Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

A Whole Cell Bioreporter tilnærming til Vurdere Transport og biotilgjengelighet av miljøgifter i vann Umettet Systems

doi: 10.3791/52334 Published: December 24, 2014

Summary

En hel celle bioreporter analysen med Burkholderia sartisoli RP037-mChe ble utviklet for å oppdage fraksjoner av en organisk forurensning (dvs. fluoren) tilgjengelig for bakteriell nedbrytning etter aktiv transport av mycel bridging luftfylte porer i et vann umettet modellsystem.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Jord er tett befolket av et bredt spekter av mikroorganismer 1,2 slik som bakterier. Men forholdene i dette habitatet er utfordrende, spesielt i form av vann tilgjengelighet tre. Bakterier permanent behov for å søke etter optimale forhold i heterogene miljøer fire, men fraværet av kontinuerlige vannfilmen som fører til nedsatt bevegelighet fem hindrer dem til å spre seg fritt. Dessuten er diffusjonshastigheter av oppløste stoffer (f.eks næringsstoffer) senket i henhold umettede forhold 6. Dermed er bakterier og næringsstoffer ofte fysisk atskilt og nærings tilgjengelighet er begrenset tre. Som en konsekvens av dette, kan en transportvektor for kjemiske forbindelser som ikke krever en kontinuerlig vannfase med på å overvinne disse begrensningene. Faktisk har mange mikroorganismer som sopp og Oomycetes utviklet en trådformede vekst skjema slik at de kan vokse gjennom luftfylte hulrommene dermed nådd og mobilizing også fysisk adskilt næringsstoffer 7 og karbonholdige åtte stoffer over lange avstander. De kan også fungere som biologiske transport vektorer som leverer sukker og andre energikilder til bakterier 9. Opptak og transport i myceliske organismer har også vist seg for hydrofobe organiske miljøgifter som polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) i Pythium ultimum 10 eller i arbuscular mykorrhizasoppene 11. Siden PAH er allestedsnærværende og tungt vannoppløselige forurensninger 12 i jordsmonnet, kan mycelia-mediert transport bidra til å øke forurensningen biotilgjengelighet for potensielle bakterielle degraders. Mens den totale mengden av forurensende transport kan kvantifiseres direkte ved kjemiske midler 10, biotilgjengeligheten av forurensninger som transporteres av mycel til nedbrytende bakterier og andre organismer kan ikke vurderes lett.

Følgende protokoll presenterer en metode for å evaluere virkningen av mycelia på forurensningen biotilgjengeligheten til bakterielle degraders i en direkte måte; det tillater å samle informasjon om tid og rom virkningen av miljøgifter på mikrobielle økosystemer. Vi beskriver hvordan du setter opp en forseggjort umettet mikrokosmos system hermet luft-vann-grensesnitt i jord ved å koble en fysisk atskilt PAH punktkilde med PAH-nedverdigende bioreporter bakterier via myceliske transport vektorer. Fordi lufttransport er utelukket, kan virkningen av mycelie basert transport på PAH biotilgjengelighet for bakterier bli studert i en isolert måte. I større detalj ble det tre-ring PAH fluoren, mycel-organisme av Pythium ultimum og bioreporter bakterien Burkholderia sartisoli RP037-mChe 13 anvendt i de beskrevne mikrokosmos oppsett. Bakterien B. sartisoli RP037-mChe ble opprinnelig konstruert for å studere fenantren flukser til cellen 14 og uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) som et resultat av PAH fluks tilcellen, mens den røde fluorescerende mCherry er uttrykt konstitutivt. Detaljert informasjon om reporteren bygging er gitt av Tecon et al. 13 I foreløpige tester, avslørte bakterien ingen svømming og bare veldig treg svermende evne. Det var i stand til å migrere langsomt på hyfer av Pythium ultimum ved påføring som en tett suspensjon på toppen av hyfer. Siden bakterier ble innleiret i agarose i den følgende protokoll, ble migrering av hyfer ikke forekomme.

Ved hjelp av konfokal laser-skanning mikroskopi (CLSM), kan de bioreporter bakterier visualiseres direkte i microcosms og ekspresjon av EGFP kan bli kvantifisert i forhold til mengden av celler (proporsjonal med mCherry signal) ved hjelp av programvaren ImageJ. Dette gjør det mulig å sammenligne biotilgjengelighet kvalitativt i ulike scenarier (dvs. høyere eller lavere). FLU ble funnet å være biotilgjengelig etter mycelial transport av P. ultimum (dvs. detvar høyere enn i en negativ kontroll). Videre, beskriver den protokoll hvor å kvantifisere den totale mengden av mycel-mediert transport via kjemiske midler og for å kontrollere forurensningen biotilgjengelighet ved hjelp av silisium-belagte glassfibrer (SPME-fibre) i identiske microcosms. Resultater ved hjelp av dette mikrokosmos oppsettet har blitt publisert og diskutert for kombinasjonen av P. ultimum, fluoren og B. sartisoli RP037-mChe 15. Her ligger fokuset på en detaljert metodebeskrivelse og identifisering av potensielle fallgruver protokollen for å gi denne kunnskapen for potensielle videre søknader. Andre applikasjoner kan innebære ulike sopp, bakteriearter (f.eks, fra forurensede områder), og andre forurensninger (f.eks plantevernmidler) eller forurensning-forsyning (f.eks alderen jord).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av Retter, lysbilder og Inkubasjon Chambers

  1. Forbered følgende materiale for hver mikrokosmos: en stor plast petriskål bunnen (d = 10 cm), en modifisert (se trinn 1.2) liten plast petriskål bunnen (d = 5 cm) med lokk og en tellekammer lysbilde med tre hull i tennene.
  2. Ta det ønskede antall petriskål bunndeler (d = 5 cm). Fjerne en del av randen med en sag til akkurat passe et lysbilde (26 mm kantlengde). Å sterilisere systemet, suge petriskål bunner og lokk i 70% etanol O / N og tørk dem i minst 2 timer i en flyt skap under UV-lys. Oppbevar petriskåler i en tett lukket beholder, som også hadde blitt eksponert for UV-lys i 2 timer.
  3. Tørk ønsket antall lysbilder med 70% etanol og luft-tørke dem. Pakk lysbilder i aluminiumsfolie og legg dem i en muffelovn for 5 timer ved 450 ° C for å fjerne eventuelle forurensninger. Forberede glass ruge kamre med lokk. Rengjør med 70% etanol og eksponere åpne kamre for UV-lys i minst 2 timer i en flyt skap.
    MERK: Store desiccators (diameter omkring 30 cm) med lokk kan anvendes for dette formål; hver eksikkator kan huse opptil ti mikrokosmos oppsett.

2. Utarbeidelse av Media og kulturer

  1. For å kjøre 20 parallelle microcosms, oppnå 100 ml modifisert trypton-gjær-medium (Mty) 14, ca. 150 ml minimalt medium 21C 16 (MM), 5 ml minimalt medium-agar (MMA; 0,5%, w / v), tre potetdekstroseagar (PDA plater; 1,5%, w / v) for P. ultimum, fire tomme plater, en PDA plate inneholdende 2 mg L -1 cykloheksimid, fire agaroseplater (3%, w / v) inneholdende 0,3 g ml -1 aktivert karbon og 40 mg av FLU i 2 mg porsjoner.
  2. Forberede Mty inneholder 50 mg L -1 av kanamycin (kanamycin er required å opprettholde EGFP reporter-plasmid) og MM inneholdende 10 mM acetat for bakteriell dyrking. Bruk MM uten acetat for å fremstille 0,5% MMA for immobilisering av bakterier i microcosms og hell plater (hver 20 ml) av 1,5% PDA for dyrking av Pythium ultimum og mikrokosmos oppsett.
  3. Vaksinere noen hyfer av P. ultimum på tre ferske PDA-plater og inkuberes i mørke ved 25 ° C i ca. 72 timer. Deretter sørge for at platene er overgrodd helt av frisk og fluffy mycel.
  4. Starte to kulturer av B. sartisoli RP037-mChe i 50 ml Mty fra en glyserol lager. Inkuber ved 30 ° C med 230 rpm roterende kolbe bevegelse O / N.
  5. Mål kulturens optiske tetthet (OD) ved 578 nm og sentrifuger ved 1000 xg i 10 min (for B. sartisoli RP037-mChe, er den forventede OD 578 på 1,0, og cellene er i eksponensiell fase). Kast supernatanten og re-suspendere cellenei en passende mengde av MM å komme frem til en OD 578 på 0,4. Inokulere 20 ml MM inneholdende 50 mg L -1 kanamycin med 400 ul av de resuspenderte celler. Inkuber ved 30 ° C med 230 rpm roterende kolbe bevegelse O / N.
  6. Måle OD 578 av kulturen i MM (for B. sartisoli RP037-mChe, er det forventet OD 578 0,2 og cellene er i tidlig eksponentiell fase). Sentrifuger kulturen på 2000 xg i 10 min, og re-suspendere cellene i en passende mengde MM å oppnå en OD på 0,4. Bland 50 ul av cellesuspensjonen med 500 ul av varm, flytende MMA i 2 ml rør og oppbevares ved 50 ° C inntil bruk. Bruk 150 ul av celler i MMA for hver miniatyr.
  7. Hell plater av agarosegel inneholdende aktivert karbon. Smelte agarose (3%, w / v) i dobbeltdestillert vann. Bland grundig med aktivert karbon (0,3 g ml -1) og hell blandingen i plast petriskåler(D = 10 cm).

3. mikrokosmos Montering

MERK:. Den komplette mikrokosmos oppsettet er vist skjematisk i figur 1 Vennligst referer til figur 1 for alle følgende enkelte trinnene. Følgende trinn beskriver utarbeidelse av en prøve (SAM) med myceliske transport vektorer og tre forskjellige kontrolloppsett (CON AIR, CON NEG, CON POS). Et sammendrag av alle forskjellige oppsett kan finnes i tabell 1.

  1. Ta ønsket antall petriskåler og lysbilder og utsette dem for UV-lys under en strøm skap for 30 min.
  2. Plasser den lille petriskål inni den store og tilpasse lysbildet gjennom åpningen av den lille petriskål. Ta en prøve av den varme cellesuspensjon i MMA og tilsett 150 mL inn i midten hulrom av ett lysbilde. Gjenta dette trinnet til de midterste hulrom i alle lysbildene erfylt med MMA. Vent 5 min for MMA å stivne.
  3. Bruk en 1 cm korkbor å slå ut sirkulære flekker fra en tom PDA plate. Plasser en lapp i en avstand på 2 mm ved siden av MMA inne liten petriskål. Legg dette til fremme mycelvekst i oppsettet (PDA 3 i figur 1).
  4. Kutte buede PDA patcher som mekaniske barrierer. Bruk en ren og steril liten petriskål nederste delen og trykk det inn i en PDA plate. Bruke en spatel for å kutte en annen mindre ring i en avstand på 0,5 cm inn i agaren, som resulterer i en PDA-ring.
    1. Skjær ut et stykke, noe som passer akkurat inn i gapet på den lille petriskål i mikrokosmos oppsett og plassere den i gapet på toppen av lysbildet. Sørg for at avstanden mellom MMA og den sirkulære PDA barriere er ca 2 mm. Lukk lokket på den lille petriskål å trykke det forsiktig inn i PDA barriere.
    2. Gjenta trinn 3.4 og 3.4.1 med en PDA plate som inneholder 2 g L -1av cycloheximide.
      MERK: Dette er kontroll oppsettet for luftbåren transport (CON AIR) mot bioreporter celler, siden mycelier hemmet av cycloheximide og ikke overgrow MMA.
  5. Bruk en 1 cm korkbor å slå ut sirkulære flekker av en blank PDA plate. Bruk en annen 0,5 cm korkbor å kutte ut midt i den første oppdateringen. Plasser den resulterende lille PDA-ring i en avstand på 1 mm ved siden av barrieren PDA PDA (1 i figur 1).
  6. Tilsett 2 mg av FLU inn i hullet på PDA 1. Bruk en 1 cm korkbor å kutte ut sirkulære patcher fra PDA-plater overgrodd med P. ultimum og plasser en patch (PDA 2 i figur 1) bunn ned på PDA ringen slik at mycel-matten er vendt mot influensa krystaller.
    1. Gjenta forrige trinn uten å legge influensa krystaller.
      MERK: Dette er den negative kontrollen setup (CON NEG) å bestemme bakgrunnenfluorescens av bioreporter celler.
  7. Bruk en 1 cm korkbor å slå ut sirkulære flekker fra agar med aktivt kull. Plassere fire lapper i hver mikrokosmos oppsett å ytterligere redusere gass FLU konsentrasjon (Figur 1).
  8. Forberede en positiv kontroll (CON POS). Legg noen influensa krystaller til 200 mL av MMA cellesuspensjon og sette den i et hulrom av en tom lysbilde.
  9. Plasser en petriskål (d = 10 cm) med en viss pulver av aktivert karbon på den nederste av inkubasjonen kammeret for å minimalisere gass FLU konsentrasjon i kammeret. Også, plasserer 04:56 50 ml begre med sterilt vann på bunnen for å opprettholde høy luftfuktighet i kammeret.
    1. Overfør mikrokosmos oppsett i ruge kamre og inkuber ved 25 ° C i 96 timer. Plasser prøvene tilfeldig i de ulike vekstkamrene å utelukke plassering effekter.
      MERK: Dette inkubasjonstid apJeff Dunham til Eggsporesopper P. ultimum. Det kan være forskjellig for andre organismer.

4. Confocal Laser Scanning Mikros

  1. Ideelt bruke en CLSM oppsett med oppreist mikroskop.
    MERK: Det kan være utstyrt med konvensjonelle lasere offer for eksempel, 488, 561 og 633 nm linjer for eksitasjon eller med et justerbart hvitt laser kilde.
  2. Bruk følgende innstillinger for samling av bilder: Eksitasjon: 490 nm (EGFP) og 585 nm (mCherry) på riktig laser intensitet (samtidig eksitasjon); utslippsområder: 500-550 nm (EGFP) og 605-650 nm (mCherry); objektiv: 63X NA 0.9 vann immersible (på grunn av sin lange arbeidsavstand); trinnstørrelse for z-stabler: 0,5 mikrometer.
  3. Åpen mikrokosmos oppsett og bruk en skalpell for å fjerne PDA 1, 2, 3 og PDA barriere. Sette et glass dekkglass på toppen av MMA og trykk den forsiktig for å fjerne luftbobler. Mount lysbilde på mikroskop scenen. Legg en dråpe vann på toppen av the dekkglass og bruke mCherry innstillinger for å finne bioreporter celler i prøven.
  4. Få en rask oversikt over prøven og optimalisere signal til støyforhold ved hjelp av en glød-over-under oppslagstabellen for rød (mCherry) og grønn (EGFP) kanal. Velg tilfeldig posisjon på prøven for å analysere bioreporter fluorescens.
    MERK: hyfer kan vise autofluorescence i området bioreporter utslipp (for eksempel grønn autofluorescence) 17. Sørg for å velge områder uten hyfer hvis dette er tilfelle.
  5. Definere og registrere z-stabler for hver posisjon i det grønne (EGFP) og den røde (mCherry) kanal. Unngå bleking av prøven ved lang eksponering for epifluorescens lys eller laserlys.
    1. Gjenta forrige trinn for ti tilfeldige, jevnt fordelt posisjoner.
  6. Gjenta alle trinn ved hjelp av de samme innstillingene for alle prøver av testbanen (SAM), CON AIR, CON NEG og CON POS.
  7. 5. Bildeanalyse

    MERK: For å analysere rød (mCherry) og grønn (EGFP) fluorescens i z-stabler registrert, blant andre alternativer fri programvare ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kan være anvendes.

    1. Sørg for å installere logi_tool plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/).
    2. Åpne fil i ImageJ. Velg "delt kanaler" og nær grønne kanalen. Bruk makro 'mCherry området' gitt som tilleggskode fil å kvantifisere område av rød fluorescens i z-stack. Juster foretrukne innstillinger i makro (uthevet).
      1. Output er en tabell med de målte piksler over terskel (og over den definerte minimumsstørrelse) i z-stack.
        MERK: Summen av alle verdier er det totale antall røde piksler (område) i bunken.
    3. Åpne fil i ImageJ. Velg "delt kanaler" og tett rød kanal. Bruke makroen 216; EGFP int 'leveres som tilleggskode fil å kvantifisere intensiteten av grønn fluorescens i z-stack. Juster foretrukne innstillinger i makro (uthevet).
      1. Output er en tabell med de gjennomsnittlige intensiteter og areal av alle grønne gjenstander over terskel (og over den definerte minimumsstørrelse) i z-stack. For å beregne den totale intensiteten av grønne piksler i bunken, multipliserer hver bety intensitet av det aktuelle området.
    4. Beregn den relative EGFP induksjon (EGFP rel):
      Ligning 1 (1)
      MERK: Siden mCherry er uttrykt konstitutivt, er den resulterende verdi av EGFP rel et relativt mål for mengden av EGFP uttrykt av en viss mengde celler. Se også tabell 3 for ytterligere informasjon om beregning av EGFP rel.
    tle "> 6. Kjemisk Kvantifisering

    MERK: Microcosm oppsett kan også brukes til å utføre kjemiske kvantifisering av translokerte influensa mengder med eller uten en abiotiske forurensning vask.

    1. Vikle 15 ml hetteglass, 1 ml GC / MS hetteglass og innstikk i aluminiumsfolie. Fyll avdamping retter med Na 2 SO 4; plassere alle i muffelovn i 5 timer ved 450 ° C for å fjerne eventuelle forurensninger. Oppbevar Na 2 SO 4 innsiden av en aktivert eksikkator.
    2. Skjær PDMS belagt glassfiber inn 0,5 cm lengde. Vask fiber ved å riste fire ganger to timer i frisk metanol. Gjenta vasketrinn ytterligere fire ganger med ultrarent vann og lagre rene fibre i ultrarent vann i en forseglet glassflaske.
    3. Forbered 1,5 l toluen / aceton (3: 1, v / v) inneholdende 10 ug L -1 fenantren-d 10.
    4. Utfør trinn 1, 2 og 3 av protokollen. Forbered mikrokosmos uten bioreporter celler for å studere FLU transport (SAM (-) og CON AIR (-)) og med bioreporter celler (SAM) for å verifisere FLU degradering.
      1. Valgfritt (uten bioreporter celler): Plasser tre PDMS belagt glassfiber (vanligvis brukes for spme eksperimenter) som kunstig og kvantifiserbare forurensning vask inne MMA SAM (-) med fin pinsett.
      2. Fjern glassfiber bruker fine tang og overføre hver og en inn i en GC / MS hetteglass med innsatsen.
      3. Tilsett 200 ul av toluen og rist vertikalt O / N og analysere via GC / MS. Bruk innstillingene som er gitt i tabell 2.
    5. Overføre MMA fra midten hulrom i et 15 ml hetteglass og tilsett ca tre spatler av Na 2 SO 4. Bland godt med en slikkepott og tilsett 10 ml løsemiddel. Vortex blandingen og rist horisontalt O / N i mørket.
      1. Transfer 1001; l av prøven i GC / MS-hetteglass med innsatsen. Tilsett 10 pl av acenaftylen-d 08 (10 mg L-1) og analysere via GC / MS ved å bruke det samme program som beskrevet i 6.4.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultatene som presenteres her har allerede blitt publisert tidligere 15. Vennligst referer til artikkelen for detaljert mekanistisk og miljø diskusjon.

Etter bildeopptak via CLSM, kan en maksimal intensitet projeksjon bli utført med den respektive mikroskop programvare eller ImageJ å få en første visuelle inntrykk av prøven og kontrollene (figur 2). Senere, kan datasettene bli projisert annerledes for å vise meningsfulle funksjoner ved spesifikk visualisering programvare. Den positive kontrollen (CON POS) viser tydelig EGFP-induksjon (figur 2A), mens den luftbårne kontroll (CON AIR) oppviser kun bakgrunns EGFP fluorescens (figur 2B). EGFP fluorescens i prøven (SAM) ser ut til å være forhøyet i forhold til CON AIR, yet ikke så markert som CON POS (Figur 2C). Den mCherry fluorescens er uavhengig av PAH degradering og derfor den samme for alle prøver. Imidlertid vil noe forhøyede EGFP-signaler ikke påvises ved denne metode og etterfølgende bildeanalyse er viktig.

For de testede mikrokosmos, ble visuell inspeksjon supplert med bildeanalyse og beregning av relativ EGFP induksjon (jf trinn 5 ff i protokollen, figur 3). Den grønne bakgrunnen fluorescens for ikke-indusert B. sartisoli RP037-mChe beregnes med CON NEG. Under de gitte forhold, ble den relative EGFP induksjon funnet å være EGFP rel = 0,53. Ingen signifikant forskjell kunne påvises mellom CON NEG og CON AIR (EGFP rel = 0,54; p> 0,95) noe som utelukker noen dampfase FLU transport mot bioreporter celler. For CON POS, sterkt forhøyet EGFP induksjon (EGFP rel = 53,7) ble funnet bekrefter vitaliteten av cellene i MMA etter 96hr, og som representerer den maksimale EGFP induksjon. I nærvær av mycelier og influensa (SAM), ble EGFP indusert vesentlig i cellene sammenlignet med de negative kontroller (EGFP rel = 1,15; p <0,001). Imidlertid er EGFP induksjon relativt lav sammenlignet med den positive kontrollen (se tabell 3, punkt 8.).

Transport av FLU av mycel av P. ultimum i mikrokosmos oppsettet ble kvantifisert kjemisk (jf trinn 6 flg i protokollen, figur 4). I nærvær av FLU og P. ultimum (SAM (-)), mycelia transligger ca 25 ng av FLU innen 96hr som tilsvarer en transporthastighet på 37.5pmold -1 cm -1. Kontroller i fravær av mycelia (CON AIR (-)) viste gassformig FLU transport inn i MMA i området fra bare 2NG innenfor 96hr, dvs. kunne induksjon av bioreporter ved dampfase-konsentrasjoner utelukkes. Når B.sartisoli RP037-mChe var til stede (SAM), <1NG av FLU ble oppdaget i MMA patch. Dette bekreftet effektiv bakteriell FLU degradering etter at mycel-mediert translokasjon.

Det er mulig å undersøke innvirkningen av bakteriell nedbrytning, dvs. av en influensa vask, på FLU translokasjon ved tilsetning av en abiotiske kontaminant synke til systemet (se trinn 6.4.1 flg protokoll). Således er man i stand til å kvantifisere mengden av FLU absorbert av fibrene, og mengden venstre innsiden av MMA og liggende hyfer. For SAM(-), Er den totale mengde translokaliseres uavhengig av tilstedeværelsen av en kontaminant vask (p> 0,9; Figur 5A). Imidlertid, en mikro med økt FLU opptak område ble også testet som beskrevet i detalj tidligere 15. Der kunne en betydelig økning av translokaliseres FLU beløpet bli oppdaget (Figur 5B).

Figur 1
Figur 1. Skjematisk tegning og bilder av hele mikrokosmos oppsett. Utsikten fra toppen (A) og fra siden (B). Alle agar patcher ble plassert på toppen av en sklie med tre små hulrom. To mg influensa krystaller ble plassert inne i et hulrom (d = 5 mm) i midten av PDA 1. PDA to var ferske grodd med hyfer av P. ultimum vendt PDA 1. En buet PDA stykke ble plassert mellom PDA 2 og MMA patch til opprette en mekanisk FLU barriere sammen med lokket på en petriskål (d = 5 cm). Fire agar patcher som inneholder aktivt kull ble plassert i oppsettet for å ytterligere redusere gass FLU konsentrasjon. Bilder av komplett mikrokosmos fra toppen (C) og diagonal visning (D) uten mikroorganismer og influensa. Figur 1A og 1B har blitt modifisert med tillatelse fra Schamfuss et al. 15 tilpasset med tillatelse fra Schamfuss, S. et al. Effekt av mycel på tilgjengeligheten av fluoren til PAH nedbrytende bakterier. Environ. Sci. Tekno. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

pg "/>
Figur 2. maksimal intensitet projeksjoner av konfokale laser skanning mikrografer. Mikrografer er visualisere mCherry og EGFP induksjon av bioreporter bakterien B. sartisoli RP037-mChe i MMA. Når bakteriene hadde kontakt til et krystallinsk FLU kilde i MMA (CON POS; A), blir EGFP signal forhøyet sammenlignet med kontroller (CON AIR; B). Prøver med influensa og P. ultimum (SAM, C) viser også en forhøyet EGFP-signal, men mindre markert enn den positive kontroll. mCherry uttrykkes konstitutivt og derfor tjener som en visuell kontroll for å påvise celler. (Forstørrelse 630X, bar 20 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 3
Figur 3. Relativ EGFP induksjon i B.sartisoli RP037-Che for CON NEG, CON AIR og SAM med vekster og FLU. Sammenligning av den relative EGFP induksjon (EGFP rel) ved B.sartisoli RP037-Che etter 96hr i fravær av FLU (CON NEG), i nærvær av influensa, men fravær av P.ultimum (CON AIR) og i nærvær av både influensa og P.ultimum (SAM). Statistisk signifikante forskjeller til CON NEG er merket med en stjerne. Forsøkene ble utført i uavhengige triplicates for CON AIR og CON NEG, henholdsvis. En prøve ble testet for CON POS og EGFP rel ble beregnet med 53,7. Dette tallet har blitt modifisert med tillatelse fra Schamfuss et al. 15 tilpasset med tillatelse fra Schamfuss, S. et al. Effekt av mycel på tilgjengeligheten av fluoren til PAH nedbrytende bakterier. Environ. Sci. Tekno. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Figur 4
. (Jf. Figur 1) Figur 4. Kjemisk FLU kvantifisering Totale mengder FLU i ng hentet fra MMA patch etter 96hr for dampfasetransport uten celler (CON AIR (-)), mycelial transport uten celler (SAM (-)), og mycelie transport med celler (SAM). Dette tallet har blitt modifisert med tillatelse fra Schamfuss et al. 15 tilpasset med tillatelse fra Schamfuss, S. et al. Effekt av mycel på tilgjengeligheten av fluoren til PAH nedbrytende bakterier. Environ. Sci. Tekno. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Figur 5
Figur 5. Kjemisk FLU kvantifisering i nærvær av en abiotiske forurensnings vask (A) Totale mengder av FLU i ng ekstrahert fra MMA plasteret etter 96hr for mycelie transport med eller uten kunstig forurensning vask (SAM (. (Jf figur 1.) - ) med eller uten PDMS corerte fiber). (B) Samme resultater for et variert testbane med økt myceliesystem FLU opptak området. Dette tallet har blitt modifisert med tillatelse fra Schamfuss et al. 15 tilpasset med tillatelse fra Schamfuss, S. et al. Effekt av mycel på tilgjengeligheten av fluoren til PAH nedbrytende bakterier. Environ. Sci. Tekno. 47, 6908-6915. Copyright (2013) American Chemical Society.

Navn FLU Mycel Celler Søknad Kommentarer
SAM + + + CLSM
GC / MS-
SAM (-) + - GC / MS- også mulig med PDMS fibre som kunstig forurensning vask
CON AIR + (+) + CLSM mycel bare vokser opp til PDA barriere; MMA ikke er dekket
CON AIR (-) + (+) - GC / MS- mycel bare vokser opp til PDA barriere; MMA ikke er dekket
CON NEG - + + CLSM
CON POS + - + CLSM cellene er direkte utsatt for influensa krystaller

Tabell 1. Oversikt over alle prøvetyper Oversikt over alle kontroll- og testprøver inkludert søknad (bioreporter assay - CLSM eller kjemisk kvantifisering - GC / MS). Og sammensetningensjon (FLU, vekster og bioreporter celler).

Stekeovn
Initial temp 50 ° C
Initial tid 2 min
Sats 15 ° C min -1
Endelig temp 300 ° C
Siste gang 6,33 min
Injektor (PTV)
Injeksjon Volume 0,5 pl
Modus splitless
Purge 2,00 min
Rensestrbmningen 50.0 ml min -1
Initial temp 80 ° C
Initial tid 0.02 min
Ramper: Pris 600 ° C min -1
Endelig temp 300 ° C
Siste gang 10 min
Kolonne
Modell J & W DB-5MS
Normert 20 m
Nominell diameter 180 mikrometer
Nominell tykkelse 0,18 mikrometer
Bæregass helium 0,8 ml min -1
MSD overføringsrør 280 ° C
MSD
Sim-modus
MS Source 230 ° C
MS Quad 150 ° C

Tabell 2. Innstillinger for GC / MS. Oppsummering av alle innstillinger for GC og MS til quantify fluoren i mikrokosmos oppsett.

Fallgruvene KOMMENTAR
1 Foreløpige vekst og helsetester Studere veksten av mycelial organisme av valget. Hvor lang tid tar det å nå MMA patch? Er det hemmet av cykloheksimid barriere? Sjekk også om bioreporter cellene holder seg avgjørende i MMA hele tiden via flette analyser. Hvis ikke, kan man også kan legge en karbonkilde til MMA, som ikke resulterer i bioreporter induksjon. Utelukke mulig gjensidig hemming av bakterier og mycel.
2 Mycelvekst rente Veksten av mycel organisme bør ikke være for treg, fordi ellers gassfasetransport av PAH øker med langvarig inkubasjonstid. Protokollen kan være tilpassetå legge til PAH på et senere tidspunkt, men da igjen, kan mycel på vaksinasjonen punktet ikke være aktiv lenger.
3 Bakteriell mobilitet Hvis et punkt avsøkende lasermikroskop anvendt, og det bakteriestamme er motile, opptak og kvantifisering av z-stabler kan være umulig på grunn av bevegelse inne i MMA. Således bør bakteriell bevegelse forhindres, f.eks, ved å øke soliditeten av MMA, ved hjelp CLSM med en rask skanner eller en roterende disk lasermikroskop.
4 Dampfasetransport Dampfasetransport av den kjemiske (for eksempel PAH) mot bioreporter celler må utelukkes tilstrekkelig ettersom bioreporter celler er ekstremt følsomme for kjemikalier i dampfase. Dette er den avgjørende punkt i hele protokoll for å hindre forårsaket av gassformig transport falske positive resultater. GassfasenKonsentrasjonen kan estimeres via kjemisk analyse av CON AIR (-) og damp-fase-konsentrasjoner kan justeres for eksempel ved å tilsette mer eller mindre agarose flekker med aktivert karbon.
5 Toksisitet Husk at høye konsentrasjoner av testet kjemisk kan ha toksiske effekter på mycelial organisme og / eller bakterier.
6 Autofluorescence Sjekk om den valgte mycelie organisme viser noen autofluorescens i området av den forventede bioreporter signal. Pass på å sjekke på ulike vekststadier siden autofluorescence kan variere 17. Hvis det oppdages autofluorescence, sørg for å ta opp z-stabler i mycelia frie områder.
7 Bleking mCherry fluorescens er vanligvis stabil og ikke følsom for bleking i det påførte bioreporter celler. I motsetning til dette, bleker EGFP ganske raskt. Derfor bør man ikke bruke EGFP kanal for å visualisere prøven før z-stack opptak.
8 EGFP induksjon Vi la merke til en lav EGFP induksjon i SAM forhold til SVINDLET POS. Dette er hensyntatt ved den sterke romlig begrensning og lav tilgjengelighet av influensa kilde for å opprettholde svært lavt dampfase konsentrasjon av FLU (jf siste resultater avsnitt). Avhengig av den valgte bioreporter belastning og kjemisk, kan opptaksområdet på PDA 1 varieres for å øke transporthastigheten (Figur 5B). Imidlertid må det tas i betraktning at dette øker også dampfasetransport mot bioreporter celler.
9 Beregning av EGFP rel Den presenterte beregningsmetoden for EGFP rel hvor intensiteten av grønne piksler sammenlignestil området av røde bildeelementer er bare en mulighet. Vennligst referer til diskusjon for ytterligere informasjon.
10 Pikselstørrelse Vær oppmerksom på at forstørrelsen av det valgte objektivet og en potensielt brukes zoomfaktor påvirke pixel størrelsen på bildet. Dette må tas i betraktning før bildeanalyse.
11 Biotilgjengelige fraksjoner Husk at biotilgjengeligheten av den transporteres sammensatte vurderes kvalitativt (ikke kvantitativt) via EGFP induksjon. Ingen korrelasjon av den beregnede relative EGFP-induksjon og biotilgjengelig fraksjon ble forsøkt. Dette kan imidlertid bli tatt opp i fremtidige søknader.
12 Deteksjonsgrenser Kjemiske gjenkjenning. For kjemisk kvantifisering av organiske forbindelser, et bredt spekter av konsensentrasjoner kan detekteres pålitelig. Vi oppdaget mengder i området 0NG og 1,000ng. EGFP kvantifisering. Vi sammenlignet i forhold EGFP induksjon i prøvene uten forurensnings transport (dvs. 0NG transportert), med mycel-mediert transport (dvs. mellom 20 og 40ng transporteres, jfr figurene 4 og 5), og med direkte kontakt med forurensningskilden (dvs. maksimum tilgjengelig beløp). Disse tre tilfeller vist seg å være godt identifiserbar med den beskrevne fremgangsmåte. Men vi kan ikke gjøre en mer detaljert redegjørelse for oppløsningen av den relative EGFP induksjon. Dette problemet kan løses i fremtiden ved å koble sammen ulike miljøgifter mengder med correlating EGFP induksjon i mikrokosmos oppsett.
13 Petriskål materiale Plast petriskåler kan føre til en undervurdering av mycelie PAH translokasjon og / eller biotilgjengelighet. Dette bør ikkevære problematisk, om kvalitative utsagn er håpet. I tilfelle nøyaktige kvantitative målinger er nødvendig, anvendelse av glasspetriskåler skal betraktes tross tilberedning og håndtering vil være mer upraktisk.

Tabell 3. Diskusjon av mulige fallgruver. Mulige fallgruver før og under forsøket og forslag til kommentarer og alternativer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den presenterte mikrokosmos oppsett viste egnet til å studere biotilgjengeligheten av romlig atskilt kjemikalier til nedverdigende organismer etter opptak og transport av mycel. Potensial gass-fasetransport av delvis flyktige forbindelser forhindres og bakterielle bioreporter celler kan bli visualisert uten omstendelig prøvepreparering og dermed med minimal forstyrrelse av det følsomme system. På samme tid, kan kjemisk analyse av prøven lett gjennomføres slik at for en god kontroll av de oppnådd resultater og for kvantifisering av total transport. Men noen punkter må vurderes nøye før og mens du utfører forsøket. Et viktig poeng er å holde mikrokosmos fri for bakterielle eller kjemiske kryss forurensing. Dette kan være vanskelig, ettersom mange microcosms drives i parallell og er således store ruge kamre (for eksempel desiccators) nødvendig. Derfor er det avgjørende å sterilisere alle deler nøye før oppsettet bygsjon. Et annet kritisk punkt kan være anvendelsen av plast petriskåler for microcosms. Selv PAH og bioreporter ikke kommer i direkte kontakt, kan en viss mengde av PAH bli absorbert av plastmateriale. Imidlertid anser vi dette ikke problematisk for den beskrevne protokoll, siden dette ville resultere, om noen, i en undervurdering av mycelie PAH-translokasjon og / eller biotilgjengelighet. I alle fall, hvis nøyaktig kvantifisering er nødvendig, bør det overveies å skifte ut deler av plast med glassdeler, selv om behandling vil være mer upraktisk. Andre punkter som bør vurderes involvere det utvalgte bakterier og sopp stammer (mulig gjensidig hemming, vekstrate, mobilitet og mulig autofluorescence), de valgte kjemikalier (giftvirkninger på mikroorganismer, volatilitet, deteksjonsgrenser) og praktiske aspekter (bleking, begrensning av EGFP induksjon og beregning av EGFP rel). En oppsummering av mulige fallgruver og respektive kommentarer kan bli funnet iTabell 3.

Vi brukte denne modellen mikrokosmos oppsett for å demonstrere myceliesystem FLU transport og påfølgende bakteriell nedbrytning i en umettet system direkte på en celle-mycel interaksjon nivå. Vår modell oppsett kan varieres og justeres for å møte forskjellige behov med forskjellige bakterielle og soppstammer, kjemiske forbindelser, etc. Således kan systemet anvendes for eksempel (i) for å evaluere innvirkningen av mycel på bakterier i nærvær av en ellers begrenset kjemisk (f.eks, toksisk) kilde, (ii) å forutsi innvirkningen av mycel på biotilgjengeligheten av forbindelsene for bakteriell nedbrytning, (iii) å studere forurensnings biotilgjengelighet avhengig av avstanden av bakterier til transportvektor, eller (iv) for å undersøke effekten av forskjellige kjemiske kilder (f.eks, krystallinsk, i jord eller oppløst). Imidlertid justering av systemet til enlternate forhold vil være skjøre og må utføres trinnvis for å oppnå entydige resultater. Så langt har vi testet systemet for andre bakterielle eller soppstammer og andre forbindelser enn PAH. Men siden myceliske nettverk er kjent for å transportere også andre forurensninger enn PAH som plantevernmidler 19 eller løselige stoffer som salicylate 20, tror vi at systemet kan utvides til ulike kjemiske forbindelser gitt en sammensatt spesifikke bakteriell biosensor.

Legg merke til at avhengig av den påførte belastning bioreporter en annen beregning av EGFP rel kan være å foretrekke. I stedet for ligning (1) følgende to alternativer kan bli anvendt:

Ligning 2 (2)

Ligning 3 (3)

However, i den framlagte protokoll ligning (1) ble valgt på grunn av følgende grunner: (i) EGFP intensitet ble rapportert å korrelere til PAH fluks til cellen 14, mens (ii) mCherry ble rapportert å vise betydelige variasjoner for forskjellige celler 13 . Ligning (2) og (3), i motsetning, kan bli valgt for å forhindre falsk informasjon fra potensielle lette gjenstander i prøven. I alle tilfelle, sammenlignet vi alle tre beregningsmetoder med hverandre, hvorved det ikke noen statistisk signifikante forskjeller ble funnet. Likevel, på grunn av de rapporterte variasjoner i fluorescens intensitet av mCherry, anbefaler vi å bruke ligning (1) eller (2).

Til slutt bør visse begrensninger av teknikken betraktes. Siden microcosms ble utformet for å hindre gass-fasetransport av den testede forbindelse, mycelie opptak av forbindelsen reduseres. Dette resulterer i lavere transportpriser enn det som forventes med uhindret opptak. Derfor følsomheten av Bioreporter belastning må være høy nok til å oppdage små endringer i biotilgjengelige fraksjoner. Videre vil oppsettet sannsynligvis ikke være egnet for sopp stammer med en lav vekstrate. I dette tilfellet, kan langvarig inkubering favorisere gassfase-transport av forurensningene og dermed fører til falske positive resultater. Det kan være mulig å endre oppsettet på en måte at forurensningen kan brukes på et senere tidspunkt. Imidlertid kan hyfer da allerede være inaktiv eller død på vaksinasjonen punktet. Til slutt, som nevnt ovenfor, er utvalget av kjemiske forbindelser som er transportert av mycelie nettverk stort. Men kanskje det finnes en passende bioreporter belastning være en begrensende nøkkelfaktor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µl m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 ml Solution 1 + 25 ml Solution 2 + 5 ml Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
Solution 3 (pH 6.0)
Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O Carl Roth 4320.2 10 mg L-1
Copper(II) sulfate Carl Roth P023.1 1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth 0274.1 3 mg L-1
Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2%
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5%; pH 6.8
Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK 1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract Merck 1037530500
Tryptone Serva 4864702
Sodium chloride Carl Roth 3957.1
ImageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
  2. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
  3. Kieft, T. L., et al. Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites. Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).
  4. Wang, G., Or, D. Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces. Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).
  5. Griffin, D. M. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 141-151 (1981).
  6. Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. Soil Science Society of America. 1-22 (1981).
  7. Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi. J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).
  8. Jennings, D. H. Translocation of solutes in fungi. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).
  9. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).
  10. Furuno, S., et al. Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).
  11. Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots. Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).
  12. Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis. Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).
  13. Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability. Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).
  14. Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes. Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).
  15. Schamfuss, S., et al. Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria. Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).
  16. Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. Manual of methods for general bacteriology. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).
  17. Wu, C. H., Warren, H. L. Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability. Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  19. Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. Handbook of Vegetation Science. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).
  20. Furuno, S., et al. Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems. Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).
A Whole Cell Bioreporter tilnærming til Vurdere Transport og biotilgjengelighet av miljøgifter i vann Umettet Systems
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).More

Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter