Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

ووضعت كله فحص bioreporter زنزانة مع بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe للكشف عن الكسور من الملوثات العضوية (أي fluorene) المتاحة للتدهور البكتيري بعد النقل النشط من قبل فطر سد المسام المليئة الهواء في نظام نموذجي غير المشبعة بالمياه.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وذات الكثافة السكانية العالية التربة عن طريق مجموعة واسعة من الكائنات الدقيقة مثل البكتيريا 1،2. لكن الأوضاع في هذه الموائل تشكل تحديا، ولا سيما من حيث توافر المياه 3. البكتيريا تحتاج بشكل دائم للبحث عن الظروف المثلى في البيئات غير المتجانسة ولكن عدم وجود أفلام المياه مستمرة يسفر عن التنقل محدود 5 تعوق لهم لنشر بحرية. أيضا، يتم خفض معدلات انتشار المواد المذابة (على سبيل المثال، والمغذيات) في ظل ظروف غير المشبعة 6. وهكذا، والبكتيريا والمواد المغذية وغالبا ما يفصل جسديا وسهولة الوصول إليها المغذيات يقتصر 3. ونتيجة لذلك، يمكن لناقلات النقل للمركبات الكيميائية التي لا تتطلب المرحلة المياه مستمرة تساعد على التغلب على هذه القيود. في الواقع، قد وضعت العديد من الكائنات الدقيقة مثل الفطريات والفطريات البيضية شكل النمو الخيطية تمكينهم من النمو من خلال مساحات مليئة بالهواء المسام وبالتالي الوصول إلى وموبيLIZING أيضا المادية فصل المواد المغذية 7 و 8 المواد الكربونية لمسافات طويلة. حتى أنها قد تكون بمثابة موجهات النقل البيولوجية التي توفر السكريات ومصادر الطاقة الأخرى للبكتيريا 9. وقد تبين أيضا امتصاص والنقل في الكائنات أفطوري للملوثات العضوية مسعور مثل الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAH) في Pythium ultimum 10 أو في الفطريات مايكورهيزال arbuscular 11. منذ PAH هي الملوثات في كل مكان وسيئة للذوبان في الماء 12 في التربة، والنقل بوساطة فطر قد يساعد على زيادة التوافر البيولوجي الملوثات البكتيرية للdegraders المحتملة. في حين أن المبلغ الإجمالي للنقل الملوثات يمكن قياسها كميا مباشرة الكيميائية يعني 10، التوافر البيولوجي للملوثات نقلها بواسطة فطر المهينة البكتيريا وغيرها من الكائنات لا يمكن تقييمها بسهولة.

يعرض بروتوكول التالية طريقة لتقييم أثر myceليا على التوافر البيولوجي الملوثات إلى degraders البكتيرية بطريقة مباشرة. لأنها تتيح جمع المعلومات عن تأثير الزماني المكاني من الملوثات الميكروبية على النظم الإيكولوجية. نحن تصف كيفية إنشاء نظام مصغر غير المشبعة تفصيلا محاكاة واجهات بين الهواء والماء في التربة عن طريق ربط مصدر نقطة PAH فصل جسديا مع bioreporter البكتيريا PAH المهينة عبر ناقلات النقل أفطوري. لأنه يتم استبعاد النقل الجوي، وتأثير النقل على أساس أفطوري على الهيئة العامة للإسكان التوافر الحيوي للبكتيريا يمكن دراستها بطريقة معزولة. في مزيد من التفاصيل، تم تطبيق ثلاثة عصابة PAH fluorene، الكائن فطر Pythium ultimum وbioreporter بكتيريا بوركهولدريا sartisoli RP037-mChe 13 في الاجهزة مصغرة وصفها. بكتيريا B. شيد sartisoli RP037-mChe أصلا لدراسة تدفقات فينانثرين إلى الخلية 14 وتعرب عن تعزيز الأخضر البروتين الفلوري (EGFP) نتيجة لتدفق الهيئة العامة للإسكان لالخلية، في حين أن الاستشعاع الأحمر يتم التعبير عن mCherry جوهري. وترد معلومات مفصلة عن بناء مراسل كتبها TECON وآخرون 13 في الاختبارات الأولية، وكشف البكتيريا لا السباحة وفقط بطيئة للغاية القدرة يحتشدون. كان قادرا على الهجرة ببطء على خيوط من Pythium ultimum عند تطبيقه كما وقف كثيفة على الجزء العلوي من خيوط. منذ جزءا لا يتجزأ من البكتيريا في الاغاروز في البروتوكول التالي، لم الهجرة على خيوط لا يحدث.

باستخدام متحد البؤر المجهري المسح الضوئي ليزر (CLSM)، والبكتيريا bioreporter يمكن تصور مباشرة في عوالم مصغرة والتعبير عن EGFP يمكن قياسها كميا بالنسبة لكمية من الخلايا (متناسبة مع إشارة mCherry) مع مساعدة من يماغيج البرمجيات. وهذا يسمح بمقارنة التوافر البيولوجي نوعيا في سيناريوهات مختلفة (أي أعلى أو أقل). تم العثور على FLU أن يكون بيولوجيا بعد نقل فطر من قبل P. ultimum (أي أنهكان أعلى مما كانت عليه في المراقبة السلبية). وعلاوة على ذلك، يصف بروتوكول كيفية تحديد المبلغ الإجمالي النقل بوساطة فطر عبر الوسائل الكيميائية وللتحقق من التوافر البيولوجي الملوثات باستخدام الألياف الزجاجية المغلفة السيليكون (الألياف SPME) في عوالم مصغرة متطابقة. النتائج باستخدام هذا الإعداد مصغرا وقد نشرت ومناقشتها لمزيج من P. ultimum، fluorene وB. sartisoli RP037-mChe 15. هنا، يكمن في التركيز على وصف طريقة مفصلة وتحديد المخاطر المحتملة للبروتوكول لتوفير هذه المعرفة لتطبيقات أخرى محتملة. قد تنطوي على مزيد من التطبيقات الفطرية المختلفة والأنواع البكتيرية (على سبيل المثال، من المواقع الملوثة)، وغيرها من الملوثات (مثل مبيدات الآفات) أو الملوثات إمدادات (على سبيل المثال، والتربة الذين تتراوح أعمارهم بين).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد أطباق، والشرائح والحضانة الغرف

  1. إعداد المواد التالية لكل مصغرة: البلاستيك واحد كبير بيتري أسفل الطبق (د = 10 سم)، واحدة المعدلة (انظر الخطوة 1.2) صغير من البلاستيك بيتري أسفل الطبق (د = 5 سم) مع أغطية واحد العد غرفة الشريحة مع ثلاثة تجاويف.
  2. أخذ العدد المطلوب من بتري أجزاء أسفل الطبق (د = 5 سم). إزالة جزء من أسنانها مع منشار لتناسب بالضبط شريحة (26 ملم طول الحافة). لتعقيم النظام، نقع بيتري قيعان طبق والأغطية في الايثانول 70٪ O / N وتجفيفها لمدة 2 ساعة على الأقل في خزانة تدفق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تخزين أطباق بتري في وعاء من البلاستيك مختوم بإحكام، والتي أيضا قد تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة.
  3. مسح العدد المرغوب فيه من الشرائح مع 70٪ من الإيثانول والهواء تجفيفها. التفاف الشرائح في رقائق الألومنيوم ووضعها في الفرن دثر لمدة 5 ساعة على 450 درجة مئوية لإزالة التلوث المحتملة. إعداد غرف الزجاج الحضانة مع الأغطية. تنظيف مع 70٪ من الإيثانول وفضح غرف مفتوحة لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة على الأقل في خزانة التدفق.
    ملاحظة: desiccators كبيرة (قطرها حوالي 30 سم) مع الأغطية يمكن أن تستخدم لهذا الغرض؛ كل مجفف قد إيواء ما يصل إلى عشرة الاجهزة مصغرة.

2. إعداد وسائل الإعلام والثقافات

  1. لتشغيل 20 عوالم مصغرة بالتوازي مع ذلك، الحصول على 100 ​​مل من تعديل تريبتون-الخميرة المتوسطة (MTY) 14، وحوالي 150 مل من 21C الحد الأدنى من المتوسط ​​16 (MM)، و 5 مل من الحد الأدنى من المتوسط ​​أجار (MMA؛ 0.5٪، ث / ت)، وثلاثة لوحات أجار البطاطس سكر العنب (PDA؛ 1.5٪، ث / ت) لP. ultimum، وأربع لوحات فارغة، واحدة لوحة PDA يحتوي على 2 ملغ L -1 سيكلوهيكسيميد، وأربع لوحات الاغاروز (3٪، ​​ث / ت) التي تحتوي على 0.3 غرام مل -1 الكربون المنشط و 40 ملغ من الانفلونزا في 2 أجزاء ملغ.
  2. إعداد MTY تحتوي على 50 ملغ L -1 من الكانامايسين (كانامايسين هو اشتراطاتإد للحفاظ على EGFP مراسل البلازميد) وMM تحتوي على 10 ملي خلات للزراعة البكتيرية. استخدام MM دون خلات لإعداد 0.5٪ MMA اللازمة لتجميد البكتيريا في عوالم مصغرة وتصب لوحات (كل 20 مل) من 1.5٪ PDA لزراعة Pythium ultimum ومصغرة الاجهزة.
  3. تطعيم بعض خيوط من P. ultimum على ثلاث لوحات PDA الطازجة واحتضان في الظلام في درجة حرارة 25 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. ثم تأكد من أن لوحات هي متضخمة بشكل كامل من قبل أفطورة الطازجة ورقيق.
  4. بدء ثقافتين من B. sartisoli RP037-mChe في 50 مل من MTY من الأسهم الجلسرين. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 230 دورة في الدقيقة حركة قارورة دوارة O / N.
  5. كثافة ثقافة التدبير البصرية (OD) في 578 نانومتر، وأجهزة الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة (لB. sartisoli RP037-mChe، وOD المتوقع 578 حوالي 1.0 والخلايا هي في مرحلة الأسي). تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايافي كمية مناسبة من MM للتوصل الى OD 578 من 0.4. تطعيم 20 مل من MM تحتوي على 50 ملغ L -1 كانامايسين مع 400 ميكرولتر من الخلايا معلق. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 230 دورة في الدقيقة حركة قارورة دوارة O / N.
  6. قياس OD 578 من ثقافة في MM (لB. sartisoli RP037-mChe، وOD المتوقع 578 حوالي 0.2 والخلايا هي في مرحلة مبكرة الأسية). ثقافة الطرد المركزي في 2،000 x ج لمدة 10 دقيقة وإعادة تعليق الخلايا في كمية مناسبة من MM للتوصل الى OD 0.4. مزيج 50 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 500 ميكرولتر من الحارة، السائل MMA في 2 مل أنابيب وتخزينها في 50 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدام 150 ميكرولتر من الخلايا في MMA لكل مصغرة.
  7. صب لوحات من agarose هلام يحتوي على الكربون المنشط. تذوب الاغاروز (3٪، ث / ت) في الماء المقطر مزدوجة. تخلط جيدا مع الكربون المنشط (0.3 مل ز -1) وتصب الخليط في البلاستيك أطباق بتري(د = 10 سم).

3. مصغر تركيب

ملاحظة: وصفت الإعداد مصغرة الكامل تخطيطي في الشكل (1) يرجى الرجوع إلى الشكل 1 لجميع الخطوات الفردية التالية. الخطوات التالية تصف إعداد عينة (SAM) مع ناقلات النقل أفطوري وثلاثة الاجهزة الرقابية المختلفة (AIR CON، CON NEG، CON POS). ملخص لجميع الاجهزة مختلفة يمكن العثور عليها في الجدول 1.

  1. خذ العدد المرغوب فيه من أطباق بتري والشرائح ويعرضهم لضوء الأشعة فوق البنفسجية في إطار مجلس الوزراء تدفق لمدة 30 دقيقة.
  2. وضع طبق صغير بيتري داخل واحدة كبيرة وتناسب الشريحة من خلال الفجوة في طبق بتري الصغيرة. أخذ عينة واحدة لتعليق الخلية الدافئ في MMA وإضافة 150 ميكرولتر في تجويف الأوسط من شريحة واحدة. كرر هذه الخطوة حتى تجاويف الأوسط من جميع الشرائحمليئة MMA. الانتظار 5 دقائق لMMA لترسيخ.
  3. استخدام 1 سم الفلين حفار لكمة من بقع دائرية من لوحة PDA فارغة. وضع التصحيح واحد على مسافة 2 مم المقبل إلى MMA داخل طبق بتري الصغيرة. هذا إضافة إلى تعزيز النمو أفطوري في الإعداد (PDA 3 في الشكل 1).
  4. قطع بقع PDA المنحنية كحواجز الميكانيكية. استخدام طبق بتري الصغيرة الجزء السفلي نظيفة ومعقمة واضغط عليه في لوحة PDA. استخدام ملعقة لخفض حلقة أخرى أصغر حجما على مسافة 0.5 سم في أجار مما يؤدي الى الدائري PDA.
    1. قطع قطعة، والذي يناسب بالضبط إلى الفجوة في طبق بيتري صغير في إعداد مصغرة ووضعه داخل فجوة في أعلى الشريحة. تأكد من أن المسافة بين MMA والجدار PDA دائري حوالي 2 مم. إغلاق غطاء طبق بيتري صغير الضغط عليه برفق في حاجز PDA.
    2. كرر الخطوات من 3.4 و 3.4.1 مع لوحة PDA تحتوي على 2 ز L -1من سيكلوهيكسيميد.
      ملاحظة: هذا هو الإعداد السيطرة للنقل الجوي (CON AIR) نحو الخلايا bioreporter، حيث يتم تحول دون فطر كتبها سيكلوهيكسيميد ولا كسا الأرض MMA.
  5. استخدام 1 سم الفلين حفار لكمة من بقع دائرية لوحة PDA فارغة. استخدام 0.5 سم الفلين حفار آخر لقطع منتصف التصحيح الأول. ضع الناتجة صغيرة PDA الدائري على مسافة 1 ملم المقبل لحاجز PDA (PDA 1 في الشكل 1).
  6. إضافة 2 ملغ من FLU في حفرة من PDA 1. استخدام 1 سم الفلين حفار لقطع بقع دائرية من لوحات PDA متضخمة مع P. ultimum ووضع التصحيح واحد (PDA 2 في الشكل 1) أسفل أسفل على عصابة PDA بحيث حصيرة أفطوري يواجه بلورات FLU.
    1. كرر الخطوة السابقة دون إضافة بلورات FLU.
      ملاحظة: هذا هو الإعداد السيطرة سلبي (CON NEG) لتحديد الخلفيةمضان من خلايا bioreporter.
  7. استخدام 1 سم الفلين حفار لكمة من بقع دائرية من أجار التي تحتوي على الكربون المنشط. وضع أربعة بقع في كل الإعداد مصغرا لمزيد من الانخفاض في تركيز FLU الغازي (الشكل 1).
  8. إعداد مراقبة إيجابية (CON POS). إضافة بعض بلورات FLU إلى 200 ميكرولتر من تعليق خلية MMA ووضعها في تجويف واحد من شريحة فارغة.
  9. وضع طبق بتري (د = 10 سم) مع بعض مسحوق الكربون المنشط على الجزء السفلي من غرفة الحضانة لتقليل تركيز FLU الغازي في الغرفة. أيضا، ضع 4-5 50 مل الأكواب بالماء المعقم على الجزء السفلي للحفاظ على الرطوبة العالية في الغرفة.
    1. نقل الاجهزة مصغرا إلى غرف حضانة واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 96 ساعة. مكان عينات بشكل عشوائي في غرف النمو المختلفة لاستبعاد آثار الموقع.
      ملاحظة: هذه المرة ا ف ب حضانةتبحر إلى P. طلائعيات بيضية ultimum. أنها قد تكون مختلفة عن غيرها من الكائنات.

4. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهر

  1. ومن الناحية المثالية استخدام الإعداد CLSM مع المجهر تستقيم.
    ملاحظة: قد يتم تجهيزه مع الليزر التقليدية التي تقدم على سبيل المثال، 488، 561 و 633 نانومتر للخطوط الإثارة أو مع مصدر الليزر الأبيض الانضباطي.
  2. استخدام الإعدادات التالية لمجموعة من الصور: الإثارة: 490 نانومتر (EGFP) و 585 نانومتر (mCherry) في كثافة الليزر المناسبة (الإثارة في وقت واحد)؛ نطاقات الانبعاثات: 500-550 نانومتر (EGFP) و605-650 نانومتر (mCherry)؛ عدسة الهدف: 63X NA 0.9 immersible التي المياه (بسبب المسافة العمل الطويلة)؛ حجم الخطوة ض مداخن: 0.5 ميكرون.
  3. مفتوحة إعداد مصغرة واستخدام مشرط لإزالة PDA 1 و 2 و 3 و حاجز PDA. وضع زلة غطاء زجاجي على أعلى من MMA واضغط برفق لإزالة فقاعات الهواء. جبل الشريحة على خشبة المسرح المجهر. إضافة قطرات من الماء على رأس عشرالبريد زلة تغطية واستخدام إعدادات mCherry لإيجاد خلايا bioreporter في العينة.
  4. الحصول على لمحة سريعة عن العينة وتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء باستخدام توهج المفرط تحت طاولة البحث لأحمر (mCherry) والأخضر (EGFP) القناة. اختيار موقف عشوائي على عينة لتحليل bioreporter مضان.
    ملاحظة: قد تظهر خيوط تألق ذاتي في حدود الانبعاثات bioreporter (على سبيل المثال، تألق ذاتي الأخضر) 17. تأكد من تحديد المناطق دون خيوط إذا كان هذا هو الحال.
  5. تحديد وتسجيل مداخن Z-لكل منصب في المنطقة الخضراء (EGFP) والأحمر (mCherry) القناة. تجنب التبييض من العينة عن التعرض الطويل لضوء epifluorescence أو ضوء الليزر.
    1. كرر الخطوة السابقة لمدة عشر، ومواقف عشوائية موزعة بالتساوي.
  6. كرر جميع الخطوات باستخدام نفس الإعدادات لجميع العينات من مسار اختبار (SAM)، CON AIR، CON NEG وCON POS.
  7. 5. تحليل صورة

    ملاحظة: لتحليل الحمراء (mCherry) والأخضر (EGFP) مضان في أكوام-Z سجلت، من بين خيارات أخرى البرمجيات الحرة يماغيج 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) يمكن أن يكون المستخدمة.

    1. تأكد من تثبيت البرنامج المساعد logi_tool (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
    2. ملف مفتوح في يماغيج. حدد "قنوات تقسيم" وقناة خضراء قريبة. استخدام الماكرو "منطقة mCherry" على النحو المنصوص عليه ملف التعليمات البرمجية التكميلي لتحديد مجال مضان أحمر في ض المكدس. ضبط الإعدادات المفضلة في الماكرو (المشار إليها بالخط العريض).
      1. الإخراج هو جدول مع بكسل محسوبة فوق عتبة (وما فوق الحد الأدنى لحجم المعرفة) في كومة Z-.
        ملاحظة: إن مجموع كل القيم هو العدد الإجمالي للبكسل الحمراء (منطقة) في المكدس.
    3. ملف مفتوح في يماغيج. حدد "قنوات تقسيم" والقناة الحمراء وثيقة. استخدام الماكرو 216؛ EGFP كثافة العمليات "على النحو المنصوص عليه ملف التعليمات البرمجية التكميلي لقياس كثافة مضان أخضر في كومة Z-. ضبط الإعدادات المفضلة في الماكرو (المشار إليها بالخط العريض).
      1. الإخراج هو جدول مع شدة متوسط ​​ومساحة كل الكائنات الخضراء فوق عتبة (وما فوق الحد الأدنى لحجم المعرفة) في ض المكدس. لحساب كثافة إجمالية قدرها بكسل الخضراء في المكدس، تتضاعف كل يعني كثافة من المنطقة المقابلة.
    4. حساب EGFP الحث النسبي (EGFP يختلط):
      المعادلة 1 (1)
      ملاحظة: بما أن يتم التعبير عن mCherry جوهري، فإن القيمة الناتجة من EGFP يختلط هي مقياس نسبي لكمية EGFP التي أعربت عنها كمية معينة من الخلايا. يرجى الرجوع أيضا إلى الجدول رقم 3 للمزيد من المعلومات عن حساب EGFP يختلط.
    TLE "> 6. الكمي الكيميائية

    ويمكن أيضا أن تستخدم الاجهزة مصغرا لأداء الكمي الكيميائي للكميات FLU translocated مع أو بدون بالوعة الملوثات اللاأحيائي: ملاحظة.

    1. التفاف 15 قارورة مل الزجاج، 1 مل قارورة GC / MS وتدرج في رقائق الألومنيوم. ملء تبخر الأطباق مع نا 2 SO وضع كل شيء في الفرن دثر لمدة 5 ساعة على 450 درجة مئوية لإزالة التلوث المحتملة. تخزين داخل نا 2 SO 4 من مجفف تفعيلها.
    2. قطع PDMS ألياف الزجاج المطلي إلى 0.5 سم طول. غسل الألياف عن طريق هز أربع مرات 2 ساعة في الميثانول النقي. تكرار غسل الخطوات آخر أربع مرات مع الماء عالى النقاء وتخزين الألياف نظيفة في الماء عالى النقاء في قارورة زجاجية محكمة الغلق.
    3. إعداد 1.5 L التولوين / الأسيتون (3: 1، V / V) تحتوي على 10 ميكروغرام L -1 فينانثرين-د 10.
    4. تنفيذ الخطوات 1 و 2 و 3 من البروتوكول. إعداد عوالم مصغرة من دون بيورخلايا eporter لدراسة النقل FLU (SAM (-) وCON AIR (-)) ومع الخلايا bioreporter (SAM) للتحقق من تدهور FLU.
      1. اختياري (بدون خلايا bioreporter): مكان ثلاثة PDMS المغلفة الألياف الزجاجية. (وعادة ما تستخدم للتجارب SPME) كما الاصطناعي وقابلة للقياس الملوثات داخل بالوعة MMA من SAM (-) باستخدام ملقط غرامة.
      2. إزالة الألياف الزجاجية باستخدام ملقط غرامة ونقل كل واحد إلى GC / MS قارورة مع إدراج.
      3. إضافة 200 ميكرولتر من التولوين ويهز عموديا O / N وتحليل عبر GC / MS. استخدام الإعدادات الواردة في الجدول 2.
    5. نقل MMA من تجويف الوسط في كوب 15 مل قارورة وإضافة حوالي ثلاث ملاعق من نا 2 SO 4. تخلط جيدا باستخدام ملعقة وإضافة 10 مل من المذيب. دوامة الخليط ويهز أفقيا O / N في الظلام.
      1. نقل 1001؛ لتر من العينة إلى GC / MS قارورة مع إدراج. إضافة 10 ميكرولتر من أسينافثيلين-د 08 (10 ملغ L -1) وتحليل عبر GC / MS باستخدام نفس البرنامج كما هو موضح في 6.4.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم بالفعل نشر النتائج المعروضة هنا في وقت سابق 15. يرجى الرجوع إلى مقالة للنقاش الميكانيكية والبيئية التفصيلية.

بعد تسجيل صورة عبر CLSM، ويمكن إجراء الإسقاط كثافة الحد الأقصى باستخدام برنامج المجهر منها أو يماغيج للحصول على انطباع بصري الأول من نموذج والضوابط (الشكل 2). وفي وقت لاحق، قد يكون المتوقع أن مجموعات البيانات بشكل مختلف من أجل إظهار الميزات ذات مغزى من قبل البرامج التصور معين. مراقبة إيجابية (CON POS) يظهر متميز EGFP الاستقراء (الشكل 2A)، في حين أن السيطرة المحمولة جوا (CON AIR) يسلك الخلفية الوحيدة EGFP مضان (الشكل 2B). يبدو EGFP مضان في عينة الاختبار (SAM) إلى أن تكون مرتفعة بالمقارنة مع CON AIR، ذوآخرون ليس كما وضع علامة CON POS (الشكل 2C). مضان mCherry مستقل عن تدهور الهيئة العامة للإسكان، وبالتالي مماثل لجميع العينات. ومع ذلك، لن يتم الكشف عن إشارات EGFP مرتفعة قليلا بواسطة هذه الطريقة وتحليل الصور اللاحقة أمر ضروري.

لعوالم مصغرة اختبارها، واستكمل الفحص البصري عن طريق تحليل الصور وحساب EGFP الحث النسبي (راجع الخطوة 5 وما يليها من البروتوكول؛ الشكل 3). مضان الخلفية الأخضر لB. غير يسببها يتم احتساب sartisoli RP037-mChe مع CON NEG. في ظل ظروف معينة، تم العثور على EGFP الحث النسبي لتكون يختلط EGFP = 0.53. يمكن أن يتم الكشف عن لا يوجد فرق كبير بين NEG CON وCON AIR (يختلط EGFP = 0.54. P> 0.95) وبالتالي استبعاد أي النقل FLU طور البخار نحو الخلايا bioreporter. لCON POS، مرتفع للغاية EGFP التحريض (EGFP يختلط = 53.7) تم العثور تؤكد على حيوية الخلايا في MMA بعد 96hr ويمثل الحد الأقصى للEGFP الاستقراء. في وجود فطر والانفلونزا (SAM)، وكان المستحث EGFP بشكل كبير في الخلايا مقارنة مع الضوابط السلبية (يختلط EGFP = 1.15. ف <0.001). ومع ذلك، فإن الاستقراء EGFP منخفض نسبيا مقارنة مع مراقبة إيجابية (راجع الجدول 3، النقطة 8).

نقل انفلونزا بواسطة فطر P. ultimum في الإعداد مصغرا كان كميا كيميائيا (راجع الخطوة 6 وما يليها من البروتوكول؛ الشكل 4). في ظل وجود الانفلونزا وP. ultimum (SAM (-))، فطر المتحولةتقع على بعد حوالي 25ng انفلونزا ضمن 96hr أي ما يعادل معدل نقل 37.5pmold -1 سم -1. التحكم في غياب فطر (CON AIR (-)) كشفت وسائل النقل FLU الغازي في MMA في نطاق 2ng فقط ضمن 96hr، أي يمكن استبعاد تحريض على bioreporter كل تركيزات طور البخار. عندما كان B.sartisoli RP037-mChe الحاضر (SAM)، <تم الكشف عن 1NG من FLU في التصحيح MMA. هذا التحقق الفعلي تدهور FLU البكتيرية احقا إلى النبات بوساطة فطر.

فمن الممكن لدراسة تأثير تدهور البكتيري، أي من بالوعة FLU، حول انفلونزا النبات عن طريق إضافة بالوعة الملوثات أحيائية للنظام (راجع الخطوة 6.4.1 وما يليها من البروتوكول). وهكذا، واحد هو قادرة على قياس كمية FLU تمتصه الألياف والمبلغ المتبقي داخل MMA وخيوط الفوقية. لSAM(-)، فإن مجموع كمية translocated مستقل عن وجود بالوعة الملوثات (P> 0.9، الشكل 5A). ومع ذلك، تم اختبار نموذج مصغر مع زيادة مساحة امتصاص FLU أيضا كما هو موضح بالتفصيل في وقت سابق 15. هناك، يمكن أن يتم الكشف عن زيادة كبيرة في كمية FLU translocated (الشكل 5B).

الشكل (1)
الشكل 1. الرسم والصور من إعداد مصغرة الكامل تخطيطي. المنظر من أعلى (A)، ومن الجانب (B). وضعت كافة تصحيحات أجار على رأس شريحة مع ثلاثة تجاويف صغيرة. وضعت اثنين ملغ من بلورات FLU داخل تجويف (د = 5 ملم) في وسط PDA 1. PDA 2 كانت متضخمة طازجة مع خيوط من P. ultimum التي تواجه PDA 1. وضعت قطعة PDA المنحني بين PDA 2 و التصحيح MMA ل خلق حاجز FLU الميكانيكية جنبا إلى جنب مع غطاء طبق بتري (د = 5 سم). وضعت أربعة بقع أجار التي تحتوي على الكربون المنشط في الإعداد لمزيد من الانخفاض في تركيز FLU الغازي. تم تعديل الصور من مصغرا الكامل من أعلى (C) وعرض قطري (D) من دون الكائنات الحية الدقيقة والانفلونزا. أرقام 1A و 1B بإذن من Schamfuss وآخرون. 15 مقتبس بإذن من Schamfuss، S. وآخرون تأثير فطر بشأن إمكانية الوصول إلى fluorene للبكتيريا الهيئة العامة للإسكان-المهينة. البيئى. الخيال العلمي. TECHNOL 47، 6908-6915. حقوق التأليف والنشر (2013) جمعية الكيميائية الأميركية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

خريج "/>
الشكل 2. التوقعات كثافة القصوى من مبائر الميكروسكوب الضوئي بالليزر. الميكروسكوب هي تصور mCherry وEGFP تحريض على bioreporter بكتيريا B. sartisoli RP037-mChe في MMA. عندما كان البكتيريا الاتصال بمصدر البلورية FLU في MMA (CON POS، A)، مرتفعة مقارنة إشارة EGFP لضوابط (CON AIR؛ ب). العينات مع الانفلونزا وP. ultimum (SAM، C) كما تظهر إشارة EGFP مرتفعة، ولكن أقل وضوحا من السيطرة الإيجابية. يتم التعبير عن mCherry جوهري، وبالتالي بمثابة المراقبة البصرية للكشف عن الخلايا. (التكبير 630X، شريط 20 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

"FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل (3)
الشكل 3. النسبي تحريض EGFP في B.sartisoli RP037-تشي لNEG CON، CON AIR وSAM مع فطر والانفلونزا. مقارنة بين EGFP الحث النسبي (EGFP يختلط) من خلال B.sartisoli RP037-تشي بعد 96hr في غياب FLU (CON NEG)، في وجود الانفلونزا لكن غياب P.ultimum (CON AIR) وبحضور كل من الانفلونزا وP.ultimum (SAM). إحصائية يتم وضع علامة فروق ذات دلالة إحصائية لCON NEG بعلامة النجمة. وأجريت التجارب في يثلث مستقلة لCON AIR و لNEG CON، على التوالي. تم اختبار عينة واحدة لCON POS وتحسب EGFP يختلط مع 53.7. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Schamfuss وآخرون. 15 مقتبس بإذن من Schamfuss، S. وآخرون تأثير فطر بشأن إمكانية الوصول إلى fluorene للبكتيريا الهيئة العامة للإسكان-المهينة. البيئى. الخيال العلمي. TECHNOL 47، 6908-6915. حقوق التأليف والنشر (2013) جمعية الكيميائية الأميركية.

الشكل (4)
. (. CF الشكل 1) الشكل 4. FLU الكيميائية الكمي كميات مجموع من FLU في NG المستخرج من التصحيح MMA بعد 96hr للنقل طور البخار دون الخلايا (CON AIR (-))، مالنقل ycelial دون الخلايا (SAM (-)) والنقل أفطوري مع الخلايا (SAM). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Schamfuss وآخرون. 15 مقتبس بإذن من Schamfuss، S. وآخرون تأثير فطر بشأن إمكانية الوصول إلى fluorene للبكتيريا الهيئة العامة للإسكان-المهينة. البيئى. الخيال العلمي. TECHNOL 47، 6908-6915. حقوق التأليف والنشر (2013) جمعية الكيميائية الأميركية.

الرقم 5
الشكل 5. FLU الكيميائية الكمي في وجود بالوعة الملوثات أحيائية (A) مجموع مبالغ FLU في NG المستخرجة من MMA التصحيح بعد 96hr للنقل أفطوري مع أو بدون بالوعة الملوثات الاصطناعي (SAM (. (راجع الشكل 1). - ) مع أو بدون PDMS شاركالألياف ated). (ب) نفس النتائج لمسار اختبار متنوع مع زيادة مساحة امتصاص FLU أفطوري. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Schamfuss وآخرون. 15 مقتبس بإذن من Schamfuss، S. وآخرون تأثير فطر بشأن إمكانية الوصول إلى fluorene للبكتيريا الهيئة العامة للإسكان-المهينة. البيئى. الخيال العلمي. TECHNOL 47، 6908-6915. حقوق التأليف والنشر (2013) جمعية الكيميائية الأميركية.

اسم FLU فطر خلايا تطبيق تعليقات
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM (-) + - GC / MS ممكن أيضا مع PDMS الألياف لامتصاص الملوثات الاصطناعية
CON AIR + (+) + CLSM فطر ينمو فقط ما يصل الى حاجز PDA. MMA لا تغطيها
CON AIR (-) + (+) - GC / MS فطر ينمو فقط ما يصل الى حاجز PDA. MMA لا تغطيها
CON NEG - + + CLSM
CON POS + - + CLSM تتعرض الخلايا مباشرة إلى بلورات FLU

الجدول 1. عرض عام لجميع أنواع عينة ملخص لجميع العينات السيطرة والاختبار بما في ذلك تطبيق (bioreporter الفحص - CLSM أو الكمي الكيميائية - GC / MS). وcomposiنشوئها (FLU، فطر والخلايا bioreporter).

فرن
درجة الحرارة الأولية 50 ° C
الوقت الأولي 2 دقيقة
معدل 15 ° C دقيقة -1
درجة الحرارة النهائية 300 ° C
مرة الأخيرة 6.33 دقيقة
حاقن (PTV)
حقن حجم التداول 0.5 ميكرولتر
طريقة splitless
تطهير 2.00 دقيقة
تدفق تطهير 50.0 مل دقيقة -1
درجة الحرارة الأولية 80 ° C
الوقت الأولي 0.02 دقيقة
سلالم: تقييم 600 ° C دقيقة -1
درجة الحرارة النهائية 300 ° C
مرة الأخيرة 10 دقيقة
عمود
نموذج J & W DB-5MS
طول الاسمي 20 م
القطر الاسمي 180 ميكرون
سماكة الفيلم الاسمي 0.18 ميكرون
الغاز الناقل الهليوم 0.8 مل دقيقة -1
MSD Transferline 280 ° C
MSD
وضع سيم
MS المصدر 230 ° C
MS رباعية 150 ° C

الجدول 2. إعدادات GC / MS. ملخص لكافة الإعدادات لGC وMS لفfluorene uantify في الاجهزة مصغرة.

مطبات COMMENT
1 النمو الأولي والاختبارات الحيوية دراسة نمو الكائن الحي أفطوري في الاختيار. كم من الوقت يلزم للوصول إلى التصحيح MMA؟ هل منعت من قبل حاجز سيكلوهيكسيميد؟ أيضا التحقق ما إذا كانت الخلايا bioreporter تبقى حيوية في MMA طوال الوقت عن طريق فحوصات ضفر. إن لم يكن، واحدة أيضا إضافة مصدر الكربون إلى MMA الذي لا يؤدي إلى bioreporter تحريض. استبعاد احتمال تثبيط المتبادل من البكتيريا وفطر.
2 معدل نمو فطر معدل نمو الكائن الحي أفطوري لا ينبغي أن تكون بطيئة جدا، لأن خلاف ذلك النقل طور الغاز من الهيئة العامة للإسكان يزيد مع المطول فترة حضانة. يمكن تكييفها بروتوكوللإضافة PAH في نقطة زمنية لاحقة، ولكن بعد ذلك مرة أخرى، فطر عند نقطة التلقيح قد لا تكون نشطة بعد الآن.
3 التنقل البكتيرية إذا تم استخدام نقطة مجهر المسح بالليزر وسلالة بكتيرية غير متحرك، وتسجيل النوعي والكمي لض مداخن قد يكون مستحيلا بسبب حركة داخل MMA. وبالتالي، يجب منع حركة البكتيرية، على سبيل المثال، عن طريق زيادة صلابة MMA، وذلك باستخدام CLSM مع ماسح ضوئي سريع أو المجهر الليزر القرص الغزل.
4 النقل طور البخار يجب استبعاد وسائل النقل طور البخار للمادة الكيميائية (على سبيل المثال، الهيئة العامة للإسكان) نحو الخلايا bioreporter بما فيه الكفاية منذ خلايا bioreporter حساسة للغاية للمواد الكيميائية في مراحل بخار. وهذه هي النقطة الحاسمة للبروتوكول كله من أجل منع النتائج إيجابية كاذبة الناجمة عن النقل الغازي. الطور الغازيويمكن تقدير تركيز عن طريق التحليل الكيميائي للAIR CON (-) وتركيزات طور البخار ويمكن تعديل على سبيل المثال من خلال إضافة أكثر أو أقل بقع الاغاروز مع الكربون المنشط.
5 سمية نضع في اعتبارنا، أن تركيزات عالية من المادة الكيميائية اختبار قد يكون لها آثار سامة على الكائنات الحية و / أو البكتيريا أفطوري.
6 تألق ذاتي معرفة ما اذا كان يظهر الكائن الحي أفطوري اختيار بعض تألق ذاتي في نطاق الإشارات bioreporter المتوقعة. مما لا شك فيه للتحقق في مراحل النمو المختلفة منذ تألق ذاتي قد تختلف 17. إذا تم الكشف عن تألق ذاتي، تأكد من تسجيل ض مداخن في المناطق الخالية من فطر.
7 تبيض mCherry مضان هو عادة مستقرة ويست حساسة لتبيض في ثنائية تطبيقهاخلايا oreporter. في المقابل، EGFP التبييض وليس بسرعة. لذلك، لا تستخدم قناة EGFP لتصور العينة قبل تسجيل ض المكدس.
8 EGFP الحث لاحظنا الحث EGFP منخفضة في SAM مقارنة الى Con POS. وهذا يفسر من قبل التقييد المكاني القوي وانخفاض إمكانية الوصول إلى مصدر FLU للحفاظ على تركيز منخفض جدا طور البخار من انفلونزا (راجع النتائج الفقرة الأخيرة). اعتمادا على سلالة bioreporter المختار والكيميائية، يجوز تغيير المنطقة امتصاص في PDA 1 إلى زيادة معدل النقل (الشكل 5B). ومع ذلك، فإنه لابد من النظر أن هذا يزيد أيضا النقل طور البخار نحو الخلايا bioreporter.
9 حساب EGFP يختلط طريقة الحساب المقدمة للEGFP يختلط حيث تتم مقارنة كثافة بكسل الخضراءإلى منطقة بكسل الحمراء هو احتمال واحد فقط. يرجى الرجوع إلى المناقشات للحصول على مزيد من المعلومات.
10 حجم بكسل يرجى أن يكون على علم بأن التكبير للعدسة المختارة وعامل التكبير يحتمل أن تطبق يؤثر على حجم بكسل من الصورة. يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار قبل تحليل الصور.
11 الكسور بيولوجيا نضع في اعتبارنا أن التوافر البيولوجي للمجمع نقلها يتم تقييم النوعية (وليس كميا) عن طريق EGFP الاستقراء. وقد حاول أي ارتباط من احتساب النسبي EGFP الاستقراء وجزء بيولوجيا. ومع ذلك، فإن هذا قد يتم تناولها في التطبيقات المستقبلية.
12 حدود الكشف الكشف الكيميائي. لالكمي الكيميائي للمركبات العضوية، ومجموعة واسعة من تركيزاتيمكن الكشف عن trations موثوق بها. اكتشفنا المبالغ في 0ng نطاق و1،000ng. EGFP الكمي. قارنا النسبي تحريض EGFP في عينات من دون نقل الملوثات (أي 0ng نقلها)، مع وسائل النقل بوساطة فطر (أي بين 20 و 40ng نقلها؛ راجع أرقام 4 و 5) ومع اتصال مباشر إلى مصدر الملوثات (أي الحد الأقصى المبلغ المتاح). أثبتت هذه الحالات الثلاث لتكون مميزة بشكل جيد مع طريقة وصفها. ومع ذلك، لا يمكننا أن يدلي ببيان أكثر تفصيلا على قرار من EGFP الحث النسبي. ويمكن معالجة هذه المسألة في المستقبل من خلال ربط كميات الملوثات المختلفة مع الحث EGFP ربط في الاجهزة مصغرة.
13 بيتري المواد الطبق أطباق البلاستيك بيتري قد يؤدي إلى التقليل من فطر النبات الهيئة العامة للإسكان و / أو التوافر البيولوجي. أليس هذا ينبغييكون مشكلة، إذا ويطمح البيانات النوعية. في حالة مطلوبة القياسات الكمية دقيقة، وينبغي النظر في تطبيق أطباق بتري الزجاج على الرغم من إعداد والتسليم وسوف تكون أكثر غير مريح.

