Abstract
Neuroscienza sperimentale è testimone un crescente interesse per lo sviluppo e l'applicazione di nuove e, protocolli a circuito chiuso spesso complessi, in cui lo stimolo applicato dipende in tempo reale sulla risposta del sistema. Recenti applicazioni vanno dalla realizzazione di sistemi di realtà virtuale per lo studio di risposte motorie, sia in topi 1 e in zebrafish 2, per il controllo delle crisi epilettiche seguenti ictus corticale utilizzando optogenetics 3. Uno dei principali vantaggi di tecniche anello chiuso risiede nella capacità di sondare superiori proprietà dimensionali che non sono direttamente accessibili o che dipendono da più variabili, quali eccitabilità neuronale 4 e affidabilità, mentre allo stesso tempo, massimizzando il sperimentale. In questo contributo e nel contesto di elettrofisiologia cellulare, descriviamo come applicare una varietà di protocolli a circuito chiuso per lo studio delle proprietà di risposta di piramidale neuroni corticali, recorded intracellulare con la tecnica del patch clamp in fettine di cervello acuto dalla corteccia somatosensoriale di ratti giovani. Poiché nessun source disponibile in commercio o aperto fornisce tutte le caratteristiche richieste per l'esecuzione in modo efficiente gli esperimenti descritti qui, un nuovo toolbox software chiamato LCG 5 è stato sviluppato, la cui struttura modulare massimizza il riutilizzo del codice informatico e facilita l'implementazione di nuovi paradigmi sperimentali. Le forme d'onda di stimolazione vengono specificati utilizzando un compatto meta-descrizione e protocolli sperimentali complete sono descritte nei file di configurazione basati su testo. Inoltre, LCG ha una interfaccia a riga di comando che è adatto per la ripetizione delle prove e l'automazione di protocolli sperimentali.
Introduction
Negli ultimi anni, elettrofisiologia cellulare è evoluto dal paradigma tradizionale anello aperto impiegata in esperimenti di tensione e corrente clamp protocolli a circuito chiuso moderni. La tecnica a circuito chiuso più noto è forse il morsetto dinamica 6,7, che ha permesso l'iniezione sintetica dei canali ionici artificiali voltaggio-dipendenti per determinare il potenziale di membrana neuronale 8, lo studio approfondito degli effetti della non-deterministico sfarfallio on canali ionici sulla dinamica di risposta neuronale 9, così come la ricreazione in vitro di realistico in vivo- come attività di fondo sinaptica 10.
Altri paradigmi a circuito chiuso che sono stati proposti includono il morsetto reattiva 11, per studiare in vitro la produzione di attività persistente di auto-sostenuta, e la risposta serrare 4,12, per studiare i meccanismi cellulari alla base eccitabilità neuronale.
ontent "> Qui si descrive un quadro potente che permette l'applicazione di una serie di anello chiuso protocolli elettrofisiologici nel contesto di cellule intere registrazioni di patch clamp effettuate in fettine di cervello acuto. Mostriamo come registrare potenziale di membrana somatica mediante registrazioni di patch clamp in neuroni piramidali della corteccia somatosensoriale di ratti giovani e di applicare tre diversi protocolli a circuito chiuso con LCG, un software toolbox basato su riga di comando sviluppato nel laboratorio di Neurobiologia e Teorica Neuroengineering.Brevemente, i protocolli descritti sono, in primo luogo l'iniezione automatica di una serie di forme d'onda di corrente morsetto stimolo, rilevanti per la caratterizzazione di un grande insieme di proprietà di membrana attiva e passiva. Questi sono stati suggeriti per catturare il fenotipo elettrofisiologico di una cella in termini di proprietà di risposta ad una serie di forme d'onda stereotipata stimolo. Conosciuta come la e-codice di un cellulare (ad esempio, vedere & #160; 13,14), una raccolta di risposte elettriche è utilizzato da diversi laboratori di classificare oggettivamente neuroni sulla base delle loro proprietà elettriche. Questo include l'analisi del rapporto di trasferimento ingresso-uscita stazionario (curva fI), con una tecnica innovativa che coinvolge il circuito chiuso, controllo in tempo reale della frequenza di scarica attraverso un (PID) regolatore proporzionale-integrale-derivativo , secondo la ricreazione realistica in vivo -come sfondo sinaptica in preparati in vitro 10 e, terzo collegamento artificiale in tempo reale dei due neuroni piramidali registrati simultaneamente mediante un interneuroni GABAergico virtuale, che viene simulato dal computer.
Inoltre, LCG implementa la tecnica nota come attivo elettrodo di compensazione (AEC) 15, che consente di implementare protocolli clamp dinamico utilizzando un singolo elettrodo. Questo consente di compensare gli effetti indesiderati (unrtifacts) dell'elettrodo di registrazione che sorgono quando viene utilizzato per la distribuzione di stimoli intracellulari. Il metodo si basa su una stima non parametrica delle proprietà elettriche equivalenti del circuito di registrazione.
Le tecniche e protocolli sperimentali descritti nel presente documento possono essere facilmente applicati in convenzionale tensione a circuito aperto e gli esperimenti clamp attuali e possono essere estesi ad altri preparati, come extracellulare 4,16 o registrazioni intracellulari in vivo 17,18. L'attento assemblaggio del setup per patch clamp cellula intera elettrofisiologia è un passo molto importante per la stabilità, registrazioni di alta qualità. Nel seguito si assume che un tale apparato sperimentale è già disponibile per lo sperimentatore, e focalizziamo la nostra attenzione sulla descrizione dell'utilizzo di LCG. Il lettore è puntato a 19-22 per ulteriori suggerimenti circa l'ottimizzazione e il debugging.
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Protocol
Il protocollo qui descritto è conforme con le raccomandazioni e le linee guida del Comitato Etico del Dipartimento di Scienze Biomediche dell'Università di Anversa. Questo protocollo richiede la preparazione di materiale non senziente dal cervello espiantato di giovani ratti Wistar, ottenuto con tecniche di eutanasia umane approvati.
1. apparecchiature Preparazione
- Installare e configurare l'acquisizione dei dati e del sistema di stimolazione.
- Utilizzare un personal computer (PC) dotato di acquisizione dati (DAQ) scheda supportata dal Comedi per registrare i segnali e inviare tensioni di controllo analogici all'amplificatore elettrofisiologico.
NOTA: Comedi un modulo su Linux e la biblioteca che supporta una moltitudine di schede DAQ dai produttori più comuni: visita http://www.comedi.org per ulteriori informazioni. - In caso di un patch clamp amplificatore controllato da computer è in uso, impiegare un secondo PC oltre a quello dedicato all'amplificatorecontrollo.
NOTA: Mentre quest'ultimo può eseguire un sistema operativo convenzionale, il PC supplementare sarà operativo in tempo reale per mezzo di un sistema operativo speciale. In queste condizioni, è conveniente utilizzare un unico monitor, mouse e tastiera collegata al PC supplementare, mentre il collegamento mediante un'applicazione desktop remoto al PC dedicato. - Scaricare l'immagine ISO del Live CD che contiene un sistema operativo Linux real-time con LCG preinstallato da http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso e masterizzarlo su un disco CD o chiavetta USB " .
- È sufficiente inserire il CD nel lettore del PC contenente la scheda DAQ e avviarlo. In alternativa, installare LCG dalla repository fonte online su un PC con il sistema operativo Linux (ad esempio, Debian o Ubuntu). Consultare il manuale on-line per i dettagli sulla procedura di installazione. Il manuale è disponibile online all'indirizzo http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Boot da CD live: this caricherà automaticamente un sistema completamente configurato. Per fare questo, inserire il Live CD LCG nel drive CD-ROM del computer e avviare il sistema da CD; selezionare il kernel in tempo reale (opzione di default) non appena viene visualizzato il menu di avvio e attendere che il sistema di inizializzazione.
- Calibrare la scheda DAQ digitando al prompt dei comandi:
sudo comedi_calibrate
o
sudo comedi_soft_calibrate
a seconda che il bordo di acquisizione dati supporta hardware o software di calibrazione, rispettivamente (utilizzare il comando sudo comedi_board_info per ottenere informazioni sulla scheda). - Impostare analogico-digitale e digitale-analogici fattori di conversione appropriato: questo richiede avere accesso al manuale dell'amplificatore elettrofisiologico cellulare, e in particolare alle sue specifiche sui suoi fattori di conversione.
- Utilizzare un editor di testo per specificare i valori numerici appropriati nel file /home/user/.lcg-env, per le variabili di ambiente AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
NOTA: Questi rappresentano l'ingresso (AI) e di uscita (AO) guadagni per pinza (CC) e morsetto di tensione (VC) le modalità ed i fattori di conversione tra i comandi di tensione forniti dal computer e l'attuale o tensioni generata dall'amplificatore rispettivamente. - In alternativa, utilizzare lo script fornito LCG (LCG-trovare-conversione-fattori), per trovare i fattori di conversione del proprio sistema.
NOTA: I valori calcolati da LCG-trovare-conversione-fattori sono ipotesi, che in alcuni casi sono necessarie per essere numericamente troncati o arrotondati per riflettere i valori esatti dei fattori di conversione. - Per utilizzare LCG-trovare-conversione-fattori, avviare collegando la 'cella modello' che spesso viene acquistato con l'amplificatore al corrispondente headstage. Quindi, aprire un terminale sulla macchina Linux in cui si esegue il CD Live e scrivete il seguente comando al prompt della shell:
lcg-trovare-conversione-fattori -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
NOTA: In entrambi i casi (ad esempio, la modifica manuale del /home/user/.lcg-env o l'utilizzo di LCG-trovare-conversione-fattori), chiudere e aprire il terminale per le modifiche abbiano effetto. - Se si utilizzano più headstages, impostare i fattori di conversione agli stessi valori in tutti i canali; se ciò non fosse possibile, consultare il manuale online LCG per capire come utilizzare più fattori di conversione in LCG-stimolo o come produrre i file di configurazione che si adattano meglio le esigenze dell'utente.
- Utilizzare un personal computer (PC) dotato di acquisizione dati (DAQ) scheda supportata dal Comedi per registrare i segnali e inviare tensioni di controllo analogici all'amplificatore elettrofisiologico.
2. Preparazione di acuta cerebrale porzioni dal corteccia somatosensoriale
- Preparazione di soluzioni per elettrofisiologia.
- Preparare fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) mescolando (in mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 glucosio, 2 CaCl 2, 1 e MgCl 2. Preparare 10x soluzioni madre per ridurre latempo di preparazione nel giorno dell'esperimento. Preparare 2 L, di cui uno sarà usato per la preparazione delle fette e l'altra per la registrazione.
- Saturare il ACSF con 95% O 2 e 5% CO 2 per almeno 30 minuti prima dell'inizio della procedura.
- Per le registrazioni corrente con la pinza, utilizzare una soluzione intracellulare (ICS) contenente (in mm) 115 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparare la soluzione in ghiaccio e filtrarla prima dell'inizio delle registrazioni per eliminare il rischio di intasamento della pipetta.
- L'estrazione del cervello.
- Anestetizzare l'animale ponendo l'animale in una camera di induzione con 4% isoflurano e rapidamente decapitarlo usando una ghigliottina o grandi forbici.
- Tagliare la pelle lungo la linea mediana e farlo scorrere per le orecchie.
- Utilizzando un bel paio di forbici tagliare cranio lungo la linea mediana. Mantenere la lama il più vicino possibile the superficie in modo da minimizzare i danni al cervello sottostante. Aprire il cranio con un paio di pinzette, utilizzare una spatola per tagliare il nervo ottico e il tronco encefalico e delicatamente cadere il cervello in ACSF ghiacciata.
- Separare il cervelletto e le due emisferi con un bisturi (lama 24).
- Rimuovere l'acqua in eccesso da uno dei due emisferi e la colla su una piattaforma inclinata con una goccia di colla. Aggiungere rapidamente alcune gocce di ACSF il cervello e trasferirlo alla camera vibratome.
NOTA: Quando si prepara fette sagittali, l'angolo della piattaforma è importante per evitare di danneggiare i dendriti delle cellule piramidali durante la procedura di taglio.
- Preparazione delle fette.
- Posizionare la lama sopra il cervello ed eliminare i primi 2,5-3 mm. Regolare la velocità e la frequenza di limitare i danni alla superficie della fetta, mentre allo stesso tempo minimizzando il tempo richiesto per la procedura di taglio.
- Impostare lo spessore di 300 μm e iniziare affettare. Una volta che la lama ha oltrepassato la corteccia, utilizzare una lama di rasoio o con un ago piegato tagliare sopra l'ippocampo e ai bordi dell'area corticale di interesse.
- Mettere le fette in una camera di incubazione più ben tenute a 32-34 ° C.
- Ritrarre la lama e ripetere i punti 2.3.2 e 2.3.3 fino a 5-8 fette sono tagliate. I migliori fette di solito sono quelli in cui i vasi sanguigni sono parallele alla superficie.
- Incubare le fette per 30 minuti dopo l'ultima fetta viene posto nella camera.
3. patch-clamp registrazioni da Layer 5 piramidali neuroni
- Mettere una fetta nella camera di registrazione e la ricerca di cellule sane. Queste cellule hanno solitamente minore contrasto, un aspetto liscio e non sono gonfiate.
- Controllare la fetta al microscopio con lente di ingrandimento 40X e la ricerca di cellule in strato 5, situato a circa 600 a 1000 micron dalla superficie del cervello. Una volta che un cellulare adeguata viene trovato, carico un terzo del micropipetta con ICS e inserirlo nella headstage.
- Sul personal computer che esegue il live CD o il sistema operativo pre-configurato Linux, avviare una shell di comando (per esempio, bash), e al suo prompt il comando LCG-zero. Questo assicura che la scheda DAQ non guida l'amplificatore.
- Applicare 30 - 50 mbar di pressione positiva premendo sul pistone di una siringa comune, connesso con un tubo al titolare pipetta e, con l'aiuto del microscopio, posizionare la pipetta circa 100 micron sopra la fetta.
NOTA: Posizionare la pipetta in una posizione che consente un percorso diretto alla cella di destinazione, preferibilmente utilizzando la modalità di approccio micromanipolatore. - Agendo sui comandi dell'amplificatore elettrofisiologia, regolare la pipetta offset e uscita un impulso di prova (10 mV) in modalità voltage clamp.
- Ridurre la pressione a 10 - 30 mbar (a seconda delle dimensioni pipetta) ritirando ilpistone della siringa; avvicinare delicatamente la cella e controllare la formazione di una fossetta osservando l'immagine sul monitor telecamera. Monitorare l'impulso di prova per un aumento di resistenza in ogni momento, osservando la forma d'onda corrente visualizzata sull'oscilloscopio collegato all'amplificatore elettrofisiologia (in alternativa è possibile utilizzare il LCG-seal-test comando per monitorare la resistenza pipetta).
- Rilasciare la pressione e, se necessario applicare una leggera pressione negativa alla pipetta per aiutare la formazione della guarnizione quando si nota un aumento della resistenza pipetta e la formazione di un 'fossetta' sulla cella.
- Mentre le forme di tenuta, gradualmente diminuire il potenziale tenendo a -70 mV.
- Una volta ottenuto un sigillo gigaohm, assicurarsi che la corrente di mantenimento è compresa tra 0 - 30 pA. Applicare brevi impulsi di pressione negativa (aspirazione) per rompere la membrana e stabilire la cellula intera configurazione. In alternativa, è possibile iniettare impulsi forti e brevi di tensione (
- Passare alla modalità pinza e verificare che il potenziale di membrana è tipico di una cellula sana. Per neuroni piramidali corticali utilizzando una soluzione basata su potassio gluconato, questo valore è di solito tra -65 e -75 mV.
4. Caratterizzazione semiautomatica delle Proprietà risposta elettrica di un neurone
- Creare una directory per memorizzare i dati dell'utente. Per fare questo l'impiego di uno script incluso nel LCG live CD che crea cartelle in base alla data. Per usarlo, digitare al prompt dei comandi
cd ~ / esperimenti
LCG-creare-esperimento-folder -s psp, in_vivo_like
Questo creerà una cartella in cui verranno salvati i dati per tale cella (e un 'psp' e 'in_vivo_like' sottocartelle) e si stamperà il suo nome al terminalefinestra; è anche possibile memorizzare informazioni aggiuntive quali la resistenza pipetta e tipo cellulare utilizzando questo script. - Cambiare la directory nella cartella appena creata utilizzando il comando
cd ~ / <nomecartella>
Il nome della cartella è quella visualizzata dal comando LCG-creare-esperimento-cartella e avrà il timestamp del giorno corrente (cioè, anno-mese-giorno), come in 20140331A01. - Assicurarsi che l'amplificatore è impostato per operare in modalità pinza, che i cavi siano collegati e il comando di tensione esterna dell'amplificatore, se presente, è abilitato.
- Digitare il comando LCG-ecodeat prompt dei comandi. Ciò richiede una serie di comandi (cioè LCG-ap, LCG-vi, LCG-ramp, LCG-tau e LCG-gradini), usato per caratterizzare le proprietà di risposta di base della cellula. LCG-ecode richiede che l'utente specifica due parametri: l'ampiezza del 1 ms lungo impulso di corrente utilizzato per sollecitare un singolo picco nella cella, e l'ampiezza massima della memoria RAM attualep iniettata nella cellula per trovare la sua reobase.
Utilizzare la seguente sintassi dei comandi:
LCG-ecode --pulse ampiezza X --ramp ampiezza Y
con una scelta dei valori X e Y (in pA) che sono sufficienti per il fuoco cellulare in risposta ad un 1 ms impulso lungo e un'iniezione di corrente costante, rispettivamente.
NOTA: Questi protocolli richiedono di eseguire la stima numerica del 'elettrodo kernel' per utilizzare Active elettrodo di compensazione (AEC) 15. Una iniezione di corrente rumorosa viene utilizzato per stimare il kernel e all'utente viene richiesto di confermare il numero di campioni che compongono il kernel. Vedere 15 per informazioni dettagliate sul significato del kernel dell'elettrodo e come scegliere il numero di campioni del kernel.
5. L'iniezione di conduttanza attraverso simulate Sinapsi e Simulazione di In Vivo -come Background Attività
- Iniezione di simulati eccitatori potenziali post-sinaptici
- Passare alla directory in cui si desidera salvare il prossimo esperimento, digitando il seguente comando al prompt dei comandi della shell:
cd psp / 01 - Copiare un file di configurazione LCG nella directory corrente e aprirlo con un editor di testo (Nano in questo esempio) digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell (questo file di configurazione di esempio è incluso nel codice sorgente e il cd live) :
cp ~ / local / src / LCG / configurazioni / epsp.xml
nano epsp.xml
NOTA: Questo è semplicemente un file di testo con diverse entità collegate tra loro. Per maggiori dettagli si veda la sezione risultati rappresentativi. - Se necessario, modificare il inputChannel, outputChannel, il inputConversionFactor e outputConversionFactor in questo file in modo che corrisponda la configurazione dell'utente.
- Calcolare il kernel elettrodo necessaria per effettuare la compensazione elettrodo attivo 'il metodo utilizzato da LCG effettuare elettrodo singolo morsetto dinamico' eseguendo il command
LCG-kernel
Ciò richiederà il numero di punti nel kernel. Ancora una volta, selezionare un numero in modo che il kernel dell'elettrodo copre l'estremità della coda di decadimento esponenziale. - Eseguire l'esperimento morsetto dinamico usando il comando
LCG-esperimento epsp.xml -c - Elencare i file e visualizzare i risultati utilizzando il comando
ls -l
LCG-plot--f file scorso
- Passare alla directory in cui si desidera salvare il prossimo esperimento, digitando il seguente comando al prompt dei comandi della shell:
- Iniezione di simulati inibitori potenziali post-sinaptici
- Creare una cartella e copiare il file epsp.xml per digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Modificare il file di configurazione utilizzando un editor di testo: cambiare il potenziale di inversione sinaptica e salire e tempo di decadimento costanti del Exp2Synapse modello di sinapsi al seguente:
parametri>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<parametri>
Chiudere l'editor di testo. - Calcola il kernel elettrodi ed eseguire l'esperimento, come in 5.1, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
LCG-kernel
LCG-esperimento ipsp.xml -c - Elencare i file e visualizzare i risultati, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
ls -l
LCG-plot--f file <filename.h5>
- Creare una cartella e copiare il file epsp.xml per digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
- Simulazione in vivo -come attività di fondo:
- Passare alla directory in cui si desidera salvare il seguente esperimento, come precedentemente indicato, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
cd ../../in_vivo_like/01 - Copiare il file di configurazione dalla directory di origine LCG, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
cp ~ / local / src / LCG / configurazioni / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Regolare i parametri di configurazione DAQ per il setup degli utenti, come descritto in 5.1.3 e uscire dall'editor.
- Calcola il kernel elettrodi ed eseguire l'esperimento, come in 5.1, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
LCG-kernel
LCG-esperimento in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3
I '-n 10' e '-i 3' interruttori indicano che la stimolazione deve essere ripetuta 10 volte ad intervalli di tre secondi. - Visualizzare le tracce prime utilizzando il seguente comando al prompt dei comandi della shell:
LCG-plot--f file tutto
- Passare alla directory in cui si desidera salvare il seguente esperimento, come precedentemente indicato, digitando i seguenti comandi al prompt dei comandi della shell:
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Representative Results
Nelle sezioni precedenti, abbiamo descritto come utilizzare il software LCG casella degli strumenti per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche delle cellule piramidali L5 e di ricreare in vivo -come attività sinaptica in un preparato fetta. L'uso di una riga di comando e protocollo semi-automatizzato favorire la riproducibilità e l'efficienza di questo esperimento, che può avere un forte impatto sul rendimento e la qualità dei dati prodotti. Inoltre, poiché i dati vengono salvati in modo coerente, è facile estendere l'analisi ad un particolare obiettivo. La Figura 1 mostra il tipico risultato di un esperimento in cui sono stati caratterizzati proprietà elettrofisiologiche di base di una cella utilizzando sei protocolli distinti.
Misurazione del potenziale d'azione forma e soglia (Figura 1A): una breve e forte impulso di corrente depolarizzante viene iniettato per misurare il potenziale forma azione media. La soglia di picco ècalcolato come il primo picco del terzo derivata del potenziale d'azione 24. Misurazione della curva tensione-corrente (Figura 1B): impulsi di corrente sotto soglia vengono iniettati nella cellula, permettendo la misurazione delle proprietà di risposta passivi come resistenza di ingresso e la caratterizzazione di sub-soglia correnti ioniche.
Misura della corrente minima sufficiente per suscitare sostenuta cottura (Figura 1C). La rampa di corrente iniettata consente per la caratterizzazione della cellula come tipo I o tipo II oscillatore 25. Misurazione della curva (Figura 1D) frequenza-corrente (FI): la corrente iniettata è una funzione della frequenza di attivazione istantanea e viene aggiornato ogni volta che le punte delle cellule, utilizzando il protocollo a circuito chiuso descritto in 5. Usando questa tecnica, una stima affidabile della curva fI può essere ottenuto in meno di 30 sec. Misura della membrane costante di tempo (Figura 1E): un breve impulso di corrente iperpolarizzante viene consegnato per misurare le proprietà di rilassamento passive della membrana. Questo impulso è quindi adatta ad un doppio esponenziale per calcolare il tempo di membrana costante (44 ms in questo caso).
Coefficiente di adattamento e risposta alla corrente depolarizzanti (Figura 1F): due valori soprallimitare di corrente vengono iniettati per misurare il coefficiente di adattamento (rapporto tra il primo e l'ultimo intervalli inter-picco). L'applicazione automatizzata di una serie di protocolli come quelli descritti consente caratterizzare ogni cella registrata in termini delle sue principali proprietà elettrofisiologiche e costituisce il passo fondamentale per qualsiasi sforzo volto a confrontare diversi tipi di neuroni e il loro ruolo, sia in salute e malattia.
Sebbene LCG contiene diversi script che implementano i protocolli specializzati, la maggior parte della potenza e la flessibilità della casella degli strumenti risiedonos nella capacità di descrivere esperimenti per mezzo di file di configurazione. In Sec. 5 è descritto come eseguire clamp dinamico iniettare simulato attività background nel neurone. Qui viene introdotto il concetto di file di configurazione e le entità. Un file di configurazione è semplicemente un file di testo contenente i nomi e le interconnessioni di tutti i componenti di base (chiamate entità) che sono necessari per l'esecuzione di un dato esperimento; per questo motivo, la progettazione di nuovi paradigmi da enti di collegamento è un compito relativamente facile, come è la condivisione e il riutilizzo di paradigmi sperimentali. Nell'esperimento mostrato in Figura 2, sono utilizzati cinque soggetti:
H5Recorder: registra le entità collegate ad un file compresso. Il formato di file HDF5 è stato scelto in quanto è supportato dalla maggior parte dei linguaggi di programmazione come Python e MATLAB.
RealNeuron: fornisce un livello di astrazione per l'aspetto tecnico del real-time recondo e iniezione. Contiene le informazioni relative alla scheda di acquisizione dati ed esegue la compensazione elettrodo attivo on-line. Quando un potenziale di azione viene rilevato dal superamento della soglia, reale Neuron emette anche un picco nella forma di un evento: questo può essere utilizzato ad esempio per monitorare la frequenza di scarica durante l'esperimento o di interfacciarsi con sinapsi artificiali.
Poisson: genera treni di impulsi a seguito di una distribuzione esponenziale con un tasso particolare. Il seme di questo processo può essere fissato in modo che le prove possono essere riprodotti in modo coerente.
SynapticConnection: riceve le punte dal generatore e li trasmette alla sinapsi appropriato dopo un certo ritardo.
Exp2Synapse: modello di un doppio sinapsi esponenziale. Contiene il potenziale di inversione e l'aumento e decadimento costanti di tempo.
Come accennato in precedenza, ogni entità è collegato ad uno o più altri to comporre un esperimento. Nell'esempio della simulazione di una corrente post-sinaptica eccitatoria descritto in Sez. 5.1, sia il RealNeuron e Exp2Synapse sono collegati al H5Recorder, salvare in un file di tensione e corrente di membrana sinaptica, rispettivamente. L'entità Poisson eroga picchi generati con una frequenza di 2 Hz al SynapticConnection, che a sua volta fornisce gli eventi al Exp2Synapse dopo 1 ms. Infine, l'entità Exp2Synapse è collegato al RealNeuron. Utilizzando piccole variazioni di questo file di configurazione, come mostrato in sec. 5.2 e 5.3, si possono simulare le correnti inibitorie e ricreare in vivo -come attività.
In figura 2 è mostrato come, tramite una configurazione clamp dinamico, si può studiare integrazione sinaptica in modo controllato simulando la corrente indotta in un neurone sinapsi artificiali. Figura 2A (alto) mostra i singoli potenziali postsinaptici (top ) insieme al injCorrenti ette. Rosso (blu) tracce indicano eccitatorie eventi (inibitori). Si noti che la corrente iniettata è una funzione del potenziale di membrana e della variazione di conduttanza associata all'attivazione della sinapsi virtuale.
Fornendo treni Poisson picco a frequenze più elevate per le sinapsi, in vivo -come attività sfondo può essere simulato (Figura 2B e 2D). Anche durante spiking quando grandi correnti sono iniettati (traccia nera nella parte inferiore della Figura 2B), le garanzie di compensazione dell'elettrodo attivo che la forma delle punte non è influenzata (Figura 2C), anche se un singolo elettrodo è utilizzato per iniettare simultaneamente corrente e registrare il potenziale di membrana. Ripetendo più prove con le stesse forme d'onda conduttanza permette estendere il lavoro di 23 a un quadro più realistico, rendendo possibile separare i contributi di diversa synapticorrenti c affidabilità e la precisione dei tempi picco.
La figura 3 mostra un semplice esempio di rete ibrida, ottenuto registrando contemporaneamente da due cellule piramidali scollegati e utilizzando un GABAergica interneurone virtuale per simulare una forma di inibizione disynaptic, un meccanismo diffuso che nella corteccia cerebrale comporta l'attivazione di cellule Martinotti. 26, 27 Figura 3A mostra uno schema del setup sperimentale: una coppia di reali, non collegati cellule piramidali (triangoli nero e rosso) è artificialmente collegata attraverso una simulazione GABAergico interneuroni, modellato come un neurone che perde l'integrazione e il fuoco. La sinapsi che collega la cellula piramidale presinaptica ai display degli interneuroni facilitazione homosynaptic breve termine attuata secondo il modello Tsodyks-Markram 28, mentre la sinapsi che collega il interneuroni e la cellula piramidale postsinaptica è una sinapsi biesponenziale con ascesa e decadenza timi costanti di 1 e 10 ms, rispettivamente.
I pesi di entrambe le connessioni sono state regolata per avere una deflessione nel potenziale di membrana postsinaptica di circa 2 mV. Figura 3B e 3C mostrano la risposta del piramidale neurone presinaptico ad un treno di impulsi intracellulari consegnati a 90 Hz e il EPSPS nel simulato interneurone:. i parametri della connessione sinaptica sono stati adeguati in modo da avere il neurone artificiale emettono un picco dopo un burst presinaptica di 3 - 4 picchi ad alta frequenza, come riportato sperimentalmente 26,29 figura 3D mostra l'effetto di inibizione sulla disynaptic il vero cellule piramidali postsinaptica:. 10 prove si sovrappongono, in cui il neurone viene stimolato con congelati vivo -come attività background in analoga a quella descritta in figura 2 Nota l'aumento di affidabilità in risposta ai tre IPSPs inibitori,riflesso nel picco jitter piccolo dopo l'attivazione della cellula inibitoria, come indicato dalle linee rosse sotto le tracce di tensione.
Figura 1. Caratterizzazione elettrofisiologica di un rattoppato L5 Piramidale neuroni figura di uscita del protocollo e-codice per una tipica cellula piramidale.; quantificazioni vengono eseguiti automaticamente e non sono necessarie ulteriori modifiche. (A) Calcolo del potenziale limite d'azione (linea tratteggiata -50,5 mV). La linea rossa è il potenziale forma di azione media. (B) Misura della risposta passiva (in alto) per le correnti iperpolarizzanti (in basso). (C) Risposta ad una crescente corrente per misurare la corrente reobase (123 pA) depolarizzante. (D) frequenza di emissione in funzione della corrente iniettata, misurata usando un approccio a circuito chiuso. Ogni punto di grigio è situato in coppia(Corrente iniettata, inversa dell'intervallo interspike). La curva rossa è la misura lineare ai punti di dati e la linea tratteggiata indica il reobase misurata a pannello (C). (E) Misura del tempo membrana costante (43,8 ms). (F) Identificazione delle proprietà attivi di base della cella rivela che la cellula è un regolare neurone chiodare e che non vi è l'adattamento minimo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Ricreazione di in vivo- come attività utilizzando morsetto dinamico. (A) Simulazione di eccitatori (rosso, Sez. 5.1) e inibitorio (blu, Sez. 5.2) sinapsi, tracce grigie sono altre realizzazioni dello stesso esperimento. (B ) (C) Forme dei picchi durante l'esperimento in (B). (D) Raster trama picchi generati attraverso 20 prove dimostra che il neurone può essere estremamente affidabile e preciso in risposta allo stesso ingresso come si è visto nel 23. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Simulazione di inibizione disynaptic tramite un interneurone inibitorio simulato (A) Schema del setup di registrazione:. Le piramidi nere e rosse rappresentano una coppia di celle reale piramidali registrati simultaneamente. Nero e rosso indicano neurone presinaptico e postsinaptico, rispettivamente. Il cerchio blu rappresenta un interneurone GABAergico virtuale, contattato dalla cellula piramidale nera, che a sua volta inibisce la cellula piramidale rossa. (B) Risposta del reale piramidale neurone presinaptico ad un treno di impulsi erogati ad una frequenza di 90 Hz, indicata dal i trattini arancioni sopra la traccia di tensione. I trattini neri sotto la traccia di tensione indicano i potenziali d'azione volte sono stati emessi dalla cellula presinaptica. (C) Risposta del interneurone simulato al treno di picchi emessi dalla cellula presinaptica. (D)Sovrapposizione di 10 tracce tensione registrati dal vero cellula piramidale postsinaptica in risposta all'attivazione del interneurone simulato. La cellula post-sinaptica è stata stimolata con congelato in vivo -come attività di fondo, per ottenere una dinamica di tensione affidabili. I trattini rossi sotto le tracce di tensione indicano le volte in cui, durante gli studi successivi, i neuroni postsinaptici emessi un potenziale d'azione. Si noti la maggiore precisione dopo l'attivazione del interneurone, indicato da un jitter picco più basso in tutti gli studi.
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Discussion
In questo testo un protocollo completo per la realizzazione di tempo reale, ad anello chiuso monocellulari esperimenti elettrofisiologici è stata descritta, con la tecnica patch clamp e strumenti software recentemente sviluppato chiamato LCG. Per ottimizzare la qualità delle registrazioni è fondamentale che il sistema di registrazione sia correttamente messa a terra, schermato e vibrazioni: questo garantisce l'accesso stabile e duratura whole-cell alla cella, che, insieme con la possibilità di automatizzare intere sezioni dei protocolli di stimolazione , permette di massimizzare la velocità dell'esperimento.
Due casi in cui LCG può essere applicata sono state presentate, cioè la caratterizzazione di una cella in termini di proprietà elettrofisiologiche (Figura 1), compreso il calcolo veloce della attiva rapporto input-output di un neurone, e la ricreazione in vivo -come attività in una fetta cerebrale (Figura 2). Such applicazioni hanno mostrato come costruire protocolli distinti e hanno evidenziato alcune delle caratteristiche più importanti di LCG: la sua interfaccia a riga di comando, è adatto per lo scripting, che consente l'applicazione automatica di una serie di protocolli. Inoltre, come è stato fatto in Figura 1, valori estratti da un protocollo può essere utilizzato per i parametri di misura protocolli successivi.
È possibile monitorare in tempo reale le caratteristiche di ordine superiore della risposta della cella in esame (per esempio, il suo tasso di cottura istantanea, come mostrato nella Figura 1D) e modificare la stimolazione di conseguenza, ad esempio utilizzando un controllore PID per calcolare la corrente necessaria per mantenere una velocità di fuoco costante o variabile nel tempo.
L'implementazione di protocolli di conduttanza e clamp dinamico con LCG è semplice e richiede solo la scrittura di un file di testo, una procedura che può essere automatizzato dall'uso di sscript cuzione. LCG comprende oltre 30 entità che possono essere collegate a elaborare nuovi protocolli sperimentali. Abbiamo descritto come utilizzare LCG utilizzando un'interfaccia a riga di comando, ma un lanciatore esperimento grafico è stato progettato per facilitare iniziare gli esperimenti e la modifica dei parametri, consentendo agli utenti non esperti combinano comandi LCG per creare le proprie interfacce grafiche.
Due cassette esistenti offrono funzionalità simili a LCG: RELACS e RTXI. Il primo è sia una piattaforma per l'esecuzione di esperimenti di elettrofisiologia e per l'analisi e l'annotazione dei dati registrati. La differenza principale tra LCG e soluzioni esistenti è la sua interfaccia utente basata su una riga di comando. I vantaggi di questo approccio sono molteplici: prima di tutto, una interfaccia a riga di comando consente l'automazione delle operazioni standardizzate e ripetitive per mezzo di script possibilmente complessi e in secondo luogo, permette di incorporare prove sperimentali in flussi di lavoro più complessi realizzatiin linguaggio di scripting di alto livello, come Matlab o Python.
In sintesi, la modularità del LCG permette ampliare il numero di protocolli sperimentali disponibili in due modi: la prima e più semplice è quella scrivendo file di configurazione ad hoc che utilizzano gli oggetti esistenti per eseguire nuovi protocolli. La seconda è implementando - C ++ - nuovi oggetti elementari che possono essere utilizzati per ampliare ulteriormente le funzionalità e le caratteristiche di LCG. Gli esempi presentati in questo protocollo riguardano lo studio delle singole cellule in fettine di cervello. Tuttavia, i protocolli simili possono anche essere impiegati con successo in preparati in vivo, di registrare sia i segnali intracellulari ed extracellulari, e in ex vivo preparati quali colture neuronali, registrare, ad esempio, i potenziali extracellulari attraverso array multi-elettrodo stimolando in chiuso- loop 4.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
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