Abstract
Experimentell neurovetenskap bevittnar ett ökat intresse för utveckling och tillämpning av nya och ofta komplexa, protokoll slutna kretslopp, där stimulans tillämpas beror i realtid på respons av systemet. Nya applikationer sträcker sig från genomförandet av virtual reality-system för att studera motoriska gensvar både hos möss 1 och i zebrafisk 2, för att kontrollera om krampanfall efter kortikal stroke använder optogenetik 3. En viktig fördel med slutna tekniker består i förmågan att sondera högre dimensionella egenskaper som inte är direkt tillgängliga eller som är beroende av flera variabler, såsom neuronala retbarhet 4 och tillförlitlighet, medan samtidigt maximera den experimentella genomströmning. I detta bidrag och i samband med cellelektro, beskriver vi hur du använder en mängd slutna protokoll till studiet av svarsegenskaperna hos pyramidal kortikala neuroner, recorded intracellulärt med patch clamp-tekniken i akut hjärnan skivor från somatosensoriska cortex av unga råttor. Eftersom ingen kommersiellt tillgängliga eller öppen källkod ger alla funktioner som krävs för att effektivt utföra de experiment som beskrivs här, en ny programvara verktygslåda kallad LCG 5 utvecklas, vars modulär struktur maximerar återanvändning av programkod och underlättar genomförandet av nya experimentella paradigm. Stimulering vågformer anges med en kompakt meta-beskrivning och fullständiga försöksprotokoll beskrivs i textbaserade konfigurationsfiler. Dessutom har LCG ett kommandoradsgränssnitt som lämpar sig för upprepning av försök och automatisering av experimentella protokoll.
Introduction
Under de senaste åren, har cellulära elektrofysiologi utvecklats från den traditionella öppen slinga paradigmet används i spänning och ström clamp-experiment till moderna med sluten slinga protokoll. Den mest kända slutna tekniken är kanske den dynamiska klämman 6,7, vilket gjorde det möjligt för syntetiska injektion av artificiella spänningskänsliga jonkanaler att bestämma nervmembranspänningen 8, den fördjupade studie av effekterna av icke-deterministiska flimmer på jonkanaler på neuronala svar dynamik 9, liksom rekreation in vitro av realistiska i vivo- som synaptiska bakgrundsaktiviteten 10.
Andra sluten slinga paradigm som har föreslagits innefattar den reaktiva klämman 11, för att studera in vitro generation av självunderhållande ihållande aktivitet, och svaret klämma 4,12, för att undersöka de cellulära mekanismerna bakom neuronala retbarhet.
INNEHÅLL "> Här beskriver vi ett kraftfullt ramverk som gör det möjligt att tillämpa en mängd slutna elektro protokoll i samband med hela celler patch clamp inspelningar utförs i akut hjärnan skivor. Vi visar hur du spelar in somatisk membranspänning med hjälp av patch clamp inspelningar i pyramidala nervceller från somatosensoriska cortex av juvenila råttor och tillämpa tre olika slutna protokoll med hjälp av LCG, ett kommando-line-baserad programvara verktygslåda utvecklats i laboratoriet för teoretisk neurobiologi och Neuroengineering.I korthet, de beskrivna protokollen är först den automatiserade injektion av en serie strömtång stimulans vågformer, som är relevanta för karakterisering av ett stort antal aktiva och passiva membranegenskaper. Dessa har föreslagits att fånga elektro fenotypen av en cell i termer av dess svar egenskaper till en stereotyp rad stimulans vågformer. Känd som e-koden för en cell (t.ex. se & #160; 13,14), är en sådan samling av elektriska svaren används av flera laboratorier att objektivt klassificera neuroner på grundval av deras elektriska egenskaper. Detta innefattar analys av den stationära input-output överförande förhållande (FI kurva) genom en innovativ teknik som innebär sluten slinga, i realtid kontroll över graden av bränning med hjälp av en proportionell-integral-derivata (PID) regulator , andra återskapande av realistiska in vivo -liknande bakgrund synaptisk aktivitet i in vitro-preparat 10 och för det tredje den konstgjorda anslutning i realtid av två samtidigt registreras pyramidala nervceller med hjälp av en virtuell GABAergic interneuronen, som simuleras av datorn.
Dessutom LCG implementerar den teknik som kallas aktiva elektroden Kompensation (AEC) 15, som gör det möjligt att genomföra dynamiska klämprotokoll med användning av en enda elektrod. Detta gör det möjligt att kompensera oönskade effekter (enrtifacts) i inspelningen elektroden som uppstår när den används för att leverera intracellulära stimuli. Metoden är baserad på en icke-parametrisk beräkning av de ekvivalenta elektriska egenskaperna hos inspelningskretsen.
De tekniker och experimentella protokoll som beskrivs i detta dokument kan lätt tillämpas i konventionell öppen slinga spännings- och strömkläm experiment och kan utvidgas till andra preparat, såsom extracellulära 4,16 eller intracellulära inspelningar in vivo 17,18. Den noggranna monteringen av installationen för hela cell patch clamp elektrofysiologi är ett mycket viktigt steg för stabila, högkvalitativa inspelningar. I det följande antar vi att en sådan experimentuppställning är redan tillgänglig för försöks och fokusera vår uppmärksamhet på att beskriva användningen av LCG. Läsaren pekade på 19-22 för ytterligare tips om optimering och felsökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som beskrivs här uppfyller de rekommendationer och riktlinjer för den etiska kommittén vid institutionen för biomedicin vid universitetet i Antwerpen. Detta protokoll kräver framställningen av icke-kännande material från explanterade hjärnan hos unga Wistar-råttor, som erhållits av godkända humana dödshjälp tekniker.
1. Förberedelse av utrustning
- Installera och konfigurera datainsamling och stimuleringssystem.
- Använd en persondator (PC) utrustad med ett datainsamlings (DAQ) kortet som stöds av Comedi att spela in signaler och skicka analoga styrspänningar till elektro förstärkaren.
OBS: Comedi är en Linux-modul och bibliotek som stöder en mängd olika DAQ kort från de vanligaste tillverkarna: besök http://www.comedi.org för mer information. - Om en datorstyrd patch clamp förstärkare används, anställa en andra dator förutom en dedikerad till förstärkarenkontroll.
OBS: Medan den senare kan köra ett konventionellt operativsystem, kommer den extra PC vara i drift i realtid med hjälp av ett speciellt operativsystem. Under dessa förhållanden är det lämpligt att använda en enda bildskärm, mus och tangentbord anslutet till extra PC, vid anslutning av en fjärrskrivbordsprogram till dedikerad PC. - Ladda ner ISO-avbildning av Live-CD som innehåller ett realtids Linux operativsystem med LCG förinstallerat från http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso och bränna den på en tom CD eller USB-minne " .
- Sätt bara in CD-enheten på datorn som innehåller DAQ kortet och starta den. Alternativt, installera LCG från sin online-källa förvar på en dator som kör operativsystemet Linux (t.ex. Debian eller Ubuntu). Konsultera online-handboken för mer information om installationen. Handboken finns tillgänglig online på http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
- Starta från live-CD: this automatiskt ladda en helt konfigurerat system. För att göra detta, placera LCG Live-CD i datorns CD-ROM-enhet och starta om datorn från cd; välj realtidskärna (standardalternativet) så snart startmenyn visas och vänta på att systemet initieras.
- Kalibrera DAQ kortet genom att skriva på kommandoraden:
sudo comedi_calibrate
eller
sudo comedi_soft_calibrate
beroende på om dataupptagningskortet stödjer hårdvara eller mjukvara kalibrering, respektive (använd kommandot sudo comedi_board_info att få information på bordet). - Ställ in lämplig analog-till-digital och digital-till-analog omräkningsfaktorer: detta kräver att ha tillgång till manualen för cellulära elektro förstärkare, och i synnerhet dess specifikationer på sina konverteringsfaktorer.
- Använd en textredigerare för att ange lämpliga numeriska värden i filen /home/user/.lcg-env, för miljövariabler AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
OBS: Dessa representerar ingång (AI) och utgångar (AO) vinster för strömtång (CC) och spänning klämma (VC) lägen, och de faktorer omräknings mellan spännings kommandon som tillhandahålls av datorn och den nuvarande eller spänningar som genereras av förstärkaren , respektive. - Alternativt kan du använda LCG skript tillhandahålls (LCG-hitta-omräkningsfaktorer), att hitta av omräkningsfaktorerna i hans eller hennes system.
OBS: Värdena beräknas genom LCG-hitta-omvandlings-faktorer är gissningar, som i vissa fall krävs för att vara numeriskt stympad eller rundade för att återspegla de exakta värdena av de omvandlingsfaktorer. - Om du vill använda LCG-hitta-omvandlingsfaktorer, börja med att ansluta modell cell "som ofta köps med förstärkaren till motsvarande huvudsteg. Sedan öppna en terminal på Linux-maskin där du kör Live-CD och ange följande kommando vid skalprompten:
LCg-hitta-omvandlingsfaktorer -i $ HOME / .lcg-ENV -o $ HOME / .lcg-ENV
OBS: I båda fallen (dvs. manuell ändring av /home/user/.lcg-env eller användning av LCG-hitta-omräkningsfaktorer), nära och öppna terminalen för att ändringarna ska träda i kraft. - Om flera headstages används, ställer de omräkningstal som samma värden i alla kanaler; om detta inte är möjligt, samråda med LCG nätet handbok för att förstå hur man använder flera konverteringsfaktorer i LCG-stimulus eller hur man kan producera konfigurationsfiler som bättre passar användarens behov.
- Använd en persondator (PC) utrustad med ett datainsamlings (DAQ) kortet som stöds av Comedi att spela in signaler och skicka analoga styrspänningar till elektro förstärkaren.
2. Framställning av akut hjärnan skivor från Somatosensoriska Cortex
- Beredning av lösningar för elektrofysiologi.
- Förbered artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) genom att blanda (i mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glukos, 2 CaCl2 och 1 MgCl2. Förbered 10x stamlösningar för att minskaförberedelsetid på dagen för experimentet. Bered 2 L, varav en kommer att användas för framställning av skivorna och den andra för inspelning.
- Mätta ACSF med 95% O2 och 5% CO2 under åtminstone 30 minuter före början av förfarandet.
- För Tång inspelningar, använd en intracellulär lösning (ICS) innehållande (i mM) 115 K-glukonat, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Bered lösningen i is och filtrera den före början av inspelningarna för att eliminera risken för igensättning av pipetten.
- Brain utvinning.
- Söva djuret placera djuret i en induktionskammare med 4% isofluran och snabbt halshugga den med en giljotin eller stora saxar.
- Skär huden längs mittlinjen och skjut den till öronen.
- Med användning av en fin sax klippa skallen längs mittlinjen. Håll bladet så nära som möjligt till the yta för att minimera skador på den underliggande hjärnan. Öppna skallen med en pincett, använd en spatel för att avskilja synnerven och hjärnstammen och försiktigt släppa hjärnan i iskall ACSF.
- Separera lillhjärnan och de två hjärnhalvorna med en skalpell (blad 24).
- Ta bort överflödigt vatten från en av de två halvkloten och limma det på en lutande plattform med hjälp av en droppe superlim. Snabbt lägga några droppar ACSF över hjärnan och överföra den till vibratome kammaren.
OBS: När man förbereder sagittal skivor, är vinkeln av plattformen viktigt att undvika att skada dendriter av pyramidala celler under skärförfarandet.
- Framställning av skivorna.
- Placera bladet över hjärnan och kasta den första 2,5-3 mm. Justera hastigheten och frekvensen för att begränsa skador på ytan av segmentet medan på samma gång minimera den tid som erfordras för skivning förfarandet.
- Ställ tjockleken till 300 μm och börja skiv. När bladet har gått förbi hjärnbarken, använder ett rakblad eller en böjd nål för att skära över hippocampus och vid kanterna av det kortikala området av intresse.
- Placera skivor i en med flera brunnar inkubation kammaren hölls vid 32 till 34 ° C.
- Dra kniven och upprepa punkterna 2.3.2 och 2.3.3 tills 5-8 skivor skärs. De bästa skivor är oftast de där blodkärlen är parallella med ytan.
- Inkubera skivorna för 30 min efter det sista segmentet är placerat i kammaren.
3. Patch-clamp inspelningar från lager 5 pyramidala nervceller
- Placera en skiva i inspelningen kammaren och söka efter friska celler. Dessa celler har oftast lägre kontrast, en slätt utseende och inte är svullen.
- Inspektera segmentet under mikroskop med 40X förstoring linsen och söka efter celler i skiktet 5, som ligger ungefär 600 till 1000 ^ m från ytan av hjärnan. När en lämplig cell hittas belastning en tredjedel av mikropipett med ICS och placera den i huvudsteg.
- På persondatorn kör live-CD eller förkonfigurerade Linux operativsystem, starta ett kommandoskal (t.ex. bash) och vid dess prompt typ kommandot LCG-noll. Detta säkerställer att DAQ styrelsen inte driver förstärkaren.
- Applicera 30-50 mbar av positivt tryck genom att trycka på kolven av en gemensam spruta, ansluten genom slang till pipetten hållaren och, med hjälp av mikroskopet, placera pipetten approximativt 100 fim ovanför segmentet.
OBS: Placera pipetten i en position som gör att en direkt väg till målcellen, företrädesvis med användning av tillvägagångssättet läge mikromanipulator. - Agera på styr elektrofysiologi förstärkaren, justera pipetten offset och mata ut en testpuls (10 mV) i spänningsklämläge.
- Reducera trycket till 10-30 mbar (beroende på pipetten storlek) genom att dra tillbakakolv hos sprutan; försiktigt närma cellen och kontrollera för bildandet av en grop genom att observera bilden på video kamerans monitor. Övervaka testpulsen för en ökning av motståndet vid alla tillfällen, genom att titta på den aktuella vågformen visas på oscilloskopet är ansluten till elektro förstärkare (alternativt kan du använda kommandot LCG-tätning-test för att övervaka pipett motstånd).
- Släpp trycket och ansöka om det behövs mild undertryck till pipetten för att hjälpa tätningsbildning när du märker en ökning av pipett motstånd och bildandet av en "grop" på cellen.
- Medan tätningsformer, gradvis minska hållpotentialen till -70 mV.
- När en gigaohm tätning har erhållits, se till att hållströmmen är mellan 0-30 Pa. Applicera korta pulser av negativt tryck (sug) för att bryta membranet och upprätta konfigurationen hela celler. Alternativt kan du injicera starka och korta pulser av spänning (
- Växla till strömtång läge och kontrollera att vila membranpotential är typisk för en frisk cell. För kortikala pyramidala nervceller med en kalium glukonat-baserad lösning, är detta värde vanligen mellan -65 och -75 mV.
4. Halvautomatiska karakterisering av en Neuron elektriska svar Egenskaper
- Skapa en katalog för att lagra användarens data. För att göra detta anställd ett skript som ingår i LCG live-CD som skapar mappar baserat på dagen. För att använda den, typ vid kommandotolken
cd ~ / experiment
LCG-create-experiment-mappen -s PSP, in_vivo_like
Detta kommer att skapa en mapp där data för denna cell sparas (och en "psp" och "in_vivo_like" undermappar) och det kommer att skriva ut sitt namn till terminalenfönster; Det är också möjligt att lagra ytterligare information såsom pipett motstånd och celltyp med hjälp av det här skriptet. - Byt katalog till den nyskapade mappen med kommandot
cd ~ / <mappnamn>
Mappnamnet är den som visas med kommandot LCG-create-experiment-mapp och kommer att ha tidsstämpeln för den aktuella dagen (det vill säga, år-månad-dag), som i 20140331A01. - Försäkra dig om att förstärkaren är inställd på att arbeta i strömtång läge, att kablarna är anslutna och extern spännings befälet över förstärkaren, i förekommande fall, är aktiverad.
- Ange kommandot LCG-ecodeat kommandotolken. Detta kräver en serie kommandon (dvs. LCG-ap, LCG-VI, LCG-ramp, LCG-tau och LCG-steg), som används för att karakterisera grundläggande svarsegenskaperna hos cellen. LCG-eCode kräver att användaren specificerar två parametrar: amplituden hos en ms långa strömpuls användas för att framkalla en enda spik i cellen, och den maximala amplituden hos strömmen kolvenp injiceras in i cellen för att hitta sin rheobase.
Använd följande kommandosyntax:
LCG-eCode --pulse-amplitud X --ramp-amplitud Y
med ett urval av värdena X och Y (i Pa) som är tillräckliga för att göra cell eld som svar på en 1 ms lång puls och en fördröjd injektion av ström, respektive.
OBS: Dessa protokoll kräver utför numerisk uppskattning av "elektrod kärna" för att kunna använda den aktiva elektroden Kompensation (AEC) 15. En bullrig ströminducering används för att uppskatta kärnan och användaren uppmanas att bekräfta antalet prover som utgör kärnan. Se 15 för mer information om innebörden av elektrod kärnan och hur man väljer antalet kärnprover.
5. Injektion av konduktans genom Simulerade synapser och simulering av in vivo -liknande bakgrundsaktivitet
- Injektion av simulerade excitatoriska postsynaptiska potentialer
- Byt till den katalog där du sparar nästa experiment, genom att skriva följande kommando vid kommandoprompten för skalet:
cd PSP / 01 - Kopiera en LCG konfigurationsfil till den aktuella katalogen och öppna den med en textredigerare (Nano i detta exempel) genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken av skalet (det här exemplet konfigurationsfil ingår i källkoden och live-cd) :
cp ~ / local / src / LCG / konfigurationer / epsp.xml
nano epsp.xml
OBS: Detta är helt enkelt en textfil med olika enheter som är anslutna till varandra. För mer information se avsnittet Resultat representanten. - Vid behov redigera inputChannel, outputChannel den inputConversionFactor och outputConversionFactor i den här filen för att matcha användarens inställningar.
- Beräkna elektrod kärnan som behövs för att utföra den aktiva elektroden kompensation "den metod som LCG att utföra enda elektrod dynamiskt klämma" genom att ge command
LCG-kernel
Detta kommer att fråga efter antal punkter i kärnan. Återigen, välj ett nummer så att elektrod kärnan täcker slutet av den exponentiella förfall svansen. - Utför den dynamiska klämma experiment med kommandot
LCG-experimentera -c epsp.xml - Lista filerna och visualisera resultat genom att använda kommandot
ls -l
LCG-plot-fil -f sista
- Byt till den katalog där du sparar nästa experiment, genom att skriva följande kommando vid kommandoprompten för skalet:
- Injektion av simulerade hämmande postsynaptiska potentialer
- Skapa en mapp och kopiera epsp.xml filen till den genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Redigera konfigurationsfilen genom att använda en textredigerare: ändra den synaptiska jämviktspotential och stiga och avklingningstiden konstant av modellen synapsen Exp2Synapse till följande:
parametrar>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0.8e-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<parametrar>
Avsluta textredigeraren. - Beräkna elektrod kärnan och utföra experiment som i 5.1, genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
LCG-kernel
LCG-experimentera -c ipsp.xml - Lista filerna och visualisera resultaten, genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
ls -l
LCG-plot-fil f <filename.h5>
- Skapa en mapp och kopiera epsp.xml filen till den genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
- Simulering av in vivo -liknande bakgrundsaktivitet:
- Byt till den katalog där du vill spara följande experiment, som tidigare visats, genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
cd ../../in_vivo_like/01 - Kopiera konfigurationsfilen från LCG källa katalog, genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
cp ~ / local / src / LCG / konfigurationer / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Justera DAQ konfigurationsparametrar för användarens inställningar, enligt beskrivningen i 5.1.3 och avsluta editorn.
- Beräkna elektrod kärnan och utföra experiment som i 5.1, genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
LCG-kernel
LCG-experimentera -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
De "-n 10" och "-i 3 'växlar indikerar att stimuleringen bör upprepas 10 gånger med ett intervall på tre sekunder. - Visualisera rå spår med hjälp av följande kommando vid kommandoprompten för skalet:
LCG-plot-fil f alla
- Byt till den katalog där du vill spara följande experiment, som tidigare visats, genom att skriva följande kommandon vid kommandotolken i skalet:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I de tidigare avsnitten har vi beskrivit hur man använder programvaran verktygslåda LCG att karakterisera elektrofysiologiska egenskaperna hos L5 pyramidala celler och att återskapa in vivo -liknande synaptisk aktivitet i en skiva beredning. Användningen av ett kommandoradsgränssnitt och halvautomatiska protokoll gynnar reproducerbarhet och effektivitet av experimentet, som kan ha en stor inverkan på produktionen och kvaliteten på de uppgifter som tas fram. Dessutom, eftersom data sparas på ett konsekvent sätt, är det lätt att utvidga analysen till ett visst mål. Figur 1 visar den typiska resultatet av ett experiment där grundläggande elektrofysiologiska egenskaperna hos en cell med sex olika protokoll har karakteriserats.
Mätning av aktionspotentialen form och tröskeln (Figur 1A): en kort och stark puls av depolariserande ström injiceras för att mäta den genomsnittliga aktionspotentialens form. Tröskeln spik ärberäknas som den första toppen av den tredje derivatan av aktionspotentialen 24. Mätning av den spännings-strömkurvan (Figur 1B): under gränsvärdena strömpulser sprutas in i cellen, vilket möjliggör mätning av passiva svarsegenskaper såsom ingångsresistans och en karakterisering av undertröskel jonströmmar.
Mätning av den minimala ström tillräcklig för att framkalla ihållande bränning (Figur 1C). Den injicerade ramp ström möjliggör karakterisering av cellen som en typ I eller typ II oscillator 25. Mätning av frekvensström (Fi) kurva (figur 1D): inducerad ström är en funktion av den momentana skottfrekvens och uppdateras varje gång cell spikar, med hjälp av sluten slinga protokoll som beskrivs i 5. Med denna teknik kan en tillförlitlig uppskattning av FI kurvan erhållas på mindre än 30 sekunder. Mätning av membrane tidskonstant (figur 1E): en kort hyperpolarizing strömpuls avges för att mäta de passiva relaxationsegenskaper hos membranet. Denna puls montera sedan till en dubbel exponentiell att beräkna membrantidskonstanten (44 ms i detta fall).
Anpassning koefficient och svar på depolariserande ström (Figur 1F): två över tröskelvärden aktuella injiceras för att mäta anpassning koefficienten (förhållandet mellan den första och den sista inter-spik intervall). Den automatiserade tillämpning av en rad protokoll som de som beskrivs kan karakterisera varje inspelad cell i termer av dess viktigaste elektrofysiologiska egenskaper och utgör den grundläggande steg för alla ansträngningar som syftar till att jämföra olika neuron typer och deras roll, både i hälsa och sjukdom.
Även LCG innehåller flera skript som implementerar specialiserade protokoll, det mesta av kraften och flexibiliteten i verktygslådan är bosattaar i förmågan att beskriva experiment medelst konfigurationsfiler. I Sec. 5 det beskrivs hur man utför dynamisk klämma att injicera simulerade bakgrundsaktiviteten i neuron. Här begreppet konfigurationsfiler och enheter införs. En konfigurationsfil är helt enkelt en textfil som innehåller namn och sammankoppling av alla de grundläggande byggstenarna (kallas enheter) som krävs för att utföra en viss experiment; Av denna anledning, att utforma nya paradigm genom anslutnings enheter är en relativt enkel uppgift, som är att dela och återanvända experimentella paradigm. I experimentet som visas i figur 2, är fem enheter användes:
H5Recorder: registrerar anslutna enheter till en komprimerad fil. Den hdf5 filformat har valts eftersom den stöds av de flesta programmeringsspråk som Python och MATLAB.
RealNeuron: ger ett abstraktionslager till den tekniska aspekten av realtids religt och injektion. Det innehåller information om dataupptagningskortet och utför den aktiva elektroden ersättning på nätet. När en aktionspotential detekteras av tröskelkorsning, Real Neuron matar också en topp i form av en händelse: det kan användas till exempel för att övervaka eldhastighet under experimentet eller att samverka med artificiella synapser.
Poisson: genererar spik tåg efter en exponentiell fördelning med en viss hastighet. Utsäde av denna process kan fästas så att försöken kan reproduceras konsekvent.
SynapticConnection: emot spikar från generatorn och vidarebefordrar dem till lämplig synaps efter en viss fördröjning.
Exp2Synapse: modell av en dubbel exponentiell synaps. Den innehåller jämviktspotential och stig- och falltidskonstanter.
Som tidigare nämnts är varje enhet ansluten till en eller flera andra to komponera ett experiment. I exemplet med simulering av en excitatorisk postsynaptisk ström beskrivs i sek. 5,1, både RealNeuron och Exp2Synapse är anslutna till H5Recorder, för att spara till fil membranspänning och synaptisk ström resp. Poisson-enheten levererar spikar alstras vid en frekvens på 2 Hz till den SynapticConnection, vilken i sin tur levererar de händelser till Exp2Synapse efter 1 ms. Slutligen är Exp2Synapse enhet ansluten till RealNeuron. Med små variationer av denna konfigurationsfil, som visas i Sek. 5.2 och 5.3, kan man simulera hämmande strömmar och återskapa in vivo -liknande aktivitet.
I fig 2 visas hur, med hjälp av en dynamisk klämkonfiguration, kan man studera synaptisk integration på ett kontrollerat sätt genom att simulera den ström som induceras i en neuron genom artificiella synapser. Figur 2A (överst) visar individuella postsynaptiska potentialer (överst ) tillsammans med det injected strömmar. Röd (blå) spår betecknar excitatoriska (hämmande) händelser. Notera att den injicerade strömmen är en funktion av membranspänningen och av förändringen i konduktans associerad till aktiveringen av den virtuella synapsen.
Genom att leverera Poisson spik tåg vid högre frekvenser till synapserna, kan in vivo-liknande bakgrundsaktivitet simuleras (Figur 2B och 2D). Även under spiking när stora strömmar injiceras (svart spår i botten av figur 2B), den aktiva elektroden Compensation garanterar att formen på spikarna inte påverkas (fig 2C), trots att en enda elektrod används för att samtidigt injicera ström och registrera membranspänning. Upprepa flera försök med samma ledningsförmåga vågformer kan utvidga arbetet inom 23 till en mer realistisk ram, som gör det möjligt att separera bidragen från olika synaptic strömmar till tillförlitlighet och precision av spik timing.
Figur 3 visar ett enkelt exempel på hybridnätverket, erhållen genom att spela in samtidigt från två osammanhängande pyramidala celler och med användning av en virtuell GABAergic interneuronen att simulera en form av disynaptic hämning, en utbredd mekanism som i hjärnbarken involverar aktivering av Martinotticeller celler. 26, 27 Figur 3A visar en schematisk bild av experimentuppställning: ett par riktiga, osammanhängande pyramidceller (svarta och röda trianglar) är artificiellt ansluten via en simulerad GABAergic interneuronen, modelleras som en läckande integrera-och brand neuron. Synapsen som ansluter presynaptiska pyramidcell till interneuronen visar homosynaptic underlättande kort sikt som genomförs i enlighet med Tsodyks-Markram modell 28, medan synapsen ansluter interneuronen och postsynaptiska pyramidcell är en biexponentiell synaps med uppgång och förfall timig konstanterna 1 och 10 ms, respektive.
Vikterna för båda anslutningarna justerades för att ha en avböjning i det postsynaptiska membranet potential på ca 2 mV. Fig 3B och 3C visar gensvaret hos den presynaptiska pyramidala neuron till ett tåg av intracellulära pulser som avges vid 90 Hz och de motsvarande EPSPS i simulerade interneuronen:. parametrarna för synaptisk förbindelse justerades för att få den artificiella neuronen avger en spik efter en presynaptisk skur av 3-4 spikar med hög frekvens, såsom rapporteras experimentellt 26,29 Figur 3D visar effekten av disynaptic inhibering på den verkliga postsynaptiska pyramidcell. 10 försök lagras, där neuron stimuleras med fryst in vivo -liknande bakgrundsaktivitet som liknar den som beskrivs i figur 2 Notera ökade tillförlitligheten som svar på de tre hämmande IPSPs,återspeglas i den mindre spik jitter efter aktiveringen av den inhiberande cellen, såsom indikeras av de röda strecken längre spännings spår.
Figur 1. Elektro karakterisering av en patchad L5 pyramidala neuron Utgångs siffra på e-kodprotokollet för en typisk pyramidcell. kvantifieringar utförs automatiskt och ingen ytterligare redigering krävs. (A) Beräkning av aktionspotential tröskel (streckad linje -50,5 mV). Röd linje är den genomsnittliga aktionspotentialens form. (B) Mätning av passiv svar (överst) till hyperpolarizing strömmar (botten). (C) svar på en ökande depolariserande ström för att mäta rheobase ström (123 pA). (D) avfyrningsfrekvens som en funktion av den injicerade strömmen, mätt med användning av en sluten slinga tillvägagångssätt. Varje grå punkt ligger på paret(Ström injiceras, inversen av interspike intervall). Den röda kurvan är linjär anpassning till datapunkterna och den streckade linjen anger rheobase mätt i panelen (C). (E) Åtgärd av membrantidskonstanten (43,8 ms). (F) Identifiering av basiska aktiva egenskaper hos cellen visar att cellen är en vanlig spiking neuron och att det är minimal anpassning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Rekreation av i vivo- liknande aktivitet med hjälp av dynamisk klämma. (A) Simulering av excitatoriska (röd, Sec. 5.1) och hämmande (blå, Sec. 5.2) synapser, grå spår är andra realiseringar av samma experiment. (B ) (C) Former av spikar under experimentet i (B). (D) Raster tomt på spikarna genereras över 20 försök visar att neuron kan vara extremt tillförlitliga och precisa svar på samma ingång som visas i 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Simulering av disynaptic hämning via en simulerad hämmande interneuronen (A) Schematisk bild av inspelningen inställningar. Svarta och röda pyramider utgör ett par riktiga pyramidceller in samtidigt. Svart och rött indikerar presynaptisk och postsynaptisk neuron, respektive. Den blå cirkeln är en virtuell GABAergic interneuronen kontaktade av den svarta pyramidcell, som i sin tur hämmar röda pyramidcell. (B) Svar av den verkliga presynaptiska pyramidala neuron till ett tåg av pulser som levereras med en frekvens på 90 Hz, vilket indikeras av de orange streck över spännings spår. De svarta strecken under spänning spår indikerar gånger aktionspotentialer släpptes ut av den presynaptiska cellen. (C) Svar av den simulerade interneuronen till tåget spikar som avges av presynaptiska cellen. (D)Överlagring av 10 spännings spår som spelats in från den verkliga postsynaptiska pyramidcell som svar på aktivering av den simulerade interneuronen. Den postsynaptiska cellen stimulerades med fryst in vivo -liknande bakgrundsaktivitet, för att erhålla tillförlitliga spännings dynamik. De röda streck under spänningen spår indikerar vid vilka tidpunkter, under successiva försök, de postsynaptiska neuroner utsända en aktionspotential. Notera den ökade precisionen efter aktiveringen av interneuronen, indikeras av en lägre spik jitter i studierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna text ett fullständigt protokoll för att genomföra realtid, var stängd slinga enda cell elektrofysiologiska experiment beskrivs med hjälp av patch clamp teknik och en nyligen utvecklad programvara verktygslåda kallas LCG. För att optimera kvaliteten på inspelningarna är det viktigt att inspelnings installationen vara jordat, avskärmad och vibrationsfri: Detta säkerställer stabil och varaktig hela-cell tillgång till cellen, som tillsammans med möjligheten att automatisera hela sektioner av stimuleringsprotokoll , möjliggör maximering av genomströmningen i experimentet.
Två fall där LCG kan tillämpas har lagts fram, nämligen frågan om hur en cell i termer av dess elektrofysiologiska egenskaper (Figur 1), inklusive den snabba beräkningen av en neuron aktiva input-output relation, och återskapande av in vivo -liknande aktivitet i en hjärna skiva (Figur 2). Such ansökningar visade hur man konstruerar olika protokoll och belyste några av de mest framträdande dragen i LCG: dess kommandoradsgränssnitt gör det lämpat för skript, vilket gör det möjligt att automatiskt tillämpa en serie protokoll. Dessutom, såsom gjordes i Figur 1, värden extraherade från ett protokoll kan användas för att skräddarsy parametrarna för efterföljande protokoll.
Det är möjligt att i realtid övervaka högre ordningens funktioner i svaret hos cellen under analysen (t ex dess momentana eldhastighet, såsom visas i figur 1D) och modifiera stimuleringen enlighet därmed, exempelvis genom användning av en PID-regulator för att beräkna den aktuella krävs för att upprätthålla en konstant eller tidsvarierande eldhastigheten.
Genomförandet av ledningsförmåga och dynamisk klämprotokoll med LCG är enkel och kräver bara att skriva en text konfigurationsfil, en procedur som kan automatiseras genom användning av sgenomfö skript. LCG innehåller över 30 enheter som kan kopplas samman för att ta fram nya experimentella protokoll. Vi beskrev hur man använder LCG använder ett kommandoradsgränssnitt, men en grafisk experiment launcher har utformats för att underlätta startförsök och ändra parametrar genom att låta icke-erfarna användare kombinera LCG kommandon för att skapa sina egna grafiska gränssnitt.
Två befintliga verktygslådor erbjuder funktioner som liknar LCG: RELACS och RTXI. Den förstnämnda är både en plattform för att utföra elektrofysiologiska experiment och för att analysera och kommentera de registrerade uppgifterna. Den största skillnaden mellan LCG och befintliga lösningar är dess användargränssnitt baserat på en kommandorad. Fördelarna med denna metod är flera: först och främst, gör en kommandoradsgränssnitt automatisera standardiserade och repetitiva uppgifter med hjälp av eventuellt komplexa skript och andra gör det möjligt att bädda experimentella försök till mer komplicerade arbetsflöden som genomförsi högnivåskriptspråk, såsom Matlab eller Python.
Sammanfattningsvis kan den modulära naturen hos LCG utöka antalet tillgängliga experimentella protokoll på två sätt: den första och enklaste man är genom att skriva ad hoc konfigurationsfiler som använder de befintliga objekt för att utföra nya protokoll. Den andra är genom att implementera - med C ++ - nya elementära föremål som kan användas för att ytterligare utöka funktionerna och funktioner i LCG. Exemplen presenteras i detta protokoll avser studiet av enskilda celler i hjärnan skivor. Men liknande protokoll kan också med framgång användas i in vivo preparat, för att spela in både intracellulära och extracellulära signaler, och i beredningar ex vivo såsom neuronala kulturer, för att spela in, till exempel, extracellulära potentialer genom flerelektrod arrayer samtidigt stimulera i krets- loop 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S.
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al.
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
