Abstract
実験的神経科学は、新規の開発と応用への関心の高まりを目撃し、多くの場合、複雑な刺激が、システムの応答にリアルタイムに依存する適用、閉ループプロトコルれます。最近のアプリケーションは、光遺伝学3を使用して、皮質脳卒中後の発作の制御に、マウス1とゼブラフィッシュ2の両方の運動反応を研究するための仮想現実システムの実装の 範囲です。閉ループ技術の重要な利点は、直接アクセスすることはできませんまたは、同時に実験スループットを最大化しながら、このような神経細胞の興奮4や信頼性などの複数の変数に依存し、より高い次元の特性を探査する能力にあります。この貢献ではと細胞電気生理学との関連で、我々はREC、錐体皮質ニューロンの応答特性の研究に閉ループの様々なプロトコルを適用する方法について説明します若年ラットの体性感覚皮質から急性脳スライスにおけるパッチクランプ法で細胞内orded。何の市販またはオープンソースソフトウェアを効率的にここに記載の実験を行うために必要なすべての機能を提供しないように、LCG 5と呼ばれる新しいソフトウェアツールボックスは、そのモジュラー構造のコンピュータ·コードの再利用を最大化し、新たな実験パラダイムの実装を容易に、開発されました。刺激波形は、コンパクトなメタ記述を使用して指定されており、完全な実験プロトコルは、テキストベースの設定ファイルに記述されています。さらに、LCGは、試験の反復と実験プロトコルの自動化に適しているコマンドライン·インタフェースを備えています。
Introduction
近年、携帯電気生理学は、近代的な閉ループプロトコルに電圧および電流クランプ実験に用い、従来のオープンループパラダイムから進化してきました。最もよく知られている閉ループ技術は、おそらく神経細胞膜電位8を決定するために人工的な電位依存性イオンチャネルの合成注入を可能に動的クランプ6,7であり、非決定論的には、フリッカの影響の詳細な研究神経応答のダイナミクス9、ならびにシナプス背景活動10のようなvivo-で現実的なのin vitroでのレクリエーションのイオンチャネル。
提案されている他の閉ループパラダイムは、 インビトロ自立持続的活動の発生、及び応答は細胞機構を下にある神経細胞の興奮性を調査するために、4,12をクランプを研究するために、反応性クランプ11を含みます。
ontent ">ここでは、急性脳スライスで行われる全細胞パッチクランプ記録のコンテキストで閉ループ電気生理学の様々なプロトコルを適用することができる強力なフレームワークを記述している。我々は、パッチクランプ記録を用いて体細胞膜電圧を記録する方法を示しています若年ラットの体性感覚野からの錐体ニューロンでLCG、理論神経生物とNeuroengineeringの研究室で開発されたコマンドラインベースのソフトウェアツールボックスを使用して、3つの異なる閉ループプロトコルを適用します。簡単に言えば、記載されたプロトコルは、アクティブおよびパッシブ膜特性の大きな集合の特性に関連する、電流クランプ刺激波形のシリーズの最初の自動注入されています。これらは、刺激波形の定型一連の応答特性の点で細胞の電気生理学的表現型を捕捉するために提案されています。セルの電子コードとして知られている（ 例えば 、参照してください＆＃160; 13,14）が 、電気的応答のようなコレクションは、客観的に、それらの電気的特性に基づいて神経細胞を分類するためにいくつかの研究室で使用されます。これは、比例積分微分（PID）コントローラにより発火の速度の閉ループリアルタイム制御を含む革新的な技術によって、固定入出力伝達関係（FI曲線）の分析が含まれ、第二のインビトロ製剤10と、コンピュータでシミュレートされた仮想のGABA作動性介在ニューロンの手段により2同時に記録錐体ニューロンのリアルタイムで第人工接続で現実的なインビボの様な背景シナプス活性のレクリエーション。
さらに、LCGは、単一の電極を用いたダイナミッククランププロトコルを実装することができ、活性電極報酬（AEC）15、として知られる技術を実装しています。これは望ましくない影響を補償することができます（Aそれは、細胞内刺激を送達するために使用される場合に生じる記録電極のrtifacts）。この方法は、記録回路の等価電気特性のノンパラメトリック推定に基づいています。
このホワイトペーパーに記載された技術と実験プロトコルは、容易に従来のオープンループ電圧と電流クランプ実験に適用することができ、 生体内 17,18 に 、このような細胞外4,16のような他の製剤、または細胞内記録に拡張することができます。全細胞パッチクランプ電気生理学のセットアップの注意深いアセンブリは安定した高品質の記録のために非常に重要なステップです。以下では、そのような実験は、実験者に既に利用可能であることを前提とし、LCGの使用法を説明する上で私たちの注意を集中します。読者は、最適化とデバッグに関する追加のヒントについては、19〜22に指摘されています。
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Protocol
ここで説明するプロトコルは、アントワープ大学の医歯薬学総合研究科の倫理委員会の勧告やガイドラインに準拠しています。このプロトコルは、承認された人道的な安楽死法により得られた幼若Wistarラットの外植脳からの非知覚材料の準備が必要です。
1.機器の準備
- データ収集と刺激システムをインストールして設定します。
- 信号を記録し、電気生理学的アンプにアナログ制御電圧を送信するためにCOMEDIでサポートされているデータ集録（DAQ）カードを搭載したパーソナルコンピュータ（PC）を使用します。
注：詳細についてはhttp://www.comedi.orgを参照してください。COMEDIは、最も一般的なメーカーからDAQカードの多くをサポートし、Linuxのモジュールとライブラリです。 - コンピュータ制御パッチクランプ増幅器が使用中である場合には、アンプ専用の1以外の第二のPCを使用しますコントロール。
注：後者は、従来のオペレーティングシステムを実行することができるが、余分なPCは特別なオペレーティングシステムによってリアルタイムで動作します。これらの条件の下では、専用のPCにリモートデスクトップアプリケーションで接続している間、余分なPCに接続された単一のモニタ、マウス、キーボードを使用すると便利です。 - 「LCGはhttp://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.isoからプリインストールして、リアルタイムLinuxオペレーティング·システムを含むライブCDのISOイメージをダウンロードして、空のCDまたはUSBスティックにそれを燃やします。
- 単にDAQカードを含むPCのドライブにCDを挿入し、それを起動します。代わりに、Linuxオペレーティングシステム（ 例えば、DebianやUbuntuを使用）を実行しているPC上のオンラインソースリポジトリからLCGをインストールしてください。インストール手順の詳細については、オンラインマニュアルを参照してください。マニュアルはhttp://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdfからオンラインで入手できます。
- ライブCDから起動：THISは自動的に完全に構成されたシステムをロードします。これを行うには、コンピュータのCD-ROMドライブにLCGのLive CDを置いて、CDからコンピュータを起動します。起動メニューが表示されるとすぐにリアルタイム·カーネル（デフォルトオプション）を選択し、システムが初期化されるまで待ちます。
- コマンドプロンプトで次のように入力してDAQカードのキャリブレーション：
sudoのcomedi_calibrate
または
sudoのcomedi_soft_calibrate
データ収集ボードはそれぞれ、ハードウェアまたはソフトウェアのキャリブレーションをサポートしているかどうかに応じて（ボード上の情報を取得するには、コマンドはsudo comedi_board_infoを使用します）。 - 適切なアナログ - デジタルおよびデジタル - アナログ変換係数を設定します。これは、細胞電気アンプのマニュアルに、特にその変換係数上の仕様にアクセスする必要があります。
- 環境変数のため、ファイル/home/user/.lcg-envに適切な数値を指定するには、テキスト·エディタを使用しAI_CONVERSION_FACTOR_CC、AI_CONVERSION_FACTOR_VC、AO_CONVERSION_FACTOR_CC、AO_CONVERSION_FACTOR_VC。
注：これらは、電流クランプ（CC）とクランプ電圧（VC）モードの入力（AI）および出力（AO）のゲインを示し、計算機によって供給される電圧指令とアンプにより生成される電流または電圧の変換係数、それぞれ。 - 代わりに、彼または彼女のシステムの変換係数を見つけるために、（LCG-見つける変換因子）が提供LCGスクリプトを使用します。
注：によって計算された値LCG-見つける変換因子は、ある場合には数値的に切断されたことが要求または変換係数の正確な値を反映するように丸みを帯びているの推測です。 - LCG-見つける変換因子を使用するには、多くの場合、対応するヘッドステージにアンプを購入した」モデルセルを「接続することから始めます。そして、あなたはライブCDを実行しているLinuxマシン上でターミナルを開き、シェルプロンプトで次のコマンドを入力します。
セントルシアG-見つける変換因子-iの$ HOME / .lcg-ENV -o $ HOME / .lcg-ENV
注：両方の場合において（ すなわち、手動/home/user/.lcg-envまたはLCG-見つける変換因子の使用の変更）、閉じて、変更を有効にするには、端末を開きます。 - 複数のヘッドステージを使用する場合は、すべてのチャネルで同じ値に換算係数を設定します。それが不可能な場合は、より優れたユーザーのニーズに合わせた設定ファイルを生成するためにLCG-刺激または方法で複数の変換係数を使用する方法を理解するためのLCGのオンラインマニュアルを参照してください。
- 信号を記録し、電気生理学的アンプにアナログ制御電圧を送信するためにCOMEDIでサポートされているデータ集録（DAQ）カードを搭載したパーソナルコンピュータ（PC）を使用します。
体性感覚皮質から急性脳スライスの作製
- 電気生理学のためのソリューションの準備。
- （MMで）混合することによって、人工脳脊髄液（ACSF）を準備125のNaCl、2.5のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、25グルコース、2のCaCl 2、および1のMgCl 2。減少させるために10倍のストック溶液を調製します実験の日に準備時間。 1スライスの準備と記録のために他のために使用されるの2 Lを、準備します。
- 手順の開始前に少なくとも30分間、95％O 2および5％CO 2でのACSFを飽和させます。
- 現在のクランプ記録のために、（MMで）115 K-グルコン酸、20のKCl、10 HEPES、4 ATP-Mgを、0.3-GTP 2のNa、10のNa 2 -phosphocreatineを含む細胞内液（ICS）を使用します。氷の中の溶液を調製し、ピペットを詰まらせる危険性を排除するために録音の開始に先立って、それをフィルタリングします。
- 脳抽出。
- 4％イソフルランで誘導チャンバ内に動物を置く動物を麻酔し、急速にギロチンや大きなハサミを使用して首を切ります。
- 正中線に沿って皮膚をカットし、耳にそれをスライドさせます。
- はさみの罰金ペアを使用すると、正中線に沿って頭蓋骨を切りました。目にできるだけ近いブレードを保ちますE面は、下にある脳の損傷を最小にするように。 、ピンセットで頭蓋骨を開き、視神経および脳幹を切断し、穏やかに、氷冷ACSFで脳をドロップし、スパチュラを使用しています。
- 小脳とメス（ブレード24）との2つの半球を分離します。
- 2つの半球の1から過剰の水を除去し、瞬間接着剤のドロップを使用して、傾斜台上に接着。すぐに脳の上にACSFを数滴を追加し、ビブラトーム室に転送します。
注：矢状スライスを調製する場合、プラットフォームの角度は、スライス手順中に錐体細胞の樹状突起の損傷を避けることが重要です。
- 切片の調製。
- 脳の上にブレードを置き、最初の2.5捨てる - 3ミリ。スライス手順に必要な時間を最小化すると同時に、スライスの表面への損傷を制限するために、速度と周波数を調整します。
- 300μの厚さを設定しますMとスライスを開始します。ブレードは皮質を過ぎてしまった後は、海馬の上、対象の皮質領域の端で切断するためにカミソリの刃や曲がった針を使用しています。
- 34℃ - マルチウェルインキュベーションチャンバー内のスライスを置き、32に保ちました。
- ブレードを撤回し、5までの点2.3.2および2.3.3を繰り返す - 8スライスがカットされています。最良のスライスは、通常、血管が表面に平行であるものです。
- 最後のスライスは、チャンバ内に配置された後、30分間、切片をインキュベートします。
レイヤ5錐体ニューロンから3パッチクランプ記録
- 記録チャンバー内のスライスを置き、健康な細胞を検索します。これらの細胞は、通常より低いコントラスト、滑らかな外観を持ち、腫れはありません。
- 40X倍率レンズを顕微鏡下でスライスを点検し、層5のセルを検索し、脳の表面から約600〜1000ミクロンに位置します。 適切なセルが検出されると、ICSとのマイクロピペットの負荷三分の一とは、ヘッドステージに配置します。
- ライブCDまたは事前設定されたLinuxオペレーティングシステムを実行しているパーソナルコンピュータでは、コマンドシェル（ 例えば 、bashの）を起動し、そのプロンプトでコマンドLCGゼロ。これは、DAQボードがアンプを駆動していないことを保証します。
- ピペットホルダーにチューブと、顕微鏡の助けを借りて、約100μmのスライスの上にピペットを配置することにより、接続された共通の注射器のピストンを押すことによって正圧の50ミリバール - 30を適用します。
注：好ましくは、マイクロマニピュレータのアプローチモードを使用して、標的細胞への直接ルートを可能にする位置にピペットを置きます。 - コントロールに電気増幅器を演じる、オフセットピペットおよび出力電圧クランプモードでのテストパルス（10 MV）を調整します。
- 吸引によって30ミリバール（ピペットサイズに応じて） - 10に圧力を低下させます注射器のピストン。優しく細胞に近づき、ビデオカメラのモニターに画像を観察することによりディンプルの形成を確認してください。電気アンプ（あるいはあなたがピペットの抵抗を監視するためのコマンドLCGシールテストを使用することができます）に接続されたオシロスコープに表示された電流波形を見て、すべての回で抵抗の増大のための試験パルスを監視します。
- 圧力を解放し、必要に応じて、ピペット抵抗の増加と細胞の「ディンプル」の形成に気づくとき、シール形成を助けるために、ピペットに緩やかな負圧を適用します。
- シール形が、徐々にmVのを-70する保持電位を低下させます。
- ギガオームのシールが得られると、保持電流が0の間であることを確認 - pAの30。膜を破壊し、全細胞構成を確立するために、負圧（吸引）の短パルスを適用します。代わりに、（電圧の強力かつ簡単にパルスを注入することができます
- 電流クランプモードに切り替えて、静止膜電位は、健康な細胞の典型的なものであることを確認します。カリウム·グルコン酸系溶液を用いて、皮質錐体ニューロンの場合、この値は-65と-75 mVの間に通常です。
4.ニューロンの電気的応答特性の半自動特性評価
- ユーザーのデータを格納するディレクトリを作成します。採用にスクリプトをこれを行うために日付に基づいてフォルダを作成しますLCGライブCDに含まれています。コマンドプロンプトで、タイプを、それを使用するには、
CD〜/実験
LCG作成-実験フォルダ-s PSP、in_vivo_like
これは、そのセルのデータが保存されたフォルダ（およびサブフォルダ「in_vivo_like '' PSP 'と）を作成し、それは端末にその名前を印刷します窓;そのようなピペット抵抗と、このスクリプトを使用して、細胞型などの追加情報を格納することも可能です。 - コマンドを使用して、新しく作成したフォルダにディレクトリを変更
CD〜/ <フォルダ>
フォルダ名は20140331A01のように、コマンドLCG--実験フォルダを作成し、現在の日のタイムスタンプを持つことになります（ つまり、年-月-日）で表示されるものです。 - 増幅器は、電流クランプモードで動作するように設定されていること、ケーブルが接続され、増幅器の外部電圧指令が、存在する場合は、有効になっていることを、確認してください。
- コマンドLCG-ecodeatにコマンドプロンプトを入力します。これは、細胞の基本的な応答特性を特徴づけるために使用される、一連のコマンド（すなわちLCG-AP、LCG-VI、LCG-ランプ、LCG-タウとLCG-工程）を呼び出します。セル内の単一のスパイクを誘発するために使用される現在の1ミリ秒の長パルスの振幅、および現在のラムの最大振幅：LCG-ECODEは、ユーザーが2つのパラメータを指定する必要がありますpは、その基電流を見つけるために、細胞に注入しました。
次のコマンド構文を使用します。
LCG-ECODE --pulse振幅X --ramp振幅Y
1ミリ秒の長さのパルスとそれぞれ現在の持続注入に応答して細胞の火を作るのに十分である値Xと（ペンシルバニア州）のYの選択と。
注：これらのプロトコルは、活性電極報酬（AEC）15を使用するために、「電極カーネル」の数値予測を行う必要があります。ノイズの多い電流注入は、カーネルを推定するために使用され、ユーザは、カーネルを構成するサンプルの数を確認するメッセージが表示されます。電極カーネルの意味とどのようにカーネルのサンプル数を選択することの詳細については、15を参照してください。
シミュレートされたシナプスとインビボ様背景活動のシミュレーションを通じコンダクタンスの5注射
- シミュレートされた興奮性シナプス後電位の注入
- あなたは、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、次の実験を保存するディレクトリに移動します。
CDのPSP / 01 - 現在のディレクトリにLCGの設定ファイルをコピーし、（この例のコンフィギュレーション·ファイルは、ソースコードとライブCDに含まれている）、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して（この例では、ナノ）テキストエディタで開きます：
CP〜/ローカル/ SRC / LCG /構成/ epsp.xml
ナノepsp.xml
注：これは、単にお互いに接続された複数の異なるエンティティのテキストファイルです。詳細については代表的な結果のセクションを参照してください。 - ユーザーの設定に合わせて、このファイルの必要に応じて編集inputChannel、outputChannel、inputConversionFactorとoutputConversionFactor。
- COMを発行することにより、「単一の電極ダイナミッククランプを実行するためにLCGで使用されるメソッド「活性電極補償を行うために必要な電極カーネルを計算しますマンド
LCG-カーネル
これは、カーネル内の点の数を入力するように求められます。電極カーネルは指数関数的減衰尾部の端部を覆うように、再び、番号を選択します。 - コマンドを使用して、ダイナミッククランプ実験を行います
epsp.xml -c LCG-実験 - ファイルを一覧表示して、コマンドを使用して、結果を可視化
LS -l
最後の-f LCG-プロットファイル
- あなたは、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、次の実験を保存するディレクトリに移動します。
- シミュレートされた抑制性シナプス後電位の注入
- フォルダを作成し、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、それにepsp.xmlファイルをコピーします。
MKDIR ../02
CP epsp.xml ../02/ipsp.xml
CD ../02 - テキストエディタを使用してコンフィギュレーションファイルを編集します。次に、モデルシナプスExp2Synapseのシナプス逆転電位と立ち上がりと立ち下がり時間の定数を変更します。
パラメータ>
<E> -80 </ E>
<tauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10E-3 </ tauDecay>
<パラメータ>
テキストエディタを終了します。 - 電極カーネルを計算し、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、5.1のような実験を行います。
LCG-カーネル
ipsp.xml -c LCG-実験 - ファイルを一覧表示し、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、結果を可視化します：
LS -l
LCG-プロット·ファイル-f <filename.h5>
- フォルダを作成し、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、それにepsp.xmlファイルをコピーします。
- in vivoでの様バックグラウンド活性のシミュレーション：
- 以前に示したように、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、以下の実験を保存するディレクトリに移動します。
CD ../../in_vivo_like/01 - LCGのソースディレクトリから、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、コンフィギュレーションファイルをコピーします。
CP〜/ローカル/ SRC / LCG /構成/ in_vivo_like.xml
ナノin_vivo_like.xml - 5.1.3で説明したように、ユーザーのセットアップのためのDAQ構成パラメータを調整して、エディタを終了します。
- 電極カーネルを計算し、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、5.1のような実験を行います。
LCG-カーネル
10 -i 3 -n in_vivo_like.xml -c LCG-実験
「-n 10」と「-i 3 'のスイッチは、刺激三秒の間隔で10回繰り返されるべきであることを示します。 - シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを使用して、生のトレースを可視化します：
LCG-プロットファイル-fすべて
- 以前に示したように、シェルのコマンドプロンプトで次のコマンドを入力して、以下の実験を保存するディレクトリに移動します。
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Representative Results
前のセクションでは、L5錐体細胞の電気生理学的特性を特徴づけるために、ソフトウェアツールボックスのLCGを使用して、スライス標本におけるインビボ様シナプス活性を再作成する方法を説明してきました。コマンド·ライン·インターフェースと半自動プロトコルの使用は、生成されたデータの出力および品質に大きな影響を持つことができ、実験の再現性及び効率性を好みます。データを一貫した方法で保存されているのでさらに、それは特定の目的に解析を拡張することは容易である。 図1は、6つの異なるプロトコルを使用して、細胞の基本的な電気生理学的特性が特徴付けされた実験の代表的な結果を示しています。
活動電位の形状と閾値（ 図1A）の測定：現在の脱分極の簡単かつ強力なパルスが平均活動電位の形状を測定するために注入されます。スパイク閾値であります活動電位24の第三の導関数の最初のピークとして計算。電圧-電流曲線（ 図1B）の測定：サブスレッショルド電流パルスは、入力抵抗とサブスレッショルドイオン電流の特徴付けなどの受動応答特性の測定を可能にする、細胞に注入されます。
持続的な発射（ 図1C）を惹起するために十分な最小電流の測定。現在の注入されたランプは、I型またはII型発振器25のような細胞の特徴付けを可能にします。周波数電流（FI）曲線（ 図1D）の測定：注入電流は、瞬間発射周波数の関数であり、毎回細胞スパイク更新 される、5に記載の閉ループプロトコルを使用して。この技術を使用して、FI曲線の信頼できる推定は、30秒未満で得ることができます。 membranの測定E時間（ 図1E）定数：短い過分極電流パルスは、膜の受動緩和特性を測定するために送られます。このパルスは、膜の時定数（この場合は44ミリ秒）を計算するために二重指数に適合しています。
適応係数と電流（ 図1F）を脱分極に応答して現在二超閾値は適応係数（最初と最後の間のスパイク間隔との比）を測定するために注入されます。記載されているもののような一連のプロトコルの自動化されたアプリケーションは、健康と病気の両方で、その主要な電気生理学的特性の点で記録された各セルを特徴付けることができ、異なる神経細胞の種類とその役割を比較することを目的と何の努力のための基本的なステップを構成しています。
LCGは特殊なプロトコルを実装いくつかのスクリプトが含まれていますが、ツールボックスのパワーと柔軟性のほとんどが存在します能での設定ファイルにより実験を説明します。秒で。 5はニューロンにシミュレートされたバックグラウンド活性を注入するために、動的クランプを実行する方法を説明します。ここでは、設定ファイルとエンティティの概念が導入されています。設定ファイルは、単に所定の実験を行うために必要なすべての基本的なビルディング·ブロック（と呼ばれるエンティティ ）の名前との相互接続を含むテキストファイルです。共有し、実験的なパラダイムを再利用されるように、この理由のため、エンティティを接続することにより、新たなパラダイムを設計することは、比較的簡単な作業です。 図2に示す実験では、5つのエンティティが使用されています。
H5Recorder：圧縮ファイルに接続されたエンティティを記録します。それは、PythonとMATLABなど、ほとんどのプログラミング言語でサポートされているので、HDF5ファイル形式が選択されています。
RealNeuron：リアルタイムREの技術的側面に抽象化レイヤを提供コーディングおよび注入。これは、データ収集ボードに関する情報が含まれており、オンラインの活性電極補償を行います。活動電位は、しきい値交差によって検出された場合、リアルニューロンは、 イベントの形でスパイクを出力する。これは実験中に発火率を監視するために、例えば、使用され得るか、または人工的なシナプスとインターフェースします。
ポアソン：特定のレートの指数分布に従うスパイク列を生成します。試験は一貫して再現できるように、このプロセスのシードを固定することができます。
SynapticConnection：発電機からのスパイクを受け、指定された遅延時間後に適切なシナプスに中継。
Exp2Synapse：二重指数シナプスのモデル。これは、逆転電位と立ち上がりと立ち下がり時定数が含まれています。
前述したように、各エンティティは、1つまたはそれ以上の他のTに接続されていますO実験を構成しています。章で説明した興奮性シナプス後電流のシミュレーションの例では。 5.1、RealNeuronとExp2Synapseの両方は、それぞれ、膜電位とシナプス電流をファイルに保存するには、H5Recorderに接続されています。ポアソンエンティティは、順番に1ミリ秒後にExp2Synapseにイベントを配信SynapticConnection、2ヘルツの周波数で生成されたスパイクを提供します。最後に、Exp2SynapseエンティティはRealNeuronに接続されています。秒数で示したように、この構成ファイルの小さな変化を使用。 5.2と5.3、1は、阻害電流をシミュレートし、in vivoでの様活性を再作成することができます。
図2では、それがダイナミッククランプ構成によって、一つは人工シナプスによってニューロンに誘導電流をシミュレートすることにより制御された様式でシナプス統合を研究する方法を、示されている。 図2（a）（上）は、個々のシナプス後電位を示している（トップ）一緒にINJとected電流。赤（青）トレースは興奮性（抑制性）のイベントを示しています。注入電流は、膜電圧の仮想シナプスの活性化に関連したコンダクタンスの変化の関数であることに注意してください。
シナプスに高い周波数でポアソンスパイク列を提供することにより、 インビボでの様バックグラウンド活性（ 図2Bおよび2D）をシミュレートすることができます。でも、大電流が活性電極補償保証は単一の電極が同時に電流を注入するために使用されていても、（ 図2C）のスパイクの形状が影響されないこと、（ 図2Bの底部の黒のトレース）を注入されたときにスパイク時と膜電圧を記録します。同じコンダクタンス波形と複数の試験を繰り返すことが可能異なるsynaptiの寄与を分離すること、より現実的なフレームワークに23の仕事を拡張することができますスパイクタイミングの信頼性と精度のC電流。
図3は、2つの未接続の錐体細胞から同時に記録しdisynaptic阻害の形、大脳皮質にマルティノッティ細胞の活性化を含む広範囲の機構をシミュレートする仮想のGABA作動性介在ニューロンを用いたハイブリッドネットワークの単純な例を示している。26、 27 図3Aは、実験の概略を示しています。本物の、未接続の錐体細胞（黒と赤の三角形）のペアは、人為的に、漏洩積分発火ニューロンとしてモデル化、シミュレートされたGABA作動性介在ニューロンを介して接続されています。介在ニューロンとシナプス後錐体細胞をつなぐシナプスが立ち上がりと立ち下がりTIとbiexponentialシナプスであるが、Tsodyks-Markramモデル28に従って実装介在ニューロンが表示homosynaptic短期円滑にシナプス前錐体細胞を接続するシナプス私は、それぞれ、1〜10ミリ秒の定数。
両方の接続の重みは約2 mVでのシナプス後膜電位のたわみを有するように調整した。 図3（b）及び（c）は、90 Hzで配信細胞内のパルスと、シミュレート内の対応のEPSPの列車へのシナプス前錐体ニューロンの応答を示します介在ニューロン：シ ナプス接続のパラメータが人工ニューロンを持つために調整した3のシナプス前のバースト後にスパイクを発する- 26,29 図3Dは、disynaptic抑制に効果を示し、実験的に報告されたように、高周波で4スパイク。実際のシナプス後錐体細胞：10試験が重畳され、ニューロンは、 図2で説明したものと同様の凍結のインビボ様のバックグラウンド活性を刺激したが三IPSPsの阻害に応答して、信頼性の向上に注意します電圧トレース下の赤い破線で示したように、抑制性細胞の活性化の後に小さいスパイクジッタに反映。
図1.典型的な錐体細胞の電子コードプロトコルのパッチを適用したL5錐体ニューロン出力図形の電気生理学的特性評価。定量化が自動的に実行され、それ以上の編集は必要ありません。活動電位の閾値（破線-50.5 mVの）の（A）の計算。基電流の電流（123 pAの）を測定するために、現在の脱分極が増加する。（D）焼成周波数に赤い線は平均活動電位の形状である。過分極電流（下）への受動的応答（上）の（B）の測定。（C）応答注入電流の関数として、閉ループアプローチを使用して測定しました。各グレー点をペアに配置されています（現在は、スパイク間の間隔の逆数を注入しました）。赤色の曲線はデータ点の線形近似であり、破線は、パネル（C）で測定基電流を示している。膜時定数（43.8ミリ）の（E）を測定し、セルの基本的な活性特性の（F）の同定細胞は、通常のスパイキングニューロンであることを明らかにし、最小限の適応があること。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ダイナミック·クランプを使用して、アクティビティなどにvivo-図2.レクリエーション。（A）興奮のシミュレーション（赤、秒。5.1）および阻害（青、秒。5.2）シナプスは、灰色のトレースは同じ実験の他の実現である。（B ） 、（B）で実験中のスパイクの興奮性（赤）、抑制（青）とセルに注入合計（黒）現在。（C）形状に対応する。（D）ラスタープロットニューロンが23に見られるように、同じ入力に応じて、非常に信頼性が高く、正確であることを示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
シミュレートされた抑制性介在ニューロンを介してdisynaptic阻害の図3.シミュレーション記録のセットアップの（A）は概略：黒と赤のピラミッドが同時に記録実際の錐体細胞のペアを表します。黒と赤は、それぞれ、シナプス前とシナプス後ニューロンを示しています。青い円は、順番に赤錐体細胞を阻害すること、黒錐体細胞と接触し、仮想GABA作動性介在ニューロンを表す。で示される90ヘルツの周波数で供給パルスの列に実際のシナプス前錐体ニューロンの（B）の対応、電圧トレース上記のオレンジ色のダッシュ。電圧トレース下の黒のダッシュは倍の活動電位がシナプス前細胞によって放出された示している。シナプス前細胞によって放出されたスパイクの列車にシミュレートされた介在ニューロンの（C）の対応。（D）シミュレートされた介在ニューロンの活性化に応答して、実際のシナプス後錐体細胞から記録された10の電圧トレースの重ね合わせ。シナプス後細胞は、信頼性の高い電圧のダイナミクスを得るために、凍結のインビボ様のバックグラウンド活性を刺激しました。電圧トレース下の赤いダッシュが連続した試験中に、シナプス後ニューロンは活動電位を放出され、時刻を示しています。試験全体の下位スパイクジッタによって示さ介在ニューロンの活性化の後に増加した精度が、注意してください。
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Discussion
このテキストリアルタイムの実施のための完全なプロトコルでは、閉ループ単一細胞電気実験はパッチクランプ法とLCGと呼ばれる最近開発されたソフトウェアツールボックスを使用して、説明しました。録音の品質を最適化するためには、記録の設定が正しく、接地シールドと振動しないことが重要である：これは、一緒に刺激プロトコルのセクション全体を自動化する可能性のある細胞への安定と持続的な細胞全体のアクセスを、確実に、実験のスループットの最大化を可能にします。
LCGを適用することができる2つの場合には、 インビボ様すなわちニューロンの活性な入出力関係の高速計算を含めた電気生理学的特性（ 図1）の点で細胞の特徴付け、およびでのレクリエーションを提示されています脳切片における活性（ 図2）。 SUCHアプリケーションは、異なるプロトコルを構築する方法を示し、LCGの最も顕著な特徴のいくつかを強調し、そのコマンドライン·インタフェースは、スクリプトを実行しても、それが適しています、プロトコルの一連の自動化されたアプリケーションを可能にします。 図1で行ったようにまた、あるプロトコルから抽出された値は、その後のプロトコルのパラメータを調整するために使用することができます。
それは（ 例えば 、 図1（d）に示すように、その瞬間発火率）をリアルタイムに分析中の細胞の応答の高次の機能を監視し、電流を計算するために、PID制御器を用いて、例えば、それに応じて刺激を変更することが可能です一定または時間変化発火率を維持するために必要。
LCGとコンダクタンスとダイナミッククランププロトコルの実装は簡単で、テキストのみの設定ファイル、Sの使用によって自動化することができますプロシージャを記述が必要ですスクリプトインプリ。 LCGは、新たな実験プロトコルを考案する相互接続することができる30以上のエンティティを含んでいます。我々は、コマンドラインインターフェイスを使用して、LCGを使用する方法を説明し、しかしグラフィカル実験ランチャーは、実験を開始すると非経験のあるユーザーは、LCGが独自のグラフィカル·インタフェースを作成するコマンドを組み合わせるせることでパラメータを変更容易にするために設計されています。
RELACSとRTXI：2つの既存のツールボックスは、LCGと同様の機能を提供しています。前者は、電気生理学的実験を行うため、記録データを分析し、注釈を付けるためのプラットフォームでもあります。 LCGと既存のソリューションの主な違いは、コマンドラインに基づいてユーザーインターフェイスです。このアプローチの利点はいくつかある：まず、コマンドラインインターフェイスは、おそらく複雑なスクリプトを用いて、標準化し、反復作業を自動化することができ、第二に、それが実現、より複雑なワークフローに実証実験を埋め込むことができますこのようなMatlabのやPythonのような高レベルのスクリプト言語、で。
要約すると、LCGのモジュール性は、2つの方法で利用可能な実験プロトコルの数を拡大することができます：最初の最も簡単なものは、新規のプロトコルを実行するために、既存のオブジェクトを使用するアドホック設定ファイルを書き込むことです。 C ++を使用して - - さらにLCGの能力と機能を拡張するために使用することができる新たな基本オブジェクトを第1は、実装することです。例としては、このプロトコルの懸念に脳スライスにおける個々の細胞の研究を発表しました。しかし、同様のプロトコルでは、正常なクローズで刺激しながら、マルチ電極アレイを介して、例えば、細胞外電位を記録するために、このような神経細胞培養物のex vivoでの製剤に細胞内および細胞外の信号の両方を記録するために、in vivoでの製剤に使用することができますループ4。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
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