A Whole Cell Bioreporter tilnærming til Vurdere Transport og biotilgjengelighet av miljøgifter i vann Umettet Systems

Summary

En hel celle bioreporter analysen med Burkholderia sartisoli RP037-mChe ble utviklet for å oppdage fraksjoner av en organisk forurensning (dvs. fluoren) tilgjengelig for bakteriell nedbrytning etter aktiv transport av mycel bridging luftfylte porer i et vann umettet modellsystem.

Abstract

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

Introduction

Jord er tett befolket av et bredt spekter av mikroorganismer ^1,2 slik som bakterier. Men forholdene i dette habitatet er utfordrende, spesielt i form av vann tilgjengelighet ^tre. Bakterier permanent behov for å søke etter optimale forhold i heterogene miljøer ^fire, men fraværet av kontinuerlige vannfilmen som fører til nedsatt bevegelighet ^fem hindrer dem til å spre seg fritt. Dessuten er diffusjonshastigheter av oppløste stoffer (f.eks næringsstoffer) senket i henhold umettede forhold ^6. Dermed er bakterier og næringsstoffer ofte fysisk atskilt og nærings tilgjengelighet er begrenset ^tre. Som en konsekvens av dette, kan en transportvektor for kjemiske forbindelser som ikke krever en kontinuerlig vannfase med på å overvinne disse begrensningene. Faktisk har mange mikroorganismer som sopp og Oomycetes utviklet en trådformede vekst skjema slik at de kan vokse gjennom luftfylte hulrommene dermed nådd og mobilizing også fysisk adskilt næringsstoffer ⁷ og karbonholdige ^åtte stoffer over lange avstander. De kan også fungere som biologiske transport vektorer som leverer sukker og andre energikilder til bakterier ^9. Opptak og transport i myceliske organismer har også vist seg for hydrofobe organiske miljøgifter som polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) i Pythium ultimum ¹⁰ eller i arbuscular mykorrhizasoppene ^11. Siden PAH er allestedsnærværende og tungt vannoppløselige forurensninger ¹² i jordsmonnet, kan mycelia-mediert transport bidra til å øke forurensningen biotilgjengelighet for potensielle bakterielle degraders. Mens den totale mengden av forurensende transport kan kvantifiseres direkte ved kjemiske midler ^10, biotilgjengeligheten av forurensninger som transporteres av mycel til nedbrytende bakterier og andre organismer kan ikke vurderes lett.

Følgende protokoll presenterer en metode for å evaluere virkningen av mycelia på forurensningen biotilgjengeligheten til bakterielle degraders i en direkte måte; det tillater å samle informasjon om tid og rom virkningen av miljøgifter på mikrobielle økosystemer. Vi beskriver hvordan du setter opp en forseggjort umettet mikrokosmos system hermet luft-vann-grensesnitt i jord ved å koble en fysisk atskilt PAH punktkilde med PAH-nedverdigende bioreporter bakterier via myceliske transport vektorer. Fordi lufttransport er utelukket, kan virkningen av mycelie basert transport på PAH biotilgjengelighet for bakterier bli studert i en isolert måte. I større detalj ble det tre-ring PAH fluoren, mycel-organisme av Pythium ultimum og bioreporter bakterien Burkholderia sartisoli RP037-mChe ¹³ anvendt i de beskrevne mikrokosmos oppsett. Bakterien B. sartisoli RP037-mChe ble opprinnelig konstruert for å studere fenantren flukser til cellen ¹⁴ og uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) som et resultat av PAH fluks tilcellen, mens den røde fluorescerende mCherry er uttrykt konstitutivt. Detaljert informasjon om reporteren bygging er gitt av Tecon et al. ¹³ I foreløpige tester, avslørte bakterien ingen svømming og bare veldig treg svermende evne. Det var i stand til å migrere langsomt på hyfer av Pythium ultimum ved påføring som en tett suspensjon på toppen av hyfer. Siden bakterier ble innleiret i agarose i den følgende protokoll, ble migrering av hyfer ikke forekomme.

Ved hjelp av konfokal laser-skanning mikroskopi (CLSM), kan de bioreporter bakterier visualiseres direkte i microcosms og ekspresjon av EGFP kan bli kvantifisert i forhold til mengden av celler (proporsjonal med mCherry signal) ved hjelp av programvaren ImageJ. Dette gjør det mulig å sammenligne biotilgjengelighet kvalitativt i ulike scenarier (dvs. høyere eller lavere). FLU ble funnet å være biotilgjengelig etter mycelial transport av P. ultimum (dvs. detvar høyere enn i en negativ kontroll). Videre, beskriver den protokoll hvor å kvantifisere den totale mengden av mycel-mediert transport via kjemiske midler og for å kontrollere forurensningen biotilgjengelighet ved hjelp av silisium-belagte glassfibrer (SPME-fibre) i identiske microcosms. Resultater ved hjelp av dette mikrokosmos oppsettet har blitt publisert og diskutert for kombinasjonen av P. ultimum, fluoren og B. sartisoli RP037-mChe ^15. Her ligger fokuset på en detaljert metodebeskrivelse og identifisering av potensielle fallgruver protokollen for å gi denne kunnskapen for potensielle videre søknader. Andre applikasjoner kan innebære ulike sopp, bakteriearter (f.eks, fra forurensede områder), og andre forurensninger (f.eks plantevernmidler) eller forurensning-forsyning (f.eks alderen jord).

Protocol

1. Utarbeidelse av Retter, lysbilder og Inkubasjon Chambers Forbered følgende materiale for hver mikrokosmos: en stor plast petriskål bunnen (d = 10 cm), en modifisert (se trinn 1.2) liten plast petriskål bunnen (d = 5 cm) med lokk og en tellekammer lysbilde med tre hull i tennene. Ta det ønskede antall petriskål bunndeler (d = 5 cm). Fjerne en del av randen med en sag til akkurat passe et lysbilde (26 mm kantlengde). Å sterilisere systemet, suge petriskål bunner og lokk i 70% etanol O / N og…

Representative Results

Resultatene som presenteres her har allerede blitt publisert tidligere 15. Vennligst referer til artikkelen for detaljert mekanistisk og miljø diskusjon. Etter bildeopptak via CLSM, kan en maksimal intensitet projeksjon bli utført med den respektive mikroskop programvare eller ImageJ å få en første visuelle inntrykk av prøven og kontrollene (figur 2). Senere, kan datasettene bli projisert annerledes for å vise meningsfulle funksjoner ved spesifikk visualise…

Discussion

Den presenterte mikrokosmos oppsett viste egnet til å studere biotilgjengeligheten av romlig atskilt kjemikalier til nedverdigende organismer etter opptak og transport av mycel. Potensial gass-fasetransport av delvis flyktige forbindelser forhindres og bakterielle bioreporter celler kan bli visualisert uten omstendelig prøvepreparering og dermed med minimal forstyrrelse av det følsomme system. På samme tid, kan kjemisk analyse av prøven lett gjennomføres slik at for en god kontroll av de oppnådd resultater og for…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Confocal Microscope	Leica		TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD	Agilent		an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522	Agilent
Cork borer	Fisher Scientific	12863952	or any other
Cover slips	Marienfeld	107222	High performance, No.1.5H
GC/MS insterts	WICOM	WIC 47080
GC/MS vials 2 ml	WICOM	WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials	DIONEX	49463 / 049464
Lids for GC/MS vials	WICOM	WIC 43948/B
Objective Slides	Menzel		ordinary
PDMS coated glass fibers	Polymicro Technologies, Inc.		V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1
Petri Dishes small / big	Greiner	633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml	DIONEX	48783	other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml	DIONEX	48784	other glass vials may be used
Acenaphthylene d08	Dr. Ehrenstorfer	C 20510100
Acetone	Carl Roth	9372.2
Activated carbon	Sigma-Aldrich	242276-1kg
Agarose	Carl Roth	2267.4
Fluorene	Fluka	46880
Kanamycin sulfate	Carl Roth	T832.2	50 mg L-1
Methanol	Carl Roth	P7171
Minimal Medium:			100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest
Solution 1
Ammonium sulfate	Carl Roth	3746.1	5 g L-1
Magnesium chloride x 6 H2O	Carl Roth	2189.1	1 g L-1
Calcium nitrate x 4 H2O	Carl Roth	P740.1	0.5 g L-1
Solution 2
Disodium phosphate	Carl Roth	P030.1	55.83 g L-1
Monopotassium phosphate	Carl Roth	3904.1	20 g L-1
Solution 3			pH 6.0
Disodium EDTA	MERCK	1084180250	0.8 g L-1
Iron(II) chloride x 4 H2O	MERCK	1038610250	0.3 g L-1
Cobalt(II) chloride x 6 H2O	Carl Roth	T889.3	4 mg L-1
Manganese(II) chloride x 1 H2O	Carl Roth	4320.2	10 mg L-1
Copper(II) sulfate	Carl Roth	P023.1	1 mg L-1
Sodium molybdate x 2 H2O	Carl Roth	0274.1	3 mg L-1
Zinc chloride	MERCK	1088160250	2 mg L-1
Lithium chloride	Carl Roth	P007.1	0.5 mg L-1
Tin(II) chloride x 2 H2O	Carl Roth	4473.1	0.5 mg L-1
Boric acid	Riedel-de-Haen	11606	1 mg L-1
Potassium bromide	Carl Roth	A137.1	2 mg L-1
Potassium iodide	Carl Roth	6750.1	2 mg L-1
Barium chloride	Carl Roth	4453.1	0.5 mg L-1
MMA			Minimal medium + agarose 0.2 %
Phenanthrene d10	Dr. Ehrenstorfer	C 20920100
Potato Dextrose Agar:			24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8
Potato Dextrose broth	Difco/ Beckton Dickinson	254920
Bacto-agar	Difco/ Beckton Dickinson	214040
Sodium acetate x 3 hydr.	Carl Roth	6779.1
Sodium sulfate	MERCK	1066495000
Toluene	MERCK	1083252500
mTY medium:			3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
Yeast extract	Merck	1037530500
Tryptone	Serva	4864702
Sodium chloride	Carl Roth	3957.1
imageJ with logi tool plugin			http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1			Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe			Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland