Abstract
Reglering av proteinsyntes utgör en viktig kontrollpunkt i cellulär reaktion på stress. I synnerhet var diskret RNA-regulatoriska element visas för att medge att selektiv translation av specifika mRNA-sekvenser, som normalt kodar för proteiner som krävs för en viss stressrespons. Identifiering av dessa mRNA samt karaktärisering av reglerande mekanismer som är ansvariga för selektiv översättning har gått i spetsen för molekylärbiologi under en tid. Polysom profilering är en hörnsten metod i dessa studier. Målet med polysom profilering är att fånga mRNA translation genom att immobilisera aktivt översätta ribosomer på olika transkript och separera de resulterande polyribosomer genom ultracentrifugering på en sackarosgradient, vilket möjliggör en distinktion mellan högt översatta avskrifter och dåligt översatta sådana. Dessa kan sedan ytterligare karakteriseras av traditionella biokemiska och molekylärbiologiska metoder. Viktigt att kombinera polysome profilering med hög kapacitet iska metoder möjliggör en storskalig analys av translationell reglering.
Introduction
Reglering av proteinsyntes (translation) är en viktig cellulär process som är intimt kopplad till cellöverlevnad. Med tanke på att översättningen konsumerar mer än 50% av cellens energi, är det inte förvånande att översättningen är hårt reglerad och att störningar i översättningen inte väl tolereras. Omvänt många avvikande cellulära processer kräver att översättnings maskiner och översättningsproduktionen (dvs. proteomet) måste modifieras. Detta är ofta fallet i olika stress och sjukdomstillstånd, och är förmodligen bäst exemplifieras i cancer. En viktig fördel med translationell kontroll är förmågan hos cellerna att snabbt programmera proteinet utsignal som svar på olika externa och interna utlösare, vari finjustering mekanism som tips balansen mellan cellöverlevnad och död en.
Två aspekter av translationell kontroll är särskilt intressant; förståelse av den typ av reglerings mechanism (er) och kontrollelement som möjliggör specifik översättning, samt identifiering av specifika mRNA och deras proteinprodukter som deltar i det cellulära svar på den speciella trigger som framkallade selektiv översättning i första hand. Polysom profilering är en teknik som möjliggör effektiv undersökning av båda processerna.
Det övergripande målet för polysom profileringstekniken är att studera och kvantifiera översättningen tillstånd specifika mRNA under olika cellulära betingelser. Principen för tekniken är att fånga mRNA översättning '' frysa '' aktivt översätta ribosomer på olika transkript och separera de resulterande polyribosomer genom ultracentrifugering på en sackarosgradient, vilket möjliggör en distinktion mellan högt översatta avskrifter (bundet av flera ribosomer) och dåligt översatt ettor (bunden av en eller två ribosomer). I detta särskilda protokoll, antibiotikan cykloheximid som binder till60S ribosomala subenheten och blockerar frisättningen av deacetylerat tRNA från ribosomerna E ställe 2, används för att förhindra ribosomen translokation och stall ribosomer på översätta mRNA. Men andra blockerande medel såsom emetin som blockerar även översättnings töjning 3, kan användas.
Till skillnad från den västra blotting och 35 S-metionin märkningsteknik som mäter slutresultatet av översättningsprocessen, polysom profilering har fördelen att mäta ribosomer association med aktivt-översatta mRNA, vilket möjliggör en mer detaljerad studie av mekanismer översättnings under olika förhållanden. Därför kan tekniken enkelt anpassas till specifikt studera olika typer av översättnings 4-6, proteiner faktorer involverade i översättningsreglering 7-9, stressförhållanden som påverkar proteinsyntesen 1,10,11 eller effekterna av mRNA-strukturer såsom IRES eller uppströms öppna läsramar på protein synthESIS 12-14. Numera polysom profilerings program är ännu bredare med hjälp av DNA-microarrays 15 eller nästa generations sekvense 16,17 för att analysera polysomer-associerade mRNA.
Protocol
OBS: En kommentar om att arbeta med RNA: Ta vanliga försiktighetsåtgärder för att skydda mot RNA nedbrytning genom RNaser. Använd handskar, barriär pipettspetsar, RNas fria plasten och kemikalier i alla steg i protokollet. Använd ultrarent eller DEPC-behandlat vatten för alla lösningar. Sanera alla misstänkta ytor med RNas inaktivelösning enligt tillverkarens protokoll.
1. Beredning av lösningar.
- Bered 500 ml av basisk lösning (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Blanda med hjälp av en omrörare tills lösningen är klar och passerar genom ett 0,45 pm filter. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered 10 och 50% sackaros Solutions och 60% Chase lösning enligt följande:
- För 10% sackaroslösning (vikt / volym), i ett 50 ml centrifugrör tillfoga 5 g sackaros och fyll till 50 ml med basisk lösning. För 50% sackaroslösning (vikt / volym), i ett 50 ml centrifugrör annonsd 25 g sackaros och fyll till 50 ml med basisk lösning.
- För 60% (vikt / volym) Chase Solution, i ett 50 ml centrifugrör tillfoga 30 g sackaros och fyll till 50 ml med basisk lösning. Addera 100 pl av en mättad bromfenol blå lösning (lägg till bromfenolblått till vatten tills inte mer kommer att lösas upp; centrifug för att pelletera oupplöst pulver) på sak lösning 60%. Blanda med hjälp av en virvel och verifiera fullständig upplösning.
- Förvara lösningarna vid 4 ° C tills det behövs.
- Förbered RNA lysbuffert. Bered denna buffert färsk på dagen för experimentet. Bered 500 | il av RNA-lysisbuffert för varje prov. Till 1 ml basisk lösning tillsätt 10 pl Triton X-100 (1% [v / v] slutlig), 1 pl 100 mg / ml cykloheximid i DMSO (CHX, 0,1 mg / ml slutlig) och 3,5 pl RNasin (140 U / ml). Blanda med hjälp av en virvel. Håll på is.
OBS: Cykloheximid är mycket giftigt och kan orsaka mutationer. Undvik hudkontakt och inandning. För att undvika hantering av pulverform för ofta, prepär en större mängd av 100 mg / ml lager i DMSO, delprov och hålla vid -80 ° C för långtidsförvaring. Håll arbets lager vid -20 ° C. - Dagen för experimentet, förbereda Sackaros + CHX Solutions genom att lägga CHX (slutlig koncentration av 0,1 mg / ml) till den önskade volymen av 10% och 50% sackaros lösning (~ 7 ml av varje lösning per lutning).
2. Beredning av sackaros Gradient Använda en automatiserad Gradient Maker
- Vrid gradienten maker ON "och jämna till plattan som kommer att hålla gradienter (criticalstep!) Klicka på '' Done '' när plattan är planat.
- Välj på menyn lutningen program som ska köras:
- Tryck på '' GRAD '' menyn och välj '' LIST ''.
- Välj "SW41".
- Bläddra genom listan och välj ''10 - 50% lutning - 11 steg' 'program genom att tryckaing av '' RUN '' knappen.
- Placera en konisk ultracentrifugrör (SW-41 rör, 14 x 89 mm) i Marker Block och använda den medföljande fina röret markör för att spåra ett märke på röret längs den övre steget i Marker Block. Placera rören i en passande rack på en stadig yta.
OBS: Detta märke kommer att vara fyllningsguiden för lager på lager av 10 och 50% sackaroslösningar. - Fäst de två medföljande kanylen till två 10 ml sprutor och tvätta genom att pipettera upp och ner med varmt destillerat vatten innehållande RNas inaktivelösning. Se till att ta bort alla spår av vatten efteråt.
- Fylla en av de sprutor med 10% sukros + CHX och för in kanylen i botten av den ultracentrifugrör. Avstå försiktigt 10% sackaros lösning tills den går bara förbi markering görs på tuben.
OBS: Undvik att göra bubblor. Om det bildas bubblor, knacka försiktigt röret för att tränga undan dem. - Fyll den andra sprutan med 50% sackaros + CHX, torka extra vätska bortmed torka och försiktigt in kanylen i botten av ultracentrifugrör. Avstå Försiktigt 50% sackaros lösning tills den når exakt märket. Snabbt och smidigt ta bort kanylen.
OBS: 10% sackaros bör stiga i röret och bilda en menisk vid toppen. Om inte, lägg till mer 10% sackaros lösning vid ytan. - Sätt i den medföljande locket genom att luta ultracentrifugrör något eller ersätter alla luftbubblor. Ta bort överflödig vätska i locket reservoar med en mikropipett.
- Torka överflödig vätska längs rörväggen och plats på lutning Maker plattan.
- Tryck på '' RUN '' knappen.
OBS: Plattan kommer att luta på angiven vinkel, paus i 5 sek och rotation att bilda gradienten börjar. - När gradient formation är klar (ca 2 min, hörs en ton), försiktigt bort ultracentrifugen (s), plats för rack och snabbt ta bort locket i en uppåtgående rörelse för att undvika att störa gradient.
- Håll-gradient (er) på is. Stör inte! Alternativt gradienter hålla över natten vid 4 ° C.
- Alternativt kan du använda en två kammare gradient maker att göra gradienter enligt följande:
- Skölj röret och gradient kokare med RNas inaktivelösning och RNas-fritt vatten.
- Tillsätt 5 ml 50% sackaros + CHX till proximala kammaren i lutning maker och se till att all luft mellan de två kamrarna avlägsnas.
- Tillsätt 5 ml 10% sackaros + CHX till distal kammare i lutning maker.
- Lägg 0,5 ml 50% sackaros + CHX till botten av ett koniskt centrifugrör (SW-41 rör, 14 x 89 mm) och placera i rörhållare.
- Aktivera omrörare placeras i proximal kammare, öppna stop-tuppar och inlånings lutning med hastighet inställd på "3" (ca 1 ml / min).
- Place-gradient (er) på is. Stör ej
OBS: Gradienter kan hållas över natt vid 4 ° C.
3. cellysering och Ultracentrifugering.
- Placera SW-41 rotor och hinkar vid 4 ° C och ställ centrifug till 4 ° C.
- Plate celler på lämplig celltäthet i tillväxtmedier minst 24 h före lys.
- Förbered en alikvot (20 ml per 150 mm platta) av tillväxtmedium innehållande 0,1 mg / ml CHX.
- Inkubera cellerna i CHX + media (20 ml per 150 mm platta) för 3 min vid 37 ° C / 5% CO2 för att gripa och stabilisera polysomer.
- Arbetar snabbt, aspirat media från plattorna, ställe plattorna på is och tvätta cellerna en gång med 10 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) kompletterat med CHX (slutlig koncentration av 0,1 mg / ml) var noga med att pipet sakta ner side av skålen väggen för att minimera lyft av encellsskiktet.
- Aspirera PBS och tillsätt ytterligare 10 ml PBS + CHX till varje platta, skrapa cellerna med en cell lyftaren och överföra den totala volymen från båda plattorna till en 50 ml centrifugrör på is. Behålla en ml av cellsuspensionen i ett mikrofugrör på is under nedströms proteinanalys.
- Centrifugera 50 ml rör av celler vid 300 xg vid 4 ° C under 10 min.
- Ta bort alla PBS och återsuspendera pelleten i 500 l av iskall RNA lyseringsbuffert.
- Överför cellsuspensionen till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
- Pipettera upp och ner för att lysera celler och inkubera på is under 10 min med sporadisk virvling.
- Centrifugera vid 2000 xg vid 4 ° C under 5 min för att pelletera kärnor.
- Överför supernatanten till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 17.000 xg vid 4 ° C under 5 min för att pelletera cellrester.
- Överför supernatanten till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör och använda 2 pl för att mätaoptisk densitet vid 260 nm (användning lysbuffert såsom blank).
- Ta bort 50 l (10% av totalt) från varje prov för analys av totalt RNA. OBS Lysate kan lagras vid -80 ° C tills de behövs.
- Försiktigt ladda lika A260 enheter på varje sackarosgradienter (min 10 OD, optimala 25 OD, i en maximal volym på 500 l,. Späd koncentrerad lysat med ytterligare lyseringsbuffert om det behövs).
- Säkerställer gradienter är inom 0,1 g av varandra före ultracentrifugering.
- Centrifugera gradienter vid 39.000 rpm (260.343 x g) under 1,5 h vid 4 ° C.
- Under spindown hålla rotorbroms på och stänga av den under inbromsning när den når 1000 rpm.
OBS: Detta steg minimerar störningar på de gradienter som orsakas av plötsliga förändringar i acceleration som borsthuvuden i kontakt med rotorn vid inbromsning.
OBS! Cellysis Förfarandet är optimerat för två 150 mm subkonfluenta (~ 70-80% sammanflytande) plattor av HEK293 celler per lutning och de mängder som används kan behöva justeras för olika cellinjer.
4. Gradient Fraktione System Instrument Set-up.
- Set-up instrumentet och tomma på spectrophotometer med vatten enligt följande:
- Slå på komponenterna och låt lampan värma upp i minst 15 minuter.
- Se till fraktionssamlare är inställd på metoden "polysom" (tryck på mappikonen två gånger, retur pilen två gånger för att återgå till startskärmen).
- Se till att ventilen på fraktionssamlaren är satt till avfall (pil som pekar till papperskorgen-ikonen). Placera en 250 ml Erlenmeyerkolv innehållande destillerat vatten under sophämtning röret.
- Välj följande inställningar på skrivare: Set Känslighet ratten "SET LAMP och optik"; ställa Brusfilter byta till "1,5"; ställa Peak separator ratten på 'OFF'; ställa Diagram snabbuppringning '30 cm / h "(5 cm / 10 min); ställa Baseline Justera ratten (ovanpå spektrofotometern enheten) till "MAX OPEN".
OBS: Tillval: En digital inspelare programvara kan användas i stället för skrivare. På datorn, klicka på "Start". Ett förvärvs fönster öppnas: i the Alternativ-menyn, avmarkera Pause grafik. Under Skalning, ställer diagrammets gränser till -10 och 100 (kan ändras on-the-fly under körning). Klicka på Spara för att skapa en ny fil och spela in körningen. - Placera sprutan och fat i pumpen och dra åt på plats (använd tillhandahålls skruvar och insexnyckel).
OBS: Dra inte åt. - Fyll sprutan med Chase Solution genom att använda "" REV "" kommando vid RAPID hastighet. Placera pumpen i upprätt läge och jaga luft genom slangen med hjälp av '' FORWARD '' kommandot. Använd endast RAPID för denna funktion och tvättar.
- Installera ett ultracentrifugrör fylldes med RNas-fritt vatten.
- Stick hål på ultracentrifugrör med kanylen tills de två svarta märken syns (dispenseringshålet ligger mellan dessa två varumärken) och börja sprutpump på '' Manual '' vid 6,0 ml / min.
- När vattnet passerar genom flödescellen (när chase lösning fyller 1/3 av röret), övergå hastigheten till rörlig och sätts till 1,0 ml / min.
- Vid en flödeshastighet av 1,0 ml / min, justera Baseline Justera ratten på spektrofotometer tills spänningen på sjökortet är noll (+/- 0,5 enheter).
OBS: Observera vatten ut från avfalls röret i Erlenmeyerkolv. - Ställ in önskad känslighet till "0.5" eller "1.0" AU.
NOTERA: 1,0 AU fungerar bäst för 10 OD-enheter i en 10 ml-gradient. Om OD är lägre än 10, "0.5" känslighet kan användas för att förstärka signalen. - Tryck på Auto Baseline-knappen och justera baslinjen inställningen till 10% märket på skrivare genom att vrida Recorder offset ratten (tillval om du använder digital inspelare).
- När en stabil baslinje uppnås, vrid pumpbrytaren till "OFF" och diagram Kortnummer till 60 cm / tim om du använder analog skrivare eller "OFF" om du använder digital inspelare.
- Åter Chase Solution genom att byta pumpen till "REV position (vid behov kan man öka flödet tillbaka till 6,0 ml / min ... ANVÄND INTE RAPID) tills den når den första markeringen på piercing kanyl.
- Ta centrifugrör och jaga eventuella luftbubblor i kanylen genom att köra en liten bit av Chase Solution genom den. Torka piercing stadiet ren.
OBS: En del kvarvarande vatten kan läcka ut från flödescellen.
5. Gradient Fraktione och provtagning.
- Installera och borra centrifugröret innehållande sukrosgradienten.
- Placera elva 2 ml mikrorör i fraktionssamlaren brick positionerna 1-11 så att locken inte sticker uppåt. Byt ut '' tube # 1 '' för nu med en '' avfallsröret '' för att samla upp vätskan kvar i uppsamlingsslangen.
- Ställ pumpkontrollknappen till "Manual" och flödeshastighet på sprutpumpen till '6,0 ml / min " Tryck på "Play" -ikonen på fraktionssamlaren. Så snart armen når det första röret, tryck på '' paus '' knappen (detta kommer att positionera armen och öppna fraktionen-doseringsventil).
- Starta pumpen genom att använda "" FORWARD "" kommando och övervaka Pennregistrerare penna. När det börjar avböjande uppåt (vilket indikerar att provet passerar genom flödescellen i spektrofotometer), snabbt ersätta '' avfallsröret '' med '' tube # 1 ''.
- När den första droppen samlas, snabbt byta kommandon till "Fjärrstart / stopp", "" Variable (1,0 ml / min) '' och tryck på '' Play '' ikonen.
OBS: Pumpen är nu styrs av fraktionssamlaren gränssnitt och 1 ml fraktioner kommer att samlas varje minut. - Från och med nu, kommer A260 avläsningar visas på den digitala inspelningsgränssnittet (eller den analoga diagrammet Recorder). Se till att '' Record '' på programmet trycks!
- Efter den blå Chase Solution kommer in i uppsamlingsröret eller den sista röret (oftast rör 11), tryck på "Stop" ikonen.
OBS: Doseringsventilen ska byta till ventil avfall. - Håll bråk på is tills alla gradienter har fraktione. Vid slutet av dagen fraktioner kan förvaras vid -80 ° C före protein eller RNA-isolering. Om protein och RNA-analys krävs, delas varje fraktion i hälften (500 l vardera för protein och RNA-analys).
6. Tvätta
OBS: (detta är ett valfritt steg som endast utföras om flera gradienter skall samlas).
- Dränka avfallsröret in i Erlenmeyer-kolv innehållande ~ 50 ml ultrarent vatten och omvänd pumpen med hjälp av en 6 ml / min flödeshastighet.
- Stanna pumpen när Chase Solution når det första märket on piercing kanyl.
- Avlägsna centrifugrör, jaga någon luft ut ur kanylen och rengöra piercing skede.
OBS: En del kvarvarande vatten kan läcka ut från flödescellen. - Upprepa fraktione proceduren med början vid steg 5.1.
7. Final Clean up.
- Koppla pumpen slangen från botten av piercer och pumpa Chase Lösning i ett 50 ml centrifugrör med användning av inställningen för snabbt flöde. Förvara Chase lösning vid 4 ° C, eftersom det kan återanvändas.
- Anslut pumpslangen till en 3 sätt rörsystem och stänga ventilen som leder till sprutan. Ansluta ett rör till en 50 ml spruta fylld med destillerat vatten och det andra röret till basen av piercer.
- Installera ultracentrifugrör används för blind steget och passera minst 50 ml destillerat vatten genom spektrofotometer och provröret (byta till uppsamlings menyn på gränssnittet genom att klicka på '' Start / Pause '' ikonen).
- Ta bort röret, spruta (använd insexnyckel för att ta bort skruvarna) och alla andra flyttbara komponenter och tvätta noggrant med varmt kranvatten och skölj sedan med ultrarent vatten.
OBS: Var särskilt försiktig när du tvättar kolven, fat, slang och piercing kanyl.
OBS: Hantera glassprutan med omsorg! Förvara alla komponenter från damm. - Torka botten av flödescell med en mjuk vävnad fuktad med destillerat vatten. Torka fraktionsuppsamlaren facket och alla andra områden där sackaros kan ha spillts.
8. Isolering av RNA från sackaros Bråk.
- Förbered 50 pl av proteinas K-lösning för varje 1 ml av sackaros-fraktionen (37,5 | il 10% SDS, 7,5 | il 0,5 M EDTA, 1 | il Glycoblue, 4 | il av 20 mg / ml proteinas K).
- I 2 ml flatbottnad rör, inkubera 1 ml sackaros-fraktionen med 50 pl av proteinas K-lösning vid 55 ° C1 timme (om du använder 500 il fraktioner justera volymen av proteinas K-lösning därefter).
- Tillsätt en lika stor volym fenol: kloroform: isoamylalkohol (125: 24: 1, företrädesvis sur (pH 4,5) för att minimera DNA-kontaminering) till sackaros-fraktioner.
OBS: Lägg en extra 200 pl kloroform till fraktionerna 7-10 eftersom de är tyngre och faser kunde få inverterad.
OBS: fenol / kloroform kan orsaka brännskador vid kontakt och inandning. Bär labbrock, skyddsglasögon, och använda en fumehood. - Vortex ~ 30 sekunder och centrifugera vid maximal hastighet i 5 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort ~ 80-90% av vattenfasen (inte röra inter som kan innehålla iskt DNA) och placera i nya rör.
- Tillsätt en lika stor volym kloroform och upprepa steg 8,4.
- Ta bort vattenfasen var noga med att undvika interfasen.
- Lägg 1:10 volym av 3 M natriumacetat, pH 5,2 (alternativt 5 M ammoniumacetat kan användas).
- Lägg 1,5 volymer av kylda, absolute etanol och skaka i 15 sekunder.
- Fällning över natten vid -20 ° C (eller 1 timme vid -80 ° C om i en kapplöpning).
OBS: Proverna kan lämnas vid -20 ° C under längre tid om det behövs. - Centrifugera vid maximal hastighet under 30 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta pelleten med 1 ml kyld RNas-fri 70% etanol.
- Lufttorka pelleten och återsuspendera i 20 | il RNas-fritt vatten.
- Kvantifiera totalt RNA genom spektrofotometri för att säkerställa adekvat utbyte och renhet (baserat på A260 / 280-förhållande) och fortsätt till standard RT-qPCR analys 14 med användning av lika stora volymer av varje fraktion och PCR-primrar som är specifika för mRNA (er) av intresse.
9. Isolering av proteiner från sackaros Bråk.
- Förutom RNA, kan proteiner isoleras och identifieras i enskilda polysom fraktioner också. Använd en av många utmärkta protokoll som finns tillgängliga för proteinisolering, t.ex. 18.
Representative Results
Vi har nyligen beskrivit en ny roll för tumörsuppressorn PDCD4 som en selektiv översättning hämmare av IRES-härbärge mRNA som kodar apoptotiska hämmare XIAP och Bcl-xL 12. Polysom profilering var en viktig teknik för att visa specifika medverkan PDCD4 i IRES-medierad översättning. HEK293-celler transfekterades transient att utarma endogena nivåer av PDCD4 (Figur 1A) och utsattes sedan för polysom profilanalys. Vi observerade att minska nivåerna av PDCD4 inte försämra den globala mobil översättning, att döma av bristen på förändringar i polysom profilen när man jämför siCTRL och siPDCD4 behandlade celler (Figur 1B). Likaså polysom distribution av icke-IRES variant av XIAP 19 var oförändrad mellan behandlade och obehandlade celler (Figur 1C). Däremot polysom fördelningen av de två IRES-härbärgerar mRNA, XIAP och Bcl-XL, var signifikant förändrad. I avsaknad av PDCD4 fördelningen av dessa två mRNA skiftas in tunga ribopolysomes (figur 1D, E). Eftersom detta inte åtföljs av förändringar i steady-state-nivåer av XIAP och Bcl-xL mRNA (Figur 1F) Dessa resultat visar förbättrad översättning av XIAP och Bcl-xL i celler med minskad PDCD4 nivåer, vilket ytterligare bekräftades genom Western blotting (figur 1G).
Figur 1:. Polysom profilering identifierar PDCD4 som selektiv inhibitor av XIAP och BcI-Xl översättning (A) HEK293 celler behandlades med PDCD4 siRNA eller kontroll (CTRL), icke-inriktning siRNA, lyserades och utsattes för Western blot-analys med anti-PDCD4 och anti-nukleolin antikroppar för att kontrollera omfattningen av PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 var knockad som i (A) ochcellysaten utsattes för polysom profilering. Representant polysom profilen visas i den övre panelen; fördelning av XIAP icke-IRES (C), är Bcl-XL (D) och XIAP-IRES (E) mRNA i förhållande till den för GAPDH som visas som procent av total-mRNA (% mRNA) i varje fraktion. (F) Steady -state mRNA-nivåer mättes genom RT-qPCR i PDCD4 siRNA eller kontroll (CTRL) siRNA behandlade celler. (G) Lysaten från (A) utsattes också för Western blot-analys med anti-XIAP, anti-Bcl-xL, och anti-nukleolin-antikroppar. (Obs. Uppgifter som presenteras i figur 1 var ursprungligen publicerades i 12) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Polysomal profilering är en kraftfull teknik som gör det möjligt för kvantifiering av tillståndet för översättningen av specifika transkript under olika behandlingsförhållanden. Det är en mycket enkel teknik i princip men det kräver flera steg av utförandet, av vilka några är kritiska för att producera bra polysom profiler. Dessa viktiga steg är: 1) med RNas-fria kemikalier och plastic, 2) förbereda goda sackarosgradienter (i vår erfarenhet en 10-50% sackarosgradienter fungerar bäst för att effektivt lösa 40 / 60S subenheter och mRNA med bundna ribosomer) och 3 ) med hjälp av celler som exponentiellt växer och högst 80% sammanflytande för att fånga de högsta nivåerna av översättning. Detta senare steg bör tas i beaktande när man gör långa cell behandlingar, såsom gen knockdown eller överuttryck, så att mängden celler att plattan kommer att vara en funktion av hur mycket cellerna kommer att sammanflytande vid endpoint.
I resultaten presented här, polysom profilanalys var ett viktigt redskap för att bedöma PDCD4 roll i översättnings regleringen av IRES-hyser mRNA XIAP och Bcl-xL 12. Det faktum att vi inte observerade någon förändring i de allmänna polysom profiler på PDCD4 knock-down (Figur 1B) tillät oss att dra slutsatsen att PDCD4 inte försämra den globala mobil översättning enligt villkoren i experimentet. Vi använde nästa RT-qPCR analys för att bestämma fördelningen av XIAP och Bcl-xL mRNA i celler som behandlats med PDCD4 eller kontroll siRNA. qPCR är en metod för val för att analysera polysom profiler, i motsats till standard RT-PCR eller Northern blotting, eftersom den möjliggör en kvantitativ snarare än halv kvantitativ analys av mRNA distribution och för att upptäcka subtila förändringar i translationell effektivitet mellan behandlingarna. Med denna teknik kunde vi visa att fördelningen av XIAP och Bcl-xL mRNA (uttryckt i procent av den totala mål-mRNA över gradient) var signifikant skiftas in tunga polyribosomer (mRNA med ett stort antal av ribosomer förknippade med dem) efter PDCD4 knock-down (figur 1D, E), vilket sålunda indikerar en ökning av translation av dessa mRNA-sekvenser. Detta bekräftades ytterligare av en ökning av XIAP och Bcl-xL proteinnivåer, men inte i deras steady-state RNA-nivåer (Figur 1F, G). Viktigt är att polysom fördelning av den icke-IRES variant av XIAP var oförändrad mellan behandlade och obehandlade celler (Figur 1C). Alternativt skulle translationell effektivitet presenteras som ett förhållande av mRNA-innehåll i polysomer (vanligtvis fraktionerna 5-10) kontra monosomes (vanligtvis fraktionerna 2-4) 14.
Användningen av kontrollerna i hela protokollet är viktigt att validera all polysom profilering resultat, som toppar observerade från absorbansmätningar vid 254 nm kan inte på egen hand tillskrivas ribosom RNA (tvättmedelar, såsom Triton X-100 absorberar starkt i detta området av spektrum och kan fördunkla 40 / 60S toppar på toppen av gradienten). Tomma gradienter utan lysat och / eller med lysat buffert måste köras för att bestämma det relativa bidraget av buffertarna till absorbansen vid 254 nm. Artefactual högre ordning strukturer kan också leda till felaktiga tolkningar av polysomer där det finns faktiskt ingen (t.ex. "pseudo-polysomer" 20). Binda magnesium (används under hela förfarandet för att stabilisera 80S ribosomer) med tvåvärd katjon chelator EDTA till lysat och gradienten buffert (20 mM under 15 min) kommer att orsaka separation av ribosomen i dess komponent små (40S) och stora (60S ) subenheter. Således, om absorbanstoppar registrerats vid 260 nm är verkligen polysomer kommer EDTA behandling kollapsa profilen så att en enda maximum kommer att observeras nära toppen av gradienten som motsvarar befria mRNA och ribosomala enheter (data visas ej). Sammanfallandemed EDTA-inducerad kollaps av profilen, bör alla de specifika mål som analyseras av qPCR nu finns på toppen av gradienten.
Antalet ribosomer förknippade med ett mRNA är inte alltid en indikator på hur effektivt detta särskilda mRNA att translateras. I själva verket finns det särskilda sammanhang där aktiv översättningen på polysomer blir strandade 21,22 vilket läsaren bör vara medveten om. Avgöra om avskrifter är aktivt engagerade med översättningen maskiner kan göras av a) behandling av provet med puromycin, som till skillnad från EDTA orsakar "avrinning" av ribosomer som aktivt translokerande över ett mRNA, eller b) behandling av provet med homoharringtonin som hämmar translokation av endast den första ribosomen vid startkodonet, återigen orsakar "run-off" av någon nedströms translokerande ribosomer.
Användningen av kontroll-transkript för qPCR analys är också kritisk. Den selecning av transkript som inte påverkas av olika behandlingsförhållanden såsom vissa hushållningsgener (GAPDH, aktin tubulin, nukleolin), ribosomala mRNA (18S, RPL13A) eller i det här fallet inte är IRES variant av XIAP IRES, är viktig i kontrollera om behandlingen har effekt på översättning är specifik eller generaliserad. Dessa kontrolltranskript kan användas för att normalisera fördelningen av de analyserade mRNA som gjordes här (XIAP och Bcl-xL mRNA normaliserades till GAPDH mRNA och uttryckt i procent av det totala mRNA innehållet utgörs av summan av mRNA-innehåll i varje fraktion ) eller alternativt kan mål- och styr mRNA uttryckas som absoluta värden och redovisas separat. qPCR analys av ingångs lysaten (vanligtvis 10% av den totala volymen) är ytterligare ett steg som kommer att kontrollera för distribution av specifika mRNA. Helst bör innehållet i ett specifikt transkript i inmatnings lysat mRNA vara jämförbar med summan av mRNA-innehåll i alla 10 fraktioner analyserade. Slutligen, Ett valfritt steg för att styra för fenol: kloroformextraktion steget är att spika varje polysom fraktion med ett in vitro-transkriberat reporter-mRNA (exempelvis CAT, kloramfenikolacetyltransferas) som senare kommer att kvantifieras med qPCR och kan även användas för att normalisera uppgifter 14.
Som med vilken teknik som helst, presenterar polysom profilering vissa begränsningar. Det faktum att vanligtvis minst 10 fraktioner (mer subtila förskjutningar i effektivitet översättning kan kräva 20 eller mer) måste samlas för att ha trevligt polysom fördel gör detta steg begränsande, i den meningen att endast maximalt 4 prover kan vara analyseras i taget för att kunna bekvämt hantera RNA-extraktion och qPCR analys av 40 prover och 4 ingångskontroller på en gång. Urvalsstorleken kan enkelt lägga upp med hur många utskrifter som ska analyseras och hur många qPCR replikerar att göra, och det kan bli kostsamt. En annan begränsning med en qPCR-baserad polysomal profilering aANALYS är att den endast kan göras på en kandidat baserad metod (där utskrifter som skall analyseras är känd i förväg) och kan inte sökas genomet hela analysen av översättning. Men i början av 21-talet, utredare började förhöra sin polysomal RNA på genomisk nivå med hjälp av DNA Microarrays 15 och mer nyligen med nästa generations sekvensering 16,17. I denna kraftfulla tillvägagångssätt är polysomal profilering utförs som beskrivs i detta protokoll, förutom att istället för att genomföra qPCR analys av enskilda fraktioner, monosomes fraktioner (oftast fraktion 2-4) och polysomer fraktioner (vanligtvis fraktioner) slås samman och variationer i den globala översättning analyseras genom DNA microarray eller hel-genom-RNA-sekvensering. Därför med denna strategi är det möjligt att bedöma alla mRNA vars distributions skiftar från polysomer till monosomes (minskning i översättning) eller vice versa (ökad translation) på särskild behandlingling. Validering och kvantifiering av specifika mRNA polysomer fördelning kan sedan göras av qPCR. En ännu mer kraftfull användning av principen polysomal profilering är ribosomen profilering. Ytterligare hög genomströmning förlängning av denna teknik rapporterades nyligen som möjliggör samtidig övervakning av hundratals polysom fraktioner 23. Detta ger en klar fördel när sondering translationeffektivitetsvinster av muterade samlingar eller i en storskalig RNAi skärmar. Ribosomen profilering är en teknik som drar nytta av nästa generations sekvensering för att kart RNA-fragment som skyddas av ribosomer (ribosom fotspår) engagerade i proteinsyntesen 24,25. I denna teknik kan ribosom sloka inhiberas med cykloheximid (reversibel) eller emetin (irreversibel) följt av cell-lys och RNas digerering för att ge en population av ribosom fotspår. Ribosomer berikas, total RNA isoleras, och förorenar ribosomal och mitokondriell ribosomalt RNA avlägsnas.RNA fotavtryck av ca 26-28 nukleotider är isolerade, omvänd transkriberas, omvandlas till ett cDNA-bibliotek och sekvens 26. Till skillnad från standard polysom profilering, detta tillvägagångssätt inte bara identifierar specifika mRNA som translation regleras utan även ger mRNA-specifik information vid kodon upplösning som den exakta ockupationen och täthet av ribosomer längs en specifik transkript. Detta är särskilt intressant för mRNA med särskilda former av översättning, såsom IRES-härbärgerar mRNA, eftersom det kan ge mer information om var på avskriften ribosomen-rekryteringen sker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
