Abstract
뇌 또는 '뇌 가소성'에 오래 지속되는 변화는 질병이나 부상으로 다음과 같은 적응 행동 및 뇌 수리의 기초가. 또한, 우리의 환경과의 상호 작용은 뇌 가소성을 유도 할 수 있습니다. 점점 연구는 뇌와 행동 장애의 치료에 도움이 뇌 가소성을 자극하는 환경을 식별하기 위해 노력하고있다. 두 조작 환경을 설명하는 증가 또는 성인 마우스 중뇌 신경 세포 티로신 수산화 효소 면역 양성의 개수 (TH +, 도파민 (DA) 합성에서 속도 - 제한 효소)을 감소시킨다. 첫 번째는 페어링 남성과 함께 지속적으로 남성의 약 12 % 중뇌 TH + 뉴런을 증가 일주, 대한 여성 마우스를 포함하지만, 여성의 약 12 % 중뇌 TH + 뉴런을 감소시킨다. 두 번째는 등 실행 바퀴, 장난감, 로프, 중첩 물질을 포함하는 '농축 환경'(EE)에서 2 주 연속 주택 마우스를 포함하는 전남성의 약 14 % 중뇌 TH + 뉴런을 ncreases. 또한, 프로토콜은 동시에 환경에 의한 뇌 가소성을 기본 메커니즘을 식별하는 데 도움이 환경 조작 중에 직접 중뇌에 약물을 주입에 대해 설명한다. 예를 들어, 더 중뇌 TH + 뉴런의 EE-유도는 중뇌 신경 세포 상에 시냅스 입력의 동시 봉쇄에 의해 폐지된다. 함께, 이러한 데이터는 환경에 대한 정보가 또는 'DA'유전자의 발현 끄려면 중뇌 신경 세포에 시냅스 입력을 통해 전달되는 것을 나타냅니다. 따라서, 기전 표적화 적절한 환경 적 자극 또는 약물, 중뇌 DA 불균형과 관련된 뇌 및 행동 장애를 치료하는데 유용 할 수있다 (예를 들어 파킨슨 병, 주의력 결핍 및 과다 활동 장애, 정신 분열병, 및 약물 중독).
Introduction
중뇌의 배쪽 피개 영역 (VTA)과 substantia nigra에의 유리체 compacta (SNC)의 신경 세포에 의해 DArgic 신호는 보상 동기 부여인지, 감정 및 모터 행동에 중요 할 것으로 생각된다. 그러나, 너무 많거나 너무 적은 중뇌 DA 시그널링은 비활성화 많은 신경계 장애의 다양한 증상 (예를 들어 파킨슨 병, 주의력 결핍 및 과다 활동 장애, 정신 분열병, 및 약물 중독)을 야기한다. 증가 또는 DA는 이러한 증상을 완화 신호 감소 마약, 그러나 그들은 또한 조절 이상 신호로 인한 부작용 및 오프 대상 효과를 생산하고 있습니다. 약물 효과는 또한 뇌의 보상 반응에 시간이 지남에 따라 감소한다. 도전 따라서 표적으로 생리 방식 정상 중뇌 DA 시그널링을 복원하고, 선호 접근법 증가 또는 중뇌 DA 뉴런의 수를 감소시킴으로써이다.
증거는 SEV에 대한 축적 된(1 검토) 성숙한 성인 세포에서 대사와 인신 매매 DA 및 기타 카테콜아민에 관여하는 유전자와 단백질의 발현이 수정할 수 있음을 대한 일반적인 수십 년. TH immunonegative (TH-) 신경 세포의 수가 반대 패턴을 나타내고있다 중뇌, 티로신 수산화 효소 면역 양성의 개수 (TH +, DA 합성에서 속도 - 제한 효소) 뉴런은 (즉, 증가 신경독 투여 2,3- 따라 증가시킨다 감소 다음) 3을 감소시킨다. 이것은 다음 몇 가지 세포에 의한 'DA 표현형'의 이득 손실과 일치한다. TH-TH + 및 SNC 뉴런의 수는 이러한 셀 4,5의 전기적 활성도를 변경 다양한 치료 다음 동일하지만 반대 방향으로 변화하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 2 주 중뇌에 작은 컨덕턴스의 주입, 칼슘 - 활성화 된 칼륨 (SK) 채널 길항제 apamin는 (동일한 양으로)를 TH + 민과의 수가 증가 감소TH-SNC의 mber은 4,5 뉴런. 대조적으로, SK 채널 작용제 -1- EBIO의 주입 TH +의 수를 증가시키고 (동량)에 의해 TH-4,5- SNC 뉴런의 수를 감소시킨다. 비슷한 변화는 구 심성 입력 4를 대상으로하는 일부 포함 SNC 신경 세포의 활동을 대상으로 다양한 트리트먼트 다음 보였다. 구 심성 신경 활성 및 입력에 의해 SNC DArgic 뉴런의 수의 이러한 규정은 명백한 환경 또는 행동 SNC 뉴런의 수에 영향을 줄 수있는 가능성을 제기한다. 다른 환경에 노출 실제로 성인 마우스는 다소 중뇌 (VTA 및 SNC) TH + 뉴런, 이러한 환경에 의해 유도 된 변화들 중 적어도 일부 중뇌 6 시냅스 동시 입력의 봉쇄에 의해 폐지되어있다. (1) 우리의 환경 조작 및 약물 주입을 구현하는 방법에 대한 자세한 내용을 제공,이 통신의 목적은 할 수 있습니다 및 (2) E 우리의 경합을 더욱 지원 데이터를 제공 할nvironment은 구 심성 입력을 통해, 중뇌 DA 뉴런의 수를 조절한다.
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Protocol
참고 : 동물의 모든 실험 절차는 신경 과학 및 정신 건강 동물 윤리위원회의 플로리 연구소의 승인을 호주의 국립 보건 의학 연구위원회 (Medical Research Council)을 준수 하였다는 과학적인 목적을 위해 동물의 관리 및 사용에 대한 실천의 코드 (7 번째 버전을 발표 2004).
1. 환경 노는
- 성별 페어링
- 성적으로 성숙 (> 8 주 이전), 연령대 남성과 여성의 마우스를 사용합니다.
참고 : 우리는 일반적으로 C57BL / 6 마우스를 사용하지만,이 프로토콜에 스위스의 마우스를 사용하여 동일한 결과가 있었다. 우리는 일반적으로 N = (N = 4 수컷) N = 2 남성에서 남성 쌍으로 나누어, 각 실험에 대해 N = 8 수컷 및 N = 8 암컷을 사용하여 2 암형 암 쌍 (N = 4 암컷), 및 N = 4 남성 여성 쌍 (N = 4 남성과 N = 4 여성). - 동물 지주 시설, 그룹-집에 도착하자마자> 3 일간 성별 마우스는 순응한다. 여기 통해 서심은 성별 페어링, 외부 환경의 자극을 유지 (예 : 주위 온도, 빛 : 어두운주기, 음식, 물, 처리 및 청소) 상수 또는 모든 마우스에 동일하게 배포 할 수 있습니다.
- 무작위로 남성 - 남성 쌍, 여성 - 여성 쌍, 또는 암수 한 쌍의 각각의 마우스를 할당합니다. 음식과 물에 대한 광고 무제한 액세스 격리에 깨끗한 케이지 (2 마우스 / 케이지)에 각 쌍을 배치하고 단지 7 일간 계속이 방법으로 집.
참고 : 일상적인 축산이 기간 동안 OK이지만 모든 마우스에 동등하게 분배해야합니다. 남성과 여성의 한배 새끼의 페어링 않도록주의하십시오.
- 성적으로 성숙 (> 8 주 이전), 연령대 남성과 여성의 마우스를 사용합니다.
- 환경 심화
- 성적으로 성숙 (> 8 주 이전), 연령대 남성 또는 여성 마우스를 사용합니다.
참고 : 우리는 일반적으로 N = 6 / 치료 그룹으로 나누어 각 실험에 대한 N = 18 마우스를 사용합니다. - 그룹 보관 동일한 표준에 수납을 유지 동물 보유 시설에 도착하면 (SH) (예 : (예 : 주위 온도, 빛 : 어두운주기, 음식, 물, 처리 및 청소) 상수 또는 모든 마우스에 동일하게 배포 할 수 있습니다.
- 환경 농축을 시작하려면, 무작위로 세 그룹 중 하나에 각 마우스 할당 : SH를; 실행 휠 (RW), 또는 환경 농축 (EE)과 함께 음식과 물에 대한 광고 무제한으로 액세스 할 수있는 동일한 깨끗한 케이지에 마우스의 각 그룹을 배치합니다.
참고 : 모든 그룹은 여기, 더 큰 쥐 잡고 케이지, 42cm 길이, 폭 27cm를 측정하고, 깊은 16cm 사용 하였다.- 또한, 다음의 각 그룹의 환경 조건을 제공한다 : 유일한 바닥에 쓰레기를 포함 SH (종이 펠렛 또는 톱밥); RW 포함 SH 플러스 2 실행 바퀴; EE는 (로프, 사다리, 터널, 빈 종이 타월 롤과 조직 종이 조각 같은 개체) RW 플러스 장난감을 포함하는과 전에plore, 놀이, 등산, 숨기기와 둥지.
- 14 일 동안 계속해서 이런 식으로 그들을 집.
참고 : 일상적인 축산이 기간 동안 OK이지만 모든 마우스에 동등하게 분배해야합니다.
- 1시간 / 일 (같은 시간 매일), 오일은 / 주를 위해 새로운 장난감을 포함하는 더 큰 케이지에 그들을 함께 배치하여 추가 '슈퍼 농축'(SE)에 따라 EE 마우스.
참고 : 여기에, 46cm, 폭 69cm 길이와 40cm 깊이 플라스틱 욕조를 사용 하였다.- 장난감의 다른 세트 각 세션을 제시하여 새로운 항목을 유지한다. 청결한 장난감 비눗물와 냄새를 제거하기 위해 80 % 에탄올로 마우스에 다시 제시한다.
- 각 SE 세션에 이어, 자신의 EE 케이지에 마우스를 반환합니다. 핸들 SH 및 RW 마우스이 기간 동안 (SE 자체 제외) SE 마우스와 동일 (예 제거에서 그 케이지에 각 SH 및 RW 마우스를 반환).
- 성적으로 성숙 (> 8 주 이전), 연령대 남성 또는 여성 마우스를 사용합니다.
- 준비하기
- 상업적으로 사용할 수있는 살균 삼투 펌프 및 뇌 주입 키트를 사용합니다. 주입 전날, 무균 기술을 사용하여, 각각의 펌프를 충전 (펌프와 함께 제공되는 지침에 설명 된대로) 멸균 약물 또는 차량 솔루션 관과 정맥을 연결하여 주요 임플란트. 둘을 연결하고 37 ℃에서 하룻밤 멸균 식염수에 품어. 교차 오염을 방지하기 위해 별도 약물 및 차량 채워진 보형물을 품어.
- 수술.
참고 : 실험자의 국가에 따라이 특별한 동물 실험 허용하거나 수당은 수술과 수술 후 실험 이러한 유형을 추구해야합니다.- 모든 수술 장비를 소독 및 전반에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다. (예 : 공기의 1 ~ 2 % 이소 플루오 란 사용) 마우스를 마취하고 stere에 배치otaxic headframe. 절차 전반에 걸쳐 마취의 깊이를 확인하고 필요에 따라 추가로 마취 관리 (유해 발 핀치에 사지 철회 등이없는 것은 적절한 마취를 나타낸다). 확인 눈은 윤활유 눈 연고에 의해 탈수으로부터 보호, 마우스의 체온 절차 전반에 걸쳐 정상 유지됩니다.
- CM 두개골의 뒤쪽 가장자리에 후부 2 눈 사이와 마무리에서 시작하여 피부를 통해 중간 선 절개를합니다. 편안 펌프와 캐 뉼러 (연결 관이 완료되면 구부러진 수 없습니다) 이식되면 연결 관에 맞게 충분히 큰 피하 '포켓'을 만들기 위해 멀리 마우스의 뒷면 아래 기본 근막으로부터 피부를 해부 무딘. 두개골의 지느러미 측면을에서 근막을 취소 쳤어요.
- , 약 1.5 mm 직경의 치과 버를 사용하여 적절한 정위가 U 좌표에서 두개골에 드릴 다운ntil 뼈의 얇은 유연한 계층은 남아있다. 껍질 멀리 미세 집게를 사용하여이 계층 (이 치과 버와 기본 경막과 뇌 손상을 피한다). 확인 두개골은 혈액과 뼈 조각의 청소하지 않으며,이 있음을 더 이상 출혈.
- 정맥 홀더에 의해 유지 캐 뉼러로, 마우스의 뒷면을 덮는 피하 '주머니'에 펌프와 연결 관을 배치합니다. 이어서, 적당한 정위 좌표 및 뇌의 표면 상에 캐 뉼러의 선단 위치. 조심스럽게 뇌에 캐 뉼러를 낮출 수 있지만, 필요한 깊이의 짧은 약 1mm를 중지합니다.
주 : 나머지 깊이 치과 아크릴의 제 1 층의 도포 다음과 협상한다. - 두개골의 표면이 깨끗하고 건조 다시 확인한 후 치과 아크릴의 작은 볼륨을 준비하고 제 주위의 두개골을 통해 버 홀에 포함, 두개골의 전체 노출 영역에 그것을 부드럽게 이쑤시개를 사용전자 정맥. 아크릴 견고하기 전에, 캐 뉼러 대상으로 남아있는 깊이 팁을 낮 춥니 다.
- 장소에 캐 뉼러를 해결하기 위해, 캐 뉼러의 흰색 플라스틱 지원을 통해뿐만 아니라, 치과 아크릴의 또 다른 작은 볼륨을 준비하고 첫 번째 제품이 계층. 필요에 따라 아크릴의 추가 레이어를 반복합니다.
- 아크릴이 강화되면, 조심스럽게 캐 뉼러 홀더를 제거하고 부탄 불꽃으로 가열 메스 블레이드를 사용하여 흰색 플라스틱 이동식 정맥 탭을 잘라. 마지막으로, 전체 임플란트에 대해 닫혀 피부를 봉합.
- 동물의 수술 후 치료
- 피부 마진 살균 연고를 적용하고 마우스에 항 염증를 관리 (예 : 멜 록시 캄, 3 ㎎ / kg SC). 프레임에서 마우스를 제거 가열 램프 아래에 배치하고, 의식을 회복 할 때까지 관찰합니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 마우스를 반환하지 않습니다.
참고 : 특급성별 페어링 및 환경 농축 등 erimental 조작이 시작 또는 초기에 수술 다음 날 재개 할 수 있습니다. - 자신의 체중, 매일 일반적인 동작과 모양을 모니터링합니다. 국소 살균 연고와 수술 절개 주위 감염의 징후 (예 : 부종, 발적, 고름)을 취급합니다. 필요에 따라 전신 진통제 및 / 또는 항생제 징후 질병, 통증, 스트레스 또는 불편 (> 10 % 체중, 사회적 철회, 정리의 부족의 소멸, "플러 핑", 운동 장애, 발작) 치료.
- > 15 % 체중 감소 또는 질병, 통증, 스트레스 또는 불편 증상이 회복 처리 1 주일 이내에 복구 할 수없는 경우 쥐를 안락사.
- 피부 마진 살균 연고를 적용하고 마우스에 항 염증를 관리 (예 : 멜 록시 캄, 3 ㎎ / kg SC). 프레임에서 마우스를 제거 가열 램프 아래에 배치하고, 의식을 회복 할 때까지 관찰합니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 마우스를 반환하지 않습니다.
3. 뇌 조직 준비, 면역 조직 화학적 처리 및 Stereology를
- 관류
- 즉시 환경 / 약물 조작에 따라, 연구를 위해 뇌를 준비합니다.
- 먼저 (예 : 100 ㎎ / ㎏ IP 나트륨 펜토 바르비 톤) 쥐를 죽일 마취제의 과다 복용을 관리 할 수 있습니다. 일단 마취하지만 심장 박동이 정지하기 전에, 그 뒷면에 마우스를 놓고 넥타이 또는 두 앞발을 아래로 핀.
- 메스를 사용하면 흉부 후 복강으로 흉곽 아래의 근육을 절개 덮는 피부를 절단. 흉곽의 칼 모양의 과정에 클램프를 놓고 조리개 노출 간로부터 멀리 흉곽를 들어 올립니다.
- 다이어프램을 통해 측면으로 흉곽이 다시 폐와 심장을 노출 머리 접을 수있을 때까지 큰 가위를 사용하여 양쪽의 갈비뼈를 잘라. 미세 가위 종료 혈액 지점 및 관류 솔루션과 우심방의 작은 절개를 사용하여, 다음 왼쪽 ventri의 자료를 잘라사이클과 좌심실, 좌심방을 통해 정맥을 배치하고 대동맥에.
- 헤파린 따뜻한 (37 ° C)를 펌프 제자리에 캐 뉼러를 클램프과 우심방을 종료 솔루션까지 혈관을 통해 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (PBS)는 혈액 완전히 무료입니다. 전체 마우스가 잘 해결 될 때까지 다음, 혈관을 통해 감기 (4 ° C) 정착액 솔루션 (PBS에서와 같은 4 % 파라 포름 알데히드를) 펌프. 뇌 싱크까지 2~3일 30 % 자당에 PBS의 뇌와 장소를 제거합니다.
참고 : 조직 준비의 다른 유형은 해당 실험실에서 전문 지식에 따라 적용 할 수 있습니다.
- 즉시 환경 / 약물 조작에 따라, 연구를 위해 뇌를 준비합니다.
- 무료 부동 저온부의 준비
- 관심있는 뇌 영역을 통해 시리얼 부분을 잘라 PBS에이를 수집합니다.
참고 : 우리는 저온 유지 장치를 사용하여 40 μm의 두께 부분을 잘라. 조직 절편의 다른 유형의 correspondi 전문성에 따라 적용 할 수있다NG 실험실.
- 관심있는 뇌 영역을 통해 시리얼 부분을 잘라 PBS에이를 수집합니다.
- 면역 조직 화학
- 관심의 단백질에 대한 표준 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 48 시간 동안 39 ° C에서, (400 (1)) 다음, 폴리 클로 날 오티 닐화 염소 항 폴리 클로 날 토끼 항 TH와 다음, 30 분 동안 immunoreact를 실온에서 PBS 중 5 % 정상 염소 혈청과 0.3 % 트리톤 X-100의 섹션을 인큐베이션 실온에서 2 시간 동안 : -rabbit (1000 1).
- 18-20 분 동안 실온에서 다음과 니켈 - 코발트 - 강화 미노 벤지딘 (0.5 ㎎ / ㎖)에서 1 시간 동안 실내 온도에서 : 다음에, 아비딘 - 퍼 옥시다아제 (500 1)에서 부화 미노 벤지딘 인큐베이션 마지막 크로마 3-5 분 동안 침전을 촉매 과산화수소 (0.01 %)를 추가한다. 전, 후, 그리고 위의 각 단계 사이에 PBS 섹션을 10 분 3 회 각을 씻으십시오.
- 다음, 공기를 건조, 젤라틴 현미경 슬라이드에 Nissl 얼룩 (중립 적색) 섹션을 탑재, 알코올, 분명 (X-3B), 및 커버 슬립 탈수.
- 공평 stereological 방법을 사용하고 TH-TH + SNC (VTA 및 및 LC) 뉴런의 수를 추정한다. stereologist받은 치료에 눈이 있는지 확인합니다. 소마 지름 <5 ㎛ 인 기초 신경교 제외하고 가시 핵과 셀만 카운트.
- TH + 세포와 Paxinos 왓슨 (7)의 뇌지도 책에 따라 해부학 적 / 경계의 공간 위치하여 SNC (과 VTA와 LC)를 확인합니다. (; X = 100 ㎛, Y = VTA와 LC 100 μm의 X = Y 140 μm의 = SNC 140 μm의) 정기적으로 미리 정해진 간격으로 계산 프레임 내에서 TH + 세포 (55 X 55 μm의 = 3025 μm의 2) 카운트 매 4 번째 섹션의 각 핵에 걸쳐.
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Representative Results
이러한 환경 조작을 실시 성인 마우스는 중뇌의 숫자 (SNC와 VTA),하지만 LC를 변경 한 TH + 뉴런, EE 플러스 피크로 톡신 또는 bicuculline 하나의 동시 중뇌 주입 (GABA 수용체 길항제) 및의 EE-유도를 폐지 더 SNC TH + 뉴런. 이 자료는 이전에 6 년에 출판되었다. 본 데이터는 이전 연구의 일환으로 수행 복제 실험에서 컴파일 된,하지만 다른 곳에서 출판되지 않았다.
특히, 성인 여성 쥐와 결합 된 성인 남성 마우스는 더 TH +이 여성 (그림 1에서와 짝을 여성보다 더 적은 TH + SNC와 VTA 신경 세포가 수컷과 짝 여성 반면 SNC와 VTA (중뇌) 남성과 짝 남성보다 신경 세포, 6). 이의 또 다른 예는 fo를 TH + SNC 남성 뉴런과 여성의 쥐의 SE 번호 ± 평균을 바로 보여줍니다 그림 1, 여기에 제공llowing 성별 페어링. 7 일간 여성과 짝 남성은 남성 (그림 1의 두 개의 파란색 열)와 짝을 남성보다 약 12 % 더 TH + SNC 신경 세포가있다. 반면, 남성과 짝 여성은 여성 (그림 1에서 두 개의 빨간 열)와 짝을 여성보다 약 12 % 적은 TH + SNC 신경 세포가있다.
TH + SNC와 VTA 신경 세포의 수는 EE (6 그림 2)에 따라 성인 남성 생쥐에서 증가하고, 더 SNC TH + 뉴런의 EE-유도는 중뇌 GABA의 수용체 (6 그림 3)의 동시 봉쇄에 의해 폐지된다. 이의 또 다른 예는 차량 주입과 EE는 차량 주입 (그림 2의 왼쪽 두 개의 열)와 SH보다 약 14 % 더 TH + SNC 뉴런 결과 그림 2, 여기에 제공됩니다. 그러나, EE와 GABA 수용체 길항제 주입 (10 μM의 5 중 피크로 톡신1, 완전히이 증가 (그림 2의 오른쪽 두 개의 열) 폐지 M의 bicuculline). 이러한 데이터는 주입 정맥에 SNC의 반대편에서, 그리고 6에보고되었다 동측 SNC에서 관찰 된 효과 거의 동일, 참고.
그림 1 :. SNC의 TH + 뉴런의 수에 성별 페어링의 효과 즉시 성인 마우스 (3.1) 관류 성 페어링 (프로토콜 1.1) 7 일 다음, 자신의 중뇌가 구분되었다 (3.2), 섹션은 TH (티로신 수산화을 위해 처리 된 , DA 합성 효소 속도 제한) 면역 조직 화학 (3.3), 및 SNC + TH 뉴런의 번호) Stereology를 (3.4를 이용하여 추정 하였다. 수컷 마우스 (N = N = 2 남성 - 남성 쌍에서 4 수컷 마우스, 라이트 블루 (COL)와 짝을 수컷 마우스에 SNC TH + 뉴런의 SE 번호 ± 평균은 현재 플로팅) UMN, 여성 (과 짝 남자 6 예 남성 여성 쌍, 진한 파란색 열), 여성 (와 짝 여자 6 수컷 마우스 N = N = 4 여성 - 여성 쌍, 라이트 레드 열) 및 8 암컷 마우스 남성 (N = N에서 6 암컷 마우스 = 6 남성 여성 쌍, 어두운 붉은 열)와 짝을 여성. 이성과 페어링이 남성에 SNC의 TH + 뉴런의 수가 증가하지만 여성의 SNC TH + 뉴런의 수가 대조군에 비해 유의 한 감소를 보였다 (P <0.001 편도 ANOVA * P <0.05 Tukey의 페어 여러 비교).
그림 2 : 중뇌 GABA와 환경 농축의 효과 SNC TH + 뉴런의 수에 대한 수용체 차단 즉시 차량 중 하나의 동시 주입, GABA 수용체 길항제 피와 환경 농축 (프로토콜 1.2) 14 일 다음과 같습니다.icrotoxin (10 μM), 또는, 성인 수컷 마우스가 관류 좌측 중뇌로 GABA 수용체 길항제 bicuculline (5 μM) (프로토콜 2) (3.1), 그들의 중뇌 절편 하였다 (3.2), 섹션 (티로신 수산화 효소에 대해 처리 하였다 TH, DA 합성) 면역 조직 화학 (3.3)의 속도 제한 효소, 오른쪽에서 TH + 뉴런의 수는 (반대측) SNC)는 Stereology를 (3.4을 사용하여 추정 하였다. (SH) 차량 주입 (N = 6, 라이트 블루 열), 환경 농축 (EE)와 수컷 마우스 보관 표준에 SNC TH + 뉴런의 SE 번호 평균 ±가 현재 플로팅는 (N = 6, 먼저 어두운 파란색 차량 주입과 수컷 열), EE는 bicuculline 주입 (N = 6, 세 번째 다크 블루 열)와 피크로 톡신 주입 (N = 6, 둘째 진한 파란색 열) 및 EE 남성과 수컷. EE는 SNC의 TH + 뉴런의 수의 증가에 나 섰으나이는 <0.001 편도 ANOVA 반대편 중뇌에 피크로 톡신 또는 bicuculline의 주입에 의해 (페이지 폐지; * P <0.001 Tukey의 페어 여러 비교).
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Discussion
환경 조작
이러한 조작 환경 (성별 페어링 및 환경 농축)의 디자인 뒤에 동기 환경 여부를 확인하는, 그리고 / 또는 동작 환경에서 메시지는 중뇌 DA 신경 세포의 수의 변화와 연관된다. 초점은 환경을 제공하고 중뇌 DA 신호를 참여 가능성이 행동을 자극에 따라서이었다. 이러한 이성에 포함 된 페어링하고, 놀이를 탐험 등반, 숨길 바퀴, 로프, 사다리, 터널, 및 개체를 실행하고 둥지에 대한 액세스를 포함하는 환경 농축. 이러한 환경은 모두 중뇌 DA 신경 방전 급성 증가하고 DA 릴리스와 관련 된 보상 동기 부여인지, 감정 및 모터 행동을 육성한다고 (예 : 8). 우리의 가설은 또한 중뇌 DA 신호 BR에서 오래 지속되는 변화와 관련되어 있었다중뇌 DA 신경 세포의 수의 변화는 약 에게서는. 여기에 다른 곳에서 6, 증거는이 참 경우가 있음을 제시한다.
우리의 조사는 핵심 원시 필수 보상 동기 부여 행동 (즉, 교미)를 포함하기 때문에 성별 페어링 프로토콜 (1.1)를 사용하기 시작했다. 또한, 생식, 한 쌍의 결합, 사회적 행동은 (옥시토신, 바소프레신과 시상 하부 9 corticotrophin-호르몬 분비 호르몬 세포의 밀도 등의 변화)와 유사한 다른 신경 화학적 시스템의 변화를 유도하는 것으로 알려져있다. 실제로, 이성 연속 페어링 7 일 후, 우리는 여성이 약 10 % 적은 TH + 중뇌 신경 세포 [참고 반해 남성은 약 10 % 더 TH + 중뇌 신경이 6 여기에 다른 곳에서 보여 이러한 효과는 SNC를 포함한다 (본 연구와 6) 및 6 VTA 아니지만 TH]는 노르 아드레날린의 합성 도와 궤적 coeruleus 6.이것은 성인 뇌 중뇌 DA 뉴런의 수가 고정되지 않는다는 개념을 지원하지만, 변화는 환경 문제 또는 환경 / 동작의 상호 작용에 따라. 다른 증거는 DA의 신경 또는 변성 반대로 이러한 변화는, 현존하는 중뇌 신경 세포에서 TH 유전자 및 단백질의 발현의 변화에 의해 초래되는 주장한다. (1) 성인 마우스 중뇌에서 DA의 신경 중 하나 전혀 10-14, 또는 일주일에 15, 16에서 약 500 새로운 SNC DA 뉴런의 추가를 설명 할 수있는 것보다 훨씬 낮은 속도에서 발생한다. (2) 중뇌 신경 세포의 전기적 활동을 대상으로 다양한 약물의 이주 주입 한 다음 SNC 신경 세포의 수의 변화를 정량화하는 연구가 지속적으로 더 그물 변화의 결과로, +와 TH-세포 TH (다시 약 10 %)과 동일하지만, 반대의 변화를 밝혀 총 세포 수의 4,5. 이것은 상술 TH 단백질 수준 조절 또는 면역 조직 아래 DET와 일치추가 또는 신경 세포의 뺄셈없이 ectable 수준. (3) 대부분의 연구는 여러 시간의 17-23 시간 틀 위에 TH 세포 내의 유전자 및 단백질 발현의 활성 - 의존성 변화를보고 있고,이 동일한 중뇌 4에보고되었다.
문제는 이렇게 현존하는 중뇌 신경 세포에서 TH 유전자 및 단백질의 발현의 변화를 기본 메커니즘이 무엇인지 발생한다. 가능성은 여기에 이전에 6보고 페어링 다음 잘 성별 별 변경 (남성의 증가는 여성의 감소)로, 남성과 여성의 TH + 중뇌 신경 세포 수의 기준 차이에 잠재있다 성 스테로이드를 포함한다. 또 다른 가능성은 TH의 발현 조절 활성 의존적이다. SNC와 VTA 뉴런 (DA 및 비 DA 모두) 선조체 (striatum), 시상 하부, 시상 핵에서 주로 시냅스 입력을 수신하고, 정면은 24 피질. 성별 페어링, 이러한 입력의 맥락에서감각 행동, 후각, 페로몬, 스트레스, 신진 대사, 또는 재생에 의해 조절 될 수있다. TH 표현의 활동에 의존하는 규제는 유전자 및 단백질 발현에 영향을 미치는 칼슘 또는 신경 펩타이드 신호 경로를 통해 매개 될 수있다 (예 : 1).
중뇌 DA 뉴런의 수에 성별 페어링의 효과를 기본 활동에 의존하는 메커니즘은 우리가 성 스테로이드 그리고 아마도 다른 호르몬의 잠재적 인 영향에 대한 환경 농축 프로토콜 (1.2), 더 나은 컨트롤을 사용 대 (성 스테로이드 사이에 구별 할 수 있도록하려면 예를 들어, 페로몬, 스트레스, 재생) 및 구 심성 중심의 신경 세포 활동의 잠재적 인 영향에 대한. 여기에 관련된 요인은 다른 그룹 남녀의 관점 (모든 남성), 호르몬, 사회적 지위와 스트레스에 훨씬 더 비슷하다. 사회적 지위와 스트레스는 여전히 (그룹간에 다를 수 있지만 예를 들어, 더 지배적이고 공격적인 남성하나의 그룹)에서, 이것이 항상 동일한 그룹 (예 EE) 및 EE의 효과 지금 6을 복수 회 복제 된 일 것이다 어렵다. EE에서, 중뇌 TH + 신경 세포의 증가의 크기는 성별 페어링 프로토콜과 동일했다 (그림 1, 2 본 연구에서 남성을 비교하고, 1 & 2 6 피규어). 또한, 환경 농축에 의해 유도 된 SNC TH + 뉴런의 EE에 의한 증가는 완전히 중뇌 DA에 모든 구 심성 입력의 약 70 %를 제공 중뇌 GABA의 수용체 (그림 2 본 연구 6 그림 3)의 동시 봉쇄에 의해 폐지되었다 (25) 뉴런. 함께, 이러한 데이터는 구 심성 중심의 신경 활동이 호르몬 등의 중뇌 DA 뉴런의 수에 적어도 강력한 영향이다 나타냅니다.
사실상 환경에 더 통찰력중뇌 TH + 뉴런의 수를 조절하는 RS는 RW 및 EE의 효과를 비교에서 온다. EE는 더 다양한에도 불구하고, 이러한 활동의 유사한 양을 포함한다 (즉, 다양한 장난감하지만 변경 십사일에 걸쳐), 플러스 새로운 장난감에 지속적으로 노출 반면 RW는 잘 배운 또는 평범한 모터 활동 (바퀴에서 실행)을 포함 SE 구성 요소 (1.2.4). 우리의 이전에 게시 된 데이터 6 밝혀 중 하나없이 또는 SH 마우스에 비해 RW에서 SNC와 VTA TH + 뉴런의 작은 증가하지만 EE (+ SE) 쥐에서 훨씬 더 큰 증가한다. 이것만으로도 평범한 신체 활동보다 중뇌 DA 뉴런의 수를 더 강력 규제 등의 감각 자극,인지, 참신 및 / 또는 학습과 기억을 강조한다.
EE는 알츠하이머 병, 헌팅턴병 및 파킨슨 병 (26)과 같은 뇌 질환의 여러 동물 모델에서 뇌 수리 치료 효과를 유도하고 향상시키기 위해 광범위하게 사용되어왔다. NA이러한 환경 조작의 진짜야은, 그러나 주목할 만하다 이전되어 27 논의한 EE 프로토콜의 주요 측면이있다 ( '표준 보관'조건처럼) 실험실 사이에 광범위하게 다를 것입니다. 감각 자극,인지 및 운동 활동의 레벨을 향상시킬 수 있도록 향상된 EE는 환경 신규성 및 표준 하우징에 대해 증가 된 복잡성을 제공한다. EE 실험 설계에서, 하나의 동물의 감각과인지 능력과 본능적 드라이브를 포함 ethological 요인을 고려할 필요가있다. 마우스 (쥐)이 인간하지만 뛰어난 감각과 후각 acuities 열등 시각적 인 능력을 가진, 야행성으로, 농축 객체는 실험 동물의 타고난 본능과 능력을 반영해야한다. 따라서 마우스에 특히 두드러진 될 수있는 개체의 참신, 모양, 질감과 냄새입니다. 설치류 '모티의 상대 강도의 평가씹을 수있는 객체의 포함이 기회 기본적인 종 전형적인 행동 (28, 29)을 행사할 수 있도록하는 농축 객체의 다양한적인 혁신은 권장 사항을 주도했다. 둥지 재료의 제공 따라서 감각,인지 및 모터 활동 (30, 31)에 대한 기회를 제공하고, 본능적으로 종이 또는 판지로 만들어진 물건을 찢어 것 농축 프로토콜 및 마우스의 기본 구성 요소로 간주됩니다. 이는, 오브젝트의 등가 신규성 복잡성 EE 그룹 내 분산을 최소화하고, 환경 파라미터의 유사한 제어는 SH 그룹 요한다 제공된다 여러 EE 케이지와 실험에서 또한 중요하다. 이상적으로, 케이지 당 마우스의 수는 EE 및 SH 기 (사회적 그룹 크기의 효과를 구체적으로 연구되고있다 제외) 사이의 동일해야하고, 더 '음식 취급이'그룹 사이의식이 차이로서, EE에 사용되어서는 안된다 있었던 혼란 tEE 12인지 향상 활동 및 운동의 효과 고 해석. 다른 주요 고려 사항이 풍부한 환경에 노출 기간과 농축이 시작하는 나이입니다. 유전자의 차등 발현이 풍부한 환경에서 32 시간 후에 3 만 도시 하였지만, 장시간 노광이 발생하는 33,34 구조적 및 기능적 변화를 요구할 수있다. 또한, 농축에 의한 소성은 출생 중요한 개발 기간 35 동안 향상 될 수있다.
약물 주입 용 삼투 펌프 및 뇌 정맥 주입 임플란트
삼투 펌프 및 정맥 임플란트는 직접 뇌에 약물을 전달하기위한 매우 효과적이다. 경험을 바탕으로 임플란트 수술은 마우스 당 약 1 시간 소요됩니다. 혼자 치과 아크릴 장기간 (주 장소에서 캐 뉼러를 해결하기에 적절하다 : 우리는 O를 28 일 갔다거기는 실험); 이러한 뼈 나사와 같은 추가적인 하드웨어에 부착 할 필요가 없다. 그것은 연결에 너무 많은 스트레스를주지 않고 최대한의 머리와 목의 굴곡을 허용하기 위해 펌프와 정맥을 연결하는 튜브에 여유가 많이이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 특히함으로써 임플란트의 유연성을 감소 펌프 주위 결합 조직의 성장이 제자리에 고정 할 수 장기 주입 용 그렇다. 가능한 경우, 마우스는 또한 단일 보관, 긁힘 잡아 당기거나 물고을 통해 임플란트를 손상 동거를 방지하기 위해 수술을 따르고 있습니다. 약물의 투여 량은 크게 펌프 추가 량에 의해 결정된다. 그러나,이 점에 또한 주목 펌프 유량, 37 ° C에서의 약물의 화학적 안정성, 및 뇌를 통해 캐 뉼러로부터 약물의 확산 속도를 기울여야한다. 현재 우리의 공급 업체에서 제공하는 펌프는 0.15 μL / hr의 유량에서 최대 6 주 동안 주입을 유지할 수있다; 빠른동부 표준시 사용할 수 유량은 10 μL / 시간 만 일주 동안 지속됩니다. 긴 주입 시간 (이식 캐 뉼러를 방해하지 않고 IE) 연결 관의 뒷면 전체 펌프 고갈 펌프를 대체하기 위해 추가적인 보조 수술을 수행함으로써 달성 될 수있다. 캐뉼라 끝에서 확산 (0.9 %, 염화나트륨 1 % 메틸렌 블루, MW 320) 메틸렌 블루의 공간적 범위는 mediolateral 측면을 따라 좌측 SNC 도중에 상기 0.3 mm가 행 중뇌의 측면 모서리로부터 연장 측정되었다 주입 단지 mediolaterally 중간 선에서, 그리고 중뇌의 전체 dorsoventral 정도에 걸쳐 (주입 2 주 후). 이 훨씬 더 광범위하게 SNC 같은 작은 핵보다, 약물의 확산 등의 MW, 화학적 안정성, 버퍼링에 실제로, 하나는 현재의 데이터로부터 추론 할 수있다을 따라 더 큰 (이하) 할 수있다 (그림 2) 그 피크로 톡신과 bicuculline 모두 생물학적 활성 concentrati에서 반대측 SNC에 도달기능.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
- Aumann, T., Horne, M. Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons. Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).
- Sauer, H., Oertel, W. H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience. 59, 401-415 (1994).
- Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat. The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).
- Aumann, T. D., et al. Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons. Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).
- Aumann, T. D., et al. SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta. Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).
- Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice. Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic Press. (2001).
- Schultz, W.
- Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry. Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).
- Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).
- Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).
- Lie, D. C., et al. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).
- Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor. Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).
- Yoshimi, K., et al. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).
- Shan, X., et al. Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice. Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).
- Zhao, M., et al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).
- Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).
- Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion. Brain research. 339, 151-153 (1985).
- Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).
- Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).
- Richard, F., et al. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).
- Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).
- Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons. Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).
- Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 74, 858-873 (2012).
- Tepper, J. M., Lee, C. R. GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons. Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).
- Hannan, A. J. Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity. Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Chmiel, D. J., Noonan, M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).
- Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects. Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).
- Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).
- Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).
- Rampon, C., et al. Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).
- Eckert, M. J., Abraham, W. C. Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus. Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).
- Sztainberg, Y., Chen, A. An environmental enrichment model for mice. Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).
- Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy. Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).
