Summary

ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه

Published: December 24, 2014
doi:

Summary

ووضعت كله فحص bioreporter زنزانة مع بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe للكشف عن الكسور من الملوثات العضوية (أي fluorene) المتاحة للتدهور البكتيري بعد النقل النشط من قبل فطر سد المسام المليئة الهواء في نظام نموذجي غير المشبعة بالمياه.

Abstract

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

Introduction

وذات الكثافة السكانية العالية التربة عن طريق مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا 1،2. لكن الأوضاع في هذه الموائل تشكل تحديا، ولا سيما من حيث توافر المياه 3. البكتيريا تحتاج بشكل دائم للبحث عن الظروف المثلى في البيئات غير المتجانسة ولكن عدم وجود أفلام المياه مستمرة يسفر عن التنقل محدود 5 تعوق لهم لنشر بحرية. أيضا، يتم خفض معدلات انتشار المواد المذابة (على سبيل المثال، والمغذيات) في ظل ظروف غير المشبعة 6. وهكذا، والبكتيريا والمواد المغذية وغالبا ما يفصل جسديا وسهولة الوصول إليها المغذيات يقتصر 3. ونتيجة لذلك، يمكن لناقلات النقل للمركبات الكيميائية التي لا تتطلب المرحلة المياه مستمرة تساعد على التغلب على هذه القيود. في الواقع، قد وضعت العديد من الكائنات الدقيقة مثل الفطريات والفطريات البيضية شكل النمو الخيطية تمكينهم من النمو من خلال مساحات مليئة بالهواء المسام وبالتالي الوصول إلى وموبيLIZING أيضا المادية فصل المواد المغذية 7 و 8 المواد الكربونية لمسافات طويلة. حتى أنها قد تكون بمثابة موجهات النقل البيولوجية التي توفر السكريات ومصادر الطاقة الأخرى للبكتيريا 9. وقد تبين أيضا امتصاص والنقل في الكائنات أفطوري للملوثات العضوية مسعور مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAH) في Pythium ultimum 10 أو في الفطريات مايكورهيزال arbuscular 11. منذ PAH هي الملوثات في كل مكان وسيئة للذوبان في الماء 12 في التربة، والنقل بوساطة فطر قد يساعد على زيادة التوافر البيولوجي الملوثات البكتيرية للdegraders المحتملة. في حين أن المبلغ الإجمالي للنقل الملوثات يمكن قياسها كميا مباشرة الكيميائية يعني 10، التوافر البيولوجي للملوثات نقلها بواسطة فطر المهينة البكتيريا وغيرها من الكائنات لا يمكن تقييمها بسهولة.

يعرض بروتوكول التالية طريقة لتقييم أثر myceليا على التوافر البيولوجي الملوثات إلى degraders البكتيرية بطريقة مباشرة. لأنها تتيح جمع المعلومات عن تأثير الزماني المكاني من الملوثات الميكروبية على النظم الإيكولوجية. نحن تصف كيفية إنشاء نظام مصغر غير المشبعة تفصيلا محاكاة واجهات بين الهواء والماء في التربة عن طريق ربط مصدر نقطة PAH فصل جسديا مع bioreporter البكتيريا PAH المهينة عبر ناقلات النقل أفطوري. لأنه يتم استبعاد النقل الجوي، وتأثير النقل على أساس أفطوري على الهيئة العامة للإسكان التوافر الحيوي للبكتيريا يمكن دراستها بطريقة معزولة. في مزيد من التفاصيل، تم تطبيق ثلاثة عصابة PAH fluorene، الكائن فطر Pythium ultimum وbioreporter بكتيريا بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe 13 في الاجهزة مصغرة وصفها. بكتيريا B. شيد sartisoli RP037-mChe أصلا لدراسة تدفقات فينانثرين إلى الخلية 14 وتعرب عن تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) نتيجة لتدفق الهيئة العامة للإسكان لالخلية، في حين أن الاستشعاع الأحمر يتم التعبير عن mCherry جوهري. وترد معلومات مفصلة عن بناء مراسل كتبها TECON وآخرون 13 في الاختبارات الأولية، وكشف البكتيريا لا السباحة وفقط بطيئة للغاية القدرة يحتشدون. كان قادرا على الهجرة ببطء على خيوط من Pythium ultimum عند تطبيقه كما وقف كثيفة على الجزء العلوي من خيوط. منذ جزءا لا يتجزأ من البكتيريا في الاغاروز في البروتوكول التالي، لم الهجرة على خيوط لا يحدث.

