame से प्रतिष्ठित किया जा सकता हैदो बार (या अधिक) उज्जवल है जो उनके लिपिड प्रतिदीप्ति द्वारा llar GUVs।

6. पैच clamping GUVs

  1. पिपेट खींचने के लिए सिफारिश की प्रोग्राम का उपयोग कर मानक borosilicate केशिका गिलास से एक 1-2 माइक्रोन टिप व्यास के साथ पैच pipettes बनाओ।
    नोट: इस तरह के आग चमकाने के रूप में विशेष उपचार के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं, और pipettes वे एक बंद बॉक्स में रखा जाता है अगर वे निकाला गया है के बाद कई दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. GUVs, पालन चैम्बर सतहों पर फैला है और टूटना नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए एक बीटा-कैसिइन समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल) के साथ incubating द्वारा चैम्बर passivate। 5 मिनट के बाद कैसिइन बंद कुल्ला।
  3. , जमीन इलेक्ट्रोड डालने अवलोकन बफर के साथ चैम्बर भरें, कदम 5.2 और 5.3 में वर्णित के रूप में guv निलंबन के 10 μl हस्तांतरण, और GUVs तल पर व्यवस्थित करने के लिए कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  4. समाधान (अवलोकन बफर या किसी अन्य आईएसओ आसमाटिक समाधान) के साथ एक ताजा पैच पिपेट भरें औरपैच दबाना एम्पलीफायर headstage पर माउंट।
  5. कक्ष के माध्यम से खोज खंड 5.4 में वर्णित के रूप में एक "दोष मुक्त" guv का पता लगाने, और यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन होता है कि जाँच करने के लिए।
  6. एक निरंतर सकारात्मक दबाव लागू करें (> 100 फोनों के लिए, या मोटे तौर पर 1 सेमी एक दबाव नापने का यंत्र में एच 2 ओ) स्वच्छ इंटीरियर पैच पिपेट रखने के लिए, और चेंबर में पैच पिपेट डालने के लिए। , देखने के क्षेत्र में पैच पिपेट लाओ / मापने ऑफसेट और प्रतिरोध पिपेट वोल्टेज क्षतिपूर्ति, और टिप साफ है कि पुष्टि करने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत पिपेट जांच करने के लिए परीक्षण दालों लागू होते हैं।
  7. Guv की ओर पैच पिपेट ले आओ, और यदि आवश्यक हो, एक साथ "दूर चला" guv नहीं पड़ता पैच पिपेट से बाहर की ओर प्रवाह इतना सकारात्मक दबाव को कम। पैच पिपेट guv के करीब हो गया है, पैच पिपेट के खिलाफ guv खींचने के लिए (5 सेमी एच 2 ओ तक) एक नकारात्मक दबाव लागू होते हैं। के रूप में प्रतिरोध मॉनिटर "; Guv झिल्ली की जीभ "पैच पिपेट और gigaseal रूपों में प्रवेश करती है।
  8. एक gigaseal फार्म नहीं किया है, तो कक्ष से पैच पिपेट को हटाने और 6.4 चरण पर लौटने। झिल्ली पैच एक gigaseal गठन किया है, लेकिन guv विंदुक के साथ जुड़ा रहता है, guv से दूर खींच फोड़ guv चैम्बर नीचे के खिलाफ, या संक्षेप में समाधान के बाहर पिपेट ले जाकर पैच आबकारी।
  9. अंदर-बाहर झिल्ली पैच guv से excised और gigaseal स्थिर है किया गया है, परीक्षण दालों बंद कर और इस तरह के चित्र 13 में दिखाया गया है एक के रूप में एक वोल्टेज प्रोटोकॉल लागू होते हैं।
    नोट: चित्रा 13 मौजूदा पैच-इलेक्ट्रोड में बह "सकारात्मक" है, जिसमें एक के अंदर-बाहर पैच के लिए मानक electrophysiological सम्मेलन इस प्रकार है, और वी वी = स्नान - वी पिपेट। एक नकारात्मक क्षमता पर पैच होल्डिंग (जैसे, वी = -100 एम वी) आराम की स्थिति में ~ 30 सेकंड स्थानों KvAP, के लिए कदम उठाए हैं, जबकि (10अधिक सकारात्मक क्षमता (जैसे, वी = 100 एम वी) फिर आयोजित करने (यानी, खुला) सक्रिय राज्यों में यह कर सकते हैं ड्राइव करने के लिए 5 सेकंड के लिए 0 मिसे)।
  10. एक झिल्ली पैच पर माप समाप्त हो जाने के बाद, एक जैप या दबाव नाड़ी के साथ पैच तोड़ने के लिए और पैच इलेक्ट्रोड की ऑफसेट वोल्टेज चली नहीं किया गया है कि जाँच करें। चैम्बर से पैच पिपेट निकालें, और 6.4 चरण पर लौटने।

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Representative Results

GUVs के विकास को जल्दी से माइक्रोस्कोप के तहत विकास चैम्बर की जांच के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। Electroformation के लिए, GUVs चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्लैटिनम के तारों के साथ गुच्छों में वृद्धि करते हैं। जेल की सहायता की सूजन के दौरान, GUVs तेजी से बढ़ने और (चित्रा 5) एक साथ फ्यूज कि गोलाकार संरचना के रूप में दिखाई देते हैं।

दोष मुक्त GUVs अधिक आसानी से पहचान की है और एक अवलोकन कक्ष में स्थानांतरित होने के बाद मूल्यांकन कर रहे हैं। अंशांकन माप कड़ाई से guv गुणवत्ता का मूल्यांकन करने की जरूरत है, और एक व्यवस्थित मात्रा का ठहराव पहले से 28 प्रकाशित किया गया है। हालांकि, एक अनुभवजन्य गाइड के रूप में, "" अच्छा GUVs के अंदर एक भी, चिकनी, गोलाकार बाहरी झिल्ली है, (आदि यानी, ट्यूब, नेस्ट पुटिकाओं,) कोई वस्तु होते हैं, (यानी, नहीं एक क्लस्टर में) अलग-थलग, और किया जाना चाहिए 'मानक' लिपिड प्रतिदीप्ति स्तर है (उज्जवल वस्तुओं आम तौर पर द्वि या बहु कर रहे हैंतहदार)। चित्रा 6 एक आईएसओ आसमाटिक ग्लूकोज समाधान करने के लिए स्थानांतरण के बाद एक 'दोष मुक्त' guv की डीआईसी और epifluorescence छवियों से पता चलता है। डीआईसी में विपरीत सूक्रोज भरा guv और ग्लूकोज युक्त स्नान समाधान के बीच ऑप्टिकल घनत्व में अंतर की वजह से है। KvAP युक्त GUVs का अपवर्तनांक विपरीत अक्सर KvAP खुद सूक्रोज या ग्लूकोज के लिए पारगम्य नहीं होना चाहिए, भले ही समय के साथ कम हो जाती है। guv झिल्ली में वर्दी प्रोटीन प्रतिदीप्ति KvAP guv में शामिल किया है (यानी, यह लिपिड फिल्म में रहना नहीं किया था) और माइक्रोन पैमाने (या बड़ा) समुच्चय का गठन नहीं किया गया है कि पुष्टि करता है।

कम नमक electroformation प्रोटोकॉल, शारीरिक नमक electroformation प्रोटोकॉल, और जेल की सहायता की सूजन प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित GUVs से आंकड़े 7, 8 और लिपिड और प्रोटीन प्रतिदीप्ति के 9 शो confocal छवियों। फ्लोरोसेंट लिपिड (मैजंटा) और प्रोटीनइकाई क्षेत्र (प्रोटीन घनत्व) प्रति प्रोटीन की एक उच्च / कम संख्या के साथ GUVs ओवरले छवियों (सही कॉलम) में मैजंटा / हरे रंग की छाया इतनी है कि (हरा) का संकेत है, एक ही औसत तीव्रता करने के लिए बढ़ाया गया है एक साथ GUVs जबकि औसत प्रोटीन घनत्व सफेद होते हैं। अलग, दोष मुक्त GUVs की पहचान की गई और guv आकार के वितरण 10 चित्र में दिखाया गया है। आमतौर पर electroformation जेल की सहायता की सूजन से भी अधिक दोष मुक्त GUVs पैदा करता है, लेकिन electroformation द्वारा उत्पादित GUVs छोटे होते हैं। 11 चित्रा अनुमानित प्रोटीन घनत्व वितरण से पता चलता है GUVs की प्रतिदीप्ति से। उच्च नमक बफर के साथ Electroformation प्रोटीन घनत्व guv को guv से बहुत भिन्न होता है, जिसमें GUVs पैदा करता है। जेल की सहायता की सूजन द्वारा उत्पादित GUVs के प्रोटीन घनत्व उल्लेखनीय समान है, जबकि व्यक्तिगत GUVs के प्रोटीन घनत्व, कम नमक बफर के साथ electroformation के लिए बहुत कम भिन्न होता है।

पैच दबाना तकनीक एक व्यापक रूप से इस्तेमाल होता हैऐसे KvAP के रूप में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल के समारोह के अध्ययन के लिए डी विधि। "अंदर-बाहर" रिकॉर्डिंग में, एक साफ ग्लास "पैच" पिपेट एक guv से झिल्ली का एक पैच आबकारी करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पैच विंदुक के अंदर एक इलेक्ट्रोड तो झिल्ली पैच के माध्यम से बह परिणामी वर्तमान वोल्टेज लागू होते हैं, और मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। झिल्ली पैच की रचना सेल / guv 31 के बाकी हिस्सों से काफी भिन्न कर सकते हैं, लेकिन "के अंदर-बाहर" परंतु एक चैनल प्रवाहकत्त्व, आयनिक चयनात्मकता, और वोल्टेज पर निर्भर gating को मापने के लिए बहुत उपयोगी है। ये तीन गुण धाराओं कलाकृतियों (जैसे, gigaseal मुद्दों) या दूषित पदार्थ (शुद्धि से जैसे, बैक्टीरियल porins) की वजह से नहीं कर रहे हैं स्थापित करने के लिए एक शानदार तरीका है, और GUVs में कार्यात्मक KvAP चैनल हैं।

चैनल प्रवाहकत्त्व सबसे आसानी से केवल एक या दो सक्रिय चैनल के साथ पैच में मापा जाता है। EXA मेंझिल्ली -100 एम वी पर आयोजित किया जाता है जब 100 एम वी पर, अलग-अलग चैनल के उद्घाटन स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है, जबकि चित्रा 12 में दिखाया गया mple, कोई चैनल के उद्घाटन, मनाया जाता है। वर्तमान हिस्टोग्राम बंद और खुले राज्यों को इसी दो चोटियों से पता चलता है, और एक डबल गाऊसी समारोह के साथ उन्हें ढाले (100 मिमी KCl में) 109.2 ± 8.5 पी एस के एक प्रवाहकत्त्व के लिए इसी 10.9 ± 0.85 देहात के एक चैनल वर्तमान पैदावार। एक चैनल प्रवाहकत्त्व समाधान (विशेष रूप से पोटेशियम एकाग्रता) और झिल्ली रचना 32,33 पर निर्भर करता है कि ध्यान दें।

कई अन्य कश्मीर चैनलों, व्यक्तिगत KvAP चैनलों प्रदर्शनी की तरह तेजी से खुलने और बंद होने के फटने "बकबक"। पहले से प्रदर्शन के रूप में, पोटेशियम चयनात्मकता पैच पिपेट में एक अलग समाधान का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, पैच पिपेट समाधान 90 मिमी NaCl, 10 मिमी KCl) 28।

वोल्टेज पर निर्भर gating अक्सर हैऔर अधिक आसानी से एक पहनावा औसत प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में, कई चैनलों के साथ पैच में TUDIED। "अंदर-बाहर" झिल्ली पैच में कोई स्पष्ट (guv इंटीरियर पर इंट्रासेल्युलर डोमेन) शारीरिक पक्ष तंत्र और उलटा (guv बाहरी पर अंतर सेलुलर डोमेन) GUVs में KvAP की प्रविष्टि, जबकि वहाँ कार्यात्मक चैनलों का बहुमत है " शारीरिक "प्रविष्टि 28। 13 चित्रा 5-दूसरे depolarizing कदम की एक श्रृंखला के लिए कई युक्त झिल्ली पैच की प्रतिक्रिया (> 10) चैनलों से पता चलता है। प्रत्येक चरण के बीच, पैच "शारीरिक" प्रविष्टि के साथ चैनल उनके आराम की स्थिति में लौटने की अनुमति देने के लिए 30 सेकंड के लिए -100 एम वी पर आयोजित किया जाता है। संभावित पर्याप्त नकारात्मक है जब (उदाहरण के लिए, वि <-60 एम वी) वर्तमान के सबसे gigaseal रिसाव की वजह से है, और "उलटा" प्रविष्टि है की संभावना है, जो एक या दो चैनलों के कभार उद्घाटन। अधिक सकारात्मक pote करने के लिए कदम के लिएव्यक्ति के उद्घाटन और closings अब नहीं सुलझाया जा सकता है कि वहाँ बहुत सारे हैं जब तक ntials, चैनलों की बढ़ती संख्या मनाया जाता है। इस प्रकार, चैनल के खुले संभावना स्पष्ट रूप से वोल्टेज पर निर्भर है। KvAP सक्रियण और निष्क्रियता के कैनेटीक्स काले लिपिड झिल्ली (BLMs) 26 और GUVs के बीच काफी अलग है, लेकिन इस केवी चैनल gating झिल्ली संरचना और राज्य 34 के प्रति संवेदनशील हो सकता है कि पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है।

चित्रा 1
चित्रा 1. guv Electroformation योजनाबद्ध:। एसयूवी युक्त बूंदों एक इलेक्ट्रोड पर जमा कर रहे हैं समाधान का आंशिक निर्जलीकरण एसयूवी झिल्ली का एक ढेर के लिए फार्म का फ्यूज करने के लिए कारण बनता है। बफर फिर जोड़ा जाता है और एक एसी बिजली के क्षेत्र लागू होता है। फिल्म फूल के रूप में, अलग-अलग झिल्ली GUVs फार्म करने के लिए ढेर से अलग। (यह आंकड़ा आधुनिक कर दिया गया है Aimon एट अल। 28 से ified)

चित्रा 2
चित्रा 2. guv Electroformation चैंबर। चैम्बर तीन कुओं (10 मिमी व्यास, 5 मिमी गहराई) के साथ एक PTFE-ब्लॉक के बाहर milled है। दो 0.5 मिमी व्यास प्लैटिनम तारों 3 मिमी (धार को बढ़त दूरी) से अलग हो रहे हैं और तारों की इमेजिंग की सुविधा के लिए कक्ष के नीचे बंद करने के लिए तैनात कर रहे हैं। नीचे और ऊपर कवर फिसल जाता है वैक्यूम तेल के साथ जगह में आयोजित की जाती हैं, और सील पेस्ट तरफ तार छेद से किसी भी लीक से बचाता है। एसी जनरेटर के तारों को मगरमच्छ क्लिप के साथ जुड़ा हुआ है। चैम्बर अर्नेस्टो Ambroggio और लुइस Bagatolli द्वारा विकसित एक पर आधारित है। (यह आंकड़ा Aimon एट अल से संशोधित किया गया है। 28)

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चित्रा 3. उठना, सूजन योजनाबद्ध जेल की सहायता की: एक एसयूवी निलंबन युक्त बूंदों एक agarose जेल पर जमा कर रहे हैं छोटी बूंद dehydrates के रूप में, एसयूवी एक लिपिड फिल्म के लिए फार्म का फ्यूज।। विकास बफर जोड़ा जाता है, फिल्म rehydrates और GUVs सतह पर फार्म। GUVs सूजन और पड़ोसी GUVs साथ fusing द्वारा ~ 10 माइक्रोन का आकार बढ़ने।

चित्रा 4
एक उच्च नमक बफर में प्लैटिनम तार पर बढ़ती KvAP युक्त DPhPC GUVs चित्रा 4. प्रतिनिधि छवि। GUVs तार के साथ अंगूर के गुच्छों के समान है। एक 40x LWD उद्देश्य का उपयोग चरण विपरीत छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ays "> चित्रा 5
Agarose जेल पर सूजन KvAP युक्त चित्रा 5. DPhPC GUVs। GUVs 10 माइक्रोन ~ की एक व्यास के साथ बेहोश क्षेत्रों के रूप में दिखाई दे रहे हैं। अंधेरा / चमकीले धब्बों पुटिकाओं प्रफुल्लित जहाँ से लिपिड / agarose के समुच्चय हैं। 40X LWD उद्देश्य के साथ चरण विपरीत छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा एक दोष मुक्त guv 6. छवियाँ। एलेक्सा-488 के साथ लेबल KvAP युक्त (अंडा-पीसी: अंडा-पीए 9 जन द्वारा 1) छोड़ दिया: जिला उद्योग केंद्र, सही: एलेक्सा-488 epifluorescence। उत्तेजना: 470/50 एनएम, उत्सर्जन: 545/75 एनएम। कोई दिखाई समुच्चय के साथ KvAP से वर्दी प्रतिदीप्ति ध्यान दें। 81fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा एक कम नमक बफर में उगाई Electroformed GUVs से लिपिड (मैजंटा) और प्रोटीन (हरा) प्रतिदीप्ति 7. Confocal छवियों (अंडा-पीसी: अंडा-पीए 9: जन द्वारा 1) (ए) सफेद तीर चिह्न (संभावना)। GUVs, जबकि लाल तीर उच्च लिपिड प्रतिदीप्ति के साथ एक संभावित द्वि-तहदार पुटिका के निशान। प्रतिदीप्ति तीव्रता क्योंकि देखने की बहुत बड़ी क्षेत्र की इस छवि के केंद्र में उज्जवल है कि ध्यान दें। (बी) ज़ूम GUVs के एक छोटे समूह दिखा। वाम (मैजंटा): TexasRed-DHPE उत्तेजना: 543 एनएम लेजर लाइन, उत्सर्जन: 605/70 एनएम। केंद्र (हरा): एलेक्सा-488 उत्तेजना के साथ लेबल KvAP: 488 एनएम लेजर लाइन, उत्सर्जन: 515/30 एनएम। अधिकार: ओवरले।oad / 52,281 / 52281fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

8 चित्रा
चित्रा शारीरिक नमक एकाग्रता में उगाई Electroformed GUVs से लिपिड (मैजंटा) और प्रोटीन (हरा) प्रतिदीप्ति 8. Confocal छवियों (अंडा-पीसी: अंडा-पीए 9: जन द्वारा 1)। (ए) GUVs (सफेद तीर संभावना unilamellar दिखाने उदाहरण) अधिक विरल कम नमक प्रोटोकॉल की तुलना में कर रहे हैं और बहुत ही अलग प्रोटीन सांद्रता (लाल तीर) हो सकता है। (बी) ज़ूम GUVs के एक छोटे समूह दिखा। वाम (मैजंटा): TexasRed-DHPE उत्तेजना: 543 एनएम लेजर लाइन, उत्सर्जन: 605/70 एनएम मध्य (हरा): एलेक्सा-488 उत्तेजना के साथ लेबल KvAP: 488 एनएम लेजर लाइन, उत्सर्जन: 515/30 एनएम। अधिकार:। ओवरले कृपया गइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां चाटना।

9 चित्रा
चित्रा 9. लिपिड (मैजंटा) और जेल की मदद से एक शारीरिक नमक एकाग्रता बफर के साथ सूजन द्वारा गठित GUVs (DPhPC) के प्रोटीन (हरा) प्रतिदीप्ति की confocal छवि। GUVs शारीरिक बफर के साथ तैयार Electroformed GUVs की तुलना में एक अधिक सजातीय प्रोटीन घनत्व दिखा। बाएं (मैजंटा): BPTR-प्रमाणपत्र 0.1% उत्तेजना: 543 एनएम लेजर लाइन, उत्सर्जन: 605/70 एनएम। मध्य (हरा): एलेक्सा-488 उत्तेजना के साथ लेबल KvAP: 488 एनएम लेजर लाइन, उत्सर्जन: 515/30 एनएम। अधिकार:। दो चैनलों का मर्ज इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

10 चित्रा
का आकार कम नमक बफर में electroformation से बढ़ी दोष मुक्त Proteo-GUVs (DPhPC) के वितरण (ऊपर, एन = 94) या जेल की सहायता के agarose सूजन (नीचे, एन = 68)।

11 चित्रा
चित्रा 11. guv प्रोटीन घनत्व histograms: प्रोटीन घनत्व कम नमक बफर (5 मिमी KCl, DPhPC) के साथ GUVs Electroformed की (प्रति इकाई क्षेत्र प्रोटीन की संख्या) शारीरिक नमक एकाग्रता (100 मिमी KCl, अंडा-पीसी के साथ की तुलना में कम से भिन्न होता है: अंडा पैक: 9। जन द्वारा 1) जेल की सहायता की शारीरिक नमक बफर में सूजन की वृद्धि हुई GUVs के प्रोटीन घनत्व (DPhPC) कम से कम भिन्नता से पता चलता है। प्रोटीन घनत्व इन सांद्रता 28 के लिए KvAP-A488 प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए आनुपातिक है, और प्रत्येक हिस्टोग्राम में प्रतिदीप्ति तीव्रता वितरण का मतलब द्वारा सामान्यीकृत कर रहे हैं। (मध्यम पैनल संशोधित किया गया है) Aimon एट अल। 28 से

चित्रा 12
Guv झिल्ली पैच (DPhPC 'के अंदर-बाहर' वोल्टेज सम्मेलन) का 12 चित्रा एकल चैनल गतिविधि। Guv प्लैटिनम तारों पर 100 मिमी KCl, 5 मिमी HEPES पीएच 7.4 में हो गया था। पैच पर 100 एम वी संभावित लगाने के बाद खुले एकल चैनल। इनसेट के अधिकार के लिए एक चैनल प्रवाहकत्त्व की गणना करने के लिए इस्तेमाल एक हिस्टोग्राम है। लाल रेखा 109.2 ± 8.5 पी एस के एक प्रवाहकत्त्व के लिए इसी 4.70 ± 0.27 पीए और 15.62 ± 0.58 प्रतिवर्ष Maxima के साथ एक डबल गाऊसी समारोह के लिए एक फिट है। ट्रेस एक 4-पोल बेसल फिल्टर के साथ 10 kHz पर फ़िल्टर और 50 kHz पर दर्ज किया गया था।

चित्रा 13
चित्रा 13 वोल्ट dependen एक उच्च नमक बफर में agarose पर गठित एक guv (DPhPC, 'अंदर-बाहर' वोल्टेज कन्वेंशन) से झिल्ली पैच में टी gating के चैनलों। वोल्टेज में एक क्षणिक कदम के लिए पैच झिल्ली वर्तमान की (ए) रिस्पांस। पिपेट और स्नान समाधान दोनों 100 मिमी KCl निहित है, और झिल्ली लगातार वोल्टेज कदम के बीच -100 एम वी पर 30 सेकंड के लिए आयोजित की गई थी। एक करीबी निरीक्षण पर एक ट्रेस नकारात्मक voltages के साथ खोलने के लिए लगता है कि एक या दो चैनलों में शामिल है कि देख सकते हैं। इनसेट क) में देरी खोलने और इनसेट ख) चैनल की देरी को बंद करने के लिए एक ज़ूम पता चलता है। धाराओं 10 kHz पर एक 4-पोल बेसल फिल्टर के साथ फ़िल्टर और 51.3 kHz पर दर्ज किए गए। ट्रेस 513 हर्ट्ज से नीचे-नमूना था ऑफ़लाइन। नकारात्मक समाई क्षणिक -150 फिलीस्तीनी अथॉरिटी में काट रहा है। कदम वोल्टेज बनाम (बी) के औसत वर्तमान (<टी <5 सेकंड 0.25 सेकंड)। चैनल खुला संभावना वोल्टेज पर निर्भर है क्योंकि सकारात्मक voltages पर धाराओं बड़े होते हैं।Iles / ftp_upload / 52,281 / 52281fig13large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Biomimetic मॉडल प्रणाली प्रोटीन और झिल्ली के गुणों और बातचीत के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। BLMs या समर्थित लिपिड झिल्ली की तरह अन्य पुनर्गठन प्रणालियों की तुलना में, guv सिस्टम काफी झिल्ली रचना, तनाव और ज्यामिति का नियंत्रण है, साथ ही सही मायने में किया जा रहा है तेल मुक्त सहित उपस्थित कई अवसर आधारित है। हालांकि, GUVs में, इस तरह के KvAP रूप transmembrane प्रोटीन, शामिल लिपिड केवल GUVs के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण रूपांतरों की आवश्यकता है। यहाँ प्रस्तुत electroformation प्रोटोकॉल पहले से विशेषता है और घुमावदार झिल्ली 2,4,35 में झिल्ली प्रोटीन वितरण और गतिशीलता के biophysical सिद्धांतों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस काम GUVs में प्रोटीन पुनर्गठन के लिए तरीकों के सेट को जोड़ने, एक नई जेल की सहायता की सूजन प्रोटोकॉल को दर्शाता है। अंदर-बाहर पैच पर दोष मुक्त KvAP के उच्च घनत्व युक्त GUVs, और माप का उत्पादन कर सकते दोनों प्रोटोकॉल पुष्टि करते हैं किएसई GUVs कार्यात्मक पोटेशियम चयनात्मक, वोल्टेज निर्भर चैनलों होते हैं।

दो दृष्टिकोण अलग अलग शक्तियों और कमजोरियों है। कम नमक स्थितियों में इस्तेमाल किया जा सकता है, electroformation guv उपज और वर्दी प्रोटीन घनत्व के बीच एक अच्छा समझौता प्रदान करता है। Electroformation अभी भी शारीरिक नमक सांद्रता के साथ उचित पैदावार देता है, लेकिन प्रोटीन घनत्व (आंकड़े 8 और 11 देखें) GUVs के बीच भिन्न हो सकते हैं। घनत्व विविधताओं विकास बहुत लंबे समय तक 2 घंटे से जारी है कम नमक बफर विकास के रूप में भी पर्याप्त घनत्व बदलाव हो सकता है, electroformation की अवधि के लिए जोड़ा जा करने लगते हैं। इसके विपरीत, जेल की सहायता की सूजन द्वारा उत्पादित GUVs भी शारीरिक बफ़र्स के लिए, एक उल्लेखनीय वर्दी प्रोटीन घनत्व है। हालांकि, बहु तहदार पुटिकाओं के अंश का अधिक से अधिक है, और agarose ऑटो प्रतिदीप्ति कम प्रोटीन की मात्रा का ठहराव 16 घनत्व पेचीदा हो। पीएलए में polyvinyl शराब का प्रयोगagarose के सीई लिपिड क्लोरोफॉर्म 20 से जमा थे जब जेल की सहायता guv उपज में सुधार करने के लिए रिपोर्ट है, लेकिन हम एसयूवी समाधान के साथ polyvinyl शराब का उपयोग कर GUVs उत्पादन करने में असमर्थ थे दिया गया है। दोष मुक्त GUVs के एक कम उपज स्वीकार्य है, तो जेल की सहायता की सूजन एक समान प्रोटीन वितरण की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए एक स्पष्ट लाभ है।

Electroformation और जेल की सहायता की सूजन भी काफी अलग उपकरण आवश्यकताओं है। जेल की सहायता की सूजन प्रोटोकॉल साफ, हाइड्रोफिलिक कांच का उत्पादन करने के लिए कई वैकल्पिक तरीकों के रूप में वहाँ आवश्यक नहीं है जो प्लाज्मा क्लीनर, के लिए छोड़कर थोड़ा विशेष उपकरणों का उपयोग करता है। इसके विपरीत, electroformation तार इलेक्ट्रोड के साथ एक कस्टम चैम्बर की आवश्यकता है। प्लैटिनम तार महंगा है, लेकिन इस प्रोटोकॉल के लिए GUVs टाइटेनियम तारों की तुलना में प्लैटिनम के साथ और अधिक आसानी से बढ़ी है, और शारीरिक नमक सांद्रता का उपयोग करते समय आईटीओ पर विकसित नहीं किया GUVs स्लाइड। इलेक्ट्रोड (0.5 मिमी) का व्यास एक compr हैइलेक्ट्रोड सतह और कीमत के बीच omise। चित्रा 2 में दिखाया गया चैम्बर लुइस Bagatolli 15 और अर्नेस्टो Ambroggio से एक डिजाइन पर आधारित है, और सबसे सॉल्वैंट्स के साथ सफाई अनुमति देने के लिए polytetrafluoroethylene (PTFE) से machined किया गया था। हालांकि, polyacetal या polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) भी अच्छी तरह से काम करना चाहिए। आक्रामक सफाई के लिए प्लैटिनम तारों को दूर करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है, और पहली प्रोटोकॉल सीखने, जब वह नीचे कवर स्लाइड के माध्यम से बगल में guv विकास निरीक्षण करने के लिए सक्षम होने के लिए बहुत उपयोगी है। छोटे, कुओं पीछे और आगे स्लोशिंग से समाधान रोकने के लिए और भी समानांतर में कई लिपिड रचनाओं का परीक्षण की अनुमति देने बंद कर दिया। बाहर शुरू हालांकि, जब एक विशेष कस्टम चैम्बर नहीं आवश्यक है। उदाहरण के लिए, सरल, एकल अच्छी तरह से कक्षों एक छोटी शीशी की टोपी के माध्यम से उन्हें poking बस एक छोटा सा पेट्री डिश के नीचे करने के लिए नीचे दो तारों tacking, या दो गिलास स्लाइड के बीच सैंडविच करने के लिए उन्हें सील मोम का उपयोग कर, या द्वारा तात्कालिक जा सकता है।

Electroformation और जेल की सहायता की सूजन प्रोटोकॉल दोनों सूक्ष्म-हेरफेर और पैच दबाना प्रयोगों के लिए दोष मुक्त GUVs के लिए पर्याप्त संख्या का उत्पादन करना चाहिए। एसयूवी समाधान आंशिक रूप से निर्जलित है हालांकि, जब guv उपज है bilayer ढेर के गठन पर संवेदनशीलता निर्भर करता है। कठिनाइयों से बढ़ GUVs में सामना कर रहे हैं (यानी, कोई या कुछ GUVs विकास कक्ष में दिखाई दे रहे हैं), यह बहुत एसयूवी 15,16 के स्थान पर एक लिपिड / क्लोरोफॉर्म समाधान का उपयोग लिपिड केवल GUVs विकसित करने के लिए उपयोगी है (और एक कम किया जा सकता है नमक बफर)। GUVs एक लिपिड / क्लोरोफॉर्म फिल्म से अच्छी तरह से विकसित नहीं है, तो मौलिक कुछ गलत (जैसे, गलत लिपिड समाधान या बफ़र्स, इलेक्ट्रोड, गलत वोल्टेज या आवृत्ति, आदि पर तेल या गंदगी) है। GUVs लिपिड / क्लोरोफॉर्म फिल्मों नहीं बल्कि एसयूवी फिल्मों से बढ़ने हालांकि, अगर है, तो इस मुद्दे को आंशिक निर्जलीकरण के साथ होने की संभावना है।

आंशिक निर्जलीकरण कदम हैसबसे आसानी से अत्यधिक निर्जलीकरण से "denaturing" लिपिड का कोई खतरा नहीं है क्योंकि लिपिड केवल एसयूवी का उपयोग कर अनुकूलित। एसयूवी बूंदों एक छोटी बूंद जमा किया गया था, जहां प्रत्येक स्थान पर उज्ज्वल लिपिड प्रतिदीप्ति वहाँ जाँच करने के लिए शुष्क करने की अनुमति दी गई है के बाद electroformation के लिए, यह तारों की जांच करने के लिए सहायक हो सकता है। चैम्बर तो, विकास समाधान से भर जाता है के बाद लिपिड प्रतिदीप्ति गायब हो जाता है, तो या तो विकास समाधान और अधिक ध्यान से जोड़ा जाना है, या एसयूवी इसलिए फिल्म तार को और अधिक मजबूती देता है लंबे समय तक के लिए निर्जलीकरण की जरूरत है। विकास के दौरान, कक्ष के भीतर सुनिश्चित करें कि तारों और न ही समाधान चाल (जैसे, माइक्रोस्कोप पर चैम्बर डाल जब) तारों से दूर GUVs अलग करना बचने के लिए न तो बनाते हैं। GUVs अच्छी तरह से बड़े होते हैं, वे आम तौर पर चरण विपरीत छवियों में देखने के लिए आसान कर रहे हैं। हालांकि, छोटे GUVs भी झिल्ली स्टैक विकास के दौरान कैसे बदल गया है देखने के लिए उपयोगी है जो लिपिड प्रतिदीप्ति, का उपयोग करते हुए अक्सर साफ कर रहे हैं। की सभी सतहों की जांचसभी कुओं में तारों (अंदर, बाहर, ऊपर और नीचे) के साथ ही पैदावार दूसरे करने के लिए एक स्थान से काफी भिन्न हो सकते हैं, क्योंकि विकास discarding से पहले चैम्बर मंजिल।

हैंडलिंग और GUVs का भंडारण कोशिकाओं को सरल तुलना की जाती है, लेकिन GUVs आसमाटिक तनाव, कतरनी बलों और आसंजन के लिए काफी संवेदनशील होते हैं। कटाई या GUVs जब स्थानांतरित चिकनी, कोमल गतियों महत्वपूर्ण हैं, और यह पालन करने और विस्फोट से GUVs को रोकने के लिए सतहों passivate करने के लिए महत्वपूर्ण है। Passivation समाधान नहीं कर सकते कोट पैच pipettes और gigaseal गठन को रोकने के लिए इतना है कि हालांकि, पैच दबाना प्रयोगों के लिए चैम्बर अच्छी तरह passivation के बाद rinsed होना चाहिए। Passivation के लिए, बीटा-कैसिइन उपचार सरल और प्रभावी है, और एक लिपिड परिवहन कार्य किया है जो गोजातीय सीरम albumin, की तुलना में है, बीटा-कैसिइन लिपिड bilayers के साथ और अधिक सीमित बातचीत की है और GUVs 36 के साथ काम करना पसंद किया जाना चाहिए। ऊष्मायन समय से अलग है, यह हैसंभव पाने के लिए GUVs विस्फोट के बिना पालन करने के लिए। हालांकि, GUVs कवर स्लाइड के रूप में मजबूती से के रूप में कोशिकाओं का पालन नहीं करेंगे, और इसलिए अभी भी (चैम्बर चलती है, जैसे, बफर छिड़काव) के चैम्बर में प्रवाह पैदा कर सकते हैं कि किसी भी प्रक्रिया के दौरान लिया जाना चाहिए परवाह है।

पैच दबाना रिकॉर्डिंग KvAP तरह वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल के अध्ययन के लिए एक शास्त्रीय विधि है और इस प्रोटोकॉल पक्षपाती कोशिकाओं से "अंदर-बाहर" पैच प्राप्त करने के लिए मानक तकनीक से ली गई है। पैच पिपेट फेर से उतरता है, जिसमें एक मानक पैच दबाना सेट अप (जैसे, क्षैतिज से 30-60 डिग्री) एक छोटे से पेट्री डिश में अच्छी तरह से काम करना चाहिए। हालांकि, पैच पिपेट और gigaseal क्षेत्र के स्पष्ट छवियों कवर फिसल जाता है चैम्बर ऊपर और नीचे (~ 1 मिमी जुदाई) तो तरफ से क्षैतिज दर्ज कर सकते हैं पैच पिपेट जो फार्म में एक कक्ष का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। बड़े पैच पिपेट दबावों की जरूरत नहीं हैं, क्योंकि दबाव सुविधाजनक सी हो सकता हैएक सिरिंज के साथ ontrolled और किसी भी साधारण दबाव मीटर (जैसे, तात्कालिक पानी नापने का यंत्र) के साथ नजर रखी। यह एक लिपिड / क्लोरोफॉर्म समाधान और कम नमक बफर का उपयोग हो लिपिड केवल GUVs के साथ पहला अभ्यास पैच दबाना प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है। दोष मुक्त GUVs की उपज बहुत अधिक है, क्योंकि कई प्रयोगात्मक चैम्बर के लिए कटाई और स्थानांतरण के दौरान नष्ट कर रहे हैं, भले ही साथ काम करने के लिए सही GUVs की बहुत हो जाएगा।

थोड़ा अभ्यास के साथ, स्थिर gigaseals साथ excised झिल्ली पैच आसानी DPhPC GUVs और KvAP-DPhPC GUVs से प्राप्त किया जा सकता है। एक उच्च सफलता दर हासिल करने के लिए, इसे ध्यान दौर का चयन करने में मदद करता है, लेकिन थोड़ा-अस्थिर, दोष मुक्त GUVs और पैच पिपेट साफ है कि जाँच gigaseal फार्म करने के लिए प्रयास करने से पहले (प्रतिदीप्ति में लिपिड के लिए देख)। एक झिल्ली "जीभ" पैच पिपेट प्रवेश करती है, gigaseal आम तौर पर मजबूत चूषण या specifi के लिए किसी की जरूरत के बिना जल्दी (<1 सेकंड) रूपोंसी होल्डिंग वोल्टेज। झिल्ली पैच पिपेट में आगे क्रॉल के रूप में एक बुरा सील में सुधार कर सकते हैं, अक्सर पिपेट इंटीरियर दूषित हो गया क्योंकि मुहर गरीब बनी हुई है और यह एक ताजा पैच पिपेट और guv के साथ शुरू करने के लिए आवश्यक है। DPhPC रूपों भी उच्च वोल्टेज (जैसे, 150 एम वी ±) में एक उत्कृष्ट मुहर प्रतिरोध के साथ झिल्ली पैच (दसियों मिनट की) बहुत स्थिर। SOPC: कोलेस्ट्रॉल (3: तिल से 1) भी बहुत स्थिर पैच फार्म कर सकते हैं लेकिन अंडा-पीसी पैच और अधिक आसानी से तोड़ने के लिए लग रहे हैं, जबकि सील करने के लिए उच्च चूषण की आवश्यकता होती है सकते हैं।

अब पैच दबाना सत्र के लिए यह चैम्बर समाधान की परासारिता समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। परासारिता guv विकास बफर से भी काफी कम है, तो GUVs, सूजन तनाव और गोलाकार हो जाते हैं और यह एक gigaseal फार्म करने के लिए पैच पिपेट में काफी दूर तक guv झिल्ली निकालना संभव नहीं हो सकता। यह अक्सर बस कक्ष से वाष्पीकरण के रूप में 10 या 20 मिनट इंतज़ार कर रही द्वारा तय किया जा सकता ext बढ़ जाती हैernal समाधान परासारिता GUVs खंडन करना और उतार चढ़ाव के लिए शुरू जब तक। चैम्बर भी लंबे समय के लिए खुला छोड़ दिया जाता है, तो GUVs, tubulate और कली खंडन जब तक इसके विपरीत, बाहरी समाधान की परासारिता बढ़ा सकते हैं। यह हवा हो गया है कि पानी की जगह आसुत जल जोड़ने के लिए समय समय पर (खनिज तेल के साथ, उदाहरण के लिए) चैम्बर से वाष्पीकरण अवरुद्ध या से बचा जा सकता है।

प्रोटीन excised झिल्ली पैच 31 से बाहर रखा जा सकता है, क्योंकि एक excised पैच में सक्रिय चैनलों की संख्या बस guv झिल्ली में प्रोटीन के घनत्व से संबंधित नहीं है। प्रतिदीप्ति माप पैच झिल्ली में KvAP की एकाग्रता guv 28 के मुकाबले काफी कम है सुझाव है और इसे चैनलों का केवल एक छोटी संख्या वाले पैच प्राप्त करने के लिए काफी आसान हो सकता है। हालांकि, पैच एक चैनल रिकॉर्डिंग के लिए भी कई चैनलों, छोटे सुझावों के साथ पैच pipettes का उपयोग करने और / या प्रोटीन करने के लिए लिपिड डी घटाने का स्पष्ट चरणों होते अगरएसयूवी मिश्रण में ensity प्रभावी हैं। इसके विपरीत, कई चैनलों युक्त पैच पर कलाकारों की टुकड़ी माप प्रदर्शन करने के लिए, यह एक अपेक्षाकृत उच्च प्रोटीन घनत्व के साथ शुरू करने के लिए सहायक हो सकता है (उदाहरण के लिए, वजन द्वारा लिपिड को 01:10, प्रोटीन), एक उच्च प्रोटीन घनत्व के साथ GUVs चयन करने के लिए प्रोटीन प्रतिदीप्ति का उपयोग , बड़े पैच pipettes का उपयोग (जैसे, 2 माइक्रोन टिप व्यास से 3) और महाप्राण जल्दी से तेजी से मुहर बनाने की कोशिश करने के लिए। जाहिर है, "पूरे सेल" प्रकार विन्यास (यानी, 'पूरे guv') एक guv में सभी चैनलों को चिह्नित करने के लिए आदर्श होगा, लेकिन दुर्भाग्य से "पूरे guv" विन्यास कई तकनीकी मुद्दों पर 37 बन गया है।

इस ट्यूटोरियल में समाधान, लिपिड और प्रोटीन सांद्रता केवल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में प्रदान की जाती हैं, और कुछ विचार के बाद एक विशेष रूप से प्रयोग की आवश्यकताओं के अनुरूप बदला जा सकता है।

सभी समाधान ऐसे HEPES के रूप में एक पीएच बफर शामिल होना चाहिएया TRIS प्रोटीन पीएच के चरम को उजागर नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए। घुला हुआ पदार्थ सांद्रता आंशिक निर्जलीकरण चरण के दौरान वृद्धि और उच्च नमक सांद्रता प्रोटीन denature या तेजी से करने के लिए लिपिड फिल्म पैदा कर सकता है के रूप में एसयूवी बफर, (उदाहरण के लिए, 5 मिमी नमक या कम) बर्दाश्त नहीं करेगा प्रोटीन के रूप में विलेय के रूप में कम एक एकाग्रता होनी चाहिए पुनर्जलीकरण चरण के दौरान delaminate। ऐसे Trehalose के रूप में शर्करा की छोटी मात्रा में (जैसे, 5 मिमी के लिए 1 मिमी) निर्जलीकरण 23 के दौरान प्रोटीन की रक्षा के लिए लगा रहे हैं। Trehalose anhydrobiosis में फंसा दिया गया है और dessication 38 के खिलाफ झिल्ली और प्रोटीन की रक्षा करने के लिए माना जाता है, सूक्रोज या ग्लूकोज समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकते हैं।

विकास बफर के लिए, नमक एकाग्रता इस इष्टतम guv विकास (जैसे, electroformation वोल्टेज, आवृत्ति और अवधि) के लिए मानकों को प्रभावित करती है के रूप में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। इसके विपरीत, अवलोकन बफर के लिए प्राथमिक बाधा टी हैटोपी यह वृद्धि बफर के रूप में एक ही परासारिता होनी चाहिए। guv आंतरिक और बाहरी के बीच अपवर्तक सूचकांक में एक फर्क चरण विपरीत या साथ में मदद करता है, जबकि "विकास बफर" और "अवलोकन बफर" में सुक्रोज और / या ग्लूकोज का समावेश है, अवलोकन कक्ष के नीचे करने के लिए GUVs तलछट सुनिश्चित करने के लिए सहायक हो सकता है डीआईसी माइक्रोस्कोपी। Electrophysiologists अक्सर कोशिका झिल्ली के साथ gigaseal गठन को बढ़ाने के लिए स्नान और / या पैच पिपेट समाधान करने के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों शामिल हैं, लेकिन इन GUVs के लिए आवश्यक होना प्रकट नहीं करते। दरअसल, इस तरह मैग्नीशियम और कैल्शियम के रूप में द्विसंयोजक आयनों लिपिड चरण जुदाई प्रेरित और आसंजन की सुविधा है, इसलिए इन समस्याओं को पैदा अगर यह एक मिमी EDTA जोड़ने के लिए सहायक हो सकता है कर सकते हैं।

जाहिर है, कोशिकाओं की तुलना में जब पुनर्गठन सिस्टम का एक प्रमुख आकर्षण लिपिड रचना नियंत्रित करने की क्षमता है। DPhPC GUVs अच्छी तरह से विकसित और स्थिर excised झिल्ली पैच फार्म, और इन प्रोटोकॉल भी एफई काम किया हैfectively लिपिड Phosphatidylcholine (पीसी) युक्त मिश्रण, phosphatidylethanolamine (पीई), phosphatidylglycerol (पीजी), phosphatidic एसिड (पीए), phosphatidylserine (पी एस) और कोलेस्ट्रॉल के लिए। हालांकि, guv विकास, दोनों लिपिड रचना के प्रति संवेदनशील है और 15 buffers, और इसलिए प्रोटोकॉल मानकों (जैसे, लिपिड की राशि जमा, electroformation वोल्टेज / आवृत्ति) पीई की उच्च सांद्रता वाले लिपिड मिश्रण के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, (पीजी लिपिड का आरोप लगाया पीए, पी एस), या कोलेस्ट्रॉल। जब से शुरु, अंडा-पीसी, DOPC या DPhPC एक अच्छा पहली पसंद हैं, और यह guv विकास निरीक्षण करने के लिए और दो या दो से अधिक bilayers साथ multilamellar पुटिकाओं से GUVs भेद करने के लिए एक फ्लोरोसेंट लिपिड शामिल करने के लिए भी बहुत उपयोगी है। लिपिड (तापमान किसी भी व्यक्ति के चरण संक्रमण के तापमान की तुलना में अधिक है प्रदान की) आंशिक निर्जलीकरण चरण के दौरान मिश्रण के रूप में लिपिड मिश्रण, शेयर समाधान की एसयूवी निलंबन के संयोजन से तैयार किया जा सकता है। (उच्च एसयूवी एकाग्रता का उपयोग जैसे,10 मिलीग्राम / एमएल) के शेयर समाधान काफी लचीलापन देता है, और ये तो 3 मिलीग्राम / एमएल निलंबन dehydrating से पहले पतला किया जा सकता है।

अन्य पार झिल्ली प्रोटीन के लिए इन प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए प्रयास कर रहा है, यह दोनों सीधे GUVs और परीक्षण प्रोटीन समारोह में प्रोटीन का समावेश निरीक्षण करने के लिए सक्षम होने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। KvAP के साथ एक मुद्दा नहीं है, जबकि पुनर्जलीकरण दौरान पार झिल्ली प्रोटीन लिपिड केवल GUVs के गठन के लिए अग्रणी झिल्ली ढेर में रहेगा कदम है कि वहाँ हमेशा की संभावना है। यह GUVs में प्रोटीन निगमन का पालन और भी GUVs भीतर एकत्रीकरण के लिए जाँच करने के लिए एक तेजी से और स्पष्ट तरीका प्रदान करता है के रूप में प्रोटीन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग बहुत सुविधाजनक है। यह प्रोटीन पुनर्गठन की प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं किया गया था कि इस बात की पुष्टि करने के लिए GUVs में प्रोटीन समारोह का परीक्षण करने के लिए भी बहुत महत्वपूर्ण है। KvAP तरह आयन चैनल के लिए, पैच दबाना माप में कार्यात्मक चैनलों की उपस्थिति स्थापित कर सकते हैंGUVs। हालांकि, एक fluorescently लेबल, उच्च आत्मीयता लिगेंड (जैसे, विष, सब्सट्रेट या विरोधी निकाय) भी GUVs में प्रोटीन की राज्य के परीक्षण के लिए बहुत मददगार होगा।

सारांश में, इस लेख वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल KvAP युक्त Proteo-GUVs उत्पादन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का प्रयोग कर उन्हें चिह्नित करने के लिए कैसे दर्शाता है। उम्मीद है कि इन विधियों झिल्ली प्रोटीन के नए वर्गों के लिए अनुकूलित और अध्ययन और अपनी मौलिक घटकों से बात रह अप के निर्माण के लिए और अधिक जटिल में इन विट्रो प्रणालियों के लिए एक आधार प्रदान किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids  850356P
Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)  Avanti Polar Lipids  840051P
Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids  840101P
18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids  850375P
Cholesterol (ovine wool, >98%)  Avanti Polar Lipids  700000P
TRed-DHPE Invirtogen T-1395MP labeled lipid
BPTR-Ceramide Invirtogen D-7540  labeled lipid
Choloroform VWR 22711.290 AnalaR Normapur
Acetone VWR 20066.296 AnalaR Normapur
Ethanol VWR 20821.330 AnalaR Normapur
Kimwipe Kimtech 7552
Hamilton syringes  Hamilton Bonaduz AG diverse
Amber vials and Teflon cups Sigma SU860083 and SU860076
Parafilm VWR 291-1214
Microcentrifuge tube Eppendorf diverse
Agarose Euromex LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
Sucrose Sigma 84097-1kg
Glucose  Sigma G8270-1kg
Trehalose Sigma T9531-25G
KCl Sigma P9333-1kg
Hepes Sigma H3375-100G
TRIS Euromex EU0011-A
Osmometer Wescor Vapro
pH meter Schott instruments Lab850
Sonicator Elmasonic S 180 H
Syringe filter 0.2 µm Sartorius steim Minisart 16532
Function generator TTi TG315
Platinum wires Goodfellow LS413074 99.99+%, d = 0.5 mm
Polytetrafluoroethylene Goodfellow
Dow Corning 'high vacuum grease' VWR 1597418
sealing paste Vitrex medical A/S, Denmark REF 140014 Sigillum Wax
Cover slides 22 x 40 mm No1.5 VWR 631-0136
Cover slides 22 x 22 mm No1.5 VWR  631-0125
Plasma cleaner Harrick PDC-32G airplasma, setting 'high'
Petri dishes Falcon BD REF 353001 3.5 cm x 1 cm
patch clamp amplifier Axon instruments Multiclamp700B
DAQ Card National Instruments PCI-6221
Labview National Instruments version 8.6
Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm Harvard Apparatus GC100-15
Electrode holder Warner Instruments  Q45W-T10P
Micromanipulator Sutter  MP-285
Pipette puller Sutter  P-2000 
Camera ProSilica  GC1380
Zeiss microscope Zeiss Axiovert 135
Objective Zeiss 40X long working distance, Phase contrast
Objective  Zeiss 100X Plan-Apochromat NA 1.3
Filterset GFP (for Alexa-488) Horiba XF100-3
Filterset Cy3 (for TexasRed) Horiba XF101-2
beta-casein Sigma  C6905-1G
Confocal microscope Nikon Eclipse TE 2000-E D-Eclipse C1 confocal head
Objective Nikon Plan Fluor 100X NA 1.3
Matlab Mathworks for image processing and analysis of the current traces

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 95 Biomimetic मॉडल प्रणाली विशालकाय unilamellar पुटिका पुनर्गठन आयन चैनल transmembrane प्रोटीन KvAP electroformation जेल सहायता प्रदान की सूजन agarose अंदर-बाहर पैच दबाना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
एक transmembrane प्रोटीन के पुनर्गठन, माइक्रोस्कोपी और पैच दबाना अध्ययन के लिए विशालकाय unilamellar vesicles में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल, KvAP,
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Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. J. Vis. Exp. (95), e52281, doi:10.3791/52281 (2015).

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