الجدول 3. مناقشة المخاطر المحتملة. المزالق المحتملة قبل وأثناء التجربة والتعليقات والخيارات المقترحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أثبتت الإعداد مصغرة عرض مناسب لدراسة التوافر البيولوجي للمواد الكيميائية فصل مكانيا للكائنات بعد امتصاص ونقل بواسطة فطر مهينة. يتم منع المحتملين النقل طور الغاز من مركبات طيارة جزئيا ويمكن تصور الخلايا البكتيرية bioreporter دون إعداد العينات تفصيلا وبالتالي مع الحد الأدنى من اضطراب في نظام حساس. في نفس الوقت، والتحليل الكيميائي للعينة يمكن أن تتم بسهولة والسماح لمراقبة جيدة من النتائج المكتسبة والكمي لنقل الكلي. ومع ذلك، بعض النقاط يجب أن تكون مدروسة بعناية قبل وأثناء تنفيذ التجربة. نقطة مهمة هي للحفاظ على عوالم مصغرة خالية من أي التلوث عبر البكتيرية أو الكيميائية. هذا يمكن أن يكون تحديا، حيث يتم تشغيل العديد من عوالم مصغرة بالتوازي، وبالتالي، يتعين على غرف الحضانة الكبيرة (مثل desiccators). وبالتالي، لا بد من تعقيم جميع أجزاء بعناية قبل CONSTRUC الإعدادنشوئها. النقطة الحرجة آخر قد يكون التطبيق من البلاستيك أطباق بتري لعوالم مصغرة. على الرغم من أن الهيئة العامة للإسكان وbioreporter لا تحصل على اتصال المباشر، وبعض كمية من الهيئة العامة للإسكان قد تمتصه المواد البلاستيكية. ومع ذلك، فإننا نعتبر هذا ليس مشكلة بالنسبة للبروتوكول وصفها، لأن هذا من شأنه أن يؤدي، إن وجدت، وذلك في التقليل من فطر PAH-النبات و / أو التوافر البيولوجي. في أي حال، إذا كان مطلوبا الكمي الدقيق، ينبغي النظر في ذلك تبادل قطع من البلاستيك مع أجزاء الزجاج، وعلى الرغم من أن التعامل سيكون أكثر غير مريح. وتشمل النقاط الأخرى التي ينبغي النظر فيها السلالات البكتيرية والفطرية التي يتم اختيارها (تثبيط الممكن المتبادل، ومعدل النمو، والتنقل واحتمال تألق ذاتي)، والمواد الكيميائية المختار (آثار سامة على الكائنات الحية الدقيقة، وتقلب، وحدود الكشف) والجوانب العملية (التبييض، والحد من EGFP الاستقراء وحساب EGFP يختلط). ملخص المزالق المحتملة وتعليقات منها يمكن العثور عليها فيالجدول 3.

استخدمنا هذا النموذج الإعداد مصغرة لإثبات النقل FLU أفطوري وتدهور البكتيري لاحق في نظام غير المشبعة بشكل مباشر على مستوى تفاعل خلايا فطر. لدينا نموذج انشاء يمكن أن تختلف وتعديلها لتلبية الاحتياجات المختلفة مع مختلف السلالات البكتيرية والفطرية، والمركبات الكيميائية، الخ وهكذا، يمكن أن تستخدم النظام على سبيل المثال (ط) لتقييم تأثير فطر على البكتيريا في وجود مادة كيميائية مقيدة خلاف ذلك (على سبيل المثال، السامة) مصدر، (ب) للتنبؤ تأثير فطر على التوافر البيولوجي للمركبات لتدهور البكتيري، (ج) لدراسة التوافر الحيوي الملوثات اعتمادا على المسافة من البكتيريا إلى ناقلات النقل أو (د) للتحقيق في تأثير مصادر كيميائية مختلفة (على سبيل المثال، بلوري، في التربة أو المنحلة). ومع ذلك، وتعديل النظام إلىشروط lternate ستكون حساسة وينبغي إجراء خطوة بخطوة من أجل تحقيق نتائج واضحة. وحتى الآن، ونحن لم تختبر نظام السلالات البكتيرية أو الفطرية الأخرى وغيرها من المركبات من الهيئة العامة للإسكان. ومع ذلك، منذ معروفة شبكات أفطوري لنقل أيضا الملوثات الأخرى من الهيئة العامة للإسكان مثل المبيدات الحشرية 19 أو المواد القابلة للذوبان مثل الساليسيلات 20، فإننا نعتقد أن النظام يمكن توسيعها لمركبات كيميائية مختلفة نظرا لجهاز الاستشعار البيولوجي مجمع محددة البكتيرية.

يرجى ملاحظة أن هذا يتوقف على bioreporter تطبيق ترهق عملية حسابية مختلفة من EGFP يختلط قد يكون من الأفضل. بدلا من المعادلة (1) اثنين من الخيارات التالية يمكن تطبيقها:

المعادلة 2 (2)

المعادلة 3 (3)

Howeveص، في المعادلة بروتوكول المعروضة (1) تم اختياره وذلك للأسباب التالية: أفيد كثافة (ط) EGFP لربط لتدفق الهيئة العامة للإسكان إلى الخلية 14 في حين (ب) أفيد mCherry لإظهار الاختلافات كبيرة لخلايا مختلفة 13 . المعادلة (2) و (3)، في المقابل، يمكن اختيار لمنع معلومات كاذبة من القطع الأثرية ضوء المحتملة في العينة. في أي حال، قارنا جميع طرق الحساب الثلاث مع بعضها البعض، حيث يمكن العثور على عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية. ومع ذلك، نظرا للتغيرات التي أعلن عنها في كثافة مضان من mCherry، نوصي باستخدام المعادلة (1) أو (2).

في النهاية، ينبغي النظر في بعض القيود المفروضة على هذه التقنية. منذ تم تصميم عوالم مصغرة لمنع نقل طور الغاز من مجمع اختبار، يتم تقليل امتصاص أفطوري للمجمع. وهذا يؤدي إلى انخفاض أسعار النقل مما هو متوقع مع امتصاص دون عوائق. وبالتالي، فإن حساسية bioreويجب أن تكون سلالة العتال عالية بما فيه الكفاية للكشف عن تغيرات صغيرة في الكسور بيولوجيا. وعلاوة على ذلك، فإن الإعداد وربما لا تكون مناسبة لسلالات فطرية مع معدل نمو منخفض. في هذه الحالة، حضانة المدى الطويل قد يفضلون النقل طور الغاز من الملوثات مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة. قد يكون من الممكن تعديل برنامج الإعداد في هذه الطريقة أن الملوثات يمكن تطبيقها في نقطة زمنية لاحقة. ومع ذلك، قد تكون خيوط ثم نشط بالفعل أو ميتا عند نقطة التلقيح. أخيرا، وكما ذكر أعلاه، ومجموعة من المركبات الكيميائية التي يتم نقلها عبر شبكات فطر كبير. ومع ذلك، فإن توافر سلالة bioreporter المناسب قد يكون عاملا رئيسيا الحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
ككل نهج Bioreporter خلية لتقييم النقل والتوافر الحيوي للملوثات العضوية في أنظمة غير المشبعة المياه
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter