Summary
電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。
Abstract
ジャイアント層小胞（GUVs）は膜結合現象を研究するための人気のある生体模倣システムです。しかし、GUVsを成長させる一般的に使用されるプロトコルは、機能的な膜貫通タンパク質を含むGUVsを形成するために修正されなければならない。電鋳とゲル支援腫脹 - - 電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを形成するために、この記事では、2脱水 - 再水和の方法について説明します。両方の方法では、タンパク質含有小単層小胞の溶液を再水和緩衝液中で膨潤させた膜のスタックを形成するために部分的に脱水される。 AC電界は、フィルム再水和の間に適用することができるようにエレクトロフォーメーション法では、フィルムは、白金電極上に堆積される。対照的に、ゲルアシスト膨潤法は、フィルム再水和を向上させるためにアガロースゲル基質を使用する。どちらの方法も、低い（ 例えば5mm）でGUVsおよび生理学的（ 例えば、100 mM）の塩濃度を生成することができます。得られGUVs蛍光顕微鏡、及びインサイドアウトパッチクランプ構成を使用して測定された再構成されチャネルの機能を介して特徴付けられる。交番電界（電鋳）の存在下で膨潤が無欠陥GUVsの高収率を与え、一方、ゲルアシスト膨潤法は、より均一なタンパク質分布を生成し、特殊な装置を必要としない。
Introduction
生体系を支配する物理的原理を研究する際に、ボトムアップアプローチは、実験者は、システム構成および容易に細胞ベースのシステム1で操作されていない他のパラメータを制御することを可能にする。 10 -彼らは顕微鏡研究とマイクロマニピュレーション8に非常に適しているとして7 -膜ベースのプロセス、ジャイアントの単層ベシクル（GUVs、直径〜1-100μm）のために非常に有用な生体模倣システム2であることが証明された。 GUVsを生成するために、多くの異なるプロトコルが存在するが、大部分は2つのカテゴリーに分類さ- 16 -ベースのエマルジ ョンは、脂質膜13を再水和に基づいて、11,12および技法に近づく。エマルジョンベースの方法では、GUV膜の内側と外側のリーフレットは、水/油界面での脂質単層から順に組み立てられる。このアプローチは、との可溶性タンパク質をカプセル化するための理想的ですGUVsで、非対称リーフレット脂質組成物を用いたGUVsを形成するため。しかし、エマルジ ョンから形成GUVs、膜の機械的特性17を変更する微量の溶媒を保持することができ、そしてアプローチは、特に膜貫通タンパク質の再構成に適していない。
フィルム再水和法は、（脱水）を乾燥して膜の多層のスタックを形成する多くの脂質混合物を生じるという事実に依存している。このスタックは、その後水性緩衝液と接触させて配置されている場合は、スタック内の膜は、それらの間に、スタックの表面のような溶媒の流れを離れて移動し、個々の膜はGUVs 13,18（同様の真の動物園を形成するために取り外すことができる他の脂質のオブジェクト）。しかし、最適な緩衝液及び脂質組成物のために、この古典的な「自発膨潤」方法は、欠陥のないGUVs比較的低い収率を有する。無欠陥GUVsの収率を高めるために1つの広く使用されている方法は、「電鋳である交流電流（AC）フィールドは、フィルム再水和の間に適用される221 ;,。メカニズムはよくわかっていないままであるが、「電鋳「壮大なGUVの収量を与えることができます（>有利な状況では90％）、低塩濃度バッファー用（<5mm）を14,19、さらには（〜100 mM）の生理的緩衝液中で作業することができます使用して高い周波数（10 Hzの対500 Hz）の交流電界と白金電極15。無欠陥GUVsの収率を高めるための別のアプローチは、「ゲル支援膨潤」、脂質溶液はなく、古典的な「自発腫脹で使用される受動的な（ 例えば 、ガラス、PTFE）基板より高分子ゲル基材上に堆積されている"。結果として得られる脂質/ゲルフィルムを再水和されると、GUVsは急速にも生理的なバッファ16,20のために形成することができる。
これら全ての方法は、次のような膜結合現象を研究するために使用することができる脂質のみGUVsを生成することができ可溶性タンパク質および膜との相互作用。しかし、GUVsに膜貫通タンパク質を組み込むために、重要な改変は、タンパク質が再構成手順の間、機能状態に留まることを確実にするために必要とされる。有機溶媒（ 例えば、クロロホルム、シクロヘキサン）中の脂質溶液は脂質膜を製造するための理想的であるが、それらの疎水性膜貫通ドメインが脂質二重層に埋め込 まれた、または界面活性剤ミセルにより囲まれている場合に、膜貫通タンパク質は、（典型的にのみ安定している例えば、タンパク質精製の 間に）。したがって、再構成のための出発材料は、典型的には界面活性剤の除去によって形成されたネイティブの膜、洗剤溶液中で精製されたタンパク質、または小さな単層のタンパク質含有小胞（プロテオのSUV）および/またはマルチラメラ小胞（MLVはプロテオ）である脂質の存在。 GUVs、これらの膜タンパク質を組み込むために、ほとんどの方法は、3つのカテゴリーに分類される。
ダイレクトInsertionは洗剤に懸濁トランスメンブレンタンパク質は、予め形成された、脂質のみ、穏やか洗剤可溶化GUVsと混合し、界面活性剤は、次にバイオビーズ21を用いて除去される。概念的には簡単ながら、この方法は、高すぎる界面活性剤濃度は、濃度が、タンパク質がアンフォールディングまたは凝集する可能性が低すぎる一方GUVsを溶解することができるように、界面活性剤濃度の正確な制御を必要とする。
GUV /プロテオSUV融合：プロテオSUVの中のタンパク質は、予め形成され、脂質専用GUVsと合わせ、融合は、特殊な膜融合性ペプチド22または洗剤21で促進される。通常、融合の程度は低タンパク質密度でGUVsにつながる制限されている。
脱水/再水和：タンパク質含有脂質膜を部分的プロテオSUVの脱水（またはプロテオMLV）溶液GUVsによって形成され、その後、純粋な脂質膜として成長させる。明白な課題は、部分的なdehydrati間にタンパク質を保護することです25 -ステップ23が、この方法で正常にGUVs 7,23にそのようなバクテリオロドプシン、カルシウムATPアーゼ、インテグリンとVDACとして膜貫通タンパク質を再構成するために使用されています。
この記事では、Hyper-好熱性古細菌、Aeropyrumのペルニクスから、電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを作るために、脱水/再水和プロトコルについて説明します。KvAPは、真核生物の電圧依存性カリウムチャンネル26と既知の結晶構造27に高度の相同性を有している、それ電圧ゲーティングのメカニズムを研究するための優れたモデルとなっています。プロテオのSUVの生産は以前に詳細に記載し、このチュートリアル26,28,29の一部ではありませんされています。重要なことには、KvAPのプロテオSUVは、それらが長期間（> 1年）のために-80℃で小さい（ 例えば、10μl）を一定分量で保存することができるように、各GUV調製のために生成する必要はない。電鋳またはゲル補助膨張はその後KvAPのプロテオのSUV（またはプロテオたMLV）からGUVsを成長させるために使用することができる。
電鋳プロトコルの重要なステップは、 図1に示されている。タンパク質を含有するSUVの溶液の液滴の白金線（ 図2に示す）上に堆積される。 SUV懸濁液の部分的脱水のSUVの融合による脂質タンパク質フィルムの形成をもたらす。再水和の間に、交流電界を離層とGUVsを形成するための脂質層を支援するために電極に印加される。 「低塩」を使用するときに10Hzのフィールドはうまく機能（<5 mM）の再水和緩衝液28とGUVsは数時間かかるが成長する。対照的に、生理的なバッファ（〜100mMの塩を含む）より低い電圧、500 HzのAC場でうまく動作しますが、長期（〜12時間）を必要とする期間15膨潤 。このメソッドは、ITOが24スライドが、カスタム室続きを使用して使用して、以前のプロトコルに基づいています図2に示すように、（単純な、即興室のための設計の詳細や提案のための議論を参照）は、2つの白金線をaining。
図3は、ゲル支援膨潤法を例示する。プロトコルは、生理的塩濃度の緩衝液を用いてうまく迅速で、より均一なタンパク質分布をGUVsを生成する。しかし、単離された、明らかに欠陥のないGUVsの収率は（ すなわち、GUV膜は、光学長さスケールで均一であり、任意のオブジェクトを囲むされません）は、パッチクランプとマイクロマニピュレーションの実験のために十分な数を提供していますが、低く、 。この方法は、脂質のみGUVs 16を生成するために、アガロースゲルを用いたプロトコルに基づいており、エレクトロフォーメーション法よりも少ない特殊な装置を必要とした。
蛍光顕微鏡によるGUVsの特徴について説明したが、同様に、標準的なパッチクランプセットアップを用いて、手順「インサイドアウト」にKvAP活性を測定は、膜パッチを切除し。
成長タンパク質含有GUVsは脂質のみGUVsよりも困難であることができる。具体的には、最終的なGUV収率はSUV溶液が膜スタックを形成するために堆積され、脱水された方法を正確に敏感に依存することができる。 GUVsと以前の経験のない人のために、第一の膜の膜は、有機溶媒から脂質を堆積することによって形成される従来のプロトコル15,16以下の脂質のみGUVsを成長させることが有用であろう。従来のプロトコルがうまく機能すると、SUVの堆積と部分脱水は、新しい脂質組成のためのプロトコルを調整する際にも非常に有用である脂質専用のSUVを、使用して習得することができます。 GUVs脂質のみのSUVから確実に成長する場合には、プロテオのSUVからのタンパク質含有GUVsを生成するためにわずかなステップがある。
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Protocol
1.溶液の調製
- 5のKCl、1 mMのHEPES（pH7.4）を、トリス（pHは7.5）、および2 mMのトレハロースを含む「SUVバッファー」の5ミリリットルを準備します。 0.2μmシリンジフィルターでバッファをフィルタリングし、-20℃で保存することができる1mlアリコートに分ける。
注：試薬および楽器のための追加の詳細は、資料のリストに記載されている。 - フィルム再水和の間にGUV内部を記入しますGUVの成長バッファー」の40ミリリットルを準備します。 「低塩」成長のために、5のKCl、1 mMのHEPES（pHは7.4）または1 mMのトリス（pHは7.5）、および〜400のスクロースを兼ね備えています。 「生理的な塩の成長のために、100のKCl、5mMのHEPES（pHは7.4）または5 mMのトリス（pHは7.5）、および〜200 mMのショ糖を結合する。
- 100のKCl、5mMのHEPES（pHは7.4）または5 mMのトリス（pHは7.5）、および〜200 mMグルコースを組み合わせることにより、実験室で外液のための「観測バッファー」の40ミリリットルを準備します。
注：これらのバッファは、唯一のエクサですmples。他の実験のためのバッファを適応させるために説明を参照してください。 - 浸透圧計で成長し、観測バッファの浸透圧を測定します。 GUVsが溶解や観察室に成長室から転送時に崩壊しないように、1％以内にそれらを一致させるために、スクロースまたはグルコースの顆粒を追加します。
注：この濃度範囲では、ショ糖の1 mMの追加（13.7 40ミリリットル当たりミリグラム）またはグルコース（40ミリリットルあたり7.2 mg）を〜1オスモルによって浸透圧を増加します。 - 0.2μmのフィルターで成長し、観察緩衝液を濾過し、細菌の増殖を阻害するために4℃で保管します。
- GUVsは、スティック広がり、バーストしないように、実験室の表面を不動態化するために必要な5 mg / mlのβ-カゼイン溶液を形成するために、20mMのTRIS（pH7.5）を緩衝液10ml中にβ-カゼインを50mg溶解する。 β-カゼインが完全に0.5ミリリットルのアリコートに、フィルター（0.2μm）をそれ（4℃で数時間まで）に溶解した後、フラッシュ凍結し、保存することができる後で使用するために-20℃で（4℃で保存し解凍したアリコート典型的に1週間までのために使用することができる）。
2. SUVの準備
- 準備し、以前に公開された詳細なプロトコール28以下のプロテオのSUVのアリコートを凍結する。 KvAP蛍光（質量比）1：10の脂質比タンパク質でDPhPCのSUVに再構成のAlexa-488マレイミド（10 mg / mlの）で標識された使用。
注：野生型KvAPは細胞内C末端（アミノ酸247）の近くにあるモノマーあたり1システインが含まれています。 - 蛍光灯、脂質のみのSUV：
注：ニトリル手袋、安全メガネを着用してヒュームフードの下でクロロホルムを処理します。クロロホルムなどの任意のプラスチックの使用は、それらを溶解することができないようにしてください。クロロホルム溶液をテフロンキャップでアンバーガラスバイアル中に保存し、ガラスシリンジを使用して転送することができる。前と脂質をペッティングした後、クロロホルムで少なくとも5から10回すべてのガラス器をすすぐように注意してください。- 100μlのを準備しますテキサスレッドDHPE溶液を8.2μlの（1 mg / mlのにDPhPC溶液100μl（クロロホルム中10mg / ml）を混合することにより、赤色蛍光脂質、テキサスレッドDHPE、0.5モル％を含有する10mg / mlのDPhPC SUVの1.5ミリリットルアンバーガラスバイアル中）のメタノール。
- バイアルを回転させながら、化学フード内で窒素気流下で脂質をドライダウン。フィルムが乾燥して表示されたら、任意の残留溶媒を除去するために3時間真空下で脂質を置く。
- 脂質にSUV緩衝液100μlを追加し、ボルテックス、激しくない脂質は、バイアルの壁に付着したままなくなるまで、溶液が均一に乳白色である。
- SUV車を形成するための脂質溶液を超音波処理。超音波は、バイアル内部のほとんどの動きと流れを起こすまで、バイアル位置を調整し、不必要なソリューションを加熱しないように注意してください。溶液が半透明になるまで超音波処理を続行するか、可能な場合は、透明（風呂超音波処理のために〜20分先端超音波処理のための2-5分、）。
- AliquoトンのSUV（ 例えば、10μlあるいは20μl）を、凍結（-20℃）のために後に使用する。
注：脂質、特に不飽和脂質、できる簡単内訳。アルゴン下で20℃（または80℃）での店舗脂質溶液と6ヶ月以内に使用します。脂質分解生成物は、薄層クロマトグラフィーを用いて検出することができる。
電鋳3. GUV成長
- エレクトロフォーメーション室を準備します。
- 室が洗浄されていない場合は、ウィンドウを削除するすべてのシーラントやグリースを拭き取って、ワイヤーを抽出し、すすぎ水と交互にエタノール（≥70％）を用いて組織を有するチャンバをスクラブ。
- 、うまく配線をこするアセトンにワイヤーやチャンバーを水没し、5分間超音波処理する。再びアセトンを用いて組織ですべてを拭きます。 5分間のエタノールおよび超音波処理中にチャンバーを置く。
- 穴を通してワイヤーを挿入することにより、チャンバを組み立て、そして回転させ、彼らはarを確認するために電線を拭く電子クリーン。蒸留水にチャンバーを入れ、5分間超音波処理し、窒素または空気の流れと、チャンバを乾燥。
- SUV·バッファ内の3 mg / mlのSUV懸濁液の30μlのを準備します。 、タンパク質含有GUVsを形成するプロテオのSUVの8μL（DPhPC 10 mg / mlのKvAP 1:10）、蛍光のSUVの2μL（10 mg / mlのDPhPC、0.5モル％テキサスレッド-DHPE）とSUVの20μlのを結合するには12.5と0.1モル％テキサスレッド-DHPE：1の最終脂質へのタンパク質（質量）比1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内のバッファ。溶液を激しく混ぜる。
- また、脂質専用のSUVとのプロトコルを実践するために、単純に20μlのSUVバッファーで蛍光のSUVの10μL（10 mg / mlのDPhPCと0.5モル％テキサスレッド-DHPE）を組み合わせる。
- SUVソリューションを堆積させる。
- ワイヤ上のSUV液の小さい（<0.2μL）の液滴を堆積させるために2μlのピペットまたは5μlのガラスシリンジを使用してください。溶液の約1μlを沿って液滴の列を形成するために必要とされる線から1cm。滴が十分に小さいと、彼らが触れたり、ヒューズないことを十分に離れて間隔を置いていることを確認してください。
- 堆積したSUV車はオープンエアで〜30分間乾燥させます。すべての滴が定住している場合には脂質沈着を顕微鏡で観察するのが容易であるように、ワイヤーを回転させる。
NOTE：SUV車が十分に乾燥させない場合の成長バッファが追加されたときに過度に乾燥して、タンパク質を損傷することができるが、彼らは、ワイヤを洗い流すことができる。空気湿度は、乾燥速度 、乾燥時間、および/ または空気湿度に影響を与えるため、最適な結果を30に調整することができる。ワイヤ上の脂質フィルムを顕微鏡で見えるはずです。
- チャンバーを組み立てます。
- チャンバ底部をシール：3つのウェルの周りのチャンバの底部に真空グリースを適用し、それが隙間なく付着するようにチャンバ底部をシールするために、それに対して優しく40ミリメートル×22 mmのカバースリップを押すように注射器を使用してください。チャンバーの側面（ワイヤー出口）とをシールペーストを封止する。 3つのウェルを概説室の上に真空グリースを適用します。
- 各ウェルを先頭に充填されるまでゆっくりと成長バッファを追加します。これは、電極から脂質フィルムを除去することができますように、ウェル中の溶液の急激な動きは避けてください。
- ボトムカバースリップを取り除くしないように注意しながら、グリースの上に静かに、トップカバースライドを押して、チャンバーを閉じます。トップカバースリップのエッジでバッファのいずれかの水滴を除去するための組織を使用してください。
注：これは脂質膜は、ワイヤ上に残っていることを確認するために顕微鏡下室を調べるのに良い時期です。
- 2ワニ口クリップを使用して配線に信号発生器を接続してください。低/高塩緩衝用の正方形（Vrmsの）を意味する周波数（低/高塩緩衝用の10ヘルツ/ 500 Hzの正弦波）を設定し、測定し、0.7 / 0.35 Vルートへの配線の両端の電圧を調整するためにマルチメーターを使用しています。光から蛍光団を保護するためにアルミホイルでチャンバーを覆う。 Tのままに彼はGUVs低塩緩衝液のための2から3時間、および高塩緩衝液のための12時間またはO / Nのために成長する。
- 発電機からチャンバを外し、慎重にGUVの成長を評価するために倒立顕微鏡上に置きます。途中で電線からGUVsを切り離すことウェル中でゆっくり、着実な動きや流体の流れを使用してください。
注：どこでも電線の下半分にGUVsは落射蛍光で見ることができる一方、ワイヤの端にGUVsは、位相コントラスト（40X長作動距離対物レンズ）には、通常表示されます。何GUVsが表示されていない場合、上面を見て、ワイヤを回転させてみてください。 GUVs数日間成長チャンバー中で4℃で保存することができる。
ジェル支援膨潤4. GUV成長
- 純水10mlのアガロース100mgを混合して1％アガロース溶液10mlを調製する。それは〜20秒間480 Wのマイクロ波に置くことで沸騰するまで加熱する。アガロースが完全に溶解されていることを確認しかき混ぜる。
注：ソリューション4°Cで保存し、必要なときに再加熱することができる。 - プラズマクリーン（空気プラズマ）1分間カバースライドアガロース溶液は、その上にうまく広がっていくようにする。プラズマ洗浄の効果がすぐに切れるように、次の15分以内にカバースライドを使用してください。
- 表面全体を濡らすソリューションように、各22×22 mm 2のスライドに温かいアガロース溶液200μlを適用します。縦にスライドを傾け、過剰な液体を除去し、スライド上のアガロースのちょうど薄い平滑な層を残すように、組織に下縁部をタッチします。
- 60℃のホットプレートやオーブンのスライドを置き、少なくとも30分間乾燥それを残す。アガロースフィルムは、目でほとんど見えないです。スライドはすぐにそれらを使用し、RTに冷却し、又は4℃で密閉容器中で最大1週間保管した後。
- 標準の3.5センチメートルシャーレにアガロースでコーティングされたカバースリップを置きます。
- 3.2節のようにSUV溶液を調製し、適用〜SUV溶液（3 mg / mlの脂質）で15μlの穏やかアガロース表面上〜30微小液滴。あまりにも多くのアガロース層を歪めないように注意してください。
- 約10〜15分間窒素の穏やかな流れの下でスライドを置き、液滴が乾燥するように目でバッファの蒸発をたどる。
- できるだけ早くのSUVが乾燥しているように、スライド面を覆うように成長バッファを追加する。バッファの〜1ミリリットル小さな3.5センチメートルペトリ皿で使用するために。
- 〜30分間進行し、その後、位相差や微分干渉コントラスト（DIC）と倒立顕微鏡を用いてチャンバー内GUVsの成長を調べるために、膨潤可能にする。
注記：落射蛍光観察によりゲル、アガロースの自己蛍光の蛍光団の強いバックグラウンドのために困難である。
5.収穫と観測GUVs
- 観測室（ 例えば、小さなペトリ皿またはカバーガラス）GUVsが付着しないように、拡散し、チャンバ底部にバーストを不動態化する。チャムカバーβ-カゼイン溶液と下部ファイバ、5分間インキュベートし、空気または窒素流で乾燥した純水でカゼイン溶液を洗い流し、最後に観察バッファ（小ペトリ皿のために、例えば、3〜5 mmの深さ）を追加する。
- GUVsを収穫。開口部が大きいので（〜2ミリメートルの直径）100μlのピペットチップの先端をカットし、ピペッティングのせん断応力としてゆっくり熱望することは簡単にGUVsを破壊することができます。
- 電気形成されたGUVsの場合は、優しくトップカバースリップを除去することにより、成長チャンバを開きます。 GUVsを切り離すワイヤに沿ってピペットチップを移動させながら、〜各ワイヤと吸引の真上に50μlのピペットチップを置きます。
注：これは、線の「反対側」にGUVsを収集するために、ワイヤを回転させるのに役立ち得る。 - 「ゲル支援腫脹」GUVsの場合、最初のGUVsはカバーガラス表面から切り離す助けるために数回ペトリ皿の側面をタップします。 Pしばらく50μlのちょうどカバースリップと吸引の上にピペットチップを置き裏面上の先端をulling。直接1週間まで4℃で1.5 mlマイクロチューブに観測室、またはストアに収穫さGUVsを転送する。
- 電気形成されたGUVsの場合は、優しくトップカバースリップを除去することにより、成長チャンバを開きます。 GUVsを切り離すワイヤに沿ってピペットチップを移動させながら、〜各ワイヤと吸引の真上に50μlのピペットチップを置きます。
- 倒立顕微鏡で観察室を置き、観察室にGUVsを追加し、チャンバ底部に沈降するGUVsための数分待って。
- すばやく滑らかな、球状（ '欠陥のない'） "GUV候補」を見つけるために、位相コントラストやDICを有するチャンバを調査。内側にネストされたすべての含む小さいリポソームを除外するために、落射蛍光の各「GUV候補」を調べます。最後に、脂質蛍光強度が均一で（ すなわち、単層）単一の膜と互換性があることを確認してください。
注：これらは、位相コントラストやDIC画像内の単層見えるようにいくつかのbilamellar（またはマルチラメラ）小胞では、膜が解決されるために一緒に接近しすぎている。しかし、これらのオブジェクトは、実際のunilameから区別することができる2倍（またはそれ以上）の明るい彼らの脂質蛍光によるリャルGUVs。
6.パッチクランプGUVs
- ピペットプラーにお勧めのプログラムを使用して、標準的なホウケイ酸キャピラリーガラスから1-2μmの先端径でパッチピペットを行います。
注：このようなファイヤーポリッシュなどの特殊な治療が必要ではなく、それらは密閉箱に保管されている場合、それらが引き出された後、ピペットを数日間使用することができる。 - GUVsは、付着チャンバ表面上に広げ、破裂しないことを保証するために、β-カゼイン溶液（5mg / ml）とインキュベートすることによって、チャンバを不動態化する。 5分後にカゼインを洗い流してください。
- 接地電極を挿入し、観察緩衝液でチャンバーを埋める、ステップ5.2と5.3で説明したようにGUV懸濁液10μlを転送し、底に沈降するGUVsための数分待って。
- 溶液（観察バッファまたは他の等張溶液）で新鮮なパッチピペットを記入し、パッチクランプアンプヘッドステージにマウント。
- チャンバを通る検索は、セクション5.4で説明したように「欠陥のない」GUVを見つけて、それが蛍光タンパク質が含まれていることを確認します。
- 一定の正圧適用する（> 100 Paで、またはおよそ1センチメートルマノメータでH 2 O）クリーンな内部パッチピペットを維持し、チャンバ内にパッチピペットを挿入する。視野にパッチピペットを持参、/測定ピペット電圧オフセットと抵抗を補償し、先端が汚れていないことを確認するために、蛍光灯照明下でピペットを調べるためにテストパルスを適用する。
- GUVの方にパッチピペットを持参し、必要に応じて、同時に「逃げる」GUVをしないパッチピペットから外側へ流れように正の圧力を低下させる。パッチピペットは、GUVに近い場合、パッチピペットに対してGUVをプルする（5センチメートルH 2 Oまで）負圧を適用する。としての抵抗を監視」、GUV膜の舌は「パッチピペットとギガシールフォームを入力する。
- ギガシールが形成されなかった場合は、チャンバーからパッチピペットを削除し、6.4のステップに戻ります。膜パッチをギガシールを形成したが、GUVピペットに付着したままの場合、GUVから引き離し破裂GUVをチャンバ底に対して、または簡単に溶液からピペットを移動してパッチを切り出す。
- インサイドアウト膜パッチをGUVから切り出し、ギガシールが安定した場合には、試験パルスをオフにし、このような図13に示すような電圧プロトコルを適用する。
メモ： 図13は 、パッチ電極に流れ込む電流で、インサイドアウトパッチのための標準的な電気生理学的慣習が「ポジティブ」、およびV = V 風呂で、次の- V ピペット 。ステップ（10ながら、休止状態に〜30秒の場所のための負電位（ 例えば、V = -100 MV）でパッチKvAPの開催より正の電位（ 例えば、V = 100 MV）が、次に実施する（ すなわち、オープン）アクティブ状態にそれを駆動することができ、5秒0ミリ秒）。 - 膜パッチの測定が終了した後、ザップまたは圧力パルスでパッチを破るとパッチ電極の電圧オフセットがドリフトしていないことを確認してください。チャンバーからパッチピペットを外し、6.4のステップに戻ります。
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Representative Results
GUVsの成長を迅速に顕微鏡下で成長チャンバを調べることによって評価することができる。電鋳のために、GUVs、 図4に示すように、白金線に沿って房に成長する傾向がある。ゲルアシスト膨潤時に、GUVsは急速に成長し（ 図5）融着球状構造として現れる。
欠陥のないGUVsは、より容易に識別され、観察室に転送した後に評価されます。較正測定は、厳密にGUV品質を評価するために必要とされ、体系的定量化は、以前に28公表されている。しかし、経験的な指針として、「良い」GUVsを分離する必要があります（ つまり、クラスタ内）、シングル、なめらかな、球状の外膜を持って、内部にはオブジェクト（ すなわち、チューブ、ネストされた小胞など ） を含んでいない、と「標準」脂質蛍光レベルを有する（明るいオブジェクトは、典型的には、二環式または多あるラメラ）。 図6は、等浸透圧グルコース溶液への転送後に「欠陥のない」GUVのDICと落射蛍光画像を示す。 DICのコントラストがスクロース満たさGUVおよびグルコース含有する浴溶液との間の光学密度の差によるものである。 KvAP含有GUVsの屈折率コントラストは、多くの場合、KvAP自体はショ糖またはグルコースに対して透過性であってはならないにもかかわらず、経時的に減少する。 GUV膜が均一なタンパク質の蛍光は集約（ すなわち 、それは、脂質膜中に残存していない）と、ミクロンスケール（またはそれ以上）を形成していないKvAPがGUVに組み込まれていることを確認する。
低塩エレクトロフォーメーションプロトコル、生理食塩エレクトロフォーメーションプロトコル、およびゲルアシスト膨潤プロトコルによって生成GUVsから図7、図8及び脂質およびタンパク質の蛍光9に示す共焦点画像。蛍光脂質（マゼンタ）、タンパク質ANとGUVsながら単位面積（タンパク質密度）あたりの蛋白質の低/高数のGUVsは、オーバーレイ画像（右列）にマゼンタ/緑の色合いを持っているように（緑）の信号は、同じ平均強度にスケーリングされています平均タンパク質密度は白です。単離された、欠陥のないGUVsを同定し、GUVサイズ分布は、 図10に示されている。典型的には、電鋳ゲルアシスト膨潤よりも無欠陥GUVsを生成するが、電鋳により製造さGUVsが小さくなっている。 図11は、推論されたタンパク質の濃度分布を示してGUVsの蛍光から。高塩緩衝液で電鋳は、タンパク質濃度がGUVからGUVに大きく変化するGUVsを生成します。ゲル支援腫脹によって生産GUVsのタンパク質密度が著しく均一である間に、個々のGUVsのタンパク質密度は、低塩緩衝液を用いて電鋳のためにはるかに少ない異なります。
パッチクランプ法は、広く使用されそのようなKvAPとして電位依存性イオンチャネルの機能を研究するためのd方法。 「インサイドアウト」のレコーディングでは、清浄なガラス「パッチ」ピペットはGUVからの膜のパッチを切除するために使用されます。パッチピペット内部電極は、電圧を印加し、膜パッチを流れる合成電流を測定するために使用される。膜パッチの組成は、細胞/ GUV 31の他の部分と大きく異なることができますが、「インサイドアウト」の構成は、まだシングルチャネルコンダクタンス、イオン選択性、および電位依存性ゲーティングを測定するために非常に便利です。これらの3つのプロパティは、電流が成果物（ 例えば、ギガシールの問題）または汚染物質（精製から例えば、細菌ポリン）によるものではないことを立証するための優れた方法であり、GUVsにおける機能KvAPチャネルがあります。
チャネルコンダクタンスは、最も簡単に、1つまたは2つのアクティブチャンネルのパッチで測定される。 EXAで膜は-100mVの保持されている場合には100 mVので、個々のチャネル開口部が明確に解決することができ、一方、 図12に示さmpleは、全くチャネル開口部は、観察されない。電流ヒストグラムは、閉鎖及び開放状態に対応する二つのピークを示し、二重ガウス関数でそれらをフィッティングする（100のKCl）で109.2±8.5のpSのコンダクタンスに対応し、10.9±0.85 pAの単一チャネル電流をもたらす。単一チャネルコンダクタンスが溶液（特にカリウム濃度）と膜組成32,33に依存することに注意してください。
他の多くのK-チャンネルのような急速なオープンとクローズのバーストを「チャタリング」、個々のKvAPチャンネルの出品です。先に示したように、カリウム選択性は、パッチピペット（ 例えば、パッチピペット溶液90のNaCl、10mMのKClを）28の異なる溶液を用いて試験することができる。
電位依存性ゲーティングは、多くの場合、sですより簡単にアンサンブル平均を得るために、複数のチャネルを有するパッチでtudied。 GUVsでKvAPの挿入（GUV外部に細胞内ドメイン）は明らかな生理的に有利メカニズム（GUV内部の細胞内ドメイン）と、逆はありませんが、「インサイドアウト」の膜は、機能的なチャンネルの大部分をパッチ」がある生理的な「挿入28。 図13は 、5秒の脱分極一連のステップに複数（> 10）チャネルを含む膜パッチの応答を示している。各ステップの間には、パッチが「生理的」挿入を有するチャネルがその休止状態に戻ることができるように、30秒間-100 mVのに保持されている。電位が十分に負である場合（ 例えば、V <-60 mVの）電流のほとんどはギガシールリークによるものである、と「逆」の挿入を持っている可能性があり、1つまたは2つのチャネルの時折の開口部。もっとポジティブPoteのステップについては、個々の開口と閉鎖がもはや解決することができないほど多くなくなるまでntials、チャネル数の増加が観察される。これにより、チャネルの開確率は明らかに電圧依存です。 KvAPの活性化および不活性化の動態は、ブラック脂質膜（BLMS）26とGUVs間でかなり異なるが、これはのKvチャネルゲーティングは、膜組成と状態34 に敏感であることを以前の報告と一致している。
図1 GUV電鋳概略：SUV車を含む液滴は、電極上に堆積された溶液の部分的脱水のSUVは、膜のスタックを形成するように融合させる。緩衝液を添加し、AC電界を印加。フィルムが膨潤するように、個々の膜がGUVsを形成するために、スタックから切り離す。 （この図は、MODてきた Aimon ら 28からified）
図2 GUVエレクトロフォーメーションチャンバー。チャンバは、3つのウェル（直径10mm、深さ5mm）を有するPTFEブロックから粉砕する。二つの直径0.5mmの白金線を3ミリメートル（端から端までの距離）によって分離され、ワイヤのイメージングを容易にするために、チャンバーの底部に近接して配置されている。下部および上部カバースリップは、真空グリースを所定の位置に保持され、シールペースト側のワイヤ孔から任意の漏れを防ぐ。交流発電機は、ワイヤにワニ口クリップが接続されている。室は、エルネストAmbroggioとルイス·Bagatolliによって開発された1に基づいています。 （この図は、Aimon ら 28から変更されている）
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図3自発膨潤回路図ジェルアシスト：SUV懸濁液を含有する液滴は、アガロースゲル上に堆積された液滴は、脱水したように、SUVの脂質膜を形成する融合。成長バッファが追加されると、フィルムは再水和およびGUVsが表面で形成される。 GUVsは腫れや近隣GUVsと融合させることによって、〜10μmの大きさに成長する。
高塩緩衝液中の白金線上に成長KvAPを含むDPhPCのGUVsの図4.代表画像。GUVsはワイヤに沿っ葡萄の房に似ている。 40X LWD対物レンズを用いて位相コントラスト画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アガロースゲルで腫れKvAPを含む図5. DPhPCのGUVs。GUVsは、10μm〜の直径を有するかすかな球として表示されます。ダーク/明るいスポットが小胞が膨潤、そこから脂質/アガロース集合体である。 40X LWDの目的とした位相コントラスト画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図欠陥のないGUV 6.イメージ。アレクサ-488で標識したKvAPを含む（エッグ-PC：卵-PA 9質量1）左：DIC、右：アレクサ-488エピ蛍光。励起：50分の470 nmの、放射：75分の545 nmの。目に見える凝集とKvAPから均一な蛍光を注意してください。 81fig6large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図低塩緩衝液中で成長電鋳GUVsからの脂質（マゼンタ）、タンパク質（緑）蛍光の7。共焦点画像（卵PC：卵-PA 9：1質量）（A）白矢印マーク（おそらく）。 GUVs、赤い矢印は高い脂質蛍光を有する可能性のある双方向ラメラベシクルをマークしている。蛍光強度があるため、ビューの非常に大きなフィールドのこの画像の中心に明るくなっていることに注意してください。 （B）ズームGUVsの小グループを示す。左（マゼンタ）：テキサスレッド-DHPE励起：543 nmのレーザー線、放射：70分の605 nmの。センター（緑）のAlexa-488で標識KvAP励起：488 nmレーザーライン、発光：30分の515ナノメートル。右：オーバーレイ。OAD / 52281 / 52281fig7large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図生理的塩濃度で増殖させた電鋳GUVsからの脂質（マゼンタ）、タンパク質（緑色）蛍光の8共焦点画像（卵PC：卵-PA 9：1質量）。（A）GUVs（白矢印は、おそらく単層を示して例）は、よりまばらな低塩プロトコルに比較して、非常に異なるタンパク質濃度（赤い矢印）を持つことができます。 （B）ズームGUVsの小グループを示す。左（マゼンタ）：テキサスレッド-DHPE励起：543 nmのレーザー線、放射：70分の605 nmの真ん中（緑）：アレクサ-488励起で標識KvAP：488nmのレーザー線、放射：30分の515 nmの。右：オーバーレイしてくださいCこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをなめる。
図9.脂質（マゼンタ）、ゲルアシスト生理的塩濃度緩衝液での膨潤によって形成さGUVs（DPhPC）のタンパク質（緑色）蛍光の共焦点画像。GUVsは、生理学的緩衝液で調製した電鋳GUVsより均質なタンパク質濃度を示している。左（マゼンタ）：BPTR-Cerを0.1％励起：543 nmのレーザー線、放射：70分の605 nmの。ミドル（緑）：のAlexa-488で標識した励起KvAP：488nmのレーザー線、発光：30分の515ナノメートル。右：2つのチャネルのマージこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11 GUVタンパク質濃度ヒストグラム：卵：タンパク質濃度、低塩緩衝液を用いて電鋳GUVsの（単位面積あたりのタンパク質の数）（5ミリモルのKCl、DPhPC）は、生理的塩濃度（100mMのKClを、卵PCの場合ほどに変化-PA 9：1質量）をゲルアシスト生理食塩緩衝液中で膨潤させることにより成長させたGUVsのタンパク質濃度（DPhPC）が最小変動を示す。タンパク質濃度は、これらの濃度28 KvAP-A488の蛍光強度に比例し、各ヒストグラムにおける蛍光強度分布の平均値によって正規化される。 （中央のパネルが変更されました）Aimon ら 28から
GUV膜パッチ（DPhPC「インサイドアウト」電圧大会）の図12.シングル·チャネル活性が。GUVは白金線に100のKCl、5mMのHEPES pH7.4の中で増殖させた。パッチに100 mVの電位を印加後に開くシングルチャンネル。挿入図の右側の単一チャネルコンダクタンスを計算するために使用されるヒストグラムである。赤い線は109.2±8.5 PSのコンダクタンスに対応し、4.70±0.27 PA及び15.62±0.58 Paの最大を有するダブルガウス関数に当てはめられる。トレースは、4極ベッセルフィルタを用いて10kHzで濾過し、50kHzで記録した。
図13.電圧- dependen高塩緩衝液中でアガロース上に形成されたGUV（DPhPC、「インサイドアウト」電圧大会）から膜パッチのTゲーチャンネル。電圧の過渡的な段階にパッチ膜電流の（A）応答。ピペットと風呂ソリューションの両方が100のKClを含有し、膜が連続した電圧ステップの間-100 mVので30秒間保持した。厳重な検査では1は、トレースが負の電圧で開くように見える1または2チャンネルが含まれていることがわかります。挿入図a）は遅延の開口部とインセットBのズーム）、チャネルの遅延閉鎖を示しています。電流は、10kHzで4極ベッセルフィルタを用いてろ過し、51.3 kHzで記録した。 513 Hzにダウンサンプリングされたトレースをオフライン。負の静電容量の過渡は-150 Paに遮断される。ステップ電圧対（B）平均電流（<T <5秒0.25秒）。チャネルオープン確率は電圧依存であるため、正の電圧で電流が大きくなっている。ジル/ ftp_upload / 52281 / 52281fig13large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
バイオミメティックモデル系は、タンパク質および膜の特性との相互作用を研究するための重要なツールである。 BLMSまたはサポートされている脂質膜、GUVベースのシステムかなりの膜組成、張力および形状の制御、ならびに真オイルフリーであることを含む本いくつかの機会のような他の再構成されたシステムと比較して。しかし、GUVsに、そのようなKvAPなどの膜貫通タンパク質を、組み込むことは、脂質のみGUVsための従来のプロトコルの重要な適応を必要とします。ここに提示エレクトロフォーメーションプロトコルは以前に特徴付けられ、湾曲した膜2,4,35に膜タンパク質の分布とダイナミクスの生物物理学的な原理を研究するために使用した。この作品はGUVs中のタンパク質の再構成のためのメソッドのセットへの追加、新しいゲル支援腫脹プロトコルを示しています。両方のプロトコルはKvAPの高い密度を含む欠陥のないGUVsを生成することができ、そしてインサイドアウトパッチの測定があることを確認SE GUVsは機能的なカリウム選択、電位依存性チャネルが含まれている。
2つのアプローチは異なる長所と短所を持っている。低塩条件は使用することができる場合には、電鋳はGUVの収量と均一なタンパク質密度の間の良好な妥協を提供しています。電鋳は依然として生理的塩濃度の合理的な収率を与えるが、タンパク質濃度は、（ 図8及び図11参照）GUVs間で大きく変化することができる。密度変化は、成長がはるかに長い2時間以上継続した場合、低塩緩衝液の成長はまた、実質的な密度変化を持つことができるように、電鋳の期間にリンクされているようだ。これとは対照的に、ゲル支援腫脹によって生成GUVsも生理的なバッファのために、非常に均一なタンパク質の密度を有する。しかし、マルチラメラ小胞の割合は大きく、アガロース自家蛍光が低いタンパク質濃度16の定量化を複雑にする。ナンプラーにポリビニルアルコールを使用して脂質をクロロホルム20から堆積されたときのアガロースce はゲルアシストGUV歩留まりを向上することが報告されているが、我々はSUV溶液でポリビニルアルコールを使用してGUVsを生成することができなかった。無欠陥GUVsの低い収率が許容可能である場合には、ゲル補助膨張は均一なタンパク質分布を必要とする実験のための明確な利点を有する。
電鋳とゲルアシスト腫れも全く異なる機器の要件があります。ゲル支援膨潤プロトコルは、クリーン、親水性ガラスを製造するための多くの代替方法が存在するように必須ではないが、プラズマクリーナーを除いて少し特殊な装置を使用する。これとは対照的に、電鋳はワイヤ電極を持つカスタムチャンバーを必要とします。白金線は高価であるが、このプロトコルのためGUVsチタンワイヤよりも白金をより容易に成長し、生理学的塩濃度を使用するときにITO上に成長しなかったGUVsが摺動する。電極（0.5 mm）の直径はCOMPRある電極表面と価格のomise。 図2に示すチャンバはルイスBagatolli 15とエルネストAmbroggioによる設計に基づいており、ほとんどの溶媒洗浄可能にするためにポリテトラフルオロエチレン（PTFE）から機械加工した。しかしながら、ポリアセタールまたはポリ塩化ビニル（PVC）は、うまく動作します。積極的なクリーニングのために白金線を除去する能力が重要であり、第一のプロトコルを学習するとき、それはボトムカバースライドを通して、その場で GUVの成長を観察することができることが非常に便利です。小さく、井戸が前後にスロッシングからソリューションを防止し、また並行して、いくつかの脂質組成物の試験を可能にする閉じた。始めしかし、特別なカスタムチャンバーは必須ではない。例えば、単純な、単一ウェルチャンバーを2枚のスライドガラスの間に、それらを小さなペトリ皿の底までのワイヤをタッキング、または挟むようにシールワックスを用いて即興することができ、または単に小バイアルキャップを介してそれらを突く。
電鋳ゲルアシスト膨潤プロトコルの両方は、マイクロマニピュレーションおよびパッチクランプ実験のために、無欠陥GUVsの十分な数を生成すべきである。 SUV溶液が部分的に脱水されたときただし、GUV収率は二層積層体の形成に敏感に依存する。困難は成長GUVsで検出された場合（ すなわち、または少数GUVsが成長室に表示されている）、それは非常にSUVの15,16の代わりに、脂質/クロロホルム溶液を用いて、脂質のみGUVsを成長させることが有用（と低くすることができる塩緩衝液）。 GUVsは脂質/クロロホルムフィルムからうまく成長しない場合は、根本的な何かが間違っている（ 例えば、不正確な脂質溶液またはバッファ、電極、誤った電圧や周波数などにグリスや汚れ）です。 GUVs脂質/クロロホルムフィルムなくSUVフィルムから成長する場合は、その問題は、部分的脱水である可能性が高い。
部分的な脱水工程である最も簡単に過度の脱水による「変性」脂質の危険性がないので、脂質のみのSUVを使用して最適化。 SUV滴が液滴が付着していた各スポットの明るい脂質蛍光があるチェックし、乾燥させてきた後に、電鋳のためには、ワイヤを調べるために役立つことができる。チャンバが成長溶液で満たされた後、脂質の蛍光が消滅した場合、いずれかの成長溶液はより慎重に添加しなければならない、またはSUVを長くするために脱水する必要があるので、フィルムは、ワイヤに、よりしっかりと付着する。成長の間、電線からGUVsストリッピングを避けるために、チャンバ（ 例えば、顕微鏡室を置く時）内の配線やソリューションの移動でもないことを確認してください。 GUVsがよく成長すると、彼らは通常、位相コントラスト画像に見やすいです。しかし、小さいGUVsはまた、膜スタックが成長中にどのように変化したかを確認するのに便利です脂質蛍光を使用して、多くの場合、より明確である。の全ての表面を調べ全てのウェル内のワイヤ（内側、外側、上部と下部）だけでなく、利回りは別の場所からかなり変化することができるので、成長を廃棄する前に、チャンバ床。
GUVsの取り扱いや保管は、細胞に比べてシンプルですが、GUVsは浸透圧ストレス、せん断力との密着性に非常に敏感である。収穫やGUVsを転送する際にスムーズな、穏やかな動きが重要であり、それが付着すると爆発するGUVsを防ぐために表面を不動態化することが重要です。不動態化溶液はできませんコートパッチピペットとはギガシール形成を防ぐようにしたが、パッチクランプ実験のためにチャンバーを徹底的に不動態化した後にすすぎ洗いする必要があります。不動態化のために、β-カゼイン処理が簡単かつ効果的であり、脂質の輸送機能を有するウシ血清アルブミンと比較して、β-カゼインは、脂質二重層とのより限定された相互作用を有するGUVs 36を操作するときに優先されるべき。インキュベーション時間を変化させることによって、それはGUVsは爆発せずに接着するために取得することが可能。しかし、GUVsとしてしっかりと細胞のようなカバースライドに付着し、そう気にしませんが、まだ（ 例えば、室内を移動する、灌流をバッファリング）チャンバー内に流れを誘導することができる任意の手順時に注意が必要です。
パッチクランプ記録はKvAPような電位依存性イオンチャネルを研究するための古典的な方法であり、このプロトコルは、接着細胞からの「インサイドアウト」のパッチを取得するための標準的な技術から導出される。パッチピペットは、小さなペトリ皿に（水平から例えば、30〜60度）斜めに下降している標準的なパッチクランプのセットアップはうまく動作するはずです。しかし、パッチピペットとギガシール領域の鮮明な画像がカバーグラスは、チャンバ上部と下部（〜1mmの分離）を形成するようにパッチピペットは、側面から水平に入力するためのチャンバを用いて得ることができる。大きなパッチピペット圧力が必要とされないので、圧力は、好都合にはcができ注射器でontrolledと任意の単純圧力計（ 例えば、即興水の圧力計）でモニター。これは、脂質/クロロホルム溶液と低塩緩衝液を使用して成長させた脂質のみGUVsの最初の練習パッチクランプ実験に役立つことができる。欠陥のないGUVsの収率が非常に高いため、多くの実験室への収穫と転送中に破壊されたとしてもで動作するように完璧なGUVsたくさんあるでしょう。
少し練習すれば安定したgigasealsで切り出し膜パッチは容易にDPhPC GUVsとKvAP-DPhPC GUVsから得ることができる。高い成功率を達成するためには、慎重にラウンド選択するのに役立つが、わずかに変動する、無欠陥GUVs及びパッチピペットは、クリーンであることを確認するにはギガシールを形成しようとする前に、（蛍光脂質を探している）。膜の「舌」はパッチピペットに入ると、ギガシールは、典型的には、強い吸引または納入仕様を必要とせずに迅速に（<1秒）を形成するCの保持電圧。膜はパッチピペットの中にさらにクロールとして悪いシールが改善するかもしれないが、多くの場合、ピペット内部が汚染されたため、シールが貧しいままで、それが新鮮なパッチピペットとGUVでやり直すことが必要である。でも、高電圧（ 例えば、±150 mVの）でのDPhPCフォーム優れたシール性を有する非常に安定した膜パッチ（数十分）を。 SOPC：コレステロール（3：1モル）は、非常に安定したパッチを形成することができるが、卵PCのパッチがより容易に破壊するように見える一方、シールするために、より高い吸引力を必要とし得る。
長いパッチクランプセッションのために、チャンバ溶液の浸透圧を調整する必要があるかもしれない。オスモル濃度は、GUV成長バッファよりあまり低い場合、GUVsは、膨潤した緊張、球状になり、それはギガシールを形成するために、パッチピペットに十分GUV膜を吸引することはできないかもしれない。これは多くの場合、チャンバからの蒸発が内線増加単に10または20分間待つことによって固定することができる。ernalソリューション浸透圧GUVsが収縮して変動し始めるまで。チャンバが長すぎる開いたままになっているとGUVsは、管状のと芽を収縮させるまでは逆に、外液の浸透圧を増やすことができます。これは、（ミネラルオイル、例えば ）チャンバからの蒸発を阻止するか、定期的に蒸発した水を置き換えるために蒸留水を添加することによって回避することができる。
タンパク質は、切除した膜パッチ31から除外することができるので、切除されたパッチ中の活性チャネルの数は、単にGUV膜中のタンパク質の濃度には関係しない。蛍光測定パッチ膜におけるKvAPの濃度はGUV 28よりもはるかに低く、それはチャネルの少数を含むパッチを得ることが非常に簡単にすることができ示唆する。しかし、パッチは単一チャネル記録にあまりにも多くのチャンネル、より小さなヒントパッチピペットを用いて、および/またはタンパク質 - - 脂質Dを低下させる明らかなステップを含んでいる場合SUVミックスのensityが有効である。対照的に、多くのチャネルを含むパッチにアンサンブル測定を実行するためには、比較的高いタンパク質濃度（ 例えば、1：10、重量脂質、タンパク質）で開始することが有益で高タンパク質濃度でGUVsを選択するために、タンパク質の蛍光を使用することができ、急速にシールを形成しようとするために迅速に、より大きなパッチピペット（ 例えば、2から3ミクロンの先端径）と吸引を使用しています。明らかに、「全細胞」型の構成（ すなわち、「全体-GUV '）はGUVのすべてのチャネルを特徴づけるために理想的であるが、残念ながら「全体-GUV」の構成は、いくつかの技術的な問題37を提起する 。
このチュートリアルのソリューション、脂質およびタンパク質濃度は、単に出発点として提供され、そしていくつかの考慮事項以下の特定の実験のニーズに合わせて変更することができる。
全ての溶液は、HEPES等のpH緩衝剤を含むべきであるまたはTRISは、タンパク質が極端なpHにさらされないようにします。溶質濃度が部分的脱水工程の間に増加し、高い塩濃度は、タンパク質を変性または急速に脂質薄膜が形成されることがあるのでSUVバッファは、（ 例えば、5 mMの塩または低い）許容するタンパク質などの溶質の低濃度を有するべきである再水和ステップの間に剥離。例えばトレハロースなどの糖の少量（ 例えば、5 mMまでの1mM）を脱水23間にタンパク質を保護すると考えられている。トレハロースは乾眠に関与しているとdessication 38に対して膜およびタンパク質を保護するために考えられているが、スクロースまたはグルコースを使用しても同様に動作できる。
成長バッファ、塩濃度は、これが最適なGUV成長（ 例えば、エレクトロフォーメーション電圧、周波数および持続時間）のパラメータに影響を与えるように特に重要である。対照的に、観察バッファの主制約をt帽子、成長バッファと同じ浸透圧を持つ必要があります。 GUV内部と外部との間の屈折率の差は、位相差に役立ちながら「成長バッファ」と「観察緩衝液」中で、スクロースおよび/またはグルコースを含むことは、観察室の底部にGUVs堆積物を確実にするために役立つことができ、またはDIC顕微鏡。電気生理学者は、多くの場合、細胞膜とギガシール形成を増強するためにバス及び/またはパッチピペット溶液にカルシウム又はマグネシウムイオンを含むが、これらはGUVsに必須であるとは思われない。実際、マグネシウム、カルシウム等の二価イオンは、脂質相分離を誘発し、接着を促進するので、これらの問題が発生した場合には、1 mMのEDTAを添加することが有用であり得ることができる。
明らかに、細胞と比較して再構成されたシステムの主要な魅力は、脂質組成を制御する能力である。 DPhPC GUVsはよく成長し、安定した切除した膜パッチを形成し、これらのプロトコルはまた、EF働いているfectivelyホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルセリン（PS）およびコレステロールを含む脂質の混合物である。しかし、GUV成長が脂質組成およびバッファ15の両方に敏感であるのでプロトコルパラメータ（堆積脂質の例えば、量、電鋳電圧/周波数）はPEの高い濃度を含有する脂質混合物のために調整する必要があり、脂質（PGを、荷電PA、PS）、またはコレステロール。始めたとき、卵-PC、DOPCまたはDPhPCは良い最初の選択肢であり、それはGUVの成長を観察し、二つ以上の二重層との多重膜小胞からGUVsを区別するために、蛍光脂質を含むようにも非常に便利です。脂質混合物は、（温度が個々の相転移温度より高い提供される）、部分脱水工程中に脂質混合物として、ストック溶液のSUV懸濁液を組み合わせることによって調製することができる。高いSUVの濃度を用いて（ 例えば、10 mg / ml）でのストック溶液は、かなりの柔軟性を可能にし、これらは、その後の3mg / mlの懸濁液を脱水する前に希釈することができる。
他の膜貫通タンパク質にこれらのプロトコルを適用しようとする場合、それは直接的GUVs及び試験タンパク質機能へのタンパク質の取り込みを観察することができることが非常に重要である。 KvAPとしない問題が、再水和の間に膜貫通タンパク質は脂質のみGUVsの形成をもたらす膜スタックに残るステップ可能性が常にある。それはGUVsへのタンパク質の取り込みを観察し、またGUVs内集約をチェックするための迅速かつ明確な方法を提供しますように、タンパク質の蛍光標識は非常に便利です。これは、タンパク質が再構成プロセスの間に損傷を受けていなかったことを確認するためにGUVsにおけるタンパク質機能をテストすることも非常に重要である。 KvAPようなイオンチャンネルは、パッチクランプ測定は、における機能チャネルの存在を確立することができるGUVs。しかしながら、蛍光標識された、高親和性リガンド（ 例えば、毒素、基質または抗体）もGUVs中のタンパク質の状態をテストするために非常に有用であろう。
要約すると、この記事では、電圧依存性カリウムチャネルKvAPを含むプロテオGUVsを生成し、蛍光顕微鏡および電気生理学を使用してそれらを特徴づけるする方法を示します。うまくいけば、これらの方法は、膜タンパク質の新しいクラスに適合し、研究し、その基本的な構成要素から生体物質を構築するためのより複雑なインビトロシステムの基盤を提供することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850356P | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051P | |
| Egg PA L-α-phosphatidic acid (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840101P | |
| 18:1 (Δ9-cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
| Cholesterol (ovine wool, >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
| TRed-DHPE | Invirtogen | T-1395MP | labeled lipid |
| BPTR-Ceramide | Invirtogen | D-7540 | labeled lipid |
| Choloroform | VWR | 22711.290 | AnalaR Normapur |
| Acetone | VWR | 20066.296 | AnalaR Normapur |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | AnalaR Normapur |
| Kimwipe | Kimtech | 7552 | |
| Hamilton syringes | Hamilton Bonaduz AG | diverse | |
| Amber vials and Teflon cups | Sigma | SU860083 and SU860076 | |
| Parafilm | VWR | 291-1214 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | diverse | |
| Agarose | Euromex | LM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C) | |
| Sucrose | Sigma | 84097-1kg | |
| Glucose | Sigma | G8270-1kg | |
| Trehalose | Sigma | T9531-25G | |
| KCl | Sigma | P9333-1kg | |
| Hepes | Sigma | H3375-100G | |
| TRIS | Euromex | EU0011-A | |
| Osmometer | Wescor | Vapro | |
| pH meter | Schott instruments | Lab850 | |
| Sonicator | Elmasonic | S 180 H | |
| Syringe filter 0.2 µm | Sartorius steim | Minisart 16532 | |
| Function generator | TTi | TG315 | |
| Platinum wires | Goodfellow | LS413074 | 99.99+%, d = 0.5 mm |
| Polytetrafluoroethylene | Goodfellow | ||
| Dow Corning 'high vacuum grease' | VWR | 1597418 | |
| sealing paste | Vitrex medical A/S, Denmark | REF 140014 | Sigillum Wax |
| Cover slides 22 x 40 mm No1.5 | VWR | 631-0136 | |
| Cover slides 22 x 22 mm No1.5 | VWR | 631-0125 | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-32G | airplasma, setting 'high' |
| Petri dishes | Falcon BD | REF 353001 | 3.5 cm x 1 cm |
| patch clamp amplifier | Axon instruments | Multiclamp700B | |
| DAQ Card | National Instruments | PCI-6221 | |
| Labview | National Instruments | version 8.6 | |
| Glass pipettes boro silicate OD 1 mm ID 0.58 mm | Harvard Apparatus | GC100-15 | |
| Electrode holder | Warner Instruments | Q45W-T10P | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-285 | |
| Pipette puller | Sutter | P-2000 | |
| Camera | ProSilica | GC1380 | |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axiovert 135 | |
| Objective | Zeiss | 40X long working distance, Phase contrast | |
| Objective | Zeiss | 100X Plan-Apochromat NA 1.3 | |
| Filterset GFP (for Alexa-488) | Horiba | XF100-3 | |
| Filterset Cy3 (for TexasRed) | Horiba | XF101-2 | |
| beta-casein | Sigma | C6905-1G | |
| Confocal microscope | Nikon Eclipse TE 2000-E | D-Eclipse C1 confocal head | |
| Objective | Nikon | Plan Fluor 100X NA 1.3 | |
| Matlab | Mathworks | for image processing and analysis of the current traces |
References
- Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
- Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
- Roux, A., et al.
- Domanov, Y. A., et al.
- Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
- Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102 (2009).
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
- Bagatolli, L. A., Pott, T.
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
- Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Kwok, R., Evans, E.
- Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
- Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
- Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
- Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
- Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
- Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102 (2005).
- Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
- Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
- Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
- Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529 (2011).
- Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
- Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
- Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
- Quemeneur, F., et al.
- Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
- Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a (2013).
- Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).
