Summary

Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

Published: December 24, 2014
doi:

Summary

Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.

Abstract

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

Introduction

Boden ist dicht mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien 1,2 besiedelt. Jedoch Bedingungen in diesem Lebensraum sind anspruchsvoll, vor allem in Bezug auf die Verfügbarkeit von Wasser 3. Bakterien dauerhaft müssen für optimale Bedingungen in heterogenen Umgebungen 4 suchen, aber das Fehlen von kontinuierlichen Wasser Filmen führt zu eingeschränkter Mobilität 5 behindern sie frei verteilen. Auch sind Diffusionsraten von gelösten Stoffen (zB Nährstoffe) unter ungesättigten Bedingungen 6 gesenkt. So werden Bakterien und Nährstoffe oft physisch getrennt und Nährstoff Zugänglichkeit begrenzt ist 3. Als Folge könnte ein Transportvektor für chemische Verbindungen, die nicht einen kontinuierlichen Wasserphase erfordern, hilft, diese Einschränkungen zu überwinden. In der Tat haben viele Mikroorganismen wie Pilze und Oomyceten ein filamentöses Wachstum bilden damit sie durch luftgefüllten Porenraum wächst dadurch erreichen und mobi entwickeltlizing auch körperliche getrennt Nährstoffe 7 und 8 kohlenstoffhaltigen Substanzen über lange Distanzen. Sie können sogar als biologische Transportvektoren, die Zucker und andere Energiequellen, um Bakterien 9 liefern zu handeln. Aufnahme und dem Transport in Myzel Organismen wurde auch für hydrophobe organische Schadstoffe, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in Pythium ultimum 10 oder in arbuskulären Mykorrhizapilzen 11 gezeigt. Seit PAH sind allgegenwärtig und schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen 12 im Boden könnte Mycel-vermittelten Transport helfen, Verunreinigung Bioverfügbarkeit für potenzielle Bakterien Abbauern erhöhen. Während der Gesamtbetrag der Schadstofftransport direkt durch chemische quantifizieren Mittel 10, die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen durch Myzel zu abbauenden Bakterien und anderen Organismen transportiert nicht leicht zu beurteilen.

Das folgende Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen myce evaluierenlia auf Schadstoff Bioverfügbarkeit um bakterielle Abbauern in direkter Weise; sie ermöglicht das Sammeln von Informationen über die räumlich-zeitliche Auswirkungen von Schadstoffen auf die mikrobielle Ökosysteme. Wir beschreiben, wie Sie eine ausführliche ungesättigten Mikrosystem imitiert Luft-Wasser-Grenzflächen in Böden durch die Verknüpfung von ein physikalisch getrennt PAH Punktquelle mit PAK-abbauenden Bakterien Bioreporter über Myzel Transportvektoren. Weil Luftverkehr ausgeschlossen ist, kann die Wirkung der Myzel-basierten Transport auf PAH Bioverfügbarkeit für Bakterien in einer isolierten Art und Weise untersucht werden. Im Einzelnen wurden drei-Ring PAK Fluoren, das Myzel Organismus Pythium ultimum und die Bioreporter Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-MCHe 13 in den beschriebenen Mikrokosmos Setups angewendet. Das Bakterium B. sartisoli RP037-MCHe wurde ursprünglich konstruiert, Phenanthren Flüsse an die Zelle 14 zu untersuchen und exprimiert enhanced green fluorescent protein (eGFP) als ein Ergebnis der PAH Flußmitteldie Zelle, während die rot fluoreszierende mCherry konstitutiv exprimiert wird. Detaillierte Informationen zu dem Reporter Bau von Tecon et al. 13 In Vorversuchen gegeben, zeigte das Bakterium keine Schwimmen und nur sehr langsam Schwarmfähigkeit. Es konnte sich langsam auf Hyphen von Pythium ultimum wandern, wenn als dichte Suspension wurde auf den Hyphen aufgebracht. Da Bakterien wurden in Agarose in dem folgenden Protokoll eingebettet ist, hat Migration auf Hyphen nicht auftritt.

Mit Hilfe der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) können die Bioreporter Bakterien direkt in den Mikrokosmen visualisiert werden und die Expression des eGFP kann in Bezug auf die Menge von Zellen (proportional zur mCherry Signal) mit Hilfe der Software ImageJ quantifizieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bioverfügbarkeit qualitativ in verschiedenen Szenarien (dh höher oder niedriger). FLU gefunden bioverfügbar nach Myzel Transport von P. zu sein ultimum (dh eshöher war als bei einer negativen Kontrolle). Außerdem wird das Protokoll beschreibt, wie die Gesamtmenge der Myzelien-vermittelte Transport über chemische Mittel zu quantifizieren und Verunreinigung Bioverfügbarkeit Überprüfung mittels silikonbeschichteten Glasfasern (SPME-Fasern) in identischen Mikrokosmen. Ergebnisse mit diesem Mikrokosmos Setup veröffentlicht wurden und für die Kombination von P. diskutiert ultimum, Fluoren und B. sartisoli RP037-MCHe 15. Hier liegt der Fokus auf einer detaillierten Beschreibung und Methode der Identifizierung von möglichen Gefahren des Protokolls, dieses Wissen für mögliche weitere Anwendungen. Weitere Anwendungen kann es sich um verschiedene Pilz-, Bakterien- Spezies (zB von verunreinigten Standorten), und andere Verunreinigungen (zB Pestizide) oder schadstoffVersorgung (zB, im Alter von Böden).

Protocol

1. Vorbereitung der Gerichte, Slides und Inkubationskammern Bereiten Sie das folgende Material für jeden Mikrokosmos: eine große Kunststoff-Petrischale unten (d = 10 cm), ein modifiziertes (siehe Schritt 1.2) kleine Kunststoff-Petrischale unten (d = 5 cm) mit Deckel und einer Zählkammer Rutsche mit drei Hohlräumen. Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Petrischale Unterteile (d = 5 cm). Entfernen Sie Teil der Rand mit einer Säge passgenau einen Schieber (26 mm Kantenlänge). Um das System zu st…

Representative Results

Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits früher 15 veröffentlicht. Bitte auf den Artikel für detaillierte mechanistische und Umweltdiskussion verweisen. Nach Bildaufzeichnung über CLSM kann ein Maximum Intensity Projection mit dem entsprechenden Mikroskop-Software oder ImageJ, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und die Bedienelemente (Abbildung 2) zu gewinnen durchgeführt werden. Später können die Datensätze unterschiedlich, um sinnvo…

Discussion

Die vorgestellte Mikrokosmos Setup als geeignet, um die Bioverfügbarkeit von räumlich getrennten Chemikalien abbauenden Organismen nach der Aufnahme und den Transport von Myzel zu studieren. Potenzielle Gasphasentransport von teilweise flüchtigen Verbindungen verhindert und bakterielle Bioreporter Zellen können ohne aufwändige Probenvorbereitung mit minimaler Störung des sensiblen System visualisiert und somit werden. Gleichzeitig kann die chemische Analyse der Probe leicht durchgeführt werden was eine gute Kontr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest
  Solution 1
    Ammonium sulfate  Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
    Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
    Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
  Solution 2
    Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
    Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
  Solution 3 pH 6.0
    Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
    Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
    Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
    Manganese(II) chloride x 1 H2O        Carl Roth   4320.2 10 mg L-1
    Copper(II) sulfate Carl Roth  P023.1 1 mg L-1
    Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth  0274.1 3 mg L-1
    Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
    Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
    Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
    Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
    Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
    Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
    Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2 %
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8
    Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
    Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK  1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
    Yeast extract Merck 1037530500
    Tryptone Serva 4864702
    Sodium chloride Carl Roth 3957.1
imageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

References

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Cite This Article
Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

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