Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Boden ist dicht mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien 1,2 besiedelt. Jedoch Bedingungen in diesem Lebensraum sind anspruchsvoll, vor allem in Bezug auf die Verfügbarkeit von Wasser 3. Bakterien dauerhaft müssen für optimale Bedingungen in heterogenen Umgebungen 4 suchen, aber das Fehlen von kontinuierlichen Wasser Filmen führt zu eingeschränkter Mobilität 5 behindern sie frei verteilen. Auch sind Diffusionsraten von gelösten Stoffen (zB Nährstoffe) unter ungesättigten Bedingungen 6 gesenkt. So werden Bakterien und Nährstoffe oft physisch getrennt und Nährstoff Zugänglichkeit begrenzt ist 3. Als Folge könnte ein Transportvektor für chemische Verbindungen, die nicht einen kontinuierlichen Wasserphase erfordern, hilft, diese Einschränkungen zu überwinden. In der Tat haben viele Mikroorganismen wie Pilze und Oomyceten ein filamentöses Wachstum bilden damit sie durch luftgefüllten Porenraum wächst dadurch erreichen und mobi entwickeltlizing auch körperliche getrennt Nährstoffe 7 und 8 kohlenstoffhaltigen Substanzen über lange Distanzen. Sie können sogar als biologische Transportvektoren, die Zucker und andere Energiequellen, um Bakterien 9 liefern zu handeln. Aufnahme und dem Transport in Myzel Organismen wurde auch für hydrophobe organische Schadstoffe, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in Pythium ultimum 10 oder in arbuskulären Mykorrhizapilzen 11 gezeigt. Seit PAH sind allgegenwärtig und schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen 12 im Boden könnte Mycel-vermittelten Transport helfen, Verunreinigung Bioverfügbarkeit für potenzielle Bakterien Abbauern erhöhen. Während der Gesamtbetrag der Schadstofftransport direkt durch chemische quantifizieren Mittel 10, die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen durch Myzel zu abbauenden Bakterien und anderen Organismen transportiert nicht leicht zu beurteilen.

Das folgende Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen myce evaluierenlia auf Schadstoff Bioverfügbarkeit um bakterielle Abbauern in direkter Weise; sie ermöglicht das Sammeln von Informationen über die räumlich-zeitliche Auswirkungen von Schadstoffen auf die mikrobielle Ökosysteme. Wir beschreiben, wie Sie eine ausführliche ungesättigten Mikrosystem imitiert Luft-Wasser-Grenzflächen in Böden durch die Verknüpfung von ein physikalisch getrennt PAH Punktquelle mit PAK-abbauenden Bakterien Bioreporter über Myzel Transportvektoren. Weil Luftverkehr ausgeschlossen ist, kann die Wirkung der Myzel-basierten Transport auf PAH Bioverfügbarkeit für Bakterien in einer isolierten Art und Weise untersucht werden. Im Einzelnen wurden drei-Ring PAK Fluoren, das Myzel Organismus Pythium ultimum und die Bioreporter Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-MCHe 13 in den beschriebenen Mikrokosmos Setups angewendet. Das Bakterium B. sartisoli RP037-MCHe wurde ursprünglich konstruiert, Phenanthren Flüsse an die Zelle 14 zu untersuchen und exprimiert enhanced green fluorescent protein (eGFP) als ein Ergebnis der PAH Flußmitteldie Zelle, während die rot fluoreszierende mCherry konstitutiv exprimiert wird. Detaillierte Informationen zu dem Reporter Bau von Tecon et al. 13 In Vorversuchen gegeben, zeigte das Bakterium keine Schwimmen und nur sehr langsam Schwarmfähigkeit. Es konnte sich langsam auf Hyphen von Pythium ultimum wandern, wenn als dichte Suspension wurde auf den Hyphen aufgebracht. Da Bakterien wurden in Agarose in dem folgenden Protokoll eingebettet ist, hat Migration auf Hyphen nicht auftritt.

Mit Hilfe der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) können die Bioreporter Bakterien direkt in den Mikrokosmen visualisiert werden und die Expression des eGFP kann in Bezug auf die Menge von Zellen (proportional zur mCherry Signal) mit Hilfe der Software ImageJ quantifizieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bioverfügbarkeit qualitativ in verschiedenen Szenarien (dh höher oder niedriger). FLU gefunden bioverfügbar nach Myzel Transport von P. zu sein ultimum (dh eshöher war als bei einer negativen Kontrolle). Außerdem wird das Protokoll beschreibt, wie die Gesamtmenge der Myzelien-vermittelte Transport über chemische Mittel zu quantifizieren und Verunreinigung Bioverfügbarkeit Überprüfung mittels silikonbeschichteten Glasfasern (SPME-Fasern) in identischen Mikrokosmen. Ergebnisse mit diesem Mikrokosmos Setup veröffentlicht wurden und für die Kombination von P. diskutiert ultimum, Fluoren und B. sartisoli RP037-MCHe 15. Hier liegt der Fokus auf einer detaillierten Beschreibung und Methode der Identifizierung von möglichen Gefahren des Protokolls, dieses Wissen für mögliche weitere Anwendungen. Weitere Anwendungen kann es sich um verschiedene Pilz-, Bakterien- Spezies (zB von verunreinigten Standorten), und andere Verunreinigungen (zB Pestizide) oder schadstoffVersorgung (zB, im Alter von Böden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Vorbereitung der Gerichte, Slides und Inkubationskammern

  1. Bereiten Sie das folgende Material für jeden Mikrokosmos: eine große Kunststoff-Petrischale unten (d = 10 cm), ein modifiziertes (siehe Schritt 1.2) kleine Kunststoff-Petrischale unten (d = 5 cm) mit Deckel und einer Zählkammer Rutsche mit drei Hohlräumen.
  2. Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Petrischale Unterteile (d = 5 cm). Entfernen Sie Teil der Rand mit einer Säge passgenau einen Schieber (26 mm Kantenlänge). Um das System zu sterilisieren, genießen Petrischale Böden und Deckel in 70% Ethanol O / N und trocknen Sie sie für mindestens 2 Stunden in einem Strom Schrank unter UV-Licht. Speichern die Petrischalen in einem dicht verschlossenen Kunststoffbehälter, der auch UV-Licht 2 Stunden ausgesetzt worden waren.
  3. Wischen Sie die gewünschte Anzahl der Folien mit 70% Ethanol und Klima trocknen. Wickeln Sie Folien in Aluminiumfolie und legen Sie sie in einem Muffelofen 5 h bei 450 ° C, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen. Bereiten Glas Inkubationskammern mit Deckel. Reinigen mit 70% Ethanol und freizulegen offenen Kammern mit UV-Licht für mindestens 2 h in einem Strömungsgehäuse.
    HINWEIS: Large Exsikkatoren (Durchmesser etwa 30 cm) mit Deckel kann zu diesem Zweck verwendet werden; jeder Exsikkator kann bis zehn Mikrokosmos Setups Haus auf.

2. Herstellung der Medien und Kultur

  1. So führen 20 parallel Mikrokosmen, erhalten 100 ml geändert Trypton-Hefe-Medium (MTY) 14, etwa 150 ml 21C-Minimalmedium 16 (MM), 5 ml Minimalmedium-Agar (MMA; 0,5% w / v), drei Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten (PDA; 1,5%, w / v) für P. ultimum, vier leeren Platten, einer PDA-Platte, die 2 mg L -1 Cycloheximid vier Agaroseplatten (3% w / v), enthaltend 0,3 g ml -1 Aktivkohle und 40 mg FLU in 2 mg-Portionen.
  2. Bereiten mty enthaltend 50 mg L -1 Kanamycin (Kanamycin ist required, um die eGFP Reporterplasmid) und MM mit 10 mM Acetat für bakterielle Anbau erhalten. Verwenden MM ohne Acetat auf 0,5% MMA zur Immobilisierung von Bakterien in den Mikrokosmen vorzubereiten und Platten gießen (jeweils 20 ml) von 1,5% PDA für den Anbau von Pythium ultimum und Mikrokosmos Setups.
  3. Impfen Sie einige Hyphen von P. ultimum auf drei frische PDA-Platten und Inkubation im Dunkeln bei 25 ° C für etwa 72 Stunden. Stellen Sie anschließend sicher, dass die Platten überwuchert vollständig durch frische und flauschige Myzel.
  4. Starten zwei Kulturen von B. sartisoli RP037-MCHe in 50 ml MTY aus einem Glycerin Lager. Inkubation bei 30 ° C mit 230 Umdrehungen pro Minute rotierenden Kolben Bewegung O / N.
  5. Maßnahme Kultur optische Dichte (OD) bei 578 nm und die Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min (für B. sartisoli RP037-MCHe ist die erwartete OD 578 etwa 1,0, und die Zellen sind in der exponentiellen Phase). Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren, die Zellenin einer angemessenen Menge von MM auf eine OD 578 von 0,4 zu erreichen. Impfen Sie 20 ml MM mit 50 mg L -1 Kanamycin mit 400 ul der resuspendierten Zellen. Inkubation bei 30 ° C mit 230 Umdrehungen pro Minute rotierenden Kolben Bewegung O / N.
  6. Messen OD 578 der Kultur in MM (von B. sartisoli RP037-MCHe ist die erwartete OD 578 etwa 0,2, und die Zellen in der frühen exponentiellen Phase). Zentrifugenkultur bei 2.000 × g für 10 min und erneut die Zellen in einer geeigneten Menge an MM auf eine OD von 0,4 erreicht. Mischen Sie 50 ul der Zellsuspension mit 500 ul warme, flüssige MMA in 2-ml-Röhrchen und lagern bei 50 ° C bis zur Verwendung. Verwenden Sie 150 ul der Zellen in MMA für jedes Mikrokosmos.
  7. Platten gießen Agarosegel Aktivkohle enthält. Schmelzen Agarose (3%, w / v) in doppelt destilliertem Wasser. Gründlich mischen mit Aktivkohle (0,3 g ml -1) und gießen Mischung in Kunststoffpetrischalen(D = 10 cm).

3. Mikrokosmos Montage

. Hinweis: Die komplette Mikrokosmos Setup ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt, finden Sie in allen folgenden Einzelschritte Abbildung 1. Die folgenden Schritte beschreiben die Vorbereitung einer Probe (SAM) mit Myzel Transportvektoren und drei verschiedene Steuerungseinstellungen (CON AIR CON NEG, CON POS). Eine Zusammenfassung der verschiedenen Einstellungen können in Tabelle 1 gefunden werden.

  1. Nehmen gewünschte Anzahl von Petrischalen und Rutschen und deckt sie mit UV-Licht unter einem Strom Schrank für 30 min.
  2. Setzen Sie den kleinen Petrischale in der großes und passen Sie die Folie durch den Spalt des kleinen Petrischale. Nehmen Sie eine Probe des warmen Zellsuspension in MMA und fügen Sie 150 ul in die Mitte Hohlraum eine Folie. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die mittleren Hohlräumen aller Folien sindmit MMA gefüllt. Warten Sie 5 Minuten für die MMA zu verfestigen.
  3. Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer aus einem leeren PDA Platte Punch-Out kreisförmigen Flecken. Legen Sie ein Patch in einem Abstand von 2 mm neben dem MMA in dem kleinen Petrischale. Fügen Sie diese auf Myzelwachstum im Setup (PDA 3 in Abbildung 1) zu fördern.
  4. Schneiden gekrümmt PDA Patches als mechanische Barrieren. Verwenden Sie eine saubere und sterile kleine Petrischale Unterteil und drücken Sie sie in ein PDA-Platte. Verwenden Sie einen Spachtel, um einen anderen kleineren Ring in einem Abstand von 0,5 cm in den Agar, die in einem PDA-Ring führt zu schneiden.
    1. Schneiden Sie ein Stück, das passt genau in die Lücke des kleinen Petrischale im Mikrokosmos Setup und legen Sie sie in die Lücke an der Spitze der Folie. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen dem MMA und dem kreis PDA Barriere beträgt etwa 2 mm. Schließen Sie den Deckel des kleinen Petrischale leichten Druck in die PDA-Schranke.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.4.1 mit einem PDA-Platte mit 2 g L -1Cycloheximid.
      HINWEIS: Dies ist die Steuer Setup für Lufttransport (CON AIR) zu den Bioreporter Zellen, da Myzel durch Cycloheximid gehemmt und nicht überwuchern MMA.
  5. Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer zu Punch-Out kreisförmigen Flecken von einem leeren PDA Platte. Verwenden Sie ein anderes 0,5 cm Korkbohrer zu schneiden Sie die Mitte der ersten Patch. Platzieren der resultierenden kleine PDA-Ring in einem Abstand von 1 mm neben dem PDA Barriere (PDA 1 in Abbildung 1).
  6. In 2 mg FLU in das Loch des PDA 1. Verwenden Sie ein 1 cm Korkbohrer ausschneiden kreisförmigen Flecken von PDA-Platten überwuchert P. ultimum und stellen Sie einen Patch (PDA 2 in Abbildung 1) unten nach unten auf den PDA-Ring, so dass der Myzelmatte steht vor der Grippe-Kristallen.
    1. Wiederholen Sie diesen Schritt ohne Zusatz von FLU-Kristallen.
      HINWEIS: Dies ist die negative Kontrolle Setup (CON NEG), um festzustellen, HintergrundFluoreszenz Bioreporter Zellen.
  7. Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer aus dem Agar mit Aktivkohle Punch-Out kreisförmigen Flecken. Zeigen vier Patches in jeder Mikrokosmos-Setup, um die gasförmigen FLU-Konzentration (Abbildung 1) weiter zu verringern.
  8. Bereiten Sie eine positive Kontrolle (CON POS). Fügen Sie einige FLU Kristalle zu 200 ul Zellsuspension MMA und steckte es in einen Hohlraum einer leeren Folie.
  9. Platzieren einer Petrischale (d = 10 cm) mit etwas Pulver aus Aktivkohle auf dem Boden der Inkubationskammer zu FLU Gaskonzentration in der Kammer zu minimieren. Auch legen vier vor fünf 50 ml-Bechergläser mit sterilem Wasser auf der Unterseite mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Kammer aufrechtzuerhalten.
    1. Übertragen Mikrokosmos Setups in Inkubationskammern und Inkubation bei 25 ° C für 96 Stunden. Platz Proben nach dem Zufallsprinzip in den verschiedenen Wachstumskammern zur Lage Effekte auszuschließen.
      HINWEIS: Diese Inkubationszeit apLagen an den Oomyceten P. ultimum. Es könnte unterschiedlich für andere Organismen.

4. konfokale Laser Scanning Mikroskopie

  1. Idealerweise verwenden Sie ein CLSM-Setup mit aufrechten Mikroskop.
    HINWEIS: Es kann mit herkömmlichen Lasern Angebot zB 488, 561 und 633 nm Linien zur Anregung oder mit Tunable White Laserquelle ausgestattet werden.
  2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Sammlung von Bildern: Anregung: 490 nm (eGFP) und 585 nm (mCherry) an der entsprechenden Laserintensität (simultane Anregung); Emissionsbereiche: 500 bis 550 nm (eGFP) und 605 bis 650 nm (mCherry); Objektiv: 63X NA 0,9 Wasser eintauchbar (aufgrund seiner großen Arbeitsabstand); Schrittweite für Z-Stapel: 0,5 um.
  3. Öffnen Mikrokosmos Einrichtung und Verwendung eines Skalpells auf PDA 1, 2, 3 und den PDA Barriere zu entfernen. Setzen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des MMA und drücken Sie sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Montieren Sie gleiten auf Mikroskoptisch. Fügen Sie einen Tropfen Wasser auf der Oberseite des the Deckglas und benutzen mCherry Einstellungen Bioreporter Zellen in der Probe zu finden.
  4. Holen Sie sich einen schnellen Überblick über die Probe und optimieren Rauschabstand mit einem Schein-über-unter Tabelle für rot (mCherry) und Grün (eGFP) Kanal. Wählen Sie eine zufällige Position auf der Probe zu Bioreporter Fluoreszenz analysiert.
    HINWEIS: Hyphen können Autofluoreszenz im Bereich von Bioreporter Emissions (zB grüne Autofluoreszenz) 17 zeigen. Achten Sie darauf, Bereiche ohne Hyphen wählen, wenn dies der Fall ist.
  5. Definieren und notieren z-Stapel für jede Position im grünen (eGFP) und die rote (mCherry) Kanal. Vermeiden Ausbleichen der Probe von Long-Positionen in Epifluoreszenz Licht oder Laserlicht.
    1. Wiederholen Sie die vorherigen Schritt für zehn zufällig, gleichmäßig verteilte Positionen.
  6. Wiederholen Sie alle Schritte mit den gleichen Einstellungen für alle Proben der Teststrecke (SAM), CON AIR CON NEG und CON POS.
  7. 5. Bildanalyse

    HINWEIS: Um die rote (mCherry) und Grün (eGFP) Fluoreszenz in den z-Stapel aufgezeichnet Analyse wird unter anderem die kostenlose Software ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kann verwendet.

    1. Achten Sie auf die logi_tool Plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) installieren.
    2. Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Wählen Sie "aufgeteilt Kanäle" und in der Nähe grünen Kanal. Verwenden Sie das Makro 'mCherry Bereich "als Zusatzcode-Datei in Bereich der roten Fluoreszenz in Z-Stapel zu quantifizieren ist. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen im Makro (fett gedruckt).
      1. Output ist eine Tabelle mit den gemessenen Pixel über dem Schwellenwert (und über dem festgelegten Mindestgröße) in z-Stack.
        Hinweis: Die Summe aller Werte ist die Gesamtzahl der roten Pixel (Bereich) in dem Stapel.
    3. Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Wählen Sie "aufgeteilt Kanäle" und in der Nähe roten Kanal. Verwenden Sie den Makro 216; eGFP int 'als Zusatzcode-Datei zur Verfügung gestellt, um die Intensität der grünen Fluoreszenz in z-Stapel zu quantifizieren. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen im Makro (fett gedruckt).
      1. Die Ausgabe ist eine Tabelle mit den mittleren Intensitäten und Fläche aller grünen Gegenstände über der Schwelle (und über dem festgelegten Mindestgröße) in Z-Stapel. Um im Stapel berechnen die Gesamtintensität der grünen Pixel, multiplizieren jeweils mittlere Intensität durch die entsprechende Region.
    4. Berechnen Sie den prozentuellen eGFP Induktion (eGFP rel):
      Gleichung 1 (1)
      Hinweis: Da mCherry konstitutiv exprimiert wird, ist der resultierende Wert von eGFP rel ein relatives Maß für die Menge an eGFP durch eine bestimmte Anzahl von Zellen ausgedrückt. Bitte auf Tabelle 3, um weitere Informationen über die Berechnung des eGFP rel verwiesen.
    tle "> 6. Chemical Quantifizierung

    HINWEIS: Mikrokosmos Konfigurationen können auch verwendet werden, um chemische Quantifizierung transloziert FLU Mengen mit oder ohne einem abiotischen Verunreinigung Körper auszuführen.

    1. Wickeln Sie 15 ml Glasfläschchen, 1 ml GC / MS-Fläschchen und Fremdbeilagen in Aluminiumfolie. Füllen Abdampfschalen mit Na 2 SO 4; stellen alle in Muffelofen 5 h bei 450 ° C, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen. Lagern Sie das Na 2 SO 4 innerhalb eines aktivierten Exsikkator.
    2. Schneiden PDMS beschichteten Glasfasern in 0,5 cm Länge. Fasern waschen durch Schütteln viermal 2 h in frischem Methanol. Wiederholen Sie die Schritte Waschen noch vier Mal mit Reinstwasser und speichern sauber Fasern in ultrareinem Wasser in einem verschlossenen Glasfläschchen.
    3. Bereiten 1,5 l Toluol / Aceton (3: 1, v / v), enthaltend 10 ug L -1 Phenanthren-d 10.
    4. Die Schritte 1, 2 und 3 des Protokolls. Bereiten Mikrokosmen ohne BIOR(-) und CON AIR (- SAM ()) eporter Zellen FLU Transport studieren und mit Bioreporter Zellen (SAM), um FLU Abbau zu überprüfen.
      1. Optional (ohne Bioreporter Zellen): Platz drei PDMS beschichteten Glasfasern (in der Regel für die SPME Experimente verwendet) als künstliche und messbaren Schadstoffwanne nach innen MMA von SAM (-) mit einer feinen Pinzette.
      2. Entfernen Glasfasern mit feinen Pinzetten und übertragen jeweils ein in ein GC / MS-Fläschchen mit Einsatz.
      3. Fügen Sie 200 ul Toluol und schütteln vertikal O / N und mittels GC / MS analysiert. Verwenden Sie die Einstellungen in der Tabelle 2 zur Verfügung gestellt.
    5. Übertragen MMA aus dem mittleren Hohlraum in eine 15 ml Glasphiole und etwa drei Spatel von Na 2 SO 4. Nach gründlichem Mischen mit einem Spatel und 10 ml Lösungsmittel. Vortex die Mischung und schütteln horizontal O / N im Dunkeln.
      1. Über 1001; l Probe in GC / MS-Fläschchen mit Einsatz. Zugabe von 10 ul Acenaphthylen-d 08 (10 mg L -1) und Analyse mittels GC / MS unter Verwendung desselben Programms wie in 6.4.3 beschrieben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits früher 15 veröffentlicht. Bitte auf den Artikel für detaillierte mechanistische und Umweltdiskussion verweisen.

Nach Bildaufzeichnung über CLSM kann ein Maximum Intensity Projection mit dem entsprechenden Mikroskop-Software oder ImageJ, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und die Bedienelemente (Abbildung 2) zu gewinnen durchgeführt werden. Später können die Datensätze unterschiedlich, um sinnvolle Funktionen durch spezifische Visualisierungssoftware zeigen projiziert werden. Die positive Kontrolle (CON POS) zeigt deutliche eGFP Induktion (2A), während die Luftregelung (CON AIR) zeigt nur Hintergrund eGFP-Fluoreszenz (2B). eGFP-Fluoreszenz in der Testprobe (SAM) auf erhöhte verglichen werden, um CON AIR, y erscheintet nicht so ausgeprägt wie CON POS (2C). Die mCherry Fluoreszenz von PAH Abbau unabhängig und daher für alle Proben gleich. Jedoch wird leicht erhöhter eGFP-Signale nicht durch dieses Verfahren und die anschließende Bildanalyse nachgewiesen werden soll, von wesentlicher Bedeutung.

Für die getesteten Mikrokosmen wurde Sichtkontrolle durch Bildanalyse und Berechnung der relativen eGFP Induktions ergänzt (siehe Schritt 5 ff des Protokolls; Abbildung 3). Die grüne Hintergrundfluoreszenz für nicht-induzierten B. sartisoli RP037-MCHe mit CON NEG berechnet. Unter den angegebenen Bedingungen wurde der relative eGFP Induktion gefunden eGFP rel sein = 0,53. Zwischen CON NEG und CON AIR konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (eGFP rel = 0,54; p> 0,95) Damit wird die Erfassung der Dampfphase FLU Transport in Richtung der Bioreporter Zellen. Für CON POS, stark erhöhte eGFP Induktion (eGFP rel = 53,7) wurde festgestellt, bestätigt die Vitalität der Zellen in MMA nach 96hr und die die maximale eGFP Induktion. In Gegenwart von Myzelien und FLU (SAM) wurde eGFP deutlich in den Zellen im Vergleich zu den Negativkontrollen induzierte (eGFP rel = 1,15; p <0,001). Allerdings ist die eGFP Induktion relativ niedrig im Vergleich zu der positiven Kontrolle (siehe Tabelle 3 Nummer 8).

Transport von FLU von Myzelien P. ultimum im Mikrokosmos Setup wurde chemisch (; 4 6 ff des Protokolls siehe Schritt) quantifiziert. In Gegenwart von FLU und P. ultimum (SAM (-)), Myzel transetwa 25 ng FLU innerhalb 96hr, die eine Transportgeschwindigkeit von 37.5pmold -1 cm -1 entspricht entfernt. Kontrollen in Abwesenheit von Mycel (CON AIR (-)) ergab gasförmigem FLU Transport in das MMA im Bereich von nur 2 ng innerhalb 96hr, also die Induktion des Bioreporter durch Dampfphasenkonzentrationen ausgeschlossen werden konnten. Wenn B.sartisoli RP037-MCHe anwesend war (SAM), <1 ng von FLU wurde in der MMA-Patch erkannt. Dies verifiziert wirksame bakterielle FLU Abbau anschließende dem Mycel-vermittelte Translokation.

Es ist möglich, den Einfluss der bakteriellen Abbau, dh eines FLU Waschbecken, auf FLU Translokation durch Hinzufügen eines abiotischen Schadstoffkörper an der System (siehe Schritt 6.4.1 ff des Protokolls) zu untersuchen. Somit ist man in der Lage, die Menge an FLU durch die Fasern absorbiert und die Menge innerhalb des MMA und darüberliegenden Hyphen links quantifizieren. Für SAM(-), Ist die Gesamtmenge transloziert aus dem Vorhandensein einer Verunreinigung Enke unabhängig (p> 0,9; 5A). Allerdings wurde ein Mikrokosmos mit einer erhöhten Aufnahme FLU Bereich getestet, wie im Detail zuvor 15 beschrieben. Dort wird eine signifikante Steigerung der transloziert FLU Menge nachgewiesen werden (5B).

Figur 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung und Fotos der gesamten Mikrokosmos Setup. Blick von oben (A) und von der Seite (B). Alle Agar Pflaster wurden auf einem Objektträger mit drei kleinen Hohlräumen platziert. Zwei mg FLU Kristalle wurden in einem Hohlraum (d = 5 mm) in der Mitte des PDA 1. PDA 2 platziert wurde frisch wuchert Hyphen von P. ultimum Blick PDA 1. Eine geschwungene PDA Stück wurde zwischen PDA 2 und der MMA Patch platziert schaffen eine mechanische FLU Barriere zusammen mit dem Deckel einer Petrischale (d = 5 cm). Vier Agar-Patches, die Aktivkohle im Setup platziert, um die gasförmigen FLU Konzentration weiter zu verringern. Fotos von der komplette Mikrokosmos von oben (C) und Schrägansicht (D) ohne Mikroorganismen und FLU. 1A und 1B wurden mit freundlicher Genehmigung von Schamfuss et al modifiziert. 15 mit Genehmigung von Schamfuss, S. et al angepasst. Auswirkungen der Myzel auf die Zugänglichkeit von Fluoren PAH-abbauenden Bakterien. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

pg "/>
Abbildung 2. Maximum Intensity Projections des konfokalen Laser Scanning mikroskopische Aufnahmen. Schliffbilder sind Visualisierung der mCherry und eGFP Induktion der Bioreporter Bakterium B. sartisoli RP037-MCHe in MMA. Wenn die Bakterien hatte Kontakt zu einem kristallinen FLU Quelle in MMA (CON POS; A), die eGFP Signals erhöht, verglichen mit Kontrollen (CON AIR; B). Proben mit FLU und P. ultimum (SAM; C) auch eine erhöhte eGFP-Signal jedoch weniger ausgeprägt als die positive Kontrolle. mCherry konstitutiv exprimiert wird, und dient somit als eine visuelle Kontrolle, um die Zellen zu detektieren. (Vergrößerung 630X, Bar 20 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

"Fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 3
Abbildung 3. Relative eGFP Induktion in B.sartisoli RP037-Che für CON NEG, CON AIR und SAM mit Myzel und Grippe. Ein Vergleich der relativen eGFP Induktion (eGFP rel) von B.sartisoli RP037-Che nach 96hr in der Abwesenheit von FLU (CON NEG), in Gegenwart von FLU aber Abwesenheit P.ultimum (CON AIR) und in Gegenwart von sowohl FLU und P.ultimum (SAM). Statistisch signifikante Unterschiede zu CON NEG sind mit einem Stern markiert. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung für unabhängige CON Luft durchgeführt und CON NEG auf. Eine Probe wurde für CON POS getestet und eGFP rel wurde mit 53,7 berechnet. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von Schamfuss et al. 15 mit Genehmigung von Schamfuss, S. et al. Auswirkungen der Myzel Angepasst auf die Zugänglichkeit von Fluoren an PAH-abbauenden Bakterien modifiziert. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

4
. (. Cf Abbildung 1) Abbildung 4. Chemische FLU Quantifizierung des Gesamtbetrags der FLU in ng vom MMA Patch extrahiert nach 96hr für Dampfphasen-Transport ohne Zellen (CON AIR (-)), mycelial Transport ohne Zellen (SAM (-)) und Myzel-Transport mit Zellen (SAM). Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von Schamfuss et al. 15 mit Genehmigung von Schamfuss, S. et al. Auswirkungen der Myzel Angepasst auf die Zugänglichkeit von Fluoren an PAH-abbauenden Bakterien modifiziert. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Abbildung 5
Abbildung 5. Chemische FLU Quantifizierung in Gegenwart eines abiotischen Schadstoffkörper (A) des Gesamtbetrags der FLU in ng vom MMA Patch extrahiert nach 96hr für Myzel-Transport mit oder ohne künstliche Schmutzkörper (SAM (. (Siehe Abb. 1) - ) mit oder ohne PDMS coATED Fasern). (B) gleiche Ergebnisse für einen abwechslungsreichen Teststrecke mit erhöhter Pilzgeflecht-FLU-Aufnahme-Bereich. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von Schamfuss et al. 15 mit Genehmigung von Schamfuss, S. et al. Auswirkungen der Myzel Angepasst auf die Zugänglichkeit von Fluoren an PAH-abbauenden Bakterien modifiziert. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Name FLU Mycelia Cells Anwendung Kommentare
SAM + + + CLSM
GC / MS
SAM (-) + - GC / MS mit PDMS Fasern als künstliche Verunreinigung Spüle möglich
CON AIR + (+) + CLSM Myzel wächst nur bis zu PDA Barriere; MMA nicht abgedeckt
CON AIR (-) + (+) - GC / MS Myzel wächst nur bis zu PDA Barriere; MMA nicht abgedeckt
CON NEG - + + CLSM
CON POS + - + CLSM Zellen werden direkt an FLU Kristallen ausgesetzt

Tabelle 1: Übersicht über alle Probentypen Zusammenfassung aller Kontroll- und Testproben einschließlich Anwendung (Bioreporter Assay - CLSM oder chemische Quantifizierung - GC / MS). Und Kompositiontion (FLU, Myzel und Bioreporter Zellen).

Ofen
Ausgangstemperatur 50 ° C
Anfangszeit 2 min
Preis 15 ° C min -1
Endtemp 300 ° C
Schlusszeit 6,33 min
Injector (PTV)
Injektionsvolumen 0,5 ul
Modus Splitlos
Säuberung 2,00 min
Spülstrom 50.0 ml min -1
Ausgangstemperatur 80 ° C
Anfangszeit 0,02 min
Rampen: Bewerten 600 ° C min -1
Endtemp 300 ° C
Schlusszeit 10 Minuten
Spalte
Modell J & W DB-5MS
Nennlänge 20 m
Nennweite 180 um
Nennschichtdicke 0,18 um
Trägergas Helium 0,8 ml min -1
MSD Transferline 280 ° C
MSD
Sim-Modus
MS Quelle 230 ° C
MS Quad 150 ° C

Tabelle 2. Einstellungen für die GC / MS. Zusammenfassung aller Einstellungen für die GC und MS quantify Fluoren in den Mikrokosmos Setups.

