Abstract
Protein sentezi Düzenleme strese hücre yanıt olarak önemli bir kontrol noktasını temsil eder. Özellikle, gizli RNA, düzenleyici elemanlar tipik olarak belirli bir stres tepkisi için gerekli olan proteinler için kodlayan spesifik mRNA, seçici çeviri izin vermek için gösterilmiştir. Bu mRNA'lardan yanı sıra seçici çeviri sorumlu düzenleyici mekanizmaların karakterizasyonu Kimlik süredir moleküler biyoloji ön planda olmuştur. Polizom profilleme bu çalışmalarda bir dönüm yöntemdir. Polizom profil amacı, farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar immobilize edilmesi ile mRNA dönüşümüyle yakalamak ve bu yüzden de çok tercüme transkript ve kötü tercüme olanlar arasında bir ayrım sağlayan, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların ayırmaktır. Bu daha sonra, klasik biyokimyasal ve moleküler biyoloji yöntemleri ile ayırt edilebilir. Önemli bir şekilde, birleştirme syüksek kapasiteli genomik yaklaşımları ile olysome profil öteleme düzenlemenin bir büyük ölçekli analizi sağlar.
Introduction
Protein sentezi (translasyon) düzenlenmesi, iyice hücre hayatta kalma ile bağlantılı önemli bir hücresel süreçtir. Çeviri hücrenin enerji% 50'sinden fazlasını tüketir göz önüne alındığında, bu çeviri sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ki ve çeviri tedirginlikler iyi tolere edilmez olması şaşırtıcı değildir. Tersine, bir çok sapkın hücresel süreçlerle nakil mekanizması ve çeviri çıkış (yani proteom) değiştirilmek üzere olmasını gerektirir. Bu genellikle, çeşitli stres cevabı ve hastalık durumlarında da olduğu, ve muhtemelen en iyi kanser örneklenmiştir. Translasyon kontrolünde önemli bir avantajı, hızlıca, çeşitli iç ve dış tetikleyicilere karşılık olarak protein çıkışı yeniden programlamak hücrelerin yeteneği, ve böylece ince ayar mekanizması olduğunu şunun hücre yaşamı ve ölümüyle 1 arasındaki denge.
Öteleme kontrolü iki yönü özellikle ilginçtir; düzenleyici mec doğa anlayışıilk yerde seçici çeviri ortaya, özel tetikle idare hücresel yanıt olarak katılmak hanism (ler) ve kontrol belli bir çeviri izin elemanları, ve spesifik mRNA tespiti ve bunların protein ürünleri. Polizom profil Her iki yöntemin etkin çalışma sağlayan bir tekniktir.
Polizom profil tekniğinin genel amacı eğitim ve farklı hücresel şartlar altında belirli mRNA'lann çeviri durumunu ölçmek için. Tekniğin temel ilkesi, böylece, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların 'dondurulması farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar ve ayrı' (birkaç ribozom bağlayıcı) son derece çevrilmiş transkriptler arasında bir ayrım için izin vererek mRNA dönüşümüyle yakalamak için kötü (bir veya iki ribozomlar bağlı) olanlar çevrilmiştir. Bu özel protokol, antibiyotik sikloheksimidin bağlandığım60S ribozomal alt birim ve bloklar ribozom E sitesinden 2 deasetillenmiş tRNA serbest, ribozom translokasyon inhibe ve çeviri mRNA üzerinde ribozomlar durak için kullanılır. Ancak, aynı zamanda blok yapıldı uzama 3, kullanılabilirler, örneğin, emetin gibi bloke edici maddeler.
Western blotting ve çeviri işleminin son çıkış ölçmek 35S-metionin etiketleme teknikleri farklı olarak, bu nedenle, farklı koşullar altında mekanizmalarından ilişkin daha ayrıntılı bir çalışma için izin veren, profil aktif çevrilmemiş mRNA ile ribozom ilişki ölçüm avantajına sahiptir polisom. Bu yüzden, tekniği kolayca özel çeviri 4-6 farklı modlar incelemek için adapte edilebilir, protein faktörleri çeviri düzenleme, 7-9, protein sentezini 1,10,11 ya da üst baş yangınlar ya da mRNA yapıları etkilerini etkileyen, gerilimli şartlar yer Protein synth açık okuma çerçeveleriagenezis 12-14. Günümüzde, polisom profil uygulama daha geniş polisomlann ilişkili mRNA'ları analiz etmek için, DNA mikrodizilerinin 15 ya da yeni nesil dizileme 16,17 kullanımı ile bulunmaktadır.
Protocol
NOT: Bir not RNA ile çalışma: RNases RNA bozulmaya karşı korumak için standart önlemler alın. Protokol tüm aşamalarında eldiven, pipet uçları, RNazsız plasticware ve kimyasallar kullanın. Tüm çözümler için UltraPure veya DEPC arıtılmış su kullanın. Üreticinin protokolü takip RNaz inaktivasyonu çözümü ile herhangi bir şüpheli yüzeyleri dezenfekte.
Çözümler 1. hazırlanması.
- Temel 500 ml hazırlanması (., 0.3 M NaCl, 15 mM MgCl2 2 O 6H; 15 mM Tris-HCI, pH 7.4) eklenmiştir. Çözelti açık olana kadar bir karıştırma çubuğu ile karıştırın ve 0.45 um'lik bir filtreden geçer. Oda sıcaklığında saklayınız.
- Aşağıdaki gibi 10 ve% 50 Sakkaroz Çözümler ve% 60 Chase Çözüm hazırlayın:
- % 10 sukroz çözeltisi için, (a / h), 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 5 gr sükroz ekleyebilir ve bir baz solüsyonu ile 50 ml kadar doldurun. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü reklamdan içinde% 50 sükroz çözeltisi (w / v) içinD, 25 g sükroz ve bir baz solüsyonu ile 50 ml kadar doldurun.
- % 60 (a / h) Chase, çözelti, bir 50 ml santrifüj tüpü içinde, 30 g sükroz ilave ve baz solüsyonu ile 50 ml kadar doldurun. Doymuş Bromophenol mavisi çözeltisi 100 ul ekleyin (eriyecektir fazla kadar suya bromofenol mavisi ekleyin; santrifüj erimemiş toz pelet için)% 60 kovalamaca çözüm. Bir vorteks ile karıştırın ve tam çözünmesini doğrulayın.
- 4 ° C'de muhafaza çözümler kadar gerekli.
- RNA lizis tamponu hazırlayın. Deney gününde taze bu tamponu hazırlayın. Her numune için bir RNA lisis tampon 500 ul hazırlayın. 1 için temel bir ml solüsyon ilave 10 ul, Triton X-100 (% 1 [hacim / hacim] nihai), 100 mg / ml sikloheksimidin ve DMSO (CHX, 0.1 mg / ml nihai) ve 3.5 ul RNasin 1 ul (140 u / ml) eklenmiştir. Bir vorteks ile karıştırın. Buz üzerinde tutun.
NOT: Siklohekzimid son derece toksik ve mutasyona neden olabilir. Solumaktan kaçının. Çok sık toz halinde ele önlemek için, hazırlıkDMSO, kısım içinde 100 mg / ml'lik stoklar daha büyük bir miktarı ve uzun süreli depolama için -80 ° C'de tutun. -20 ° C'de çalışma stok tutmak. - Deney günü, istenilen% 10 hacim ve% 50 sukroz çözeltisi (gradyan başına her çözeltinin pH değeri 7 mi) CHX (0.1 mg / ml son konsantrasyon) eklenmesi ile sükroz + CHX çözeltilerinin hazırlanması.
Otomatik Eğim Maker Kullanımı Sakkaroz Gradyan 2. Hazırlık
- Degrade makinesi '' ON '' açın ve eğimleri yapacak plakasını level (criticalstep!) Üzerine tıklayın '' Bitti '' plaka tesviye zaman.
- Menüsünden degrade programı seçmek çalıştırmak için:
- Basın '' GRAD '' menüsü ve '' LİSTE '' seçeneğini seçmeniz.
- "SW41" seçeneğini seçin.
- Listede ilerleyin ve seçmek basın tarafından 'programı' '10 - 11 adımlar -% 50 degrade ''' RUN '' tuşuna ing.
- Marker Blok içine konik ultrasantrifüjdeki tüp (SW-41 tüp, 14 x 89 mm) yerleştirin ve Marker Blok üst adımında tüp üzerinde bir işareti izlemek için sağlanan ince tüp kalem kullanınız. Sabit bir yüzey üzerinde bir uydurma rafa tüpleri yerleştirin.
NOT: Bu işaret 10 ve% 50 sukroz çözümleri katman için dolgu rehber olacaktır. - Iki 10 ml'lik şırınga için sağlanan iki kanül takın ve RNaz inaktivasyonu solüsyon içeren ılık damıtılmış su ile pipetle ve aşağı yıkayın. Sonradan tüm su izlerini kaldırmak için emin olun.
- % 10 sukroz + CHX ile şırınga biri doldurun ve bir ultra santrifüj tüpüne altındaki kanül yerleştirin. Sadece tüp üzerinde yapılan işareti geçmiş girene kadar yavaşça% 10 sukroz çözüm dağıtmak.
NOT: kabarcıkları yapmaktan kaçının. Kabarcıklar oluşturan, yavaşça onları yerinden tüp dokunun. - % 50 sakaroz + cHx ile diğer şırınga doldurun, kapalı ekstra sıvı silinultrasantrifüjdeki tüpün dibinde bir yerleştirin hafifçe silin ve kanül ile. Tam işaretine kadar yavaşça% 50 sakaroz çözüm dağıtmak. Hızlı ve sorunsuz kanül çıkarın.
Not:% 10 sukroz, boru içinde yükselir ve üst kısmında bir eğri yüzeyi teşkil edilmelidir. Eğer değilse, yüzey daha fazla,% 10 sukroz çözeltisi ekleyin. - Biraz ultrasantrifüjdeki tüpü eğerek ve tüm hava kabarcıklarını değiştirmesiyle sağlanan kapak takın. Bir mikropipetle Çanak rezervuar aşırı sıvı kaldırmak.
- Degrade yapımcısı plaka üzerinde tüp duvar ve yer boyunca aşırı sıvı silin.
- '' RUN '' tuşuna basınız.
NOT: plaka degrade başlayacak oluşturmak için 5 saniye ve rotasyonlar için duraklatmak, belirli bir açıyla eğmek olacaktır. - Gradyan formasyonu (yaklaşık 2 dk, makine bipleyecektir) tamamlandığında, yavaşça rafa ultrasantrifüjdeki (ler), yer çıkarın ve hızla gradie rahatsız etmemek için bir yukarı hareketin kapağı çıkarınnt.
- Buz üzerinde degrade (ler) tutun. Rahatsız etmeyin! Alternatif olarak gradyanlar, 4 ° C'de gece boyunca devam edin.
- Alternatif bir şekilde, gradyanlar yapmak için iki bölmeli gradyan makinesi kullanımı:
- RNaz inaktivasyonu çözüm ve RNaz içermeyen su ile durulayın boru ve degrade yapımcısı.
- Degrade yapımcısı proksimal odasına% 50 sakaroz + cHx 5 ml ekleyin ve iki oda arasında herhangi bir hava kaldırılır emin olun.
- Degrade yapımcısı uzak odasına% 10 sakaroz + cHx 5 ml ekleyin.
- Tüp tutucu bir konik santrifüj tüpü altındaki (GB-41 tüp, 14 x 89 mm) ve yer% 50 sakaroz + cHx 0.5 ml ekleyin.
- "3" (yaklaşık 1 ml / dak) için ayarlanmış hızda proksimal odasına yerleştirilen karıştırıcı, açık stop-musluklar ve mevduat degrade açın.
- Buz koyun gradyan (ler). Rahatsız etmeyin.
Not: Eğimler 4 ° C'de bir gece boyunca muhafaza edilebilir.
3. Hücre Lisis ve Ultrasantrifüj.
- 4 ° C'de SW-41 rotor, 4 ° C de kepçeler ve set santrifüj yerleştirin.
- En az 24 saat önce lizise büyüme ortamı içinde uygun bir hücre yoğunluğunda plakası hücreleri.
- 0.1 mg / ml CHX ihtiva eden büyüme ortamı içinde bir kısım (150 mm plaka başına 20 mi) hazırlayın.
- Yakalayıp polizom stabilize etmek için 37 ° C /% 5 CO2 ile 3 dakika boyunca (150 mm plaka başına 20 mi) CHX + ortam içinde hücreler inkübe edin.
- Buz üzerinde tabak, bir yer plakalardan, hızlı bir şekilde aspire ortamı çalışan ve 10 ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su ile bir kez yıkama hücreleri (IX PBS: 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) desteklenmiş Sid aşağı yavaşça pipetle CHX (0.1 mg / ml son konsantrasyonda) dikkatli olmakçanak duvarının E kompleksleri, hücre mono tabakasının kalkmasını en aza indirmek için.
- PBS aspire ve her bir plakaya ilave bir 10 mi, PBS + CHX ekleme, bir cep kaldırıcı hücreler kazıma ve buz üzerinde bir 50 ml santrifüj tüpüne her iki plaka arasında toplam hacmi aktarın. Alt protein analizi için buz üzerinde bir mikrofüj tüpüne hücre süspansiyonu 1 ml saklayın.
- Santrifüj 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de hücrelerinin 50 ml'lik bir tüp.
- Buz soğukluğunda RNA, liziz tamponunda 500 ul bütün PBS ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
- 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
- Pipet ve Hücreleri, aşağı ve arada sırada burgaç gibi karıştırılarak 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 5 dakika çekirdekleri pelet haline getirmek üzere, 4 ° C'de 2000 x g'de santrifüjleyin.
- Yeni bir 2 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
- 5 dakika boyunca 4 ° C'de 17,000 x g'de santrifüjleyin hücre kalıntıları topak haline getirilmiştir.
- Yeni bir 2 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın ve ölçmek için 2 ul kullanın260 nm'de optik yoğunluk (boş olarak kullanımı lizis tamponu).
- Toplam RNA analizi için her numuneden 50 ul (toplam% 10) çıkarın. Kadar gerekli Lysate -80 ° C'de saklanabilir NOT.
- (, Gerekirse, ek liziz tamponu ile konsantre edildi lizat seyreltin. 500 ul maksimum hacminde OD 25 optimum en az 10, OD) yavaşça her bir sukroz dereceleri üzerinde eşit A260 üniteleri yüklemek.
- Emin olun eğimleri birbirlerine önce ultrasantrifugasyon 0.1 g içindedir.
- 4 ° C'de 1.5 saat boyunca 39,000 rpm'de (260.343 x g) santrifüje tabi tutulur; gradyanlar.
- Yavaşlatmayı sırasında rotor freni tutmak ve 1000 devir sayısına ulaştığında yavaşlama sırasında kapatmak.
Not: Bu adım, fırça kafalarının frenleme esnasında rotor temas ederken ivme ani değişikliklerin neden olduğu gradyanlar hasar görmesini en aza indirir.
Not: Hücre parçalama prosedürü, iki 150 mm, subconfluent (~% 70-80 ortak akışlı) gradyanının HEK293 hücre plakaları için optimize edilmiştir ve kullanılan miktarlar farklı hücre hatları için ayarlanması gerekebilir.
4. Gradyan Bölünmesi Sistemi Enstrüman Set-up.
- Set-up aracı ve boş saşağıdaki gibi suyla pectrophotometer:
- Bileşenleri açın ve lamba ısınma için en az 15 dakika süreyle sağlar.
- Emin olun bölüngütoplar 'Polizom' yöntemi ayarlanır (iki kez basın klasör simgesi; eve dönüş ekrana dönmek için iki kez ok).
- Fraksiyon toplayıcı üzerindeki vanayı olun (çöp kutusu simgesine ok işaret) atık ayarlanır. Atık toplama tüpü altında distile su ihtiva eden 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesine koyun.
- Grafik kaydedici üzerinde aşağıdaki ayarları seçin: Set Hassasiyet 'SET LAMP VE OPTİK' dial; '1,5' Gürültü filtre ayarı; 'KAPALI' Tepe ayırıcı kadranını; '30 cm / saat '(5 cm / 10 dk) Grafik hızlı aramayı ayarlamak; Baseline 'MAX OPEN' için (spektrofotometre ünitenin üstüne) kadran ayarlayın ayarlayın.
NOT: İsteğe bağlı: Bir dijital kaydedici yazılım yerine grafik kaydedici kullanılabilir. Bilgisayarda, 'start' üzerine tıklayın. Bir edinim penceresi açılacaktır: th altındae Seçenekler menüsü, işaretini kaldırın Pause grafik. Ölçeklendirme altında, (çalışma sırasında-fly değiştirilebilir) -10 ve 100 grafiğin sınırlarını ayarlayın. Yeni bir dosya oluşturmak ve çalıştırmak kaydetmek için Kaydet düğmesini tıklatın. - Pompada şırınga ve şırınga yerleştirin ve (kullanımı sağlanan vidaları ve allen anahtar) içine sıkın.
NOT: Çok fazla sıkmayın. - HIZLI hızında 'REV' 'komutunu kullanarak Chase Çözüm ile şırınga doldurun. Dik konumda pompayı yerleştirin ve 'İLERİ' 'komutunu kullanarak tüp yoluyla hava kovalamak. Sadece bu fonksiyon ve yıkar HIZLI kullanın.
- RNaz içermeyen su ile dolu bir ultra santrifüj tüpüne takın.
- Pierce iki siyah işaretleri kadar kanül ile ultrasantrifüjdeki tüp görünür (dağıtıcı delik bu iki işaretleri arasında yer alır) ve 6.0 ml / dak '' Elle 'üzerinde şırınga pompası başlar.
- Su (C * akış hücresi içinden geçerkenHase çözeltisi değişkene) geçiş hızı tüp 1/3 doldurur ve 1,0 ml / dakika olarak ayarlanır.
- 1.0 ml / dk'lık bir akış hızında, grafikte voltajın sıfır (+/- 0.5 birim) gelene kadar Taban spektrofotometre üzerinde kadranı ayarlayın.
NOT: Erlenmeyer atık tüp su çıkış gözlemleyin. - '0.5' veya '1.0' AU istenen Hassasiyet ayarlayın.
NOT: 1.0 AU 10 ml'lik bir gradyan 10 OD birimleri için en iyi çalışır. OD 10 daha düşük ise, '0.5' hassasiyeti sinyali artırmak için kullanılabilir. - Otomatik Baseline düğmesine basın ve (dijital kaydedici kullanıyorsanız isteğe bağlı) Kaydedici ofset kadranı çevirerek grafik kaydedici üzerine% 10 işareti ayarı taban çizgisini ayarlayın.
- Istikrarlı bir temel elde edildikten sonra dijital kayıt cihazı kullanıyorsanız analog grafik kaydedici veya 'OFF' kullanıyorsanız, 60 cm / saat 'KAPALI' ve Grafik Hızlı arama pompa düğmesini açın.
- RE 'Pompayı geçerek Chase Çözüm kurtarmakO delici kanül üzerinde ilk işareti ulaşana kadar (tek HIZLI KULLANMAYIN ... geri 6.0 ml / dk akış hızını artırabilir gerekirse) V pozisyon.
- Santrifüj tüpünü çıkarın ve içinden Chase Çözüm biraz çalıştırarak kanül içindeki hava kabarcıklarını kovalamak. Delici sahne tozunu silin.
NOT: Bazı artık su akış hücresi sızabilir.
5. Gradyan Bölünmesi ve Örneklerin Toplanması.
- Install ve sükroz degrade içeren santrifüj tüpü delmek.
- Kapaklar yukarı çıkıntı yok böyle ki bölüngütoplar tepsi pozisyonlarda 1-11 onbir 2 ml mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. Kolektör boru içinde kalan herhangi bir sıvıyı toplamak için bir 'atık tüp' ile şimdi '' tüp # 1 '' değiştirin.
- 'Elle' için pompa kontrol kadranını ve '6.0 ml / dak' için şırınga pompası akış hızı Fraksiyon toplayıcı üzerindeki 'Play' simgesine basın. En kısa sürede kol ilk tüp ulaştığında, 'pause' düğmesine basın (bu kolunuzu ve kesir-dağıtım vanası açılacaktır).
- 'İLERİ' 'komutunu kullanarak pompayı çalıştırmak ve Grafik kaydedici kalem izlemek. Yukarı doğru saptırma başladığında, hızla 'ile' atık tüp '' 'tüp # 1' 'yerine (ki örnek spektrofotometre akış hücresi geçiyor gösteren).
- Ilk açılan tahsil edilmesi durumunda, hızla 'Uzaktan start / stop', '' Değişken (1.0 ml / dak) 'tuşuna basın' 'Play' 'simgesi komutları geçmek.
NOT: Pompa şimdi bölüngütoplar arayüzü ile kontrol edilir ve 1 ml'lik fraksiyonlar her dakika tahsil edilecektir. - Bu noktadan itibaren, A260 okumalar dijital kayıt arabirimi (veya analog grafik recorde görünecektirr). '' Record '' yazılımında düğmesine basıldığında emin olun!
- Mavi Chase Çözüm toplama tüpü veya son tüp (genellikle tüp 11) girdikten sonra, 'Stop' simgesine basın.
NOT: kapakçığı atık vana geçmelisiniz. - Tüm geçişlerini parçalanmış kadar buz üzerinde kesirler tutun. Günün kısımların sonunda önceden protein veya RNA izolasyonu için -80 ° C'de saklanabilir. Protein ve RNA analizleri gerekli ise, devre her bir fraksiyonu (protein ve RNA analizi için 500 ul her biri) ayrıldı.
6. Yıkama
NOT: (birden degradeler tahsil edilmesi durumunda bu sadece yapılacak isteğe bağlı bir adımdır).
- ~ Içeren bir Erlenmeyer şişe içine, aşırı saf su, 50 ml atık borusunu daldırın ve 6 ml / dakika akış hızı kullanılarak pompayı ters.
- Chase Çözüm ilk işareti o ulaştığında pompayı durdurunn delici kanül.
- , Santrifüj tüpü çıkarın kanül herhangi bir hava kovalamak ve delici sahne temizleyin.
NOT: Bazı artık su akış hücresi sızabilir. - Aşama 5.1 'dan başlayan fraksiyonasyon prosedürü tekrarlayın.
7. Final Clean up.
- Delicisinin altından pompa hortumunu kesin ve hızlı bir akım değerini kullanarak bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne Chase çözelti pompası. Yeniden kullanılabilir edildiği gibi 4 ° C'de Chase Çözüm saklayın.
- 3 yollu boru sisteminin pompa hortumunu bağlayın ve şırınga giden vanasını kapatın. Damıtılmış su ve delici tabanına başka boru ile doldurulmuş bir 50 ml şırınga ile bir tüp bağlayın.
- Kesme adımı için kullanılan bir ultra santrifüj tüpüne takın ve 'Yıldız tıklayarak arabirimde toplama menüsüne spektrofotometre ve toplama tüpü (bir anahtar yoluyla damıtılmış suda en az 50 ml geçmesit / Pause '' simgesi).
- Ve diğer tüm taşınabilir bileşenleri (vidayı çıkarmak için kullanım Allen anahtarı) ve ılık musluk suyu kullanarak iyice yıkayın ve sonra saf su ile durulayın tüp, şırınga çıkarın.
NOT: piston, namlu, boru yıkama ve kanül delici özel dikkat.
NOT: dikkatle cam şırınga varil tutun! Tozdan uzak tüm bileşenleri saklayın. - Distile su ile nemlendirilmiş yumuşak bir doku ile akış hücresinin altını silin. Fraksiyon toplayıcı tepsi ve sakaroz dökülmüş olabilecek diğer alanları silin.
Sakaroz fraksiyonlardan RNA 8. izolasyonu.
- (37.5 ul% 10 SDS, 7.5 ul 0.5 M EDTA, 1 ul Glycoblue, 20 mg 4 ul / ml Proteinaz K) Sükroz fraksiyonunun her 1 ml Proteinaz K çözeltisi 50 ul hazırlayın.
- 2 mi düz taban kısmı bir tüp içinde, 55 ° C 'de, 1 ml Proteinaz K çözeltisi 50 ul sükroz fraksiyon inkübe1 saat (eğer 500 ul fraksiyonlar buna proteinaz K çözeltisi seviyesini ayarlamak kullanarak).
- Kloroform: fenol eşit hacimde ekleme İzoamil alkol sükroz fraksiyonlar (125: 24: 1, tercihen asidik (pH 4.5) ile DNA kontaminasyonu en aza indirmek için).
NOT: ağırdır ve fazlar ters alabilir çünkü kesirler 7-10 kloroform ekstra 200 ul ekleyin.
NOT: fenol / kloroform teması ve solunması yanıklara neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri takın, ve bir fumehood kullanın. - Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca maksimum hızda vorteks ~ 30 sn ve santrifüj.
- ~ Sulu faz% 80-90 kaldır yeni tüp ve yer (genomik DNA içerebilecek olan interfaz dokunmayın).
- Kloroform ve tekrar adım 8.4 eşit hacmi ekleyin.
- Interfazda önlemek için dikkatli olmak sulu faz çıkarın.
- 3 M sodyum asetat 01:10 hacim, pH 5.2 ekleyin (alternatif olarak 5 M amonyum asetat da kullanılabilir).
- Soğutulmuş, Absolu 1.5 hacimleri ekle15 sn için te etanol ve vorteks.
- -20 ° C'de (ya da -80 ° C'de 1 saat bir acele ise), bir gece boyunca çökelmeye.
NOT: örnekler bırakılabilir -20 Gerekirse daha uzun süre ° C. - 4 ° C'de 30 dakika süreyle maksimum hızda santrifüje.
- Soğutulmuş RNase içermeyen,% 70 etanol, 1 ml pelet yıkayın.
- Hava RNaz içermeyen su 20 ul pelet ve tekrar süspansiyon kurutun.
- Yeterli verim ve (A260 / 280 oranına göre) saflıkta temin etmek ve çıkar mRNA (lar) özel bir eşit Her fraksiyonun hacmi ve PCR primerleri kullanılarak standart RT-qPCR analizi 14 geçmek için spektrofotometre ile toplam RNA miktarı belirlenir.
Sukroz Kesirler Proteinlerin 9. İzolasyonu.
- RNA'ya ek olarak, proteinler izole edilebilir ve aynı zamanda tek tek polisom fraksiyonlarda belirlenmiştir. 18, protein izolasyonu için kullanılabilir birçok mükemmel protokollerden birini kullanın.
Representative Results
Biz son zamanlarda apoptotik inhibitörleri XIAP ve Bcl-xL 12 kodlayan mRNA'lan IRES-barındıran bir seçici çeviri inhibitörü olarak tümör baskılayıcı PDCD4 için yeni bir rol tarif var. Polizom profil IRES-aracılı çeviri PDCD4 özel katılımını göstermek için önemli bir tekniktir. HEK293 hücreleri geçici PDCD4 (Şekil 1A) endojenik düzeylerini tüketmek için transfekte edilmiş ve daha sonra profil analizleri polisom tabi tutuldu. Biz siCTRL ve siPDCD4 ile işlenen hücrelerde (Şekil 1B) karşılaştıran polisom profilindeki değişikliklerle eksikliği ile karar PDCD4 azaltılması kat, küresel hücresel Çeviri zarar almadığı gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, XIAP 19 olmayan IRES varyantının polisom dağılımı, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Buna karşılık, iki IRES-barındıran mRNA'ların polisom dağılımı, XIAP ve Bcl-xL, önemli ölçüde değişmiş edildi. P yokluğundaDCD4 Bu iki mRNA'ların dağılımı ağır ribopolysomes (Şekil 1D, E) içine kaydırılır. Bu XIAP ve Bcl-xL, mRNA (Şekil 1F), bu sonuçlar kararlı durum seviyelerinde değişikliklere eşlik olmadığından daha ileri olarak Western lekeleme (Şekil ile teyit edilmiştir, indirgenmiş PDCD4 seviyeleri ile hücrelerde XIAP ve Bcl-xL translasyonunu daha zengin oldukları bilinir 1G).
Şekil 1:. Polisom profil XIAP ve Bcl-xL çeviri seçici önleyicisi olarak PDCD4 tanımlayan (A), HEK293 hücreleri PDCD4 siRNA veya kontrol (CTRL) ile muamele edildi, bir anti-PDCD4 lizlendi ve Western blot analizine tabi tutulmuştur siRNA olmayan hedefleme ve anti-Nucleolin antikorları. PDCD4 knock-down kapsamını doğrulamak (B) PDCD4 (A) gibi yıkıldığında veHücre lizatları, profil polisom tabi tutuldu. Temsilci Polizom profil üst panelde gösterilir; XIAP olmayan IRES (C) dağılımı, GAPDH edilene göre, Bcl-xL (D) ve XIAP IRES (E) mRNAlar, her bir parça halinde toplam mRNA yüzde (% mRNA) olarak gösterilmiştir. (F) Sabit -durum mRNA seviyeleri PDCD4, siRNA veya Kontrol (CTRL) siRNA ile muamele görmüş hücreler RT-qPCR ölçüldü. (G) 'den Lizatlar (A)' da, anti-XIAP, anti-Bcl-xL, ve birlikte western blot analizine tabi tutulmuştur Anti-Nucleolin antikorlar. (NB. Veri başlangıçta 12 yayınlandı Şekil 1'de sunulan) bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Polysomal profil farklı tedavi koşulları altında belirli transkript çeviri devletin ölçümü için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. Prensip çok basit bir tekniktir ama iyi Polizom profilleri üretmek için kritik bazıları yürütme birkaç adımları gerektirir. 1) RNazsız kimyasallar ve plastik malzeme kullanılarak, 2) (iyi sakaroz geçişlerini hazırlamak bizim deneyim% 10-50 sakaroz geçişlerini verimli bağlı ribozomlarla 40 / 60S alt birimleri ve mRNA'lan) çözümlemek için en iyi iş, ve 3: Bu tuş adımlar ) en yüksek çeviri oranlarını yakalamak için katlanarak büyüyen hücreleri ve fazla% 80 konfluent kullanarak. Bu tür gen demonte veya aşırı ekspresyonuna sürece hücre tedavileri, yaparken plaka hücre miktarı hücreler son ucunda birleştirilebilmeli ne kadar bir fonksiyonu olacaktır, böylece bu ikinci aşaması dikkate alınmalıdır.
Sonuçlarda Konusuted burada, Polizom profili analizi IRES'e-barındıran mRNAlar XIAP ve Bcl-xL 12 çeviri düzenlenmesinde PDCD4 rol değerlendirmek için önemli bir araç oldu. Biz PDCD4 knock-down (Şekil 1B) üzerine genel Polizom profillerinde herhangi bir değişiklik dikkat etmedi aslında bize PDCD4 deney koşullarında küresel hücresel çeviri zarar vermedi sonucuna izin verdi. Önümüzdeki PDCD4 veya kontrol siRNA'lara ile tedavi hücrelerde XIAP ve Bcl-xL mRNA'ların dağılımını belirlemek için RT-qPCR analizi kullanılmıştır. Bu mRNA'nın dağılımının niceliksel yerine Yarı-nicel analiz için ve tedaviler arasında çeviri verimliliği ince değişimlerin saptanması için sağlar, çünkü QPCR, standart RT-PCR veya Northern Blot karşıt olarak, polisom profilleri analiz için tercih edilen bir yöntemdir. Bu tekniği kullanarak, XIAP ve Bcl-xL mRNA'ların dağılımı (gr edilen toplam hedef mRNA'nın bir yüzdesi olarak ifade edilen bu gösterebilmişlerdiradient) belirgin ve böylece, bu mRNA çevirisinde bir artışla, PDCD4 knock-down (Şekil 1D, e) bunlarla ilişkili ribozom çok sayıda) ağır poliribozomların (mRNA içine kaydırılmıştır. Bu da XIAP ve Bcl-xL protein düzeyinde değil, bunların kararlı durum RNA düzeyi (Şekil 1F, G), bir artış ile teyit edilmiştir. Önemli bir şekilde, XIAP olmayan IRES varyantının polisom dağılımı tedavi edilen ve edilmeyen hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Seçenek olarak ise, dönüşüm etkinliğini 14 (genellikle 2-4 fraksiyonlar) monosomes karşı polizom mRNA içeriği olan bir oranda (genellikle 5-10 fraksiyon) olarak sunulabilir.
254 nm absorbans okuma gözlenen zirveleri kendi ribozomal RNA (deterjan isnat edilemez olarak protokol boyunca kontrolleri kullanımı sonucu profilleme herhangi Polizom doğrulayarak önemlidirörneğin Triton X-100 gibi ler, kuvvetli) spektrumun bu bölgede absorbe ve gradyan üstündeki 40 / 60S tepe gizleyebilir. Lisatı olmayan ve / veya lisat tamponu ile Boş gradyanı, 254 nm'de abzorbans, tamponlar nispi katkısının belirlenmesi için çalıştırılması gerekir. Artefactual yüksek mertebeden yapılar da aslında hiçbiri (örneğin "sözde Polisomlar" 20) vardır polizom hatalı yorumlara yol açabilir. Magnezyum Ayrılan iki değerlikli katyon kenetleme maddesi EDTA (80S ribozomlar stabilize etmek için işlem boyunca kullanılan) büyük (60S bileşen küçük (40S) içine ribozom ayrılmasına neden olacaktır lizatlarına ve gradyan tamponu (15 dakika için 20 mM) eklendi ) alt birimi. 260 nm'de kaydedilen absorbans pikleri polisomlann gerçekten de Dolayısıyla, eğer EDTA muamelesiyle tek bir maksimum mRNA ve ribozomal birimleri serbest tekabül gradyanının üst kısmında görülen edilecek şekilde profili çökecek (veriler gösterilmemiştir). RastlayanProfilin EDTA kaynaklı çökmesiyle birlikte, qPCR analiz belirli hedeflerin hepsi şimdi degrade üstünde bulunmalıdır.
Bir mRNA ile ilişkili ribozomların sayısı her zaman belirli bir mRNA tercüme ediliyor nasıl verimli bir göstergesi değildir. Nitekim, polisomlar aktif çeviri okuyucu farkında olmalıdır 21,22 durdu hale geldiği özel bağlamları vardır. Transkript aktif EDTA aksine, 'run-off' aktif bir mRNA boyunca translocating olan ribozomların neden Puromycin ile örnek, tedavi) bir tarafından yapılabilir çeviri makine ile meşgul, veya b) örnek tedavisi olsun ya da olmasın belirlenmesi Yine herhangi bir aşağı translokasyon Ribozomların 'run-off' neden başlangıç kodonu sadece ilk ribozomun translokasyonu inhibe homoharringtonin'le.
QPCR analizi için kontrol transkriptleri kullanılması da önemlidir. SelecBu tür XIAP IRES olmayan IRES varyant bazı temizlik genin (GAPDH, aktin, tubulin, Nucleolin), ribozomal mRNA (18S, RPL13A) halinde ya da bu durumda, farklı tedavi koşullarında etkilenmez transkript tion, önemlidir doğrulama çeviri üzerinde tedavinin etkisinin spesifik ya da genel olup olmadığını. Bu kontrol transkriptleri burada yapılan gibi analiz mRNA'ların dağılımını normalize etmek için kullanılabilir (XIAP ve Bcl-xL mRNA'lar, GAPDH mRNA için normalize edildi ve her fraksiyon mRNA içeriğinin toplamı ile temsil edilen toplam mRNA'nın içeriğinin yüzdesi olarak ifade edildi ) ya da seçenek olarak, hedef ve kontrol mRNA'lar, mutlak değerler olarak ifade edilen ve ayrı olarak gösterilebilir. giriş lizatlan (toplam hacmi genellikle,% 10) olarak QPCR analizi belirli mRNA'ların dağıtımı için kontrol edecek bir adımdır. İdeal olarak, giriş lizat belirli transkriptin mRNA içeriği analiz 10 fraksiyonları mRNA muhtevası toplamının ile karşılaştırılabilir nitelikte olmalıdır. NihayetBir isteğe bağlı aşama fenol kontrol etmek için: kloroform ile ekstre etme aşaması (kedi, kloramfenikol asetil transferaz gibi) ardından qPCR sayısal olarak ve hatta kullanılabilir normalleştirmek için bir in vitro transkribe raportör mRNA ile her polisom fraksiyonu başak etmektir Veriler 14.
Herhangi bir teknik olduğu gibi, polisom profil bazı sınırlamalar sunulur. Genellikle 10 kesirler bir asgari güzel Polizom dağılımları olması için toplanması gerekmektedir (çeviri verimliliğinde daha ince kaymalar 20 veya daha fazla gerekebilir) olması bu adımı 4 örneklerinin sadece maksimum olabilir anlamda, sınırlayıcı yapar Bir anda analiz rahat bir kerede RNA ekstraksiyon ve 40 örnekleri ve 4 giriş kontrolleri QPCR analizini idare edebilmek için. Örneklem büyüklüğü kolayca QPCR yapmak çoğaltır kaç transkript analiz edilecek ve kaç ile ekleyebilirsiniz, ve bu pahalıya mal olabilir. QPCR tabanlı polysomal profil a diğer kısıtlılığınalysis sadece (transkript önceden bilinen analiz edilmesi) ve çeviri genom analizi için tatbik edilemez bir aday temelli yaklaşım yapılabilir olmasıdır. Ancak, 21. yüzyılın başında, araştırmacılar DNA kullanılarak bir genomik düzeyde polysomal RNA sorguya başladı nesil dizileme 16,17 ile daha yakın zamanda 15 ve mikroarray'ler. Daha çok ayrı ayrı fraksiyonların QPCR analizi yapan daha haricinde bu protokolde tarif edildiği gibi, bu güçlü bir yaklaşım olarak, polysomal profil gerçekleştirilir, genel çeviri kısımlar (genellikle fraksiyon 2-4) ve polizom parçacıklar (genellikle kısımlar) toplanır ve varyasyonları analiz monosomes DNA mikro-dizisi ya da tüm genom RNA sekansları vasıtası ile. Dolayısıyla bu yaklaşım ile, bu değerlendirmek mümkündür tüm olan dağıtım kaymalar polisomlar dan monosomes için (çeviri azalma) ya da tam tersi (çeviri artış) belirli bir tedavi üzerine mRNAlarment. Belirli mRNA Polisomlar dağıtım Doğrulama ve miktar sonra qPCR yapılabilir. Polysomal profil ilkesinin daha da güçlü kullanım ribozom profillemesidir. Bu tekniğin daha yüksek verimlilik uzatma Polizom fraksiyonların 23 yüzlerce eşzamanlı izleme sağlayan son zamanlarda bildirildi. Mutant koleksiyonları veya büyük ölçekli RNAi ekranlarında öteleme verimliliği sondalama Bu açık bir avantaj sağlamaktadır. Ribozom profil protein sentezinde 24,25 yapan ribozomlar (ribozom ayak) tarafından korunan RNA parçaları eşleştirmek için yeni nesil dizileme yararlanır bir tekniktir. Bu teknikte, ribozom translokasyon sikloheksimid (geçici) ya da emetin (geri dönüşümsüz) bir ribozom ayak izi bir popülasyonunu üretmek üzere hücre lizizi ve RNaz sindirimi ile başlık ile inhibe edilebilir. Ribozomlar, zenginleştirilmiş total RNA izole edilir ve kirletici ribozomal ve mitokondriyal ribozomal RNA çıkarılır.Yaklaşık 26-28 nükleotid RNA ayak izi izole bir cDNA kütüphanesine dönüştürülmüştür, transkripsiyonu ve 26 dizilenmiştir ters. Standart Polizom profilleme aksine, bu yaklaşım sadece translationally düzenlenir belirli mRNA'lan tanımlayan değil aynı zamanda belirli bir transkript boyunca tam işgal ve ribozomların yoğunluğu gibi kodon çözünürlükte mRNA özgü bilgileri verir. O nerede oluştuğunu transkript ribozom-istihdamına hakkında daha fazla bilgi verebilir Bu, özellikle, bu tür IRES-yataklık mRNA'lanmn gibi çeviri özel modları ile mRNA'larL için ilginçtir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J.
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