باستخدام متحد البؤر المجهري المسح الضوئي ليزر (CLSM)، والبكتيريا bioreporter يمكن تصور مباشرة في عوالم مصغرة والتعبير عن EGFP يمكن قياسها كميا بالنسبة لكمية من الخلايا (متناسبة مع إشارة mCherry) مع مساعدة من يماغيج البرمجيات. وهذا يسمح بمقارنة التوافر البيولوجي نوعيا في سيناريوهات مختلفة (أي أعلى أو أقل). تم العثور على FLU أن يكون بيولوجيا بعد نقل فطر من قبل P. ultimum (أي أنهكان أعلى مما كانت عليه في المراقبة السلبية). وعلاوة على ذلك، يصف بروتوكول كيفية تحديد المبلغ الإجمالي النقل بوساطة فطر عبر الوسائل الكيميائية وللتحقق من التوافر البيولوجي الملوثات باستخدام الألياف الزجاجية المغلفة السيليكون (الألياف SPME) في عوالم مصغرة متطابقة. النتائج باستخدام هذا الإعداد مصغرا وقد نشرت ومناقشتها لمزيج من P. ultimum، fluorene وB. sartisoli RP037-mChe 15. هنا، يكمن في التركيز على وصف طريقة مفصلة وتحديد المخاطر المحتملة للبروتوكول لتوفير هذه المعرفة لتطبيقات أخرى محتملة. قد تنطوي على مزيد من التطبيقات الفطرية المختلفة والأنواع البكتيرية (على سبيل المثال، من المواقع الملوثة)، وغيرها من الملوثات (مثل مبيدات الآفات) أو الملوثات إمدادات (على سبيل المثال، والتربة الذين تتراوح أعمارهم بين).

Protocol

1. إعداد أطباق، والشرائح والحضانة الغرف إعداد المواد التالية لكل مصغرة: البلاستيك واحد كبير بيتري أسفل الطبق (د = 10 سم)، واحدة المعدلة (انظر الخطوة 1.2) صغير من البلاستيك بيتري أسفل الطبق (د = 5 سم) مع أغطية واحد العد غرفة ال…

Representative Results

وقد تم بالفعل نشر النتائج المعروضة هنا في وقت سابق 15. يرجى الرجوع إلى مقالة للنقاش الميكانيكية والبيئية التفصيلية. بعد تسجيل صورة عبر CLSM، ويمكن إجراء الإسقاط كثافة الحد الأقصى باستخدام برنامج المجهر منها أو يماغيج للحصول ع…

Discussion

أثبتت الإعداد مصغرة عرض مناسب لدراسة التوافر البيولوجي للمواد الكيميائية فصل مكانيا للكائنات بعد امتصاص ونقل بواسطة فطر مهينة. يتم منع المحتملين النقل طور الغاز من مركبات طيارة جزئيا ويمكن تصور الخلايا البكتيرية bioreporter دون إعداد العينات تفصيلا وبالتالي مع الحد الأ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest
  Solution 1
    Ammonium sulfate  Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
    Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
    Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
  Solution 2
    Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
    Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
  Solution 3 pH 6.0
    Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
    Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
    Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
    Manganese(II) chloride x 1 H2O        Carl Roth   4320.2 10 mg L-1
    Copper(II) sulfate Carl Roth  P023.1 1 mg L-1
    Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth  0274.1 3 mg L-1
    Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
    Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
    Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
    Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
    Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
    Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
    Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2 %
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8
    Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
    Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK  1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
    Yeast extract Merck 1037530500
    Tryptone Serva 4864702
    Sodium chloride Carl Roth 3957.1
imageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S., Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. . Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. , 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B., et al. . Manual of methods for general bacteriology. 19, 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D., Mukerji, K. G. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Vol. 19, 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).

Play Video

Cite This Article
Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

View Video