FALLEN KOMMENTAR
1 Vorläufige Wachstum und Vitalität Tests Studieren Sie das Wachstum von Myzel Organismus der Wahl. Wie lange dauert es, bis die MMA-Patch zu erreichen? Wird sie durch die Cycloheximid Barriere gehemmt? Überprüfen Sie auch, ob Bioreporter Zellen bleiben vital in MMA die ganze Zeit über Flechten Assays. Wenn nicht, kann man auch eine Kohlenstoffquelle zu der MMA, die nicht in Bioreporter Induktion führt, hinzuzufügen. Ausschließen mögliche gegenseitige Hemmung von Bakterien und Myzel.
2 Myzel-Wachstum Die Wachstumsrate des Mycel-Organismus sollte nicht zu gering sein, da sonst Gasphasentransport von PAH bei längerer Inkubationszeit steigt. Das Protokoll kann angepasst werdenPAH zu einem späteren Zeitpunkt hinzufügen, aber dann wieder, kann Myzel an der Impfstelle nicht aktiv sein mehr.
3 Bakterielle Mobilität Wenn ein Punkt Scanning-Laser-Mikroskop verwendet wird, und der Bakterienstamm ist beweglich, die Aufzeichnung und die Quantifizierung der z-Stapel kann unmöglich sein aufgrund einer Bewegung innerhalb des MMA. Somit sollte bakteriellen Bewegung gehindert werden, beispielsweise durch eine Erhöhung der Festigkeit von MMA unter Verwendung von CLSM eine schnelle Scanner oder einer Drehscheibe Lasermikroskop.
4 Dampfphasen-Transport Dampfphasen-Transport der Chemikalie (zum Beispiel PAH) in Richtung der Bioreporter Zellen müssen hinreichend ausgeschlossen werden, da Bioreporter Zellen extrem empfindlich gegenüber Chemikalien, die in der Dampfphase befinden. Das ist der entscheidende Punkt der ganzen Protokoll, um falsch-positive Ergebnisse durch Gastransport zu verhindern. Die Gasphase(-) Konzentration kann durch chemische Analyse CON AIR abgeschätzt und Dampfphasenkonzentrationen können beispielsweise durch Hinzufügen von mehr oder weniger Agarose Patches mit Aktivkohle eingestellt werden.
5 Toxizität Denken Sie daran, dass hohe Konzentrationen der Prüfsubstanz können toxische Wirkungen auf den Organismus Myzel und / oder Bakterien.
6 Autofluoreszenz Überprüfen Sie, ob die gewählte Myzel Organismus zeigt einige Autofluoreszenz im Bereich der erwarteten Bioreporter Signal. Achten Sie darauf, auf verschiedenen Wachstumsstadien zu überprüfen, da die Autofluoreszenz kann 17 variieren. Wenn Autofluoreszenz erkannt wird, müssen Sie Z-Stapel in Myzel freie Bereiche zu erfassen.
7 Bleichen mCherry Fluoreszenz ist normalerweise stabil und unempfindlich gegenüber Bleich im angelegten bioreporter Zellen. Im Gegensatz dazu bleicht eGFP ziemlich schnell. Daher verwenden Sie nicht die eGFP-Kanal, um die Probe vor der Z-Stapel-Aufnahme sichtbar zu machen.
8 eGFP Induktions Uns ist aufgefallen eine niedrige eGFP Induktion in SAM im Vergleich zum POS CON. Dies wird durch die starke räumliche Beschränkung und geringe Zugänglichkeit der FLU Quelle entfielen auf sehr niedrige Dampfphasenkonzentration von FLU (vgl letzten Ergebnisse Absatz) aufrecht zu erhalten. Abhängig von der gewählten Bioreporter Belastung und chemischer kann die Festhaltezone auf PDA 1 variiert, um die Transportrate (5B) zu erhöhen. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass sich dadurch auch Dampfphasen-Transport zu den Zellen Bioreporter werden.
9 Berechnung der eGFP rel Die vorgestellte Methode zur Berechnung eGFP rel wo die Intensität des grünen Bildpunkten verglichen wird,auf den Bereich der roten Pixel ist nur eine Möglichkeit. Bitte auf die Diskussion für weitere Informationen.
10 Pixelgröße Bitte beachten Sie, dass die Vergrößerung des gewählten Linse und ein mögliches Einsatzzoomfaktor beeinflussen die Pixelgröße des Bildes. Dies muss berücksichtigt vor der Bildanalyse berücksichtigt werden.
11 Bioverfügbar Fraktionen Beachten Sie, dass die Bioverfügbarkeit der Verbindung transportiert wird qualitativ über eGFP Induktion bewertet (nicht quantitativ). Eine Korrelation der berechneten relativen eGFP-Induktion und der bioverfügbare Fraktion wurde versucht. Jedoch kann dies in zukünftigen Anwendungen angesprochen werden.
12 Die Nachweisgrenzen Chemische Detektion. Für chemische Quantifizierung von organischen Verbindungen, einem breiten Spektrum von Konzentrationen können sicher erkannt werden. Wir haben festgestellt Mengen im Bereich 0ng und 1,000ng. eGFP Quantifizierung. Wir verglichen gegen eGFP Induktion in Proben ohne Schadstofftransport (dh 0NG transportiert), mit Myzel-vermittelten Transport (dh zwischen 20 und 40 ng transportiert; vgl 4 und 5) und mit direktem Kontakt zu den Schadstoffquelle (dh maximal zur Verfügung stehende Betrag). Diese drei Fälle erwiesen gut unterscheidbar mit dem beschriebenen Verfahren zu sein. Wir können aber eine detailliertere Aussage machen über die Auflösung des relativen eGFP Induktion. Dieses Problem kann in der Zukunft durch die Verknüpfung von unterschiedlichen Schadstoffmengen mit der Korrelation von eGFP Induktion in den Mikrokosmos Setups angesprochen werden.
13 Petrischale Material Petrischalen aus Kunststoff können in einer Unterschätzung der Myzel-PAH-Translokation und / oder Bioverfügbarkeit führen. Dies sollte nichtproblematisch, wenn qualitative Aussagen angestrebt werden. Für den Fall, präzise quantitative Messungen erforderlich, die Anwendung von Glaspetrischalen sollten trotz Herstellung und Handhabung berücksichtigt werden mehr unbequem sein werden.

Tabelle 3. Diskussion der möglichen Fallstricke. Mögliche Fallstricke vor und während des Experiments und der vorgeschlagenen Kommentare und Optionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die vorgestellte Mikrokosmos Setup als geeignet, um die Bioverfügbarkeit von räumlich getrennten Chemikalien abbauenden Organismen nach der Aufnahme und den Transport von Myzel zu studieren. Potenzielle Gasphasentransport von teilweise flüchtigen Verbindungen verhindert und bakterielle Bioreporter Zellen können ohne aufwändige Probenvorbereitung mit minimaler Störung des sensiblen System visualisiert und somit werden. Gleichzeitig kann die chemische Analyse der Probe leicht durchgeführt werden was eine gute Kontrolle der gewonnenen Ergebnisse und für die Quantifizierung des Gesamtverkehrs. Haben einige Punkte jedoch sorgfältig vor und während der Durchführung des Experiments zu betrachten. Ein wichtiger Punkt ist die Mikrokosmen frei von bakteriellen oder chemischen Kreuzkontaminationen zu halten. Dies kann eine Herausforderung sein, da viele Mikrokosmen laufen parallel und damit große Inkubationskammern (wie Exsikkatoren) erforderlich sind. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um alle Teile sorgfältig, bevor Sie das Setup-Bau zu sterilisierention. Ein weiterer kritischer Punkt kann die Anwendung von Kunststoffpetrischalen für den Mikrokosmos sein. Obwohl PAH und Bioreporter nicht in direkten Kontakt kommen, kann eine gewisse Menge an PAH durch den Kunststoff absorbiert. Allerdings betrachten wir dies nicht problematisch für die beschriebenen Protokoll, da dies zur Folge haben, wenn überhaupt, zu einer Unterschätzung des Mycel-PAH-Translokation und / oder Bioverfügbarkeit. In jedem Fall, wenn genaue Quantifizierung erforderlich ist, ist zu berücksichtigen, den Austausch der Kunststoffteile mit Glasteilen, obwohl Handhabung mehr unbequem. Andere Punkte, die berücksichtigt werden sollten, beinhalten die gewählte Bakterien- und Pilzstämme (mögliche gegenseitige Hemmung, Wachstum, Mobilität und mögliche Autofluoreszenz), die gewählten Chemikalien (toxische Wirkungen auf Mikroorganismen, Volatilität, Nachweisgrenzen) und praktische Aspekte (Bleichen, Begrenzung der eGFP Induktion und Berechnung von eGFP rel). Eine Zusammenfassung der möglichen Gefahren und entsprechende Kommentare finden Sie inTabelle 3.

Wir haben dieses Modell Mikrokosmos Setup Myzel FLU Transport und nachfolgende bakterielle Zersetzung in einem ungesättigten System direkt auf einer Zelle-Myzel Interaktionsebene zu demonstrieren. Unsere Modellaufbau variiert und eingestellt werden, um unterschiedliche Bedürfnisse verschiedener Bakterien- und Pilzstämme, chemische Verbindungen, etc. So könnte das System beispielsweise (i) verwendet werden, zu erfüllen, um den Einfluss von Myzelien auf Bakterien in Gegenwart auszuwerten ein ansonsten eingeschränkten chemischen (beispielsweise toxische) Quelle, (ii) um den Einfluss von Myzelien auf die Bioverfügbarkeit von Verbindungen zur bakteriellen Abbau vorherzusagen, (iii) an Verunreinigung Bioverfügbarkeitsstudie abhängig von der Entfernung von Bakterien in die Transportvektor oder (iv) um die Wirkung von verschiedenen chemischen Quellen (beispielsweise kristallin, im Boden oder gelöst) zu untersuchen. Allerdings ist die Einstellung des Systems, um einlternate Bedingungen heikel und sollte Schritt für Schritt, um eindeutige Ergebnisse zu erzielen durchgeführt werden. Bisher haben wir die Anlage nicht für andere bakterielle oder Pilz-Stämme und andere Verbindungen als PAH getestet. Da jedoch Myzel Netzwerke sind bekannt für den Transport auch andere Verunreinigungen als PAH wie Pestizide 19 oder lösliche Substanzen wie Salicylat 20, denken wir, dass das System an verschiedenen chemischen Verbindungen, die eine Verbindung spezifischen bakterielle Biosensor erweitert werden.

Bitte beachten Sie, dass je nach angelegter Bioreporter Stamm eine andere Berechnung der eGFP rel vielleicht vorzuziehen. Anstelle von Gleichung (1) die beiden folgenden Optionen angewandt werden könnte:

Gleichung 2 (2)

Gleichung 3 (3)

However, in der angegebenen Protokoll Gleichung (1) wurde aus den folgenden Gründen ausgewählt: (i) eGFP-Intensität wurde Berichten zufolge auf die PAH-Flußmittel auf die Zelle 14 zu korrelieren wohingegen (ii) mCherry wurde berichtet, dass beträchtliche Unterschiede bei verschiedenen Zellen 13 zeigen . Gleichung (2) und (3) Im Gegensatz dazu kann so gewählt werden, um falsche Informationen von potentiellen Licht Artefakte in der Probe zu verhindern. In jedem Fall, verglichen wir alle drei Berechnungsmethoden miteinander, wobei keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Dennoch, aufgrund der gemeldeten Schwankungen in der Fluoreszenzintensität mCherry empfehlen wir die Verwendung der Gleichung (1) oder (2).

Letztendlich sollten einige Beschränkungen der Technik betrachtet werden. Da die Mikrokosmen wurden entwickelt, um Gasphasentransport von der getesteten Verbindung zu verhindern, wird Myzel Aufnahme der Verbindung verringert. Dies führt zu niedrigeren Transportraten als mit ungehinderte Aufnahme zu erwarten. Daher ist die Empfindlichkeit des biorePorter-Stamm muss hoch genug sein, um kleine Änderungen in bioverfügbare Fraktionen erkennen. Ferner ist die Einrichtung wird wahrscheinlich nicht für Pilzstämme mit einer niedrigen Wachstumsrate sein. In diesem Fall könnte langfristig Inkubation Gasphasentransport der Verunreinigung zu falsch-positiven Ergebnissen führt begünstigen. Es könnte möglich sein, um die Einrichtung in einer Weise, die die Verunreinigung kann zu einem späteren Zeitpunkt aufgebracht werden, zu modifizieren. Jedoch kann Hyphen dann an der Impfstelle bereits inaktiv oder tot. Schließlich wird, wie oben angegeben, ist der Bereich der chemischen Verbindungen, die durch Mycel-Netzwerke transportiert werden, groß. Allerdings könnte die Verfügbarkeit eines geeigneten Bioreporter Stamm ein Begrenzungsschlüsselfaